Name: Kontrolowane środowisko mikroprzepływowe do dynamicznego badania agregacji czerwonych krwinek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę ilościowego badania agregacji erytrocytów w mikrokrążeniu przy kontrolowanych prędkościach ścinania. Wykorzystuje się mikroprzepływ i analizę obrazu do określenia rozmiarów agregatów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych. Mikrofabrykację przeprowadzono przy wsparciu zakładu McGill Nanotools Microfab na Uniwersytecie McGill oraz Wydziału Elektroniki Uniwersytetu Carleton.

Krew jest pobierana od zdrowych osób za zgodą komisji etyki Uniwersytetu w Ottawie (H11-13-06).
1. Produkcja mikrokanałów
Mikrokanały są wytwarzane w oparciu o standardowe metody fotolitografii19.
<ol>
	<li>Zaprojektuj geometrię mikrokanału za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) i wydrukuj konfigurację na przezroczystej fotomasce. Maski te są kluczowe, ponieważ dyktują ścieżkę światła podczas procesu produkcyjnego. W tym przypadku wymiary mikrokanalików to 120 μm grubości, 60 μm głębokości i 7 mm długości.</li>
	<li>W pomieszczeniu czystym należy odwirować ujemny fotorezystor na bazie żywicy epoksydowej na płytce krzemowej z prędkością 2 000 obr./min przez 30 sekund, aby uzyskać żądaną głębokość mikrokanalików (60 μm).</li>
	<li>Naświetl wafel i fotomaskę pod lampą UV o temperaturze 650 mJ/cm2 przez 70 sekund. Upewnij się, że na działanie światła UV wystawione są tylko przezroczyste obszary fotomaski. Odsłonięcie przezroczystych obszarów pozwala na polimeryzację łańcuchów, co skutkuje utwardzeniem fotorezystu. Zanurz silikonowy element w wywoływaczu, aby usunąć nadmiar fotorezystu.</li>
	<li>Po wyprodukowaniu formy wymieszaj elastomer na bazie silikonu i utwardzacz w stosunku 10:1, aby uzyskać roztwór poli-dimetylosiloksanu (PDMS). Umieść roztwór PDMS w komorze próżniowej w celu odgazowania. Wlej go do formy i podgrzewaj w temperaturze 60 °C przez 90 minut, aby utworzyć mikrokanaliki. Następnie połącz poszczególne kanały ze szkiełkiem podstawowym za pomocą wiązania plazmą tlenową przez 90 sek. 
	UWAGA: proces odgazowywania PDMS jest wykonywany w celu wyeliminowania pęcherzyków powietrza powstających w procesie mieszania.</li>
	<li>Upewnij się, że wymiary mikrokanalików pozwalają na pomyślne przetestowanie. W tym protokole mikrokanaliki mają przekrój prostokątny 120 x 60 μm. Dla porównania, przeciętny RBC ma średnicę 8 μm i grubość 2 μm. W związku z tym szerokość mikrokanalików jest wystarczająca do zaobserwowania prawidłowej agregacji i dokładnego wyznaczenia profili prędkości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie krwi
<ol>
	<li>Pobieranie krwi od zdrowych dawców-ochotników, po uzyskaniu zgody komisji bioetycznej. Krew należy traktować kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) obecnym w probówkach zbiorczych (7,2 mg EDTA w 4 ml krwi). 
	UWAGA: EDTA stosuje się w celu uniknięcia krzepnięcia krwi.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi trzy razy przez 10 minut przy 1 400 x g (3 000 obr./min) w celu oddzielenia składników krwi. W wyniku wirowania obserwuj trzy wyraźne warstwy. 
	UWAGA: Trzy warstwy to warstwa RBC (znajdująca się na dole probówki), kożuchowa (składająca się z białych krwinek i płytek krwi znajdujących się na górze warstwy RBC) i warstwa osocza (znajdująca się na górze wszystkich innych składników).
	<ol>
		<li>Po pierwszym odwirowaniu należy pobrać osocze krwi za pomocą pipety do krwi. Unikaj kontaktu z kożuchową sierścią.</li>
		<li>Zbierz i wyrzuć płaszcz buffy do pojemnika z wybielaczem rozcieńczonym w 10%.</li>
		<li>Dodać 3 ml PBS o pH 7,4 do każdej z probówek z pozostałą warstwą RBC i zapewnić właściwą równowagę wirówki. Delikatnie wymieszać probówki i ponownie odwirować przy 1.400 x g (3.000 obr./min) przez 10 min. 
		UWAGA: Upewnij się, że roztwór PBS nie zawiera magnezu ani wapnia, ponieważ mogą one zmienić adhezję komórek.</li>
		<li>Po drugim odwirowaniu wyrzuć PBS do probówek i usuń pozostałą powłokę kożuchową, jeśli jest obecna. Powtórzyć kroki 2.2.3 i 2.2.4 dla trzeciego wirowania, aby uzyskać czyste erytrocyty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać wymaganą ilość (0,05, 0,1 i 0,15 ml) czystych krwinek czerwonych z osoczem (0,95, 0,9 i 0,85 ml) w probówce o pojemności 1 ml w celu uzyskania zawiesin krwinek czerwonych o odpowiednim (5%, 10% i 15%) hematokrycie. Sprawdź hematokryt za pomocą mikrowirówki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie płynów
Wprowadź dwa płyny do podwójnego mikrokanału Y: zawiesiny RBC i PBS.
<ol>
