Name: Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z małych próbek surowicy za pomocą papierowej platformy bez ultrawirówki. Technika ta umożliwia szybką analizę EV z zaledwie 10 μl surowicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były częściowo wspierane przez granty Tajwańskiej Narodowej Rady Nauki - NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) i NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) oraz Veterans General Hospitals and University System of Taiwan Joint Research Program (CC).

Ogólny schemat procedury operacyjnej przedstawiono na rysunku 1. Stosując praktyki etyczne, pobraliśmy próbki krwi od zdrowych osób i uzyskaliśmy próbki cieczy wodnistej od pacjentów za pośrednictwem Szpitala Ogólnego Weteranów Taichung (TCVGH), Taichung, Tajwan zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IRB (IRB TCVGH No. CF11213-1).
1. Produkcja urządzeń papierowych
<ol>
	<li>Pociąć bibułę chromatograficzną na okręgi o średnicy 5 mm, aby uzyskać taki sam układ, jak 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania. Ułóż te kawałki papieru na kanapie dwoma arkuszami polistyrenu z zarejestrowanymi otworami przelotowymi i laminatem.</li>
	<li>Zmodyfikuj urządzenia papierowe za pomocą metody koniugacji chemicznej opisanej w poniższych krokach28.
	<ol>
		<li>Urządzenia papierowe należy traktować plazmą tlenową (100 mW, 1% tlenu, 30 sekund) w komorze plazmowej. 
		UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z 3-merkaptopropylotrimetoksysilanem i estrem N-γ-maleimidobutyryloksysukcynimidu (GMBS), ponieważ są one zarówno wrażliwe na wilgoć, jak i toksyczne. Nosić rękawice ochronne i unikać wdychania lub kontaktu ze skórą i oczami. Trzymaj butelkę bulionową szczelnie zamkniętą i pozwól jej zrównoważyć się do RT przed otwarciem, aby uniknąć kondensacji wody. Alternatywnie, otwórz butelkę z zapasem w wypełnionej azotem torbie lub pudełku na rękawiczki. Porcję rozlać do małych fiolek, aby uniknąć częstego otwierania butelki podstawowej.</li>
		<li>Natychmiast inkubować urządzenia papierowe poddane działaniu substancji w 4% (v/v) roztworze 3-merkaptopropylotrimetoksysilanu w etanolu (200 proof) przez 30 minut.</li>
		<li>Wypłukać urządzenia papierowe etanolem i inkubować je z 0,01 μmol/ml GMBS w etanolu przez 15 minut.</li>
		<li>Spłukać etanolem (200 proof) i inkubować urządzenia papierowe z 10 μg/ml roztworu awidyny w buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 4 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwilżyć każdą papierową strefę testową 10 μl PBS zawierającymi 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 3 × 10 minut, a następnie wykryć 10 μl biotynylowanych cząsteczek wychwytujących przez 3 × 10 minut. Stosować przeciwciało anty-CD63 (20 μg/ml w PBS zawierające 1% (w/v) BSA i 0,09% (w/v) azydku sodu) lub aneksynę V (1:20, v/v w buforze wiążącym aneksynę V) jako cząsteczki wychwytujące.</li>
	<li>Wypłukać niezwiązane przeciwciało anty-CD63 lub cząsteczki aneksyny V za pomocą 10 μl odpowiedniego PBS zawierającego 1% (w/v) BSA lub wiążące roztwory buforowe aneksyny V odpowiednio przez 3 × 1 minutę.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przetwarzanie próbek surowicy i cieczy wodnistej
<ol>
	<li>Kolekcja serum.
