Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wytworzenie i scharakteryzowanie sprzężonych nanosystemów biologicznych łączących stałe podłoża nanostrukturalne z unieruchomionymi biomolekułami. Osiąga się to poprzez wykorzystanie litografii wiązką elektronów o ultra wysokiej rozdzielczości lub EBL w celu uzyskania macierzy maleńkich metalicznych nanostruktur na stopionych nośnikach krzemionkowych. W drugim etapie substraty umieszcza się w roztworze, a biomolekuły są unieruchamiane na ich powierzchni, tworząc nanobiologiczne interfejsy.

Następnie stosuje się powierzchniowo wzmocnioną spektroskopię ramenu lub SIRS w celu zbadania cząsteczek biologicznych na granicy faz. Otrzymane widma sir wykazują charakterystykę trybu ramenu dla poszczególnych cząsteczek z intensywnościami silnie zależnymi od konstrukcji podłoża. Główną przewagą naszego podejścia nad istniejącymi technikami, takimi jak spektroskopia w podczerwieni, jest to, że czułość może być znacznie zwiększona dzięki plazmie powierzchniowej i rezonansowi w nanostrukturach metalowych.

Nasze podejście tworzy wysoce selektywne powierzchnie, które można łatwo kontrolować za pomocą połączenia funkcjonalizacji molekularnej i litografii wiązką elektronów. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w wielu dziedzinach, od badań eksploracyjnych w dziedzinie biologii strukturalnej lub usług mobilizowanych przez polimery po rozwój różnych urządzeń wykorzystujących nanobiologiczne interfejsy. Metody te mogą dostarczyć informacji naukowych na temat właściwości strukturalnych biomolekuł, a ich implikacje mogą sięgać po diagnostykę medyczną lub wykrywanie środowiska.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą zmagać się z problemami, ponieważ obejmuje ona aspekty nanoprodukcji, funkcjonalizacji powierzchni, biochemii i spektroskopii, które tradycyjnie nie były ze sobą powiązane Aby rozpocząć powlekanie przędzą polimetakrylanu metylu lub PMMA, warstwy odporne i przewodzące na podłożach. Aby to osiągnąć, użyj przędzarki waflowej z uchwytem próżniowym i umieść próbki pojedynczo na środku uchwytu. Umieść jedną kroplę rezystu PMMA na środku próbki za pomocą szklanej pipety.

Następnie kręć z prędkością 3 500 obr./min przez 60 sekund z dwusekundowym czasem przyspieszenia. Następnie piecz substraty w temperaturze 180 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu minut po upieczeniu substratów, schładzaj próbki do temperatury pokojowej ze schłodzonymi podłożami i wróć do uchwytu obrotowego. Rozprowadź kroplę przewodzącego polimeru na podłożu.

Obracaj podłoże przez 40 sekund z prędkością 3000 obr./min z dwusekundową rampą po wirowaniu. Piecz próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez jedną minutę po wykonaniu litografii wiązką elektronów lub ekspozycji na EBL zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotuj zlewkę ze zjonizowaną wodą w celu usunięcia przewodzącego polimeru. Następnie przygotuj drugą zlewkę z mieszanką wywoływacza i mieszaj przez pięć minut, ustaw temperaturę pokojową.

Na koniec przygotuj izopropanol w trzeciej zlewce jako środek nabłyszczający za pomocą pęsety. Umieść próbki w wodzie na trzy sekundy, aby usunąć przewodzącą warstwę polimerową. Następnie umieść próbkę w wywoływaczu i powoli przesuwaj pęsetę w górę iw dół przez 20 sekund, natychmiast przenieś substraty do izopropanolu i płucz jeszcze przez 10 sekund przed wysuszeniem próbki azotem, załaduj próbki do góry nogami do systemu parownika wiązki elektronów, aby umożliwić osadzenie się odparowanego metalu na przedniej powierzchni próbek.

Umieść warstwę złota o grubości 10 nanometrów na próbkach w przypadku wzorów pierwszego i trzeciego oraz warstwę srebra o grubości 10 nanometrów w przypadku projektu. Dwa z szybkością około 0,1 nanometra na sekundę. Następnie napełnij system sonikacyjny do zalecanej wysokości wodą i napełnij oddzielną zlewkę acetonem.

Umieścić próbkę stroną zadrukowaną do góry na dnie zlewki i pozostawić próbkę do namoczenia przez 10 minut, trzymając zlewkę. Umieść go w łaźni wodnej i pozwól, aby wysokość acetonu odpowiadała wysokości wody. Następnie włącz system sonikacji.

Pozwól na wystąpienie sonikacji przez maksymalnie 60 sekund. Aby przygotować jedną próbkę, najpierw przygotuj jednomilimolowy roztwór MUA i etanolu w temperaturze pokojowej i poddaj sonikacji przez 10 minut. Zanurz odpowiednie podłoże nanostrukturalne w roztworze MUA na 48 godzin.

Następnie trzykrotnie przepłukać próbkę etanolem i suszyć przez pięć minut. Ustaw temperaturę pokojową. Następnie przygotuj 75-milimolowy roztwór EDC i wody destylowanej.

Przygotuj również 15-milimolowy roztwór NHS w wodzie destylowanej za pomocą osadzacza mikropipet, 100 mikrolitrów NHS na złoto na podłożu i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów EDC na tym samym obszarze. Inkubować przez jedną minutę, aby aktywować samoorganizującą się monowarstwę MUA. Następnie umieść 100-mikrolitrową kroplę białka, roztwór na tym samym obszarze podłoża.

Umieścić próbkę w jednej komorze szalki Petriego z jednym mililitrem wody destylowanej w innej komorze. Uszczelnić szalkę Petriego pokrywką i przechowywać próbkę przez 24 godziny w temperaturze pięciu stopni Celsjusza. Następnie przepłukać próbkę w wodzie destylowanej trzykrotnie, w sposób ciągły próbki w oddzielnych zlewkach przez 20 sekund w każdej zlewce, nie dopuścić do wyschnięcia próbek po płukaniu lub podczas płukania w przypadku wzorów dwóch próbek.

Przygotować 0,9 milimolowy roztwór białka wiążącego glukozę lub GBP w buforze fosforanu potasu. Przygotuj również 100-milimolowy roztwór DG glukozy w buforze. Następnie wymieszaj 30 mikrolitrów roztworu glukozy D i 30 mikrolitrów roztworu GBP.

Za pomocą jednomililitrowego plastikowego pojemnika na mikroprobówki i mikropipety inkubować przez 30 minut, a następnie umieścić 20 mikrolitrów roztworu GBP bez ligandu i 20 mikrolitrów roztworu GBP związanego z ligandem na przygotowanych podłożach. Za pomocą mikropipety przechowuj próbki w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez 24 godziny na szalce Petriego z szczelną pokrywą. Przepłukać próbki trzykrotnie w roztworze buforowym fosforanu potasu w temperaturze pokojowej Aby się przygotować.

Zaprojektuj trzy próbki, rozcieńcz roztwór wiążący dopaminę apre lub DBA do stężenia jednego mikromola. Używając buforu tris EDTA o końcowym pH 7,4, przygotuj roztwór dopaminy do stężenia pięciu mikromolowych, mierząc proszek dopaminy na wadze analitycznej i mieszając go z roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem lub PBS z kulką mieszającą przez pięć minut. Następnie nanieś 20-mikrolitrową kroplę roztworu DBA na powierzchnię każdego podłoża i pozostaw próbkę na godzinę w temperaturze pokojowej z przykryciem na szalce Petriego.

Po trzykrotnym przepłukaniu próbek w buforze fosforanu potasu, należy umieścić próbki pionowo na chusteczce do pomieszczeń czystych, aby wysuszyć tylną stronę, zachowując folię z przodu podłoża. Odłóż próbkę na bok jako kontrolę. Następnie umieść pięciomikrolitrową kroplę roztworu dopaminy na powierzchni istniejącego PBS.

Upuść na pozostałe próbki. Inkubować próbki przez 10 minut, a następnie trzykrotnie przepłukać je w roztworze buforowym fosforanu potasu. Aby wykonać spektroskopię ramen.

Umieść każdą próbkę w wodoodpornej komorze, aby uniknąć parowania przez naświetlanie laserem. Napełnij plastikową strzykawkę chemicznie obojętnym smarem wysokopróżniowym. Następnie umieść próbki na szkiełkach podstawowych i napełnij kilka milimetrów tłuszczu otaczającego próbki, nie dotykając ich.

Umieść szkiełko nakrywkowe mikroskopu na wierzchu podłoży. Delikatnie dociśnij, aby utworzyć uszczelnienie, tworząc cienką ciecz między podłożami a szkiełkami nakrywkowymi, nie dopuszczając do kontaktu bufora ze smarem próżniowym. Korzystając z optycznego mikroskopu Ramanowskiego, uzyskaj ostrość na powierzchni obszaru nanowzoru metalu, który ma być próbkowany, bez włączania lasera.

Wykonaj próbkowanie ramanowskie zgodnie z opisem w przedstawionym protokole tekstowym. Oto tablice punktowe w kształcie nano złota i srebrnego niklu na stopionej krzemionce. Zastosowanie litografii wiązką elektronów lub EBL pozwala na uzyskanie doskonałej pozycji i wymiarów.

Kontroluj rozmiar punktu i szerokość przerwy za pomocą ekspozycji EBL. W tym miejscu wyświetlane są sześciokątne tablice dawek złotego końca srebrnego niklu. Zarodkowanie tak bardzo cienkich warstw metalu powoduje powstawanie nieciągłych struktur.

Oto widmo szeregowe białka A unieruchomionego substratu w projekcie o natężeniu sygnału z tablicy pierwszej jest znacznie silniejsze niż z tablicy drugiej. Sygnał z tablicy trzeciej był bardzo słaby. Odstępy między szczelinami są wyraźnie krytycznym parametrem dla rozprzęgania plazmy i poprawy powierzchni rozpraszania ramenu.

Oto widma białka wiążącego glukozę, pokazujące wpływ różnych konstrukcji substratów w stanie wolnym od ligandów i związanym ligandem. Wreszcie, widma aptamera wiążącego dopaminę pokazano dla cząsteczek wolnych od ligandów i związanych z ligandem. Widmo dopaminy w proszku pokazano w celach informacyjnych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia substratów. Ponieważ technika spektroskopii jest bardzo czuła i można mieć fałszywe odczyty Stosując tę procedurę. Dla określonych analitów można określić optymalne projekty substratów źródłowych.

Następnie można zastosować inne metody nphy, takie jak phy bez druku, aby poprawić skalowalność wytwarzania podłoża po jego opracowaniu. Technika ta pomogła naukowcom zajmującym się biochemią i biodetekcją w wykrywaniu cząsteczek biologicznych pozbawionych określonych powierzchni w bardzo małych ilościach, pozostając w roztworze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak kontrolować rozmiar nanostruktury metalu i właściwości filmu za pomocą technik wytwarzania oraz jak wykorzystać różne strategie rozpoznawania biomolekularnego do celowania w różne anality.