	<li>Dodać 60 μl roztworu fluorescencyjnych cząstek znacznikowych (1% ciała stałego, cząstka d = 0.86 μm, λabs = 542 nm i λ emisja = 612 nm) do probówek z zawiesiną RBC o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Fluorescencyjne cząstki znacznikowe (wewnętrznie barwione cząstki polistyrenu) służą do pomiaru prędkości przepływu w mikrokanale. Cząstki te fluoryzują pod wpływem odpowiedniej długości fali wiązki laserowej (λ = 542 nm).</li>
	<li>Przygotować roztwór PBS o pH 7,4 i dodać 60 μl tego samego roztworu fluorescencyjnych cząstek znacznikowych do 1 ml roztworu PBS.</li>
</ol>
4. Pomiary wielkości agregatów
<ol>
	<li>Aby wprowadzić płyny (zawiesiny RBC i PBS) do mikrokanału, należy użyć dwóch szklanych strzykawek o pojemności 25 μl i 100 μl. Pomoże to zmniejszyć zgodność systemu. Podłączyć mikrokanał do strzykawek za pomocą rurki i łączników pasujących do otworów wejściowych. Napełnić szklane strzykawki, wykorzystując różnicę ciśnień istniejącą między pojemnikiem na płyn a strzykawką. Upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Jako alternatywną metodę należy użyć systemu sterowanego ciśnieniem do napędzania obu płynów w mikrokanale.</li>
	<li>Umieść mikrokanalik na odwróconym stoliku mikroskopowym podłączonym do szybkiej kamery i systemu μPIV. Zaprogramować pompę strzykawkową na żądane natężenie przepływu (np. Q = 2 μl/h dla krwi, co powoduje natężenie przepływu Q = 8 μl/h dla PBS). 
	UWAGA: Używana jest tylko jedna pompka strzykawkowa. Za pomocą dwóch różnych szklanych strzykawek, o dwóch różnych średnicach wewnętrznych, możliwe jest zmienianie natężenia przepływu wchodzącego do każdej gałęzi mikrokanału Y.</li>
	<li>Wprowadzić oba płyny do podwójnego mikrokanału Y, każdy z innej gałęzi wejściowej i przy różnych natężeniach przepływu, jak pokazano na rysunku 1. Aby przetestować różne prędkości ścinania, zmień natężenie przepływu pompy. W ten sposób zachowany jest ten sam odpowiedni stosunek (w tym przypadku 4) między dwiema gałęziami20 (rys. 2 i 3). Przed wykonaniem pomiarów poczekaj, aż przepływ osiągnie stan ustalony: sprawdź wzrokowo obrazy z kamery o dużej szybkości, aby uzyskać płynny przepływ. 
	UWAGA: Stosunek ten ma kluczowe znaczenie dla uzyskania liniowego profilu prędkości w warstwie krwi.</li>
	<li>Wizualizuj RBC za pomocą szybkiej kamery. Podłącz kamerę do komputera, aby kontrolować, nagrywać i zapisywać obrazy przepływu płynu. Gdy dwa strumienie płynu osiągną stan ustalony, rozpocznij nagrywanie.
	<ol>
		<li>Uzyskaj kilka obrazów, aby uzyskać lepsze wyniki przetwarzania. Określ optymalny czas naświetlania kamery, aby uzyskać wyraźny obraz agregatów. 
		UWAGA: Czas naświetlania aparatu w tym przypadku wynosił 0,5 ms. Wybór odstępu czasu między każdą klatką zależy od liczby klatek na sekundę kamery i natężenia przepływu w mikrokanale. Czas pomiędzy każdą klatką przetworzoną w tej procedurze wynosił 60 ms. Dlatego wystarczy kamera zdolna do nagrywania 18 klatek na sekundę. 
		UWAGA: Należy unikać osadzania się krwi w probówce i strzykawce, co może prowadzić do błędnych pomiarów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z technik przetwarzania obrazu (w tym przypadku programu MATLAB) w celu poprawy jakości obrazu, wykryj agregacje w każdym z obrazów na podstawie intensywności pikseli (zilustrowanych na rysunku 4) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Zwiększ kontrast obrazów za pomocą metody korektora histogramu, aby uzyskać lepszą jakość obrazu dla każdej klatki.</li>
		<li>Przekonwertuj obrazy w skali szarości na obrazy binarne. W tym celu należy ustawić wartość progową z zakresu od 0 do 1, która decyduje o konwersji każdego piksela. Każdy piksel na obrazie poniżej wartości progowej zostanie wykryty jako piksel, podczas gdy piksele o wartościach większych niż próg zostaną wykryte jako białe piksele.</li>
		<li>Wypełnij otwory (jeśli są i są potrzebne) odpowiadające szczelinom w jednym agregatzie, aby uzyskać lepsze wyniki.</li>
		<li>Wykryj komórki, określając sąsiednie białe piksele na obrazie binarnym, tak aby sąsiednie komórki zostały skojarzone jako agregacje.</li>
		<li>Oznacz różne wykryte agregacje i przekonwertuj obraz binarny na obraz czerwono-zielono-niebieski (RGB) w celu lepszej wizualizacji. Połącz oryginalne klatki z każdym z odpowiadających im przetworzonych obrazów, aby zweryfikować skuteczność techniki przetwarzania obrazu i upewnić się, że wszystkie komórki są brane pod uwagę, jak pokazano na rysunku 5. Wykonaj kroki 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3, 4.5.4 i 4.5.5 dla wszystkich przechwyconych klatek.</li>
		<li>Oblicz obszar każdej agregacji wykrytej w klatce na podstawie liczby wykrytych pikseli. Na podstawie zastosowanego powiększenia obiektywu oblicz współczynnik konwersji za pomocą siatki kalibracyjnej i przelicz wyniki na μm2. Uśrednić zagregowane rozmiary wykryte w każdej klatce, a następnie uśrednić wyniki dla wszystkich klatek, aby uzyskać średni zagregowany rozmiar dla każdego nagrania zawiesin RBC.</li>
		<li>Obliczyć powierzchnię jednego RBC w celu wyznaczenia reprezentatywnej szacowanej liczby RBC w każdym wykrytym skupisku. Korzystając z tych wyników, oblicz rozkład procentowej zawartości erytrocytów w każdym agregacji w funkcji rozmiarów agregacji (reprezentowanych przez szacowaną liczbę komórek w każdym zagregowaniu), jak pokazano na rysunku 6. 
		UWAGA: Do pomiaru agregatów RBC można użyć oprogramowania ImageJ (zamiast MATLAB) do wykonywania tych samych zadań na każdej klatce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiary prędkości płynu i szybkości ścinania
Określ prędkość płynu, a tym samym szybkość ścinania, korzystając z systemu μPIV.
<ol>
	<li>Po zebraniu danych za pomocą kamery szybkoobrotowej przełącz się na kamerę dwuimpulsową używaną w systemie μPIV. Użyj oprogramowania do obrazowania do akwizycji obrazu przepływu i przetwarzania obrazu w celu określenia pola prędkości.</li>
	<li>Podejmij wszelkie niezbędne środki ostrożności, w zależności od klasy lasera, przed włączeniem lasera. Następnie włącz system, kamerę i laser.</li>
	<li>Skalibruj aparat w oparciu o używane powiększenie obiektywu. W tym celu należy użyć pod mikroskopem mikroskali o dokładności 10 μm i ustawić rozmiar 1 piksela na obrazie.</li>
	<li>Uruchom laser i zwizualizuj cząsteczki w obu płynach. Znajdź środkową płaszczyznę mikrokanału, skupiając się na najszybszych cząstkach w przepływie (tj. najszybsze cząstki powinny być najjaśniejsze).</li>
	<li>Ustaw dt (odstęp czasu między dwiema kolejnymi klatkami), aby zapewnić prawidłowe przemieszczenie cząstki. Najszybsze cząstki powinny przemieszczać się o około 5 do 10 pikseli między oboma obrazami.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie przepływu. Ustaw oprogramowanie tak, aby pobierało 100 par obrazów w odstępie 5 ms. Wykonaj kroki 5.4, 5.5 i 5.6 dla wszystkich różnych zawiesin RBC i dla różnych szybkości ścinania. 
	UWAGA: Więcej szczegółów na temat metodologii znajduje się w badaniu Pittsa i Fenecha21.</li>
	<li>Przetwarzaj nagrania uzyskane metodą korelacji krzyżowej za pomocą oprogramowania do obrazowania. 
	UWAGA: Polega to na dyskretyzacji pary obrazów w małe okna o z góry określonym rozmiarze (na podstawie przepływu płynu i przedziału czasu wybranego przez użytkownika) zwane oknami korelacji i śledzenie przemieszczenia cząstek w każdym oknie.
	<ol>
		<li>Po pierwsze, ustal, czy uzyskane obrazy wymagają wstępnego przetwarzania (w tym odejmowania tła, "przycinania bazy"22 lub nakładania się obrazu23,24) w celu lepszego przetwarzania danych.</li>
		<li>Następnie wybierz rozmiar i kształt okna korelacji, a także procent nakładających się obrazów. Szczegółowe badanie zostało przeprowadzone przez Pitts i wsp.25 w celu określenia optymalnych parametrów i technik wstępnego przetwarzania obrazu dla przepływu krwi w różnych konfiguracjach kanałów. Wyraż wyniki jako średnie pole prędkości obliczone na podstawie 100 par obrazów i błędu średniej kwadratowej (RMS) prędkości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyodrębnij profil prędkości na wylocie kanału z przetworzonych danych, jak pokazano na rysunku 7. Aby uzyskać lepszy profil, uśrednij pole prędkości w przestrzeni. 
	UWAGA: Słupki składające się na profil prędkości odpowiadają rozmiarowi okna korelacji wybranemu względem szerokości kanału. Błąd RMS prędkości jest również pokazany na rysunku 7, reprezentując błąd w eksperymentalnym oszacowaniu prędkości.</li>
	<li>Wyłącz laser po wykonaniu wszystkich pomiarów i przetwarzania. Wyłącz wszystkie elementy systemu: oprogramowanie, kamery, ruchomą scenę, komputery i laser.</li>
	<li>Aby obliczyć szybkość ścinania, najpierw wykryj i oszacuj grubość krwi w mikrokanale na podstawie nagrania z kamery o dużej prędkości. W tym celu należy uśrednić wszystkie klatki w konkretnym nagraniu, aby uzyskać obraz tła wideo. Określić warstwę krwi (jak pokazano na rysunku 8 dla zawiesin RBC płynących z prędkością 10 μl/h, gdy są zawieszone w stężeniu 5%, 10% i 15% hematokrytu). Uzyskaj wartość prędkości dla odpowiedniej grubości warstwy krwi i oblicz szybkość ścinania, dzieląc wartość prędkości przez grubość warstwy krwi.</li>
</ol>

