Name: Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj technikę barwienia immunologicznego do wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji neuroprzekaźników pochodzących z komórek grzebienia nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Nagrodę Fundacji Amerykańskiego Towarzystwa Chirurgicznego Dziecięcego (AG) oraz National Institutes of Health K08DK098271 (AG).

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Wisconsin zatwierdził wszystkie procedury.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Użyj 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako buforu rozwarstwiającego i roztworu do płukania.</li>
	<li>Przygotuj 30% sacharozy, ważąc 30 g sacharozy i umieść w butelce. Dodać 99 ml 1x PBS i dodać 1 ml 10% azydku sodu. Dokładnie wymieszaj, aż cała sacharoza się rozpuści. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.</li>
	<li>Przygotować roztwór blokujący, mieszając 1x PBS, 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% Triton-X-100. Dokładnie wymieszaj i przechowuj w lodówce, aż będzie potrzebny.</li>
	<li>Przygotować 8% roztwór paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS, ważąc odpowiednią ilość PFA do 1x PBS, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać w 25 ml porcji w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Rozcieńczyć do 4% PFA w 1x PBS w dniu stosowania.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie zarodków i jelit
<ol>
	<li>Zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, poddaj eutanazji ciężarną mysz w czasie i przenieś macicę na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty 1x PBS.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą ostrych nożyczek rozetnij ścianę macicy, aby odsłonić zarodki. Usuń zarodki z macicy i umieść je na czystej szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej lodowatą płytkę 1x PBS.</li>
	<li>Eutanazja każdego zarodka przez dekapitację w lodowatym 1x PBS. Jeśli używasz myszy transgenicznych zawierających białka fluorescencyjne, w oświetleniu fluorescencyjnym zidentyfikuj dodatnie zarodki transgeniczne.</li>
	<li>Wypreparuj przewód pokarmowy z każdego zarodka za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Za pomocą cienkich kleszczy ustaw zarodek tak, aby lewa strona była skierowana do góry, a prawa strona przylegała do dna szalki Petriego. Usuń górną ścianę ciała z zarodka, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Włóż cienkie kleszcze między grzbietową ścianę ciała a narządy wewnętrzne. Skrzyżuj kleszcze ze sobą w ruchu tnącym przypominającym nożyczki, aby usunąć narządy wewnętrzne z zarodka.</li>
	<li>Następnie należy rozciąć przewód pokarmowy z dala od otaczających narządów, a następnie umieścić każdy przewód pokarmowy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej lodowaty 1x PBS.</li>
</ol>
3. Utrwalenie przewodu pokarmowego
<ol>
	<li>Przepłucz każdy przewód pokarmowy 3 razy lodowatym 1x PBS, a następnie zastąp 4% PFA. Zamocuj przewód pokarmowy w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Opłucz przewód pokarmowy 3 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez 1 godzinę na platformie do bujania. Na tym etapie należy przechowywać przewód pokarmowy w temperaturze 4 °C w 30% sacharozie w 1x PBS zawierającym 0,1% azydku sodu, aż będzie potrzebny. 
	UWAGA: Alternatywnie, przechowuj zarodki w 30% sacharozie przez okres do jednego roku bez żadnego wpływu na integralność tkanek. Przechowywanie próbek w 30% sacharozie pozwala na późniejsze przetworzenie próbek do barwienia immunologicznego lub do OCT w celu kriosekcji. Alternatywnie postępuj zgodnie z protokołem barwienia immunologicznego opisanym poniżej.</li>
</ol>
4. Protokół barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Jeśli próbki były przechowywane w 30% sacharozy, przepłucz je 3 razy przez 20 minut w 1x PBS na platformie bujanej.</li>
	<li>Umieść odcinki przewodu pokarmowego w roztworze blokującym na platformie bujanej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i inkubować drogi pokarmowe z odpowiednią ilością przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej. Stosować rozcieńczenie 1:1,000 ludzkiego przeciwciała anty-Hu (surowica uzyskana od pacjenta), rozcieńczenie 1:1,000 przeciwciała przeciwko białku zielonej fluorescencji (GFP) kurczaka i 1:100 rozcieńczenie koziego przeciwciała anty-ChAT. 
	UWAGA: Używamy ludzkiego przeciwciała anty-Hu, które zostało uzyskane lokalnie od pacjenta, jednak przeciwciała anty-Hu są dostępne w handlu, na przykład mysie przeciwciała anty-Hu (stosować w rozcieńczeniu 1:500).</li>
	<li>Płucz przewód pokarmowy w 1x PBS 3 razy przez 5 minut, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze RT na bujanej platformie.</li>
	<li>Zastąp 1x PBS przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w stosunku 1:500 w roztworze blokującym na platformie kołyszącej przez 4 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C. Użyj barwnika anty-ludzkiego przeciw-ludzkiego reagującego z aminami, takiego jak Dylight, osła anty-kurczak Cy2 i ośła anty-koza Cy5. Jeśli używasz mysiego przeciwciała anty-Hu, użyj rozcieńczenia 1:500 barwnika anty-mysiego reagującego z aminami 405, 
	UWAGA: Intensywność endogennej ekspresji GFP i tdTomato oraz klarowność barwienia immunologicznego wzrastają wraz z wiekiem rozwojowym. Zazwyczaj barwiemy immunologicznie jelita embrionalne pojedynczo w probówkach o pojemności 0,2 ml ze 150 μl roztworu barwiącego, aby zmniejszyć objętość użytego przeciwciała, a także zapewnić skuteczne barwienie tkanki.</li>
	<li>Płucz przewód pokarmowy w 1x PBS 3 razy przez 5 minut, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze RT na bujanej platformie.</li>
	<li>Umieść kilka kropli fluorescencyjnego podłoża montażowego z DAPI na szklanym szkiełku. Zanurz przewód pokarmowy w pożywce do montażu fluorescencji i dodaj szkło nakrywkowe bezpośrednio na chusteczkę. Fluorescencyjny nośnik montażowy -G jest rozpuszczalnym w wodzie związkiem, który zapewnia półtrwałe uszczelnienie. 
	UWAGA: Użyj pożywki do montażu fluorescencji, takiej jak Vectashield, która jest pożywką montażową na bazie glicerolu, która zapobiega blaknięciu i fotowybielaniu przeciwciał. Oba te produkty umożliwiają przechowywanie tkanek przez długi czas w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Uchwyć obrazy każdego z fluoroforów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Dla zastosowanych fluoroforów i filtrów należy stosować długości fal wzbudzenia przedstawione w tabeli 3.</li>
	<li>Wykonuj komputerową analizę obrazu za pomocą odpowiedniego oprogramowania w zależności od typu konfokalnego używanego do przechwytywania obrazów.</li>
</ol>

<ol><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+determinants+of+the+independence+and+complexity+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system.</a> Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+enteric+nervous+system+analysis+during+parenteral+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition.</a> J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).</li>
<li>Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sacral+neural+crest-derived+cells+enter+the+aganglionic+colon+of+Ednrb%28-%2F-%29+mice+along+extrinsic+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers.</a> J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).</li>
<li>Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neuronal+density+and+neurotransmitter+expression+in+the+ganglionated+region+of+Ednrb+null+mice%3A+implications+for+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease.</a> Neurogastroenterol Motil. , (2013).</li>
<li>Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuronal+density+contributes+to+the+severity+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation.</a> Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).</li>
<li>Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+neuron+types+in+the+mouse+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine.</a> Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).</li>
<li>Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+transmission+at+functionally+distinct+synapses+in+descending+reflex+pathways+of+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon.</a> Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).</li>
<li>Johnson, C. D., Epstein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+and+polyvalent+antiserum+to+chicken+choline+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase.</a> J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).</li>
<li>Tooyama, I., Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+encoded+by+an+alternative+splice+variant+of+choline+acetyltransferase+mRNA+is+localized+preferentially+in+peripheral+nerve+cells+and+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers.</a> J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).</li>
<li>Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+Choline+Acetyltransferase+of+Peripheral-Type+%28pChAT%29+in+the+Trigeminal+Ganglion+Neurons+of+the+Non-Human+Primate+Macaca+fascicularis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+histochemica+et+cytochemica%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis.</a> Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).</li>
<li>Sang, Q., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+chemical+coding+of+cholinergic+neurons+in+the+small+and+large+intestine+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse.</a> Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).</li>
<li>Lei, J., Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Hand2+in+enteric+neural+precursor+cells+affects+its+functions+in+neurogenesis%2C+neurotransmitter+specification+and+gangliogenesis%2C+causing+functional+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis.</a> Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).</li>
<li>Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+cholinergic+myenteric+neurons+during+enteric+nervous+system+development%3A+comparison+of+different+ChAT+fluorescent+mouse+reporter+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines.</a> Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).</li>
<li>Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+of+Hirschsprung%27s-associated+enterocolitis%3A+importance+of+histologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates.</a> J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).</li>
<li>Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Children+with+Hirschsprung%27s+disease+have+an+abnormal+colonic+mucus+defensive+barrier+independent+of+the+bowel+innervation+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status.</a> J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).</li>
<li>Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Pten+in+the+mouse+enteric+nervous+system+induces+ganglioneuromatosis+and+mimics+intestinal+pseudoobstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction.</a> J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasze laboratorium i inne wykazały, że wady jelitowe w HSCR nie ograniczają się do okrężnicy zwojowej, ale rozciągają się proksymalnie, nawet do zwojowego jelita cienkiego5,15,16. Zmiany te obejmują zmiany w gęstości neuronów ENS i fenotypie neuroprzekaźników i mogą odpowiadać za dysmotorykę, którą zaobserwowano u pacjentów z HSCR. Wykorzystaliśmy powyższe techniki w naszych wysiłkach na rzecz zrozumienia determinantów powstawania ENS. W szczególności techniki te zostały wykorzystane do wizualizacji neuronów n...

