Papierowe urządzenia do izolacji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą platformy papierowej. Osiąga się to poprzez uprzednie laminowanie dwoma arkuszami polistyrenu z okrągłą celulozą, wycinankami z papieru wyrównanymi na szeregu zarejestrowanych otworów przelotowych. Drugim krokiem jest chemiczna koniugacja cząsteczek, które wiązałyby pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ze strefą testową papieru.

Następnie próbkę biologiczną można pipetować bezpośrednio na papierową strefę testową, a pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są izolowane po etapie płukania. Ostatnim krokiem jest scharakteryzowanie wychwyconych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej, Elizy lub analizy transkryptomicznej. Ostatecznie podzbiory pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z zaledwie 10 mikrolitrów próbek surowicy można oczyścić i zagęścić.

Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ultra edukacja, jest to, że jest ona bardzo delikatna w montażu i prosta do wykonania. Demonstracja procedury będzie studentem studiów magisterskich. Zaczynając od dwóch arkuszy styropianu, utwórz szereg okrągłych wycięć.

Każdy z nich ma średnicę mniejszą niż pięć milimetrów za pomocą ręcznego dziurkacza lub cad, automatycznego plotera tnącego. Ponadto wytnij serię chromatografii o średnicy pięciu milimetrów, papierowe krążki z dziurkaczem. Umieść jeden arkusz styropianu na stole i nałóż pojedynczy krążek papierowy na każdy odpowiedni otwór przelotowy.

Ułóż krążki papierowe warstwowo, rejestrując i nakładając drugi arkusz styropianu. Sprawdź ogólne wyrównanie przed sklejeniem kanapki w laminatorze termicznym. Następnie rozpocznij chemiczne modyfikacje powierzchni na papierowych krążkach, wkładając laminowane urządzenie do komory plazmowej.

Krótko aktywuj powierzchnię papieru plazmą tlenową po uwolnieniu próżni w komorze, natychmiast przenieś urządzenie papierowe do roztworu cyliny i inkubuj przez 30 minut. Ustaw temperaturę pokojową. Usuń nadmiar pasów cy, przepłukując urządzenie pięcioma mililitrami 200-procentowego etanolu.

Następnie inkubuj urządzenie z roztworem łącznika A-G-M-B-S przez 15 minut. Ustaw temperaturę pokojową. Usuń nadmiar cząsteczki łącznika za pomocą dużej ilości płukanek etanolem.

Następnie inkubuj urządzenie z avadonem przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usuń niezwiązany avadon za pomocą pięciomililitrowego płukania PBS. Urządzenie może następnie przejść do etapu wiązania przeciwciał lub być przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery tygodnie, jeśli zajdzie taka potrzeba. Po dołączeniu Aden odpipetuj 10 mikrolitrów roztworu blokującego na odsłonięte obszary papierowego dysku i inkubuj papier przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej powtórzyć dodawanie 10 mikrolitrów roztworu blokującego i 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Jeszcze dwa razy, aby zakończyć biofunkcjonalizację odsłoniętego podłoża papierowego, odpipetować 10 mikrolitrów biotynylowanych cząsteczek wychwytujących na dyski i inkubować przez 10 minut W temperaturze pokojowej dla pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wybrane cząsteczki wychwytujące mogą być przeciwciałami anty CD 63 lub xin pięć. Powtórzyć proces pipetowania 10 mikrolitrów i 10-minutową inkubację.

Jeszcze dwa razy po wychwyceniu przyczepienia cząsteczki. Zmyć nadmiar ugrupowań pipetując. 10 mikrolitrów odpowiedniego buforu do płukania na każdy krążek papierowy.

Inkubować pranie przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i powtórzyć 10 mikrolitrów prania i jednominutowe etapy inkubacji jeszcze dwa razy. W pełni funkcjonalne urządzenie papierowe jest teraz gotowe do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z surowicy lub cieczy wodnistej do przetwarzania surowicy. Zbierz 10 mililitrów krwi obwodowej do probówki próżniowej i delikatnie odwróć probówkę pięć razy.

Umieść probówkę w pozycji pionowej i odczekaj 30 minut. Ustaw temperaturę pokojową, odwiruj próbkę krwi przez 15 minut. Ustaw temperaturę pokojową.

Przenieś górną warstwę przezroczystej surowicy do czystej plastikowej probówki i wyrzuć dolną fazę półstałą. Klarować surowicę przy większej prędkości wirowania przez 30 minut. Ustaw temperaturę pokojową.

Przenieść supernatant do świeżej probówki i usunąć drobne cząstki, przepuszczając supernatant przez filtr 0,8 mikrometra. Powstałą przefiltrowaną surowicę można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jeśli pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mają zostać wyekstrahowane z humoru, należy pobrać ciecz wodnistą od pacjentów bezpośrednio za pomocą procedur inwazyjnych i przechowywać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Do czasu użycia nie są potrzebne żadne etapy filtracji ani klarowania w przypadku próbek ciała szklistego. Aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z surowicy lub cieczy wodnistej, należy odpipetować punktowo pięć mikrolitrów próbki biologicznej na każdy krążek z biofunkcjonalizowanym podłożem papierowym. Inkubować miejsce przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i powtórzyć proces pipetowania pięciu mikrolitrów i jednominutową inkubację.

Jeszcze dwa razy Po związaniu powinowactwa spłukać niezwiązane pęcherzyki, najpierw pipetując 10 mikrolitrów odpowiedniego buforu do płukania. Inkubować bufor przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i powtórzyć mycie 10 mikrolitrami, a następnie inkubację. Krok jeszcze dwa razy.

Uchwycone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są teraz gotowe do kolejnych testów w celu utrwalenia wychwyconych pęcherzyków na funkcjonalizowanej pipecie z papierowym nośnikiem 10 mikrolitrów 0,5 x utrwalacz Karnofsky'ego na każdym krążku papierowym. Pozwól reakcji sieciowania przebiegać w temperaturze pokojowej przez 10 minut i płucz wszystkie krążki dużą ilością PBS przez pięć minut. Następnie odwodnić podłoża papierowe, nakładając kolejno następujące prania.

Jedna inkubacja 35% etanolu, dwie inkubacje 50% etanolu, dwie inkubacje 70% etanolu, dwie inkubacje 95% etanolu i cztery inkubacje 100% etanolu. Przy każdym pojedynczym myciu pozwól roztworowi etanolu inkubować się na papierowych krążkach w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Gdy urządzenie papierowe jest suche jak kość, napyl próbki 18-nanometrową warstwą palladu, złota w metalowym napylaczu.

Włóż próbkę do skaningowego mikroskopu elektronowego i wykonaj mikroskopię przy pięciu kilowoltach, aby zapobiec nadmiernemu ładowaniu próbki biologicznej w celu wykrycia wychwyconych pęcherzyków za pomocą testów immunologicznych. Zacznij od dodania pięciu mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego anty CD nine na każdy krążek papierowy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Usunąć wszystkie niezwiązane przeciwciała, myjąc urządzenie papierowe 30 mililitrami PBS o temperaturze pokojowej przez mechaniczne mieszanie.

Następnie odpipetować pięć mikrolitrów sprzężonego przeciwciała drugorzędowego peroksydazy chrzanowej na każdym papierze. Krążek i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Umyć urządzenie 30 mililitrami PBS przez mechaniczne mieszanie w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.

Na koniec dodaj pięć mikrolitrów mieszaniny koloru i substratu metrycznego na każdy papier. Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut i zeskanuj wynikową zmianę intensywności koloru plamki za pomocą skanera biurkowego. Na początek odizoluj poszczególne papierowe krążki od urządzenia zbiorczego, odcinając obszary nadmiaru laminatu polistyrenowego za pomocą nożyczek lub żyletki.

Umieść każdy papierowy krążek w czystej mikrowirówce o pojemności 1.5 mililitra. Dwa lys wychwycone pęcherzyki, dodając 265 mikrolitrów buforu do lizy. I 35 mikrolitrów nośnika do usuwania polisacharydów na bazie PVP do energicznie wiru każdej rurki.

Aby zapewnić całkowite pęcherzyki, lizę i usunięcie uwolnionych cząsteczek RNA, dodaj 30 mikrolitrów roztworu homogenatu do wiru lizatu, aby wymieszać i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Następnie dodaj 330 mikrolitrów mieszaniny kwaśnego chloroformu fenolowego do lizatu, aby zapewnić prawidłowe oddzielenie RNA od obu białek i wiru DNA przez co najmniej 15 sekund na probówkę. Wirować probówkę na pełnych obrotach przez pięć minut.

W temperaturze pokojowej przenieś RNA zawierające górną fazę wodną do świeżej 1,5 mililitrowej probówki i odrzuć dolną fazę organiczną. Dodaj 1,25 objętości 100% etanolu o wartości wodnej do RNA i krótko zmieszaj, aby wymieszać. Następnie nanieść mieszaninę na komercyjną kolumnę do ekstrakcji RNA w postaci stałej.

Odwirować probówkę przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ przez frakcję. Przemyć kolumnę, dodając 700 mikrolitrów roztworu roboczego. Po pierwsze, odwiruj probówkę przez pięć do 10 sekund i wyrzuć przepływ.

Następnie umyj kolumnę 500 mikrolitrami roztworu roboczego. Po drugie, odwiruj probówkę przez pięć do 10 sekund. Wylej przepływ i powtórz pranie jeszcze raz.

Usuń resztki etanolu z ostatnią minutą odwirowania w temperaturze pokojowej i przenieś wysuszoną kolumnę ekstrakcyjną do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanej wody wolnej od R RNA. Odwirować probówkę z pełną prędkością przez pięć do 10 sekund i wyrzucić górną kolumnę ekstrakcyjną, jeśli uzna to za konieczne.

Skoncentruj i dalej oczyść RNA EIT za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia RNA przy użyciu fluorescencyjnie znakowanej biotyny. Jako reporter mobilizacji na powierzchni. Skuteczność i swoistość protokołu funkcjonalizacji papieru można zobaczyć, porównując wysoką fluorescencję występującą na powierzchni modyfikowanej środkiem sieciującym z niefunkcjonalizowanymi powierzchniami papieru.

Co więcej, gdy cząsteczka reporterowa zostanie zastąpiona biotynylowanym przeciwciałem anty CD 63, odpowiednio funkcjonalizowany substrat papierowy ułatwi wyższą szybkość wychwytywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w porównaniu z ujemnym substratem papierowym. Kiedy różne cząsteczki wychwytujące są unieruchomione na podłożach papierowych, różne podgrupy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydają się wykazywać różne rozkłady wielkości za pomocą urządzenia papierowego. Można również oznaczać zarówno zawartość RNA w pęcherzu, jak i obfitość białek powierzchniowych specyficznych dla pęcherzyków.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i zaspokajać wzrost w zewnątrzkomórkowych obszarach za pomocą urządzenia na papierze.