	<ol>
		<li>Zebrać 10 ml krwi obwodowej przez nakłucie żyły do probówek do separacji surowicy i delikatnie odwrócić probówkę pięć razy. Ustaw rurkę w pozycji pionowej i odczekaj 30 minut.</li>
		<li>Wirować przy 1 200 × g przez 15 minut. Przenieść surowicę z wierzchniej warstwy do czystej probówki i ponownie odwirować przy 3 000 × g przez 30 minut.</li>
		<li>Przepuścić supernatant przez filtr 0,8 μm. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie cieczy wodnistej: pobierać próbki cieczy wodnistej od pacjentów zdiagnozowanych przez okulistę bezpośrednio podczas zabiegów inwazyjnych i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
<ol>
	<li>Próbki należy umieścić w każdej strefie testowej na papierze z szybkością 5 μl/min.</li>
	<li>Spłukać niezwiązane EV 10 μl odpowiedniego PBS zawierającego 1% (w/v) BSA lub roztwory buforu wiążącego anektynę V przez 3 × 1 minutę dla urządzeń papierowych funkcjonalizowanych odpowiednio przeciwciałem anty-CD63 lub cząsteczkami aneksyny V. Wykonaj następujące dalsze testy.</li>
</ol>
4. Przykład testu 1: Skanowanie elektromikrofotografii
<ol>
	<li>Utrwal EV uchwycone na funkcjonalizowanej strefie testowej na papierze za pomocą 10 μl 0,5× utrwalacza Karnovsky'ego przez 10 minut.</li>
	<li>Przepłukać próbki dużą ilością PBS przez 2 × 5 minut.</li>
	<li>Odwodnić próbki kolejno 35% etanolem przez 10 minut, 50% etanolem przez 2 × 10 minut, 70% etanolem przez 2 × 10 minut, 95% etanolem przez 2 × 10 minut i 100% etanolem przez 4 × 10 minut.</li>
	<li>Krytyczne suszenie i napylanie próbek pokryć palladem/złotem i zbadać za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego działającego przy niskim napięciu przyspieszenia elektronów (~ 5 kV).</li>
</ol>
5. Przykład testu 2: Test ELISA na papierze
<ol>
	<li>Dodać 5 μl roztworu zawierającego pierwszorzędowe przeciwciało anty-CD9 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS do każdej strefy testowej zawierającej wychwycone EV. Odczekaj 1 min.</li>
	<li>Przepłukać próbki 30 ml PBS, wstrząsając z prędkością 100 obr./min przez 30 sekund.</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu zawierającego przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:1 000 w PBS i odczekać 1 minutę.</li>
	<li>Przepłukać próbki 30 ml PBS, wstrząsając z prędkością 100 obr./min przez 30 sekund.</li>
	<li>Dodać 5 μl podłoża kolorymetrycznego zawierającego stosunek objętościowy nadtlenku wodoru 1:1 i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) i zeskanować za pomocą skanera biurkowego.</li>
</ol>
6. Przykład testu 3: Izolacja RNA
<ol>
	<li>Zanurzyć próbki w 35 μl środka do izolacji RNA na bazie poliwinylopirolidonu i 265 μl buforu do lizy/wiązania w celu lizy wychwyconych EV. Wiruj energicznie.</li>
	<li>Do lizatu dodać 30 μl homogenatu znajdującego się w zestawie izolacyjnym. Energicznie wirować i umieszczać na lodzie na 10 minut.</li>
	<li>Ekstrahować RNA za pomocą rozdzielania kwasem fenolowo-chloroformowym opisanym w poniższych krokach.