<ol><li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Math.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li>
<li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li>
<li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).</li>
<li>Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+shear+rate+dependence+of+red+cell+aggregation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorheol.+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Rheology of the microcirculation.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).</li>
<li>Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaskurt%2C+OK+%22Red+Blood+Cell+Aggregation%22">Red Blood Cell Aggregation</a>. , Taylor and Francis. Florida. (2011).</li>
<li>Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemorheological+disorders+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Hemorheological disorders in diabetes mellitus.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).</li>
<li>Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaskurt%2C+OK+%22Handbook+of+Hemorheology+and+Hemodynamics%22">Handbook of Hemorheology and Hemodynamics</a>. , IOS Press. Netherlands. (2007).</li>
<li>Lindqvist, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viscosity+of+the+blood+in+narrow+capillary+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.-Legacy+Content%22%5BJournal%5D)">The viscosity of the blood in narrow capillary tubes.</a> Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).</li>
<li>Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F%C3%A5hraeus%3A+Evolution+of+his+concepts+in+cardiovascular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology.</a> Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).</li>
<li>Fåhraeus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suspension+stability+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The suspension stability of the blood.</a> Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).</li>
<li>Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+specific+red+blood+cell+aggregation+indices+via+an+automated+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorheol%22%5BJournal%5D)">Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system.</a> Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).</li>
<li>Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laser-assisted+optical+rotational+cell+analyzer+%28lorca%29+as+red+blood+cell+aggregometer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorheol.+Microcirc%22%5BJournal%5D)">The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).</li>
<li>Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRampling%2C+MW+%22Clinical+Blood+Rheology%22">Clinical Blood Rheology</a>. , CRC Press. Boca Raton, Florida. (1988).</li>
<li>Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+human+erythrocyte+velocity+field+and+aggregation+measurements+at+physiological+haematocrit+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels.</a> J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).</li>
<li>Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+variation+of+blood+viscosity%3A+modelling+using+shear+fields+measured+by+a+%C2%B5PIV+based+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Eng.+Phys%22%5BJournal%5D)">Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique.</a> Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).</li>
<li>Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+variation+of+blood+viscosity+and+velocity+distributions+of+aggregating+and+non-aggregating+blood+in+a+bifurcating+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model.+Mechan%22%5BJournal%5D)">Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel.</a> Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li>
<li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Hemorhol.+Microcirc%22%5BJournal%5D)">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).</li>
<li>Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+microfluidic+system+for+red+blood+cell+aggregation+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation.</a> J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).</li>
<li>Pitts, K. L., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+for+velocity+profile+measurements+of+micro+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows.</a> J. Vis. Exp. (74), e50314(2013).</li>
<li>Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro+particle-image+velocimetry+of+bead+suspensions+and+blood+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows.</a> Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).</li>
<li>Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+algorithms+for+microscale+particle+image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22AIAA+J%22%5BJournal%5D)">Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry.</a> AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).</li>
<li>Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+measurement+accuracy+in+micro+PIV+by+image+overlapping%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Fluids%22%5BJournal%5D)">Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping.</a> Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).</li>
<li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow%3A+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302(2012).</li>
<li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Eng.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li>
<li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Comput.+Appl%22%5BJournal%5D)">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li>
<li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells+classification+using+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Res.+Repot%22%5BJournal%5D)">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.+Man.+Cybern%22%5BJournal%5D)">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z niniejszej metodologii, możliwa jest jakościowa i ilościowa analiza agregatów RBC w różnych warunkach przepływu i hematokrytów. Aby pomyślnie przeprowadzić testy i wykryć agregaty, kluczowe znaczenie ma określenie odpowiedniego stosunku prędkości między dwoma płynami przy wejściu do mikrokanału. Stosunek ten jest bardzo ważny dla uzyskania optymalnej grubości warstwy krwi, gdzie profil prędkości wynosi quasi-liniowo20.
Kolejnym kluczowym czynnikiem decydującym o udanym...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Czerwone krwinki (RBC) odgrywają kluczową rolę w określaniu reologicznego zachowania krwi. Są one niemal wyłącznie odpowiedzialne za szczególne właściwości krwi in vitro i in vivo. W warunkach fizjologicznych erytrocyty zajmują od 40% do 45% objętości krwi. W mikrokrążeniu erytrocyty zajmują tylko do 20% objętości krwi ze względu na mniejsze średnice naczyń i efekt odtłuszczania osocza1. To zjawisko zmniejszenia mikrokrążenia w osoczu jest znane jako efekt Fåhræusa. Przy niskich szybkościach ścinania erytrocyty są w stanie łączyć się ze sobą i tworzyć jednowymiarowe lub trójwymiarowe struktury zwane "rouleaux" lub agregatami, przyczyniając się w ten sposób do nienewtonowskiego zachowania krwi. Jednak mechanizm agregacji RBC nie jest w pełni poznany. Istnieją dwie teorie modelujące agregację erytrocytów: teoria mostkowania komórek z powodu sieciowania makrocząsteczek2 oraz teoria przyciągania sił spowodowana zubożeniem cząsteczek z powodu gradientu osmotycznego3.
Zazwyczaj, dla ludzkiej krwi, agregaty tworzą się przy bardzo niskich szybkościach ścinania4 w zakresie od 1 do 10 sec-1. Powyżej tego zakresu erytrometry mają tendencję do dezagregacji i oddzielnego przepływu w obrębie naczynia.
Zrozumienie warunków powstawania agregatów ma ogromne znaczenie dla dziedziny hemorheologii pod względem definiowania reologicznego zachowania krwi. Agregaty te są często obserwowane na poziomie makrocyrkulacji (>300 μm średnicy)5. W tej skali krew jest uważana za płyn newtonowski i jednorodną mieszaninę. Jednak agregaty te są rzadko widoczne na poziomie naczyń włosowatych (o średnicy 4-10 μm) i zwykle wskazują na stany patologiczne, takie jak cukrzyca6 i otyłość. Inne stany patologiczne, które mogą zmienić agregację RBC, obejmują stany zapalne lub zakaźne, choroby sercowo-naczyniowe, takie jak nadciśnienie lub miażdżyca, zaburzenia genetyczne i choroby przewlekłe7. Dlatego zrozumienie mechanizmu agregacji RBC i analiza tych jednostek (poprzez zdefiniowanie związku między wielkością tych agregatów a warunkami przepływu) może prowadzić do zrozumienia zachowania mikroreologicznego krwi, a tym samym odnieść je do zastosowań klinicznych.
Agregaty RBC mogą być zmieniane przez kilka czynników, takich jak hematokryt (objętość krwinek czerwonych we krwi), szybkość ścinania, średnica naczynia, sztywność błony RBC i skład podłoża zawieszającego8-10. W związku z tym wymagane są kontrolowane warunki, aby skutecznie analizować agregaty RBC. Kilka metod jest w stanie analizować tworzenie się agregatów, zapewniając statyczne pomiary agregacji (wskaźnik agregacji), które dostarczają istotnych informacji o zachowaniu krwi. Metody te obejmują między innymi metodę szybkości sedymentacji erytrocytów11, metodę przepuszczalności światła12, metodę odbicia światła13 oraz metodę niskiej lepkości ścinania14.
Niewiele badań próbowało badać agregację RBC i określić stopień agregacji w warunkach kontrolowanego przepływu15-17. Jednak badania te pośrednio badają rozmiary agregatów RBC, określając stosunek zajmowanej przestrzeni w systemie ścinania mierzonym na podstawie mikroskopijnych obrazów krwi dostarczających informacji o stopniu agregacji, a także o lokalnej lepkości. Chen i wsp. W ramach projektu 18 przedstawiono technikę bezpośredniego pomiaru wielkości agregatów RBC i przedstawiono rozkład wielkości kruszywa RBC dla różnych naprężeń ścinających poprzez zmianę natężenia przepływu zawiesin przy jednoczesnym monitorowaniu spadku ciśnienia w komorze przepływowej. Naprężenia ścinające są obliczane na podstawie monitorowanego ciśnienia przy użyciu równaniaStokesa 18.
Dlatego prezentujemy nową procedurę bezpośredniego ilościowego oznaczania agregatów RBC w kontrolowanym środowisku mikroprzepływowym, dynamicznie, pod określoną, stałą i mierzalną szybkością ścinania. Przepływ krwi w układzie ścinania jest obserwowany bezpośrednio (prostopadle do kierunku przepływu), co zapewnia inny kąt badania przepływu w porównaniu z poprzednimi badaniami15,18 i wizualizację pełnej dziedziny zainteresowania. Zawiesiny RBC są porywane w podwójnym mikrokanale Y (jak pokazano na rysunku 1) roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), tworząc w ten sposób przepływ ścinający w warstwie krwi. W tej warstwie krwi można uzyskać stałą szybkość ścinania. Zawiesiny RBC są testowane przy różnych poziomach hematokrytu (H) (5%, 10% i 15%) i przy różnych szybkościach ścinania (2-11 sek-1). Prędkość krwi i szybkość ścinania są określane za pomocą systemu kontroli prędkości obrazu mikrocząstek (μPIV), podczas gdy przepływ jest wizualizowany za pomocą szybkiej kamery. Uzyskane wyniki są następnie przetwarzane za pomocą kodu MATLAB w oparciu o intensywność obrazu w celu wykrycia erytrocytów i określenia rozmiarów agregatów.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 negatyw na bazie żywicy epoksydowej</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programista SU8-50</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli(dimetylosiloksan) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>System plazmowy serii PE-50&nbsp;</td><td>Wytrawianie plazmowe</td> Seria <td></td><td>PE-50</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi z K2-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td><td>FisherSci</td><td>B367861</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, i.e. Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer fluorescencyjna roztwór cząstek stałych (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Agregometr</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>Szklane strzykawki (50 &mikro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Rurki (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>Można zastosować kamerę zdolną do nagrywania 18 klatek na sekundę.</td></tr><tr><td>Kamera z podwójnym impulsem&nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Intensywny</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa (Nexus3000 i PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. i Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 i PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie DaVis</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

kontrolowane środowisko mikroprzepływowe do dynamicznego badania agregacji czerwonych krwinek

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Krew, jako nienewtonowski płyn biologiczny, stanowi przedmiot licznych badań w dziedzinie hemorheologii. Składniki krwi obejmują czerwone krwinki, białe krwinki i płytki krwi, które są zawieszone w osoczu krwi. Ze względu na obfitość erytrocytów (od 40% do 45% objętości krwi), ich zachowanie dyktuje zachowanie reologiczne krwi, zwłaszcza w mikrokrążeniu. Przy bardzo niskich szybkościach ścinania obserwuje się, że erytrocyty łączą się i tworzą jednostki zwane agregatami, co powoduje nienewtonowskie zachowanie krwi. Ważne jest, aby zrozumieć warunki powstawania agregatów, aby zrozumieć reologię krwi w mikrokrążeniu. Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje procedurę eksperymentalną mającą na celu ilościowe określenie agregacji RBC w mikrokrążeniu przy stałej szybkości ścinania, w oparciu o przetwarzanie obrazu. W tym celu zawiesiny RBC są testowane i analizowane w mikrokanałach poli-dimetylosiloksanu (PDMS) o wymiarach 120 x 60 μm. Zawiesiny RBC są porywane za pomocą drugiego płynu w celu uzyskania liniowego profilu prędkości w warstwie krwi, a tym samym osiągnięcia szerokiego zakresu stałych szybkości ścinania. Szybkość ścinania jest określana za pomocą systemu mikro Particle Image Velocimetry (μPIV), podczas gdy agregaty RBC są wizualizowane za pomocą szybkiej kamery. Filmy zarejestrowane z agregatów RBC są analizowane przy użyciu technik przetwarzania obrazu w celu określenia zagregowanych rozmiarów na podstawie intensywności obrazów.