Funkcjonujący jelitowy układ nerwowy (ENS), który kontroluje ruchliwość, wchłanianie składników odżywczych i miejscowy przepływ krwi, jest niezbędny do życia1. ENS jest tworzony przez komórki grzebienia nerwowego (NCC), które namnażają się, migrują i kolonizują jelita, gdzie różnicują się w zwoje zawierające neurony i komórki glejowe. Choroba Hirschsprunga (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), wielogenowe zaburzenie wrodzone, występujące 1 na 4000 żywych urodzeń, może być uważana za chorobę prototypową do badania zaburzonego tworzenia ENS. W HSCR NCC nie migruje i nie kolonizuje zmiennych długości dystalnego jelita tylnego2. Ponadto inne powszechne wady rozwojowe przewodu pokarmowego (GI) w populacji pediatrycznej, takie jak wady rozwojowe odbytu, atrezje jelit i zaburzenia motoryki, są związane z zaburzeniami podstawowych funkcji ENS i prawdopodobnie są związane z subtelnymi, niedocenianymi zmianami anatomicznymi i zmianami funkcjonalnymi w ENS3-6. W związku z tym techniki, które pozwalają zrozumieć rozwojowe uwarunkowania powstawania ENS, mogą rzucić światło na patogenezę i potencjalne leczenie zaburzeń przewodu pokarmowego u dzieci.
Po migracji i kolonizacji, NCC różnicuje się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Neurony cholinergiczne stanowią około 60% neuronów jelitowych7 i można je wykryć poprzez barwienie na obecność acetylotransferazy choliny (ChAT), enzymu syntetyzującego neuroprzekaźnik pobudzający acetylocholinę. Historycznie rzecz biorąc, próby wizualizacji neuronów cholinergicznych były mylone przez różną swoistość antygenową przeciwciał skierowanych przeciwko ChAT ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w porównaniu z obwodowym układem nerwowym (PNS) ChAT8-10. Jednak przeciwciała skierowane przeciwko łożyskowemu ChAT rozpoznają zarówno centralny, jak i obwodowy ChAT11-13, a ostatnio opisaliśmy techniki, które pozwalają na wizualizację neuronów cholinergicznych ENS o wysokiej czułości na wcześniejszym etapie rozwoju niż osiągnięto to w przypadku linii reporterowychChAT 14.
Tutaj prezentujemy technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników ENS w neuronach. Do tych badań wykorzystaliśmy myszy ChAT-Cre współpracujące ze zwierzętami R26R:floxSTOP:tdTomato do produkcji ChAT-Cre; R26R:floxSTOP:tdMyszy pomidorowe (zdefiniowane jako ChAT-Cre tdTomato w całym manuskrypcie). Zwierzęta te zostały następnie skrzyżowane z homozygotycznymi myszami reporterowymi ChAT-GFP, aby uzyskać myszy wykazujące ekspresję obu fluorescencyjnych reporterów, które wykrywają ekspresję ChAT14. Te dwa zwierzęta reporterskie są na tle C57BL/6J i są dostępne na rynku (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S2</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP9221</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Szalki Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ-18 stereoskop</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ-18 stereoskop</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Narzędzia precyzyjne</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, AL</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon Nikon</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elementy</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Immunostaining to Visualize Murine Enteric Nervous System Development