	<ol>
		<li>Pobrać 330 μl chloroformu fenolowego z dolnej warstwy butelki i dodać do homogenatu/lizatu. Wiruj energicznie.</li>
		<li>Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut. Przenieść fazę wodną (górną) do czystej probówki i zanotować usuniętą objętość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącić całkowity RNA ze 100% etanolem o objętości 1,25 razy większej niż objętość fazy wodnej usuniętej w poprzednim etapie i zebrać RNA w roztworze elucyjnym podgrzanym do 95 °C.</li>
	<li>Zagęścić i dalej oczyścić RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li>
<li>Lasser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9(2011).</li>
<li>Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).</li>
<li>Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procoagulant+activity+in+normal+human-urine+associated+with+subcellular+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles.</a> Kidney Int. 29, 591-597 (1986).</li>
<li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li>
<li>Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+fluid+derived+exosomes+as+a+novel+template+for+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics.</a> J. Transl. Med. 9, 86(2011).</li>
<li>Asea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein-containing+exosomes+in+mid-trimester+amniotic+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids.</a> J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).</li>
<li>Bard, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+exosomes+isolated+from+human+malignant+pleural+effusions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Resp.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions.</a> Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).</li>
<li>Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocilin-associated+exosomes+in+human+ocular+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myocilin-associated exosomes in human ocular samples.</a> Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).</li>
<li>Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+extracellular+membrane+vesicles+in+the+pathogenesis+of+various+diseases%2C+including+cancer%2C+renal+diseases%2C+atherosclerosis%2C+and+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis.</a> Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119, 756-766 (2012).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+released+from+human+renal+cancer+stem+cells+stimulate+angiogenesis+and+formation+of+lung+premetastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche.</a> Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).</li>
<li>Jaiswal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle-associated+nucleic+acids+mediate+trait+dominance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer.</a> Faseb. J. 26, 420-429 (2012).</li>
<li>Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThery%2C+C+%22Current+protocols+in+cell+biology%22">Current protocols in cell biology</a>. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).</li>
<li>Rood, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).</li>
<li>Fernandez-Llama, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tamm-Horsfall+protein+and+urinary+exosome+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation.</a> Kidney Int. 77, 736-742 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+isolation+and+transcriptome+analysis+of+serum+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles.</a> Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).</li>
<li>Davies, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+filtration+system+to+isolate+extracellular+vesicles+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood.</a> Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+immunoaffinity+devices+for+accessible+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles.</a> Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).</li>
<li>Lamparski, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+clinical+grade+exosomes+derived+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells.</a> J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).</li>
<li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1%3A+Purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).</li>
<li>Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+wax+printing%3A+a+simple+micropatterning+process+for+paper-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics.</a> Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).</li>
<li>Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+detection+for+paper-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrochemical detection for paper-based microfluidics.</a> Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).</li>
<li>Glavan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omniphobic+%27R-F+paper%27+produced+by+silanization+of+paper+with+fluoroalkyltrichlorosilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes.</a> Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).</li>
<li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+linear+shear-stress+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a linear shear-stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).</li>
<li>Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+flow+and+surface+conditions+on+human+lymphocyte+isolation+using+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers.</a> Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).</li>
<li>Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+chemical+cleaning+methods+of+glass+in+preparation+for+silanization%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization.</a> Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).</li>
<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Scanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+T+cells+generate+microparticles%2C+which+mimic+cellular+contact+activation+of+human+monocytes%3A+differential+regulation+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokine+production+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins.</a> J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).</li>
<li>Inal, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Ex%22%5BJournal%5D)">Microvesicles in health and disease.</a> Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).</li>
<li>Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+nitrocellulose+as+a+material+for+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Mrs+Bull%22%5BJournal%5D)">The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays.</a> Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).</li>
<li>Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrillated+cellulose+surface+modification%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Nanofibrillated cellulose surface modification: a review.</a> Materials. 6, 1745-1766 (2013).</li>
<li>Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrillated+cellulose%3A+surface+modification+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications.</a> Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszymi krokami dla pomyślnej izolacji podgrup pęcherzyków zewnątrzkomórkowych są: 1) dobry wybór papieru; 2) stabilne i wysokie pokrycie cząsteczek wychwytujących na powierzchni włókien papieru; 3) właściwe obchodzenie się z próbkami; oraz 4) ogólna praktyka higieny laboratoryjnej.
Porowate materiały zostały wykorzystane w wielu niedrogich i niewymagających użycia sprzętu testach. Mogą charakteryzować się regulowanym rozmiarem porów, wszechstronną funkcjonalnością, niskim kosztem i wy...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to heterogeniczne błoniaste cząstki o rozmiarach od 40 nm do 5 000 nm i są aktywnie uwalniane przez wiele typów komórek poprzez różne drogi biogenezy1-9. Zawierają unikalne i wyselekcjonowane podzbiory DNA, RNA, białek i markerów powierzchniowych z komórek rodzicielskich. Ich udział w różnych procesach komórkowych, takich jak komunikacja międzykomórkowa10, modulacja odporności11, angiogeneza12, przerzuty12, chemooporność13 i rozwój chorób oczu9, jest coraz bardziej rozpoznawalny i wzbudził duże zainteresowanie ich przydatnością w zastosowaniach diagnostycznych, prognostycznych, terapeutycznych i biologii podstawowej.
EVs można klasycznie klasycznie klasyfikować jako egzosomy, mikropęcherzyki, ciała apoptotyczne, onkosomy, ektosomy, mikrocząsteczki, telerosomy, prostatosomy, kardiosomy i weksosomy itd., w zależności od ich biogenezy lub pochodzenia komórkowego. Na przykład egzosomy powstają w ciałach wielopęcherzykowych, podczas gdy mikropęcherzyki powstają w wyniku pączkowania bezpośrednio z błony komórkowej, a pęcherzyki apoptotyczne pochodzą z komórek apoptotycznych lub nekrotycznych. Jednak nomenklatura jest nadal niedostatecznie dopracowana, częściowo z powodu braku dokładnego zrozumienia i scharakteryzowania pojazdów elektrycznych. Opracowano kilka metod oczyszczania EV, w tym ultrawirowanie14, ultrafiltracja15, kulki magnetyczne16, wytrącanie polimerów17-19 i techniki mikroprzepływowe20-22. Najczęstsza procedura oczyszczania pojazdów elektrycznych obejmuje serię wirowania i/lub filtracji w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń i innych zanieczyszczeń komórkowych, a następnie końcowe ultrawirowanie z dużą prędkością, proces, który jest kosztowny, żmudny i niespecyficzny14,23,24. Niestety, technologiczna potrzeba szybkiej i niezawodnej izolacji pojazdów elektrycznych o zadowalającej czystości i wydajności nie została jeszcze zaspokojona. 
Opracowaliśmy papierowe urządzenie do immunoaffinity, które zapewnia prosty, oszczędzający czas i koszty, a jednocześnie skuteczny sposób izolowania i charakteryzowania podgrup EVs22. Papier celulozowy pocięty na określony kształt można układać i laminować za pomocą dwóch arkuszy z tworzywa sztucznego z zarejestrowanymi otworami przelotowymi. W przeciwieństwie do ogólnej strategii określania granicy płynów w urządzeniach na bazie papieru poprzez drukowanie hydrofobowego wosku lub polimerów25-27, te laminowane wzory papieru są odporne na wiele cieczy organicznych, w tym etanol. Papierowe strefy testowe są modyfikowane chemicznie, aby zapewnić stabilne i gęste pokrycie cząsteczek wychwytujących (np. przeciwciał specyficznych dla celu), które mają wysokie powinowactwo do określonych markerów powierzchniowych w podgrupach EV. Próbki biologiczne mogą być pipetowane bezpośrednio do papierowych stref testowych, a oczyszczone EV są zatrzymywane po etapach płukania. Charakterystykę izolowanych EV można przeprowadzić za pomocą SEM, ELISA i analizy transkryptomicznej.

<table><tbody><tr><td>Bibuła chromatograficzna</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3001-861</td><td>Whatman&reg; Papier celulozowy klasy 1</td></tr> <tr><td>(3-merkaptopropylo) trimetoksysilan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175617</td><td>Ta substancja chemiczna reaguje z wodą i wilgocią i powinna być stosowana w wypełnionej azotem torbie na rękawice. Unikać kontaktu z oczami i skórą. Nie wdychać oparów ani wdychać oparów.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td>Absolut, 200 Proof, klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>ALB001</td><td>Często określany jako frakcja Cohna V.</td></tr><tr><td>N-&#947;-maleimidobutyryloksy sukcynimidu (GMBS)</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>22309</td><td>GMBS jest środkiem sieciującym aminę do sulfhydrylu. GMBS jest wrażliwy na wilgoć.</td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>31000</td><td>NeutrAwidyna ma 4 miejsca wiązania biotyny, a jej wartość pI wynosi 6,3, co jest bardziej neutralne niż natywna awidyna</td></tr><tr><td>Biotynylowany mysz anty-ludzki anty-CD63</td><td>Ancell</td><td>215-030</td><td>klon AHN16.1/46-4-5</td></tr><tr><td>biotynylowana aneksyna V</td><td>BD Biosciences</td><td>556418</td><td>Annxin V ma wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny (PS)</td></tr> <tr><td>Pierwotnej anty-CD9 i wtórnej przeciwciało</td><td>System Biosciences</td><td>EXOAB-CD9A-1</td><td>Przeciwciałem drugorzędowym jest chrzanowo sprzężone z peroksydacją chrzanu</td></tr><tr><td>Probówki do separacji surowicy</td><td>BD Biosciences</td><td>367991</td><td>Aktywator skrzepu i żel do separacji surowicy</td></tr><tr><td>Aneksyna V bufor</td><td>wiążący BD Biosciences</td><td>556454</td><td>10x; przed użyciem rozcieńczyć do 1x.</td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do substratów TMB</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>Zestaw zawiera nadtlenek wodoru i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB)</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td>MirVana Pomoc</td></tr><tr><td>w izolacji RNA na bazie poliwinylopirolidonu</td><td>Life Technologies</td><td>AM9690</td><td>Środek do izolacji roślinnego RNA zawiera poliwinylopirolidon (PVP), który wiąże się z polisacharydami.</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia RNA</td><td>Qiagen Inc.</td><td>74004</td><td>Zestaw do oczyszczania RNA MinElute przeznaczony jest do oczyszczania do 45&nbsp; &mu; g RNA.</td></tr><tr><td>Komora plazmowa</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi Sp. z o.o.</td>Skaner biurkowy <td>S-4300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hewlett-Packard Company</td><td>Photosmart B110</td><td>Wykonano 8-bitowe kolorowe obrazy. Można również korzystać z aparatów fotograficznych i smartfonów.</td></tr><tr><td>System rejestracji obrazu</td><td>J& H Technology Co</td><td>GeneSys G:BOX Chemi-XX8</td><td>wykonano 16-bitowe obrazy fluroscecji. Można również stosować mikroskopy fluroscecyjne.</td></tr></tbody></table>

papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), błoniaste cząsteczki uwalniane z różnych typów komórek, mają duży potencjał do zastosowań klinicznych. Zawierają kwas nukleinowy i białko i są coraz częściej uznawane za środek komunikacji międzykomórkowej wykorzystywany zarówno przez komórki eukariontyczne, jak i prokariotowe. Jednak ze względu na ich niewielkie rozmiary, obecne protokoły izolacji pojazdów elektrycznych są często czasochłonne, kłopotliwe i wymagają dużych objętości próbek oraz drogiego sprzętu, takiego jak ultrawirówka. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy papierową platformę immunoaffinity do rozdzielania podgrup EV, która jest łatwa, wydajna i wymaga objętości próbki już od 10 μl. Próbki biologiczne można pipetować bezpośrednio do papierowych stref testowych, które zostały chemicznie zmodyfikowane cząsteczkami wychwytującymi, które mają wysokie powinowactwo do określonych markerów powierzchniowych EV. Walidujemy test za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), papierowych testów immunoenzymatycznych (P-ELISA) i analizy transkryptomu. Te papierowe urządzenia umożliwią badanie pojazdów elektrycznych w warunkach klinicznych i badawczych, aby pomóc w lepszym zrozumieniu funkcji pojazdów elektrycznych w zdrowiu i chorobie.

Zdolność urządzenia papierowego do efektywnej izolacji podgrup EV zależy od czułego i specyficznego rozpoznawania markerów powierzchniowych EV. Stabilną modyfikację włókien papieru cząsteczkami wychwytującymi uzyskuje się z wykorzystaniem chemii awidyna-biotyna, zgodnie z opisem zamieszczonym w innych publikacjach28-30. Skuteczność koniugacji chemicznej oraz metody fizysorpcji jest oceniana przy użyciu odczytów fluorescencyjnych. Strefy testowe na papierze przygotowuje się zgodnie z krokiem 1) protokołu, z wyj...

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), małych błoniastych cząsteczek uwalnianych z komórek, z zaledwie 10 μl próbek surowicy. Takie podejście pozwala obejść potrzebę ultrawirowania, wymaga tylko kilku minut czasu na oznaczenie i umożliwia izolację EV od próbek o ograniczonej objętości.

Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu platformy papierowej. Osiąga się to najpierw poprzez laminowanie dwóch arkuszy polistyrenu z okrągłymi wycinkami z papieru celulozowego, wyrównanymi w matrycy zarejestrowanych otworów przelotowych. Drugim krokiem jest chemiczna koniugacja cząsteczek, które wiążą pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, z papierową strefą testową.Następnie próbkę biologiczną można nanieść pipetą bezpośrednio na papierową strefę testową, a pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są izolowane po etapie płukania. Ostatnim krokiem jest charakterystyka wychwyconych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu mikroskopii elektronowej, testu ELISA lub analizy transkryptomicznej. W rezultacie można oczyścić i skoncentrować subpopulacje pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek surowicy o objętości już 10 µL.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ultramentracja, jest to, że jest ona znacznie łagodniejsza i prostsza w wykonaniu. Procedurę zaprezentuje student studiów magisterskich. Rozpocznij od dwóch arkuszy polistyrenu i wykonaj w nich układ okrągłych wycięć.Każdy z nich powinien mieć średnicę mniejszą niż pięć milimetrów, uzyskaną za pomocą ręcznego dziurkacza lub automatycznego plotera tnącego CAD. Dodatkowo, za pomocą dziurkacza wytnij serię papierowych dysków chromatograficznych o średnicy pięciu milimetrów. Połóż arkusz polistyrenu na blacie i nałóż pojedynczy papierowy dysk na każdy z odpowiadających mu otworów przelotowych.Umieść papierowe krążki pomiędzy warstwami, dopasowując i nakładając drugą arkusz polistyrenu. Sprawdź ogólne wyrównanie przed złączeniem warstw w laminatorze termicznym. Następnie rozpocznij chemiczną modyfikację powierzchni krążków papierowych, umieszczając zalaminowane urządzenie w komorze plazmowej.Krótko aktywować powierzchnię papieru plazmą tlenową; natychmiast po zwolnieniu próżni w komorze przenieść urządzenie papierowe do roztworu cyllanów i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar cyllanów, płucząc urządzenie 5 mL 200-procentowego etanolu.Następnie inkubować urządzenie w roztworze łącznika A-G-M-B-S przez 15 minut. Ustawić temperaturę pokojową. Usunąć nadmiar cząsteczek łącznika poprzez obfite płukanie etanolem.Następnie inkubuj urządzenie z avadonom przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C i usuń niezwiązany avadonom, przemywając je 5 mL PBS. Urządzenie można następnie poddać etapowi wiązania przeciwciał lub, w razie potrzeby, przechowywać w temperaturze 4 °C przez cztery tygodnie. Po przyczepieniu Aden nanieś pipetą 10 µL roztworu blokującego na odsłonięte obszary papierowych dysków i inkubuj papier przez 10 minut.W temperaturze pokojowej powtórz dodawanie 10 µL roztworu blokującego oraz 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Aby zakończyć biofunkcjonalizację odsłoniętego podłoża papierowego, nanieś pipetą 10 µL biotynilowanych cząsteczek wychwytujących na krążki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako cząsteczki wychwytujące można zastosować przeciwciała anty-CD63 lub anksynę 5. Powtórz proces pipetowania 10 µL oraz 10-minutowej inkubacji.Powtórzyć czynność jeszcze dwa razy po przyłączeniu cząsteczek wychwytujących. Usunąć nadmiar grup funkcyjnych poprzez pipetowanie 10 µL odpowiedniego buforu płuczącego na każdy papierowy krążek.Inkubować płukanie przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie powtórzyć etapy płukania 10 µL oraz jednej minutowej inkubacji jeszcze dwa razy. W pełni funkcjonalne urządzenie papierowe jest teraz gotowe do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z surowicy lub ciała szklistego. W przypadku przetwarzania surowicy: zebrać 10 mL krwi obwodowej do probówki typu vacutainer i delikatnie odwrócić probówkę pięć razy.Ustaw probówkę w pozycji pionowej i odczekaj 30 minut. W temperaturze pokojowej odwiruj próbkę krwi przez 15 minut. Ustaw temperaturę pokojową.Przenieś górną, klarowną warstwę surowicy do czystej plastikowej probówki, a dolną fazę półstałą odrzuć. Oczyść surowicę poprzez wirowanie z większą prędkością przez 30 minut. Ustaw temperaturę pokojową.Przenieś nadsącz do nowej probówki i usuń drobne cząstki, przepuszczając nadsącz przez filtr 0,8 µm. Otrzymane przefiltrowane serum można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mają zostać wyizolowane z cieczy wodnistej oka, należy pobrać ją od pacjentów bezpośrednio za pomocą procedur inwazyjnych i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.Do momentu użycia próbki ciała szklistego nie wymagają etapów filtracji ani klarowania. Aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z surowicy lub cieczy wodnistej, nanieś pipetą 5 µL próbki biologicznej na każdy biofunkcjonalizowany papierowy dysk podłoża. Inkubuj naniesioną próbkę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie powtórz proces pipetowania 5 µL oraz jedną minutę inkubacji.Powtórz tę czynność jeszcze dwa razy. Po wiązaniu powinowactwa wypłucz niezwiązane pęcherzyki, pipetując najpierw 10 µL odpowiedniego buforu do mycia. Inkubuj bufor przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie powtórz mycie 10 µL i następującą po nim inkubację. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. przechwycone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są teraz gotowe do kolejnych analiz downstream. Aby unieruchomić przechwycone pęcherzyki na funkcjonalizowanym podłożu papierowym, nanieś pipetą 10 µL utrwalacza Karnofsky'ego w stężeniu 0,5 x na każdy papierowy dysk. Pozostaw reakcję sieciowania w temperaturze pokojowej na 10 minut, a następnie przemyj wszystkie dyski obfitymi ilościami PBS przez pięć minut. Następnie odwodnij podłoża papierowe, stosując kolejno następujące przemycia.Jedna inkubacja w 35% etanolu, dwie inkubacje w 50% etanolu, dwie inkubacje w 70% etanolu, dwie inkubacje w 95% etanolu oraz cztery inkubacje w 100% etanolu. Podczas każdego pojedynczego przemywania należy pozostawić roztwór etanolu na papierowych krążkach w temperaturze pokojowej na 10 minut. Gdy urządzenie papierowe będzie całkowicie suche, należy napylić na próbki 18 nanometrową warstwę złota i palladu przy użyciu napylacza metalicznego.Wprowadź próbkę do skaningowego mikroskopu elektronowego i przeprowadź obrazowanie przy napięciu 5 kV, aby zapobiec nadmiernemu ładowaniu próbki biologicznej, w celu wykrycia wychwyconych pęcherzyków za pomocą testów immunoanalitycznych. Rozpocznij od naniesienia 5 µL przeciwciała pierwszorzędowego anty-CD9 na każdy papierowy dysk i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Usuń wszystkie niewiążące przeciwciała, przemywając urządzenie papierowe 30 mL PBS w temperaturze pokojowej poprzez wytrząsanie mechaniczne.Następnie nanieś pipetą 5 µL sprzężonego z peroksydazą chrzanową przeciwciała wtórnego na każdy papierowy dysk i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Przemyj urządzenie 30 mL PBS poprzez wytrząsanie mechaniczne, aby usunąć nieswoiście związane przeciwciała wtórne.Na koniec nanieś pięć µL mieszaniny substratu kolorymetrycznego na każdy papierowy dysk. Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut, a następnie zeskanuj powstałą zmianę intensywności koloru plamki za pomocą skanera biurkowego. Aby rozpocząć, odizoluj poszczególne papierowe dyski z urządzenia głównego, wycinając nadmiar laminatu polistyrenowego za pomocą nożyczek lub żyletki.Każdy papierowy krążek należy umieścić w czystej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mililitra. Następnie należy zlizować wychwycone pęcherzyki, dodając 265 mikrolitrów buforu do lizy oraz 35 mikrolitrów nośnika do usuwania polisacharydów na bazie PVP do każdej probówki, a następnie energicznie wymieszać w wstrząsarze typu vortex.Aby zapewnić całkowitą lizę pęcherzyków i uwolnienie cząsteczek RNA, należy dodać 30 µL roztworu homogenatu do lizatu, wymieszać go w wirówce wortex i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Następnie do lizatu należy dodać 330 µL mieszaniny kwasowego fenolu i chloroformu, aby zapewnić prawidłowy rozdział fazowy RNA od białek i DNA, a następnie intensywnie mieszać w wirówce wortex przez co najmniej 15 sekund każdą probówkę. Probówkę należy odwirować z maksymalną prędkością przez pięć minut.W temperaturze pokojowej przenieś zawierającą RNA górną fazę wodną do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i odrzuć dolną fazę organiczną. Do RNA dodaj 1,25 objętości wodnej 100% etanolu i krótko wymieszaj na wirówce typu vortex. Następnie nanieś mieszaninę na komercyjną kolumnę do ekstrakcji RNA w fazie stałej.Wiruj probówkę przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i odrzuć frakcję przepływową. Przemyj kolumnę, dodając 700 µL roztworu roboczego nr 1, odwiruj probówkę przez 5–10 sekund i odrzuć ciecz przepływową.Następnie przemyj kolumnę 500 µL roztworu roboczego. Po drugie, wiruj probówkę przez 5–10 sekund. Odlej przesącz i powtórz płukanie jeszcze raz.Usunąć pozostałości etanolu, wirując próbkę przez ostatnią minutę w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść wysuszoną kolumnę ekstrakcyjną do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 µL podgrzanej wody wolnej od RNA. Wirować probówkę z maksymalną prędkością przez 5–10 s i, jeśli uznane za konieczne, usunąć górną kolumnę ekstrakcyjną.Skoncentruj i dodatkowo oczyść RNA EIT, korzystając z komercyjnego zestawu do oczyszczania RNA z wykorzystaniem biotyny znakowanej fluorescencyjnie jako reportera do immobilizacji powierzchniowej. Skuteczność i specyficzność protokołu funkcjonalizacji papieru można ocenić, porównując wysoką fluorescencję uzyskaną na powierzchni zmodyfikowanej czynnikiem sieciującym z niefunkcjonalizowanymi powierzchniami papieru.Ponadto, gdy cząsteczkę reporterową zastąpiono biotynilowanym przeciwciałem anty-CD 63, prawidłowo funkcjonalizowane podłoże papierowe umożliwi wyższy wskaźnik wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w porównaniu z papierowym podłożem kontrolnym ujemnym. W przypadku unieruchomienia różnych cząsteczek wychwytujących na podłożach papierowych, różne podgrupy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wykazują zróżnicowane rozkłady wielkości przy użyciu urządzenia papierowego. Można również przeprowadzić analizę zawartości RNA wewnątrz pęcherzyków oraz zawartości specyficznych białek powierzchniowych pęcherzyków.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak izolować i badać poziom zewnątrzkomórkowy przy użyciu urządzenia papierowego.

paper-based-devices-for-isolation-characterization-extracellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Urządzenia na bazie papieru do izolowania i charakteryzowania pozakomórkowych wezykuł

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Prezentowany jest protokół do produkcji papierowego urządzenia do skutecznego wzbogacania i izolowania mikropęcherzyków i egzosomów.

Wstępna koncentracja i izolacja mikropęcherzyków i egzosomów na podstawie papieru

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z małych próbek surowicy za pomocą papierowej platformy bez ultrawirówki. Technika ta umożliwia szybką analizę EV z zaledwie 10 μl surowicy.

Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów