Izolacja komórek mononuklearnych z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z EAE

Dzień dobry. Nazywam się Christine Beaton i jestem asystentką badawczą w laboratorium George'a Chen w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj pokażę Państwu, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów.

Niniejsza procedura polega na głębokim znieczuleniu szczura w celu przeprowadzenia perfuzji serca, aby wyeliminować zanieczyszczenie ośrodkowego układu nerwowego krwią. Po zakończeniu tego etapu pobierzemy mózg oraz rdzeń kręgowy, a następnie przygotujemy zawiesinę pojedynczych komórek przy użyciu sitka komórkowego. Następnie, wykorzystując dwuwarstwową gradientową separację w Percollu, wyizolujemy komórki mononuklearne. Przejdźmy zatem do realizacji.

Jestem teraz gotowy do przeprowadzenia perfuzji serca, więc przedstawię wszystkie materiały, których do tego potrzebuję. Pierwszą rzeczą, której potrzebujemy, jest dzwonek szklany, a tutaj na dole umieściliśmy ręczniki papierowe nasączone lotnym środkiem anestetycznym. Można użyć halotanu lub izofluranu.

W następnej kolejności potrzebujemy czegoś do unieruchomienia szczura oraz naczynia do zbierania krwi. Przygotowaliśmy zatem tymczasową instalację do perfuzji szczurów. Należy użyć igły o rozmiarze 21 G, a następnie przeprowadzić perfuzję roztworem soli fizjologicznej, podawanym grawitacyjnie przez system do perfuzji dożylnej.

Jeśli nie mają Państwo dostępu do żadnego z tych systemów, można również napełnić kilka strzykawek solą fizjologiczną i przeprowadzić perfuzję ręcznie. Jednak ta metoda jest znacznie łatwiejsza. Potrzebujemy również korpusu strzykawki 10 ml, w którym umieściliśmy chusteczki Kim wipes.

Następnie dodam do niego środek znieczulający, który zostanie naniesiony na nos szczura, aby zapewnić głęboką narkozę podczas zabiegu. Oczywiście niezbędne będą również instrumenty. Dzisiaj nie będę przeprowadzać procedury w warunkach sterylnych, ponieważ nie zamierzam hodować tych komórek in vitro.

Wszystkie narzędzia, których używam, nie są sterylne. Oczywiście, jeśli chcą Państwo wprowadzić komórki do hodowli, należy użyć narzędzi sterylnych. Na potrzeby tego filmu będę korzystać ze szczura, który jest martwy.

Dzięki temu mogę przeprowadzić procedurę powoli, aby zaprezentować ją Państwu krok po kroku. Oczywiście w rzeczywistej procedurze szczur musiałby być poddany głębokiej anestezji, ale nie mógłby być martwy. Serca powinno nadal bić.

Zacznijmy więc od tego szczura. Położyłem szczura na brzuchu, tyłem do siebie, a na jego nos położyłem nasączone chusteczki. Pierwszą rzeczą, którą zrobię, będzie sprawdzenie, czy szczur znajduje się w stanie głębokiej anestezji.

Należy to zrobić przed każdą z tych procedur. Używam więc pęsety i uszczypuję szczura – w tym przypadku nie występuje żadna reakcja. Jeśli pojawi się jakakolwiek reakcja, szczura należy umieścić z powrotem w komorze do narkozy, aby upewnić się, że jest on głęboko znieczulony.

Następnie użyję 70% etanolu, aby namoczyć górną połowę szczura. Potem otworzę jamę klatki piersiowej. Najpierw nacinam skórę i rozchylam ją na boki.

Następnie otworzę samą jamę. Ta masa tutaj to serce. Tutaj można zobaczyć prawy przedsionek.

To jest miejsce, które przetnę, aby umożliwić wypłynięcie krwi. Następnie, aby przeprowadzić perfuzję całego ciała, muszę wprowadzić igłę do lewej komory. Zatem wprowadzę igłę dokładnie w tym miejscu.

Po wprowadzeniu igły otworzę rurkę do infuzji, aby umożliwić przepływ soli fizjologicznej, i pozostawię ją na od 5 do 10 minut. Jeśli perfuzja przebiega prawidłowo, zauważalna będzie zmiana koloru w obrębie tętnicyy szyjnej, nosa i oczywiście oczu szczura, co świadczy o tym, że krew opuszcza organizm zwierzęcia. Oznacza to, że perfuzja powinna być prawidłowa.

Oto szczur po perfuzji serca. Jak widać, nos, uszy i oczy tego szczura nie są już różowe ani czerwone. Są całkowicie białe, co wskazuje, że perfuzja przebiegła pomyślnie.

Większość lub cała krew opuściła organizm szczura. Po przeprowadzeniu perfuzji przez serce muszę odciąć głowę zwierzęciu. Muszę przeprowadzić dekapitację szczura.

W tym celu wykorzystam standardowy sprzęt laboratoryjny. Teraz przystąpię do wyjęcia mózgu szczura. Najpierw namoczę całe futro w 70% ethanolu, aby uniknąć rozprzestrzeniania się sierści w otoczeniu.

Następnie usunę najpierw skórę. Ponieważ nie zamierzam wykorzystać mózgu do badań histologicznych i będę go ciąć na małe kawałki, nie będę szczególnie uważać, aby wyjąć go w sposób nienaruszony. W jednym ruchu wsunę nożyczki u podstawy czaszki, w miejscu, gdzie mózg łączy się z rdzeniem kręgowym, dokładnie tutaj.

Następnie przetnę kość po każdej stronie, a potem usunę górną część. Będę powtarzać tę czynność wielokrotnie. W ten sposób mózg jest całkowicie odsłonięty.

Jak widać, perfuzja przebiegła pomyślnie, ponieważ mózg jest całkowicie przejaśniony. U zwierzęcia niepoddanego perfuzji górna warstwa mózgu byłaby całkowicie pokryta czerwonymi kapilarami krwionośnymi; tutaj w ogóle ich nie widać, co oznacza, że perfuzja była skuteczna. Teraz będę wyjmować mózg, upewniając się, że nie pozostawię opuszki węchowej, i umieszczę go w probówce z schłodzonym PBS.

Teraz, nie dbając nadmiernie o zachowanie nienaruszonej struktury, przełożę mózg do probówki z PBS, przetnę nerwy wzrokowe, a następnie, używając szpatułki, dość łatwo go wyjmę. Teraz usunę rdzeń kręgowy z tego samego szczura. Tutaj również, ponieważ i tak będziemy go ciąć na małe kawałki, nie będę zbyt ostrożnie go wyjmować, o ile uda mi się usunąć go w całości.

Najpierw wykonuję nacięcie skóry wzdłuż całej kolumny kręgosłupa, a tutaj widoczny jest kręgosłup. Następnie usunę tutaj tkankę mięśniową, aby odsłonić kręgosłup na całej jego długości. I właśnie tutaj można zobaczyć rdzeń kręgowy.

W przypadku myszy można przeciąć oba końce i wstrzyknąć PBS za pomocą strzykawki, dzięki czemu rdzeń kręgowy wysunie się niemal w całości. U szczurów nie jest to jednak takie proste. Muszę go rozciąć i wydobyć rdzeń kręgowy łyżeczką.

Teraz wykonuję nacięcia po obu stronach i, tak jak w przypadku mózgu, przecinam i usuwam kość, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Podobnie jak w przypadku mózgu, rdzeń kręgowy jest całkowicie biały, co świadczy o prawidłowym przebiegu perfuzji przezsercowej. Powtórzę tę czynność wzdłuż całego kręgosłupa.

Następnie schodzę do poziomu prawego biodra, które znajduje się tutaj. Teraz użyję pęsety – nie wygląda to zbyt estetycznie, ale po prostu wyciągnę rdzeń kręgowy i umieszczę go w probówce wraz z mózgiem. W probówce mam teraz zarówno mózg, jak i rdzeń kręgowy szczura, zatem jestem gotowy do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek.

Jestem teraz gotowy do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z ośrodkowego układu nerwowego. Będę do tego potrzebować 10 cm szalki Petriego, w której umieszczę sitko komórkowe o oczkach 70 µm. Będę również używać tłoka z 1 ml strzykawki, a dodatkowo potrzebuję pęsety i nożyczek.

Przeniosę próbkę do sita komórkowego, upewniając się, że w probówce nic nie zostało. Następnie potnę ją na małe kawałki, mieszając mózg z rdzeniem kręgowym. Gdy całość zostanie drobno posiekana, użyję tłoka strzykawki O'Neill, aby przecisnąć materiał przez sito.

Zauważą Państwo, że PBS na zewnątrz urządzenia do treningu komórek będzie stawał się stopniowo bardziej mętny w miarę przepływu pojedynczych komórek. Gdybym chciał przygotować zawiesinę komórkową w sposób sterylny, oczywiście zrobiłbym to w komorze z laminarnym przepływem powietrza i nie wkładałbym do niej palców. Teraz, gdy PBS jest mętny, zbiorę go po raz pierwszy i przeleję do probówki 50 ml.

