Kontrolowane środowisko mikroprzepływowe do dynamicznego badania agregacji czerwonych krwinek
June 4th, 2015
Protokół opisuje szczegółowo eksperymentalną procedurę ilościowego oznaczania agregatów krwinek czerwonych (RBC) pod kontrolowaną i stałą szybkością ścinania, w oparciu o techniki przetwarzania obrazu. Celem tego protokołu jest odniesienie rozmiarów agregatów RBC do odpowiedniej szybkości ścinania w kontrolowanym środowisku mikroprzepływowym.
Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednie ilościowe określenie agregatów krwinek czerwonych w mikrokrążeniu, dynamicznie pod kontrolowaną i stałą szybkością ścinania. Osiąga się to poprzez pierwszy trening, zawiesiny czerwonych krwinek i mikrokanał podwójnej y z roztworem soli fizjologicznej buforu fosforanowego, tworząc stałą radość w warstwie krwi. Drugim krokiem jest wizualizacja i zarejestrowanie przepływu za pomocą szybkiej kamery.
Następnie użyj technik przetwarzania obrazu, aby przetworzyć nagranie i uzyskać średnią wielkość agregatu oraz rozkład wielkości zagregowanej w mikrokanale. Ostatnim krokiem jest określenie prędkości krwi poprzez śledzenie przemieszczenia cząstek fluorescencyjnych wstrzykniętych do mikrokanału między dwiema kolejnymi ramkami. Ostatecznie szybkość ścinania w mikrokanale jest obliczana na podstawie prędkości krwi i grubości warstwy krwi, aby powiązać rozmiary agregatów z odpowiednią lokalną szybkością ścinania.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak metoda transmisji światła, jest to, że agregaty czerwonych krwinek są analizowane dynamicznie w mikroskopijnym przepływie udziałów, w przeciwieństwie do statystyk w przypadku innych technik. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hemoradiologicznej, takie jak zrozumienie warunków tworzenia się agregatów czerwonych krwinek i znalezienie zachowania radiologicznego krwi w mikrokrążeniu. Na początek należy wykonać mikrokanały o szerokości 120 mikronów, wysokości 60 mikronów i długości siedmiu milimetrów zgodnie ze standardowymi metodami fotolitografii.
Następnie zbierz krwinki od zdrowych dawców-ochotników i przygotuj zawiesiny czerwonych krwinek z pięcioma, 10 i 15% poziomami hematokrytu, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, połącz jeden mililitr każdej zawiesiny czerwonych krwinek z 60 mikrolitrami 1% roztworu zawierającego fluorescencyjne cząstki znacznikowe. Delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać roztwór. Połącz również tę samą objętość cząstek znacznikowych z jednym mililitrem PBS o pH 7,4.
Załadować szklaną strzykawkę o pojemności 25 mikrolitrów roztworem znacznikowym zawierającym czerwone krwinki i szklaną strzykawką o pojemności 100 mikrolitrów. W przypadku roztworu znacznikowego w PBS upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie umieść mikrokanał na odwróconym stoliku mikroskopowym podłączonym do szybkiej kamery zdolnej do rejestrowania 18 klatek na sekundę lub więcej oraz systemu prędkości obrazu mikrocząstek.
Podłączyć każdą strzykawkę za pomocą rurki do jednego z portów wlotowych kanału mikroprzepływowego, a następnie załadować je do uchwytu tej samej pompy strzykawkowej. Zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby dozowała strzykawkę o pojemności 25 mikrolitrów z szybkością dwóch mikrolitrów na godzinę. Spowoduje to również dozowanie strzykawki o pojemności 100 mikrolitrów z czterokrotnie większą szybkością ze względu na różnicę w ich wielkości.
Zmieniaj natężenie przepływu między eksperymentami, aby przetestować różne szybkości ścinania. Użyj kpiny kalibracyjnej z założonym obiektywem 20x, aby skalibrować szybką kamerę. Następnie uruchom pompę, aby rozpocząć dozowanie dwóch roztworów do mikrokanału.
Określ optymalną ekspozycję aparatu. Czas na wyraźne obrazowanie agregatów. Ważne jest, aby poczekać, aż przepływ osiągnie stan ustalony przed wykonaniem jakichkolwiek pomiarów.
Jeśli stan stacjonarny zostanie osiągnięty w ciągu trzech do pięciu minut. Uzupełnić strzykawkę, aby oczyścić mieszaninę i utrzymać czerwone krwinki w zawiesinie. Po osiągnięciu przepływu w stanie ustalonym rozpocznij rejestrowanie ruchu czerwonych krwinek.