Przykład przepływu dwóch płynów w podwójnym mikrokanale w kształcie litery Y przedstawiono na Ryc. 2 dla ludzkich erytrocytów (RBC) zawieszonych przy hematokrycie 5%, 10% i 15% i przepływie 10 µl/hr. Ryc. 3 pokazuje różnice w wielkości agregatów przy zmniejszeniu przepływu w kanale z 10 µl/hr do 5 µl/hr dla hematokrytu 10%. Pozwala to na jakościową ocenę wielkości agregatów przy zmiennym hematokrycie i szybkości ścinania. Ryc. 5 przedstawia przemieszczanie się czterech a...

Protokół opisuje szczegółowo eksperymentalną procedurę ilościowego oznaczania agregatów krwinek czerwonych (RBC) pod kontrolowaną i stałą szybkością ścinania, w oparciu o techniki przetwarzania obrazu. Celem tego protokołu jest odniesienie rozmiarów agregatów RBC do odpowiedniej szybkości ścinania w kontrolowanym środowisku mikroprzepływowym.

Kontrolowane środowisko mikroprzepływowe do dynamicznego badania agregacji czerwonych krwinek

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpośrednia kwantyfikacja agregatów erytrocytów w mikrokrążeniu, dynamicznie, przy kontrolowanych i stałych szybkościach ścinania. Osiąga się to poprzez uprzednie przepłukanie zawiesin erytrocytów i podwójnego mikrokanału w kształcie litery Y roztworem soli fosforanowej (PBS), co pozwala na wytworzenie stałego ścinania w warstwie krwi. Drugim krokiem jest wizualizacja i rejestracja przepływu za pomocą kamery wysokiej rozdzielczości.Następnie należy wykorzystać techniki przetwarzania obrazu do analizy nagrania w celu wyznaczenia średniej wielkości agregatów oraz rozkładu wielkości agregatów w mikrokanale. Ostatnim krokiem jest określenie prędkości krwi poprzez śledzenie przemieszczenia cząsteczek fluorescencyjnych wstrzykniętych do mikrokanału pomiędzy dwiema kolejnymi klatkami. Ostatecznie, na podstawie prędkości krwi i grubości warstwy krwi, oblicza się szybkość ścinania w mikrokanale, aby powiązać wielkości agregatów z odpowiadającą im lokalną szybkością ścinania.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda transmisji światła, jest fakt, że agregaty erytrocytów są analizowane dynamicznie w mikroskopowym przepływie ścinającym, w przeciwieństwie do analizy statystycznej stosowanej w innych technikach. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu hemoradiologii, takie jak zrozumienie warunków powstawania agregatów erytrocytów oraz poznanie zachowania radiologicznego krwi w mikrokrążeniu. W celu rozpoczęcia należy wykonać mikrokanały o szerokości 120 µm, wysokości 60 µm i długości 7 mm zgodnie ze standardowymi metodami fotolitograficznymi.Następnie należy pobrać komórki krwi od zdrowych dawców-ochotników i przygotować zawiesiny erytrocytów o poziomach hematokrytu wynoszących 5%, 10% i 15%, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, a następnie połączyć jeden mililitr każdej zawiesiny erytrocytów z 60 µL 1% roztworu zawierającego fluorescencyjne cząsteczki znacznika. Delikatnie potrząsnąć probówką, aby wymieszać roztwór. Należy również połączyć taką samą objętość cząsteczek znacznika z jednym mililitrem PBS o pH 7.4.Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 25 µL roztworem znacznika zawierającym erytrocyty oraz szklaną strzykawkę o pojemności 100 µL. Przy użyciu roztworu znacznika w PBS upewnij się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie umieść mikrokanał na stole mikroskopu odwróconego, który jest połączony z kamerą wysokiej prędkości zdolną do rejestracji obrazu z częstotliwością 18 klatek na sekundę lub wyższą oraz z systemem mikrocząsteczkowej welocymetrii obrazowej (micro-PIV).Podłącz każdą strzykawkę za pomocą rurek do jednego z portów wlotowych kanału mikroprzepływowego, a następnie umieść je w uchwycie tej samej pompy strzykawkowej. Zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby dozowała zawartość strzykawki 25 µL z prędkością 2 µL/h. Ze względu na różnicę w wielkości strzykawek, spowoduje to również dozowanie zawartości strzykawki 100 µL z czterokrotnie większą prędkością.Zmień szybkość przepływu pomiędzy eksperymentami, aby przetestować różne szybkości ścinania. Użyj wzorca kalibracyjnego z zainstalowanym obiektywem 20x, aby skalibrować kamerę wysokiej rozdzielczości. Następnie uruchom pompę, aby rozpocząć dozowanie dwóch roztworów do mikrokanału.Należy określić optymalny czas ekspozycji kamery, aby uzyskać wyraźne obrazy agregatów. Ważne jest, aby przed przeprowadzeniem pomiarów odczekać, aż przepływ osiągnie stan ustalony.Jeśli stan stacjonarny zostanie osiągnięty w ciągu trzech do pięciu minut, ponownie napełnij strzykawkę, aby wymieszać zawiesinę i utrzymać erytrocyty w zawiesinie. Po osiągnięciu stacjonarnego przepływu rozpocznij rejestrację ruchu erytrocytów.Rejestruj przepływ przez siedem sekund. Używając programu do przetwarzania obrazu, zwiększ kontrast każdego obrazu w skali szarości, stosując metodę wyrównywania histogramu. Następnie przekształć obrazy w skali szarości w obrazy binarne.Starannie ustaw wartość progu, testując kilka wartości i wybierając tę, dla której wszystkie agregaty są prawidłowo wykrywane. W razie potrzeby wypełnij otwory odpowiadające przerwom wewnątrz jednego agregatu. Następnie wykryj komórki, określając sąsiednie białe piksele w obrazie binarnym, tak aby sąsiadujące komórki zostały uznane za agregaty.Oznacz wykryte, różne agregaty erytrocytów, a następnie przekonwertuj obraz binarny na obraz RGB w celu lepszej wizualizacji. Na koniec nałóż obraz RGB na obraz oryginalny. Aby zweryfikować skuteczność przetwarzania obrazu, oblicz pole powierzchni każdego agregatu wykrytego w klatce na podstawie liczby wykrytych pikseli.Przetwórz wszystkie klatki w ten sam sposób. Następnie oblicz średnią wielkość agregatów wykrytych w każdej klatce, a potem średnią z wyników wszystkich klatek. Aby uzyskać średnią wielkość agregatów dla każdego nagrania zawiesin erytrocytów, przelicz wyniki na mikrometry kwadratowe, korzystając z obrazu skali.Następnie oblicz powierzchnię jednego erytrocyta, aby wyznaczyć wartość reprezentatywną. Po uzyskaniu danych oszacuj liczbę erytrocytów w każdym wykrytym agregacie. Korzystając z kamery wysokich prędkości, przełącz się na kamerę z podwójnym impulsem wykorzystywaną w systemie mikrocząsteczkowej welocymetrii obrazowej.Do akwizycji obrazów przepływu oraz przetwarzania obrazów w celu wyznaczenia pola prędkości należy użyć oprogramowania do obrazowania, takiego jak pokazane tutaj. Należy założyć okulary ochronne, a następnie włączyć system laserowy i kamerę. Pod mikroskopem należy umieścić mikrometr i wykorzystać uzyskany obraz do kalibracji systemu.Następnie uruchom przepływ cieczy i zwizualizuj cząsteczki w obu płynach. Znajdź płaszczyznę środkową mikrokanału, koncentrując się na najszybszych i najjaśniejszych cząsteczkach w przepływie. Następnie ustaw odstęp czasu między klatkami na około dwie milisekundy, tak aby najszybsze cząsteczki przemieściły się od pięciu do 10 pikseli pomiędzy obiema obrazami, i rozpocznij rejestrację przepływu O. Skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pozyskać 100 par obrazów dla wszystkich różnych zawiesin erytrocytów oraz dla różnych szybkości ścinania.Po wstępnym przetwarzaniu obrazów należy wybrać rozmiar i kształt okna korelacji oraz procent nakładania się obrazów. Wyniki należy przedstawić jako średnie pole prędkości obliczone z 100 par obrazów oraz pierwiastkowy błąd średni kwadratu prędkości.Wyłącz kamerę laserową i komputer. Po przeprowadzeniu wszystkich pomiarów i przetwarzaniu obrazów oblicz szybkość ścinania, najpierw wykrywając i szacując grubość krwi w mikrokanale na podstawie nagrania z kamery wysokiej rozdzielczości. W tym celu uśrednij wszystkie klatki w danym nagraniu, aby uzyskać obraz tła wideo.Na koniec wyznacz grubość warstwy krwi, wizualnie analizując obraz uśredniony ze wszystkich klatek i ręcznie określając krawędź warstwy krwi. Następnie odczytaj ręcznie wartość prędkości dla odpowiadającej jej grubości warstwy krwi z wyodrębnionego profilu prędkości i oblicz szybkość ścinania, dzieląc wartość prędkości przez grubość warstwy krwi. Przedstawione tutaj grubości są wypadkowym ruchem czterech agregatów erytrocytów, które zostały wykryte w trzech kolejnych klatkach.Duże agregaty składające się z ponad 30 komórek są zaznaczone na czerwono. Agregaty średniej wielkości, zawierające od 9 do 30 komórek, są zaznaczone na zielono, a małe agregaty, składające się z mniej niż 9 komórek, są zaznaczone na niebiesko. Prędkość agregatu zmienia się w zależności od jego położenia w przedstawionym mikrokanale.Oto profile prędkości erytrocytów zawieszonych przy hematokrycie 5%, 10% i 15% przy natężeniu przepływu 10 µL/h. Widać, że prędkość dąży do zera przy obu krawędziach, zgodnie z oczekiwaniami, a punkt przegięcia między dwoma strumieniami przepływu nieznacznie różni się w zależności od poziomu hematokrytu, ponieważ wraz ze wzrostem całkowitej szybkości ścinania rozmiar agregatów dla każdego poziomu hematokrytu spada. Jest to spowodowane tym, że siła ścinania w mikrokanale przewyższa siłę agregacji, co prowadzi do dezagregacji erytrocytów.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zadbać o wysoką jakość obrazu przepływu w mikrokanale oraz zapewnić odpowiedni kontrast między płynącymi erytrocytami a tłem obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat jakościowej i ilościowej analizy agregatów erytrocytów w kontrolowanych warunkach przepływu.

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kontrolowany mikrofluidyczny środowisko do dynamicznego badania skupiania się czerwonych krwinek

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Ten film demonstruje test chemotaksji neutrofili przy użyciu metody all-on-chip. Metoda ta pozwala na bezpośrednią izolację neutrofili z krwi pełnej poprzez immunomagnetyczną selekcję ujemną, a następnie test chemotaksji na chipie mikroprzepływowym.

Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Prędkość obrazowania mikrocząstek (μPIV) służy do wizualizacji sparowanych obrazów mikrocząstek zasianych w przepływie krwi, które są skorelowane krzyżowo, aby uzyskać dokładny profil prędkości.  Na podstawie tych pomiarów można uzyskać szybkość ścinania, prędkość maksymalną, kształt profilu prędkości i natężenie przepływu, z których każdy ma zastosowania kliniczne.

Obrazowa prędkość mikrocząstek do pomiarów profilu prędkości mikroprzepływów krwi

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Badanie zachowania komórek pod wpływem stresu mechanicznego jest kluczowe dla postępów w mechanice komórkowej i mechanobiologii. Wprowadzamy technikę aspiracji mikropipetami fluorescencyjnymi (fMPA), nowatorską metodę łączącą kontrolowaną stymulację mechaniczną z kompleksową analizą sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala na przeprowadzenie nowych, dogłębnych badań nad mechanobiologią żywych komórek.

Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Poznaj metodę ilościowego badania agregacji erytrocytów w mikrokrążeniu przy kontrolowanych prędkościach ścinania. Wykorzystuje się mikroprzepływ i analizę obrazu do określenia rozmiarów agregatów.

Kontrolowane środowisko mikroprzepływowe do dynamicznego badania agregacji czerwonych krwinek

Przeglądaj więcej filmów