Będę jednak nadal obserwować proces i dodam nieco więcej PBS do sitka do komórek, a następnie przecisnę zawiesinę. Ponieważ OUN zawiera bardzo dużo tłuszczu, jest to jeden z organów, z których najtrudniej przygotować zawiesinę komórkową przy użyciu tej techniki. Przecisnąłem całą tkankę OUN przez sitko do komórek kilkakrotnie i zebrałem całą zawiesinę pojedynczych komórek.

A tutaj znajduje się probówka, którą dopełniłem do 50 ml buforem PBS zawierającym moją zawiesinę pojedynczych komórek przygotowaną z OUN po prawej stronie. Teraz odwiruję tę probówkę, aby przygotować ją do gradientu; wirowanie komórek dobiegło końca. Mamy teraz osad, więc odrzucę nadsącz i ponownie zawieszę komórki w 20 ml 30% Percoll w PBS.

Następnie nałożę to na 10 µL 70% perkolu w PBS, aby umożliwić migrację. Odrzucam supernatant. Rozbijam pellet, aby upewnić się, że komórki znajdują się w pojedynczej zawiesinie, a nie w skupisku w osadzie.

W tym momencie mam zawiesinę komórek OUN w formie pojedynczych komórek. Zawieszę te komórki w 20 ml 30% Percoll w PBS, a następnie nałożę te 20 ml na 10 ml 70% Percoll w PBS. Następnie poddam całość wirowaniu.

Teraz wezmę 20 ml zawiesiny CNS i powoli nałożę ją na warstwę 70% Percoll, aby ułatwić ten proces. Do jednej z warstw można dodać barwnik, taki jak czerwień fenolowa, ale nie jestem pewien, czy i w jaki sposób wpływa on na komórki. Dlatego staram się go unikać.

Należy postępować wystarczająco powoli, aby dwie warstwy nie wymieszały się, unikając tym samym powstawania dużych turbulencji w warstwie dolnej. Wraz ze zwiększaniem grubości warstwy górnej można zwiększyć prędkość dozowania. W ten sposób dodałem komórki do gradientu.

Przezroczysta warstwa na dole to warstwa Percoll 70%, a mętna warstwa na górze to warstwa Percoll 30%, która zawiera moją zawiesinę pojedynczych komórek. Teraz umieczę tę probówkę w wirówce na 20 minut; jeśli wszystko przebiegło pomyślnie, będę w stanie zobaczyć warstwę mononuklearnych komórek. Wirowanie gradientu zostało zakończone.

Zatem, jak zawsze, wirujemy w gradiencie, pamiętając o tym, aby wyłączyć hamulec, by nie zakłócić gradientu poprzez zbyt szybkie spowolnienie. W ten sposób otrzymujemy nasze warstwy. Nad gradientem znajduje się warstwa tłuszczu, którą usunę, aby uniknąć zanieczyszczenia zawiesiny komórkowej.

A na styku dwóch warstw Perkel 30% i 70% widać, że granica nie jest ostra, lecz rozmyta i to właśnie tam znajdują się komórki. Po usunięciu komórek granica ta stanie się znacznie wyraźniejsza. Dlatego teraz usunę główną część tłuszczu z górnej warstwy i przełożę ją do pojemnika na odpady.

Nie muszę usuwać wszystkiego, ale chcę usunąć wystarczającą ilość, aby ciecz nie pokryła całkowicie pipety podczas pobierania komórek mononuklearnych. Teraz, używając drugiej pipety transferowej, zejdę do poziomu interfejsu i zbiorę komórki. W ten sposób zebrałem kilka mililitrów materiału z interfejsu.

Zatem prawdopodobnie zebrałam już wszystkie dostępne komórki. Liczba mononuklearnych komórek w tym OUN była bardzo mała. Obecnie mam zatem komórki mononuklearne w probówce.

Wypełnię tę probówkę PBS do 50 ml, a następnie odwiruję komórki, aby utworzyć osad, co pozwoli usunąć Phenol Red. Zalecam wypłukanie ich co najmniej kilka razy, używając pełnej probówki PBS, aby upewnić się, że cały Phenol Red został usunięty. Po tym zabiegu komórki są gotowe do przeprowadzenia dowolnej procedury.

Dzisiaj zaprezentowałem, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów. Oczywiście, po uzyskaniu tych komórek mononuklearnych, można je dalej oczyszczać, aby wyizolować z tej populacji na przykład limfocyty T. W przypadku tych komórek przeprowadzę analizę cytometryczną, aby wykryć populacje komórek obecne w moim mózgu.

Powodzenia w izolacji komórek.