Rejestruj przepływ przez siedem sekund. Korzystając z programu zdolnego do przetwarzania obrazu, zwiększ kontrast dla każdego obrazu w skali szarości wykonanego przy użyciu metody korektora histogramu. Następnie przekonwertuj obrazy w skali szarości na obrazy binarne.
Ostrożnie ustaw wartość progową, testując kilka wartości i wybierając wartość, dla której wszystkie agregaty są prawidłowo wykrywane. W razie potrzeby należy wypełnić otwory odpowiadające szczelinom w obrębie jednego agregatu. Następnie wykryj komórki, określając sąsiednie białe piksele na obrazie binarnym, tak aby sąsiednie komórki były rozliczane jako agregacje.
Oznacz różne wykryte agregaty czerwonych krwinek, a następnie przekształć obraz binarny w czerwony, zielony niebieski obraz w celu lepszej wizualizacji. Na koniec nałóż czerwony, zielony niebieski obraz na oryginalny obraz. Aby zweryfikować wydajność przetwarzania obrazu, oblicz obszar każdego agregatu wykrytego w klatce na podstawie liczby wykrytych pikseli.
Przetwarzaj wszystkie klatki w ten sam sposób. Następnie należy uśrednić zagregowane rozmiary wykryte w każdej klatce, a następnie wyniki wszystkich ramek. Aby uzyskać średnią zagregowaną wielkość dla każdego nagrania silników zawiesin krwinek czerwonych, przelicz wyniki na mikrometry kwadratowe, korzystając z obrazu wyśmiewania.
Następnie oblicz powierzchnię jednej czerwonej krwinki, aby określić przedstawiciela. Szacowana liczba czerwonych krwinek w każdym wykrytym agregale po uzyskaniu danych. Korzystając z szybkiej kamery, przełącz się na kamerę z podwójnym impulsem używaną w systemie pomiaru prędkości obrazu mikrocząstek.
Użyj oprogramowania do obrazowania, takiego jak pokazane tutaj, do akwizycji obrazu przepływu i przetwarzania obrazu w celu określenia pola prędkości. Pamiętaj, aby założyć okulary ochronne, a następnie włączyć system laserowy i aparat. Umieść mikrometr pod mikroskopem i użyj uzyskanego obrazu do kalibracji systemu.
Następnie rozpocznij przepływ płynu i zwizualizuj cząstki w obu płynach. Znajdź środkową płaszczyznę mikrokanału, skupiając się na najszybszych i najjaśniejszych cząstkach w przepływie. Następnie ustaw odstęp czasu między klatkami na około dwie milisekundy, aby najszybsze cząstki przemieściły się o pięć do 10 pikseli między obydwoma obrazami i rozpocznij rejestrowanie przepływu O. Ustaw oprogramowanie tak, aby uzyskać 100 par obrazów dla wszystkich różnych zawiesin czerwonych krwinek i dla różnych szybkości ścinania.
Po wstępnym przetwarzaniu obrazu. Wybierz rozmiar i kształt okna korelacji, a także procent nakładających się obrazów. Wyraź wyniki jako średnie pole prędkości obliczone na podstawie 100 par obrazów i błąd średniokwadratowy prędkości.
Wyłącz kamerę laserową i komputer. Po wykonaniu wszystkich pomiarów i przetworzeniu obrazu, oblicz czystą szybkość, najpierw wykrywając i szacując grubość krwi w mikrokanale na podstawie zapisu z kamery o dużej prędkości. W tym celu należy uśrednić wszystkie klatki w konkretnym nagraniu, aby uzyskać obraz tła wideo.
Na koniec zlikwiduj warstwę krwi, wizualnie sprawdzając średni obraz wszystkich ramek i ręcznie wykryj krawędź warstwy krwi. Następnie ręcznie uzyskaj wartość prędkości dla odpowiedniej grubości warstwy krwi z wyodrębnionego profilu prędkości i oblicz szybkość ścinania, dzieląc wartość prędkości przez warstwę krwi. Pokazana tutaj grubość to ruchy netto czterech agregatów czerwonych krwinek, które zostały wykryte w trzech kolejnych klatkach.
Duże agregaty składające się z ponad 30 komórek są pokazane na czerwono. Średnie agregaty od dziewięciu do 30 komórek są pokazane na zielono, a małe agregaty zawierające mniej niż dziewięć komórek są pokazane na niebiesko. Prędkość agregatu zmienia się w zależności od jego położenia w pokazanym mikrokanale.
Oto profile prędkości czerwonych krwinek zawieszonych na poziomie 5% hematokrytu, 10% hematokrytu i 15% hematokrytu przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na godzinę. Zgodnie z oczekiwaniami można zobaczyć, że prędkość zmierza w kierunku zera na obu krawędziach, a punkt przegięcia między dwoma strumieniami przepływu różni się nieznacznie między poziomami hematokrytu, ponieważ ogólna szybkość ścinania zwiększa rozmiar agregatów w każdym spadku poziomu hematokrytu. Wynika to z samej siły w mikrokanaliku przekraczającej siłę agregującą, powodującą dezagregację czerwonych krwinek.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu dobrej jakości obrazu przepływu w mikrokanaliku oraz zapewnieniu kontrastu między przepływającymi krwinkami czerwonymi a tłem obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować jakościowo i ilościowo agregaty czerwonych krwinek w kontrolowanych warunkach przepływu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania agregatów czerwonych krwinek (RBC) w warunkach kontrolowanych szybkości ścinania przy użyciu technik przetwarzania obrazu. Badanie ma na celu skorelowanie wielkości agregatów RBC z szybkościami ścinania w mikrofluidalnym środowisku.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikrofluidyka
- Hematologia
- Przetwarzanie obrazów
Tło
- Agregaty czerwonych krwinek odgrywają kluczową rolę w mikrocirkulacji.
- Rozumienie szybkości ścinania jest niezbędne do badania dynamiki przepływu krwi.
- Techniki przetwarzania obrazów mogą poprawić analizę agregatów RBC.
- To badanie wykorzystuje konfigurację mikrokanału do przeprowadzenia kontrolowanych eksperymentów.
Cel badania
- Ilościowe określenie agregatów RBC w mikrofluidalnym środowisku.
- Korelację wielkości agregatów z lokalnymi szybkościami ścinania.
- Lepsze zrozumienie zachowania przepływu krwi w mikrocirkulacji.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zawiesiny RBC w buforze fosforanowym soli.
- Wizualizacja przepływu za pomocą szybkiej kamery.
- Przetwarzanie obrazów w celu określenia średniej wielkości i rozkładu agregatów.
- Obliczenie szybkości ścinania na podstawie prędkości krwi i grubości warstwy.
Główne wyniki
- Udane ilościowe określenie wielkości agregatów RBC.
- Ustanowienie związku między wielkością agregatów a szybkościami ścinania.
- Wykazanie efektywnego wykorzystania technik przetwarzania obrazów.
- Wgląd w dynamikę zachowania czerwonych krwinek w mikrocirkulacji.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania agregatów RBC.
- Wyniki poprawiają zrozumienie przepływu krwi w systemach mikrofluidalnych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania zaburzeń krwi i terapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to RBC aggregation pathways and modulators of hemorheological function.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization and quantification of aggregate dynamics under physiologically relevant shear conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible aggregate size metrics under controlled flow.
- Operational Value: Enhances assay standardization and scalability through microfluidic platform reuse and quantitative image-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity by modeling shear-dependent RBC behavior in microcirculation.
- Operational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by correlating aggregate stability with hemodynamic conditions relevant to vascular function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic observation of aggregate formation and dissociation under controlled shear rates.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microfluidic environments and quantitative aggregate size distribution outputs.
- Analytics: Provides measurable readouts including average aggregate size, size distribution, and localized shear rate calculations derived from velocity fields and layer thickness.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RBC behavior in microvascular environments relevant to disease states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating compounds or conditions affecting hemorheological properties across multiple hematocrit levels and shear conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RBC-plasma interactions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through controlled shear rates, calibrated imaging, and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hemorheological liabilities that could impact drug safety or efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate aggregation propensity in a shear-dependent manner.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, high-speed imaging, and image processing techniques for binary thresholding and particle labeling.
- Depends on microfluidic fabrication capabilities, high-speed cameras capable of ≥18 fps, and μPIV systems for velocity field determination.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit preparation, tracer particle concentration, and flow rate protocols to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to diseased RBC samples or varying plasma conditions that may alter aggregation kinetics.
- Includes practical limitations such as the need for bubble-free systems, steady-state flow validation, and manual validation of blood layer thickness for shear rate calculation.
