Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Ogólnym celem tej procedury jest ocena pierwszych konsekwencji mutacji w czynnikach inicjacji translacji bez ingerencji nowo transkrybowanego mRNA lub problemów z wydajnością transfekcji, często występujących w badaniach komórek eukariotycznych. Osiąga się to poprzez pierwszą syntezę zmutowanego typu dzikiego i kontroli lub mRNA GFP z odpowiednich plazmidów. Następnie zsyntetyzowane RNA jest mikrowstrzykiwane do cytów XUS Lavis w szóstym etapie, a ich dojrzewanie jest stymulowane progesteronem.

Następnie dojrzewanie cytów ocenia się za pomocą wizualizacji rozpadu pęcherzyków rozrodczych, a niektóre składniki kaskady kinazy MA, których aktywacja zależy od ekspresji białka mchu, są analizowane za pomocą western blot. Na koniec badana jest poliadenylacja mRNA mchu i inne mRNA niezbędne do odzyskania miozy cytów XPO. Ostatecznie kinetyczne dojrzewanie cytów.

Analizy Western blot i poliadenylacji są stosowane w celu wykazania potencjalnego wpływu ekspresji białka, gdy czynnik inicjacji translacji jest zmutowany. Główną przewagą tej techniki nad naszymi istniejącymi metodami lub odtworzonym układem komórkowym wyekstrahowanym na równi z retikulocytami zarodkowymi lub króliczymi jest to, że skutki mutacji wprowadzonej w MR. NA będzie szybko obserwowalny i łatwo badany w kilku opłatach xop. Cyty: Bardziej ogólnie.

Model ten ma tę zaletę, że jest prosty dzięki pojedynczym gigantycznym komórkom, a jego zastosowanie prowadzi do uzyskania znacznej ilości materiału do eksperymentów biochemicznych. Proces ten jest również efektywny czasowo w porównaniu ze stabilnym wytwarzaniem linii komórkowych. To miso może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad tłumaczeniem, takie jak lepsze zrozumienie roli określonych dziedzin czynników acji lub badanie splicingu tych czynników.

Po raz pierwszy dodaliśmy pomysł na tę metodę, gdy chcieliśmy zbadać wpływ zmutowanego czynnika inicjacji translacji na syntezę białek bez ingerencji w transkrypcję. W ten sposób unikamy potencjalnych pętli sprzężenia zwrotnego między tymi dwoma mechanizmami ome. Rzeczywiście, transkrypcja materiału jest przechowywana i umieszczana.

Translacja może być wywołana za pomocą progesteronu Po wypróżnieniu, cyty xus lavos i przygotowanie CRN zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 10 x mopy i 6,6% formaldehydu, aby odlać 1,5% żel AROS. Przygotuj próbki w probówce o pojemności 0,2 mililitra z 8,8% formaldehydu, 60 procentdla AMIDU 0,1 objętości 10 x mopy i jeden mikrolitr CRNA inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez trzy minuty i umieścić probówki na lodzie na 10 minut. Odwirować próbki w temperaturze 5 000 razy G przez kilka sekund przed dodaniem dwóch mikrolitrów buforu ładującego żel.

Uruchom próbki pod napięciem 90 woltów przez 20 minut, aby pogardzać żelem. Namocz go na noc w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie przeanalizuj go, aby sprawdzić jakość CNA.

Użyj spektrofotometru, aby określić stężenie CNA i przechowuj próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przeprowadzenia mikroiniekcji RNA. Użyj pożywki ND 96, aby wypełnić zeskrobaną szalkę Petriego jedną do dwóch godzin po defoliacji. Ułóż cyty wzdłuż zeskrobanego pasa w naczyniu.

Następnie za pomocą mikropipety kapilarnej ze złamaną końcówką umieszczoną pod kątem 45 stopni. Włóż końcówkę kapilarną na głębokość około 150 do 200 mikronów w strefę równikową poniżej pigmentowanego obszaru zwierzęcia. Wstrzyknij 30 nanogramów CRNA w 60 nanolitrach do pierwszego oocytu.

Następnie odczekaj od pięciu do 10 sekund przed wyjęciem końcówki kapilarnej, aby zapobiec wyciekaniu próbki. Aby wstrzyknąć następny cyt, ręcznie przesuń naczynie. Przenieś wstrzyknięte cyty do 24-dołkowych płytek hodowlanych wypełnionych trzema mililitrami pożywki ND 96 i poprowadź je w temperaturze 19 stopni Celsjusza, aby wywołać dojrzewanie mitotyczne.

Inkubować oocyty w ND 96 z dwoma mikrogramami na mililitr progesteronu lub PG w temperaturze 19 stopni Celsjusza przez 15 godzin. Przetestuj wpływ translacji dzikich typu EIF 4G one CRNA na zmutowany fenotyp zgodnie z protokołem tekstowym. Aby określić zakres rozpadu pęcherzyków zarodkowych pod mikroskopem stereoskopowym.

Policz liczbę dojrzałych cytów po stymulacji PG przez obecność białej plamki na czarnym biegunie zwierzęcia. Powtarzaj liczenie co godzinę do 24 godziny, aby przeprowadzić zachodnią analizę krwi. Wykonując ruchy w przód iw tył końcówki mikropipety w temperaturze czterech stopni Celsjusza, homogenizuj 10 cytów w 200 mikrolitrach pokazanego tutaj buforu.

Odwirować próbki w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut, aby wyekstrahować frakcję cytoplazmatyczną znajdującą się w środku. Faza górnej frakcji odpowiadającej lipidom, a dolnej resztkom komórkowym. Zebrać frakcję cytoplazmatyczną i przechowywać podwielokrotność w celu określenia stężenia białka.

Połącz pozostałą ilość w stosunku jeden do jednego z buforem próbki lamely lub Biss przed uruchomieniem strony SDS i western blotting. Zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przeprowadzić test wentylacji poliawencyjnej, umieść pięć cytów na stan w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach fuge z jednym mililitrem wolnego od nukleaz jednego XPBS umyj cyty.

Następnie pod wyciągiem użyj zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyizolować RNA. Po sprawdzeniu integralności RNA i określeniu stężenia, należy przygotować dwie mieszaniny ligacyjne na warunek CRNA z następującymi odczynnikami do pierwszej mieszaniny. Dodaj RNA z cytów niestymulowanych pg i do drugiej mieszaniny.

Dodaj RNA z oocytów stymulowanych PG. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut. Aby dezaktywować enzym za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji CD NA.

Dla każdej próbki należy przygotować wymienioną tutaj mieszaninę RT. Dodać 10 mikrolitrów wcześniej przygotowanej reakcji ligacji i wykonać RT zgodnie z instrukcjami producenta po przeprowadzeniu PCR, stosując następującą mieszaninę reakcyjną i warunki do każdej reakcji przy czterech mikrolitrach buforu ładującego i uruchomić 10 mikrolitrów każdej próbki na 3% żelu agros przy 110. Na koniec przeanalizuj żel po 10 i 20 minutach, aby zaobserwować zmianę wielkości odzwierciedlającą długość ogona poliA, a tym samym dojrzewanie RNA, co jest warunkiem wstępnym ich translacji.

Jak pokazano tutaj, dojrzewanie kinetyczne oocytów mikroiniekowanych w warunkach kontrolnych jest podobne do typu dzikiego, z podobną liczbą poddawanych GVBD po 12 i 24 godzinach od stymulacji PG, 24 godziny po stymulacji PG. Odsetek oocytów osiągających dojrzałość jest podobny dla grupy kontrolnej typu dzikiego, a także wody i GFP, co wskazuje, że mikroiniekcja wodą lub kontrolą lub EIF 4G one CRNA miała niewielki wpływ na mikroiniekcję mięśni oocytów z dominującym ujemnym EIF 4G, jednak skutkowała dramatycznym spadkiem GVBD nawet po stymulacji PG. Rysunek ten pokazuje, że wadę dojrzewania można przywrócić CRNA typu dzikiego, ponieważ stosunek typu dzikiego do dominującego ujemnego EIF 4G o jeden CRNA wzrasta.

Podobnie jak procent cytów, które dojrzewają zgodnie z oczekiwaniami. Nie wykrywa się endogennej ekspresji mchu przy braku stymulacji PG i nadekspresji EIF 4G, jeden dominujący ujemny ma niewielki wpływ na endogenny mech zgodnie z wcześniejszymi wynikami. Ponadto Aurora AEEG two, która działa przed indukcją mchu, nie wykazuje dowodów na deregulację białka lub jego fosforylowaną formę indukowaną po stymulacji PG.

I odwrotnie, fosforylacja irk two, która jest indukowana przez mech, jest hamowana w obecności dominującego ujemnego EIF 4G. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie przekraczać 120 nanolitrów CNA o stężeniu poniżej określonych nanogramów Postępując zgodnie z tą procedurą.

Chociaż można przeprowadzić analizę profilowania polisomów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie, takie jak określenie, które RNA może być słabo lub wysoce translowane.