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Po kolonizacji komórki grzebienia nerwowego muszą następnie różnicować się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Neurony cholinergiczne, główny fenotyp neuroprzekaźnika w jelitowym układzie nerwowym, są identyfikowane przez barwienie acetylotransferazy choliny (ChAT), enzymu syntetyzującego acetylocholinę. Historyczne wysiłki mające na celu wizualizację neuronów cholinergicznych były utrudnione przez przeciwciała o różnej swoistości dla ośrodkowego układu nerwowego w porównaniu z obwodowym układem nerwowym ChAT. My i inni przezwyciężyliśmy to ograniczenie, używając przeciwciała przeciwko łożyskowemu ChAT, które rozpoznaje zarówno centralny, jak i obwodowy ChAT, aby skutecznie uwidocznić embrionalne jelitowe neurony cholinergiczne. Dodatkowo porównaliśmy to przeciwciało z reporterami genetycznymi dla ChAT i wykazaliśmy, że przeciwciało jest bardziej niezawodne podczas embriogenezy. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Opisaliśmy wcześniej generowanie myszy wykazujących ekspresję obu fluorescencyjnych reporterów, GFP oraz tdTomato, które wykrywają ekspresję ChAT14. W skrócie, myszy ChAT-Cre krzyżowano z zwierzętami R26R:floxSTOP:tdTomato, aby uzyskać myszy ChAT-Cre;R26R:floxSTOP:tdTomato (nazwane ChAT-Cre tdTomato). Zwierzęta te krzyżowano następnie z homozygotycznymi myszami reporterowymi ChAT-GFP. Embriony izolowano, a tkanki preparowano przed utrwaleniem i immunobarwieniem zgod...

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must ...

immunostaining-to-visualize-murine-enteric-nervous-system-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Barwienie immunologiczne w celu wizualizowania rozwoju układu nerwowego jelitowego u myszy

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek glejowych jelit od błony podśluzowej i blaszki właściwej jelita myszy. Przedstawiono w nim etapy ekstrakcji tkanki podśluzówkowej i blaszki właściwej, izolowania z nich komórek glejowych jelitowych i hodowli komórek na powlekanej płytce studzienkowej w celu ustanowienia hodowli komórek glejowych jelitowych.

Izolowanie komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej myszy

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Ten film demonstruje barwienie immunologiczne embrionalnego mysiego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji i analizy rozmieszczenia populacji neuronów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunofluorescencyjne populacji neuronów w embrionalnym mysim przewodzie pokarmowym

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Całościowe podejście immunohistochemiczne, do wizualizacji ekspresji białka neurofilamentu w pozawątrobowym przewodzie żółciowym u Suncus murinus. jest prezentowane tutaj. Protokół ten może być wykorzystany do analizy unerwienia wszystkich narządów trzewnych u S. murinus lub innych gatunków.

Zastosowanie całościowej metody immunohistochemicznej do badania unerwienia dróg żółciowych u Suncus murinus

Tutaj opisujemy izolację komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej jelita za pomocą sekwencyjnych inkubacji EDTA do chelatowania kationów dwuwartościowych, a następnie inkubacji w nieenzymatycznym roztworze do odzyskiwania komórek. Posiewanie powstałej zawiesiny komórkowej na poli-D-lizynie i lamininie daje w wyniku wysoce wzbogaconą hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej dorosłej myszy

Organoidy jelitowe człowieka muszą być unerwione, aby lepiej oddać strukturę i funkcję rodzimego ludzkiego jelita. W tym miejscu przedstawiamy jedną z metod włączania jelitowego układu nerwowego do tych konstruktów.

unerwienie ludzkich organoidów jelitowych

Poznaj technikę barwienia immunologicznego do wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji neuroprzekaźników pochodzących z komórek grzebienia nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów