Name: Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo sygnalizacji wapnia indukowanej nikotyną i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa. Technika ta umożliwia analizę mechanizmów pre- i postsynaptycznych w obwodzie hipokampowo-łuskowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yehui Qin i Mallory Myers za wsparcie techniczne. Dziękujemy również dr Sigismundowi Huckowi za dostarczenie nam przeciwciała anty-α4-ECD. Praca ta jest wspierana przez grant National Institutes of Health NS22061 dla L. W. R.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Publikacje NIH nr 80-23, poprawione 2012), a badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt dla Badań na Uniwersytecie Stony Brook (#1618 i #1792).
1. vHipp-nAcc Synaptyczne Kokultury
<ol>
	<li>Myszy ofiarne (dzień po urodzeniu 0 - 3, z transgenicznej linii myszy typu dzikiego (WT) lub α7 nAChR) z CO2. Odetnij głowę każdemu szczeniakowi i zachowaj ogon w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu genotypowania post facto. Wykonaj następujące czynności w wysterylizowanym kapturze.</li>
	<li>Usuń górną część czaszki nożyczkami i kleszczami, aby odsłonić cały mózg. Zaczynając od miejsca, w którym kora mózgowa oddziela się od siebie doogonowo, uzyskaj przekrój koronalny, który zawiera tylną korę, w tym vHipp5,21 pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Wypreparuj paski tkanki vHipp zawierające region CA1-subiculum zgodnie z rozwijającym się atlasem mózgu myszy22 (ryc. 1A). Przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm zawierającego zimne pożywki (4 °C), pokroić w małe cienkie plasterki (około 100 μm × 100 μm mikroplasterki).</li>
	<li>Wstępnie inkubować szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm pokrytych poli-D-lizyną/lamininą w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych z pożywką hodowlaną (~ 500 μl) przez co najmniej 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Usunąć podłoże przed posiewem mikroplastrów.</li>
	<li>Płytka z polerowaną ogniowo pipetą Pasteura na środku szkiełka nakrywkowego z minimalną ilością podłoża (~ 50 μl, zawierające ~ 20 sztuk mikroplastrów) w celu ułatwienia mocowania eksplantatów. Płytki vHipp mikroplastry pochodzące od pojedynczego zwierzęcia (genotyp +/+ lub -/- transgenicznej linii α7) na każdym szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Po tym, jak eksplantaty osiądą na szkiełku nakrywkowym, delikatnie dodaj dodatkowe podłoża (~ 100 μl) przy ścianie, tak aby poziom podłoża był wystarczająco wysoki, aby całkowicie pokryć eksplantaty na obrzeżach, ale nie te w środku szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Po inkubacji O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 należy rozproszyć neurony nAcc od 18 dnia embrionalnego do 1 dnia po urodzeniu myszy WT i dodać do eksplantatów.
	<ol>
		<li>Wypreparuj tkanki nAcc zgodnie z rozwijającym się atlasemmózgu myszy 20 (ryc. 1B).</li>
		<li>Pokrój na małe kawałki (około 500 μm × 500 μm mikroplasterki) i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Traktować 0,25% trypsyną (2 ml) przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Umyć kawałki tkanki trzykrotnie zimnym środkiem myjącym (5 ml, 4 °C), a następnie raz przemyć w zimnej pożywce hodowlanej (5 ml, 4 °C). Pozostawić zawiesinę na 5 minut na każdym etapie płukania, a następnie ostrożnie wylać supernatant.</li>
		<li>Dysocjację komórek przez delikatne rozcieranie w 2 ml pożywki hodowlanej za pomocą lekko wypolerowanej pipety Pasteura.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do innej probówki o pojemności 15 ml i odwirować z prędkością 2 000 x prędkość obrotową przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce w stężeniu 1 ml na 6 młodych. Rozproszyć komórki, kilkakrotnie delikatnie pipetując w pożywce za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura.</li>
		<li>Dodać 0,25 ml rozproszonych komórek nAcc do każdego szkiełka nakrywkowego z eksplantatami vHipp.</li>
		<li>Utrzymuj kultury w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umieść płytki hodowlane na zwilżonych sterylnych gazikach, aby mechanicznie ustabilizować i utrzymać wilgotność, ułatwiając tworzenie synaps.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Utrwal kultury (5 - 7 dni in vitro) w 4% paraformaldehydzie/4% sacharozy/PBS (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 20 min, RT).</li>
	<li>Kultury przepuszczalne należy przepuszczać za pomocą 0,25% Triton X-100/ PBS (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 5 min, RT).</li>
	<li>Blokuj hodowle z 10% normalną surowicą osła w PBS (~ 500 μl na szkiełko nakrywkowe, 30 min, RT) przed barwieniem przeciwciał. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi O/N w temperaturze 4 °C. Stosować następujące przeciwciała pierwszorzędowe: anty-nAChRs (α4-ECD 1:500; anty-α5 podjednostek, 1:500), przeciwpęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (1:250), anty-GAD65 (1:100).</li>
	<li>Wypłukać przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą PBS (3 razy/~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 5 min), a następnie inkubować kultury w przeciwciałach drugorzędowych skoniugowanych z Alexa 488 (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 1:500) lub Alexa 594 (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 1:500) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Inkubować kultury w αBgTx sprzężone z Alexa 594 (~500 μl na szkiełko nakrywkowe, 1:1,000 w pożywce hodowlanej) przez 45 minut w temperaturze 37 °C przed utrwaleniem w celu znakowania powierzchni α7*nAChRs.</li>
	<li>Zamontuj i uszczelnij szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektywy planapochromatyczne (20X z 0,8 NA lub 63X olej z 1,4 NA) i kamerę CCD.</li>
</ol>
3. Fuzja pęcherzykowa na bazie FM1-43
<ol>
	<li>Utrzymuj hodowle (5 - 7 dni in vitro) w komorze obrazowania, zamontuj komorę na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem. Ciągły perfuzja (1 ml/min) z koktajlem HBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zatrzymaj perfuzję i załaduj kultury za pomocą 10 μM FM1-43 w 56 mM K+ ACSF (~500 μl) przez 90 sekund (barwienie), zmyj zewnętrzny barwnik przez 15 minut za pomocą Ca2+ free HBS zawierającego ADVASEP-7 (0,1 mM), aby usunąć FM1-43 związany z błoną.</li>
	<li>Stymulować kultury za pomocą 56 mM K+ ACSF (~500 μl) bez FM1-43 przez 120 sekund (odbarwienie), ponownie załadować kultury za pomocą FM1-43 w tych samych warunkach i ponownie przemywać za pomocą Ca2+ free HBS zawierającego ADVASEP-7 przez 15 min.</li>
	<li>Rejestruj obrazy fluorescencyjne FM1-43 za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem wyposażonym w obiektyw planapochromatyczny (60X woda o 1,4 NA, wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm) i rejestruj obrazy za pomocą kamery CCD.</li>
	<li>Zbierz wyjściowe obrazy fluorescencji FM1-43 (co 2 s przez 1 min) jako kontrolę przed nikotyną; zastosuj nikotynę (1 μM) przez szybką perfuzję (2 ml / min) przez 1 minutę, a następnie wypłucz nikotynę koktajlem HBS. Rób zdjęcia poklatkowe przed, w trakcie i po aplikacji nikotyny co 2 sekundy przez 5 minut.</li>
	<li>Określ ilościowo intensywność fluorescencji FM1-43 przed (barwienie F) i po (barwienie F) zastosowaniu nikotyny w każdym bulionie synaptycznym.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą ilość uwalnialnej fluorescencji FM1-43 wzdłuż aksonów vHipp, określając ilościowo różnicę intensywności fluorescencji FM1-43 przed i po zastosowaniu nikotyny (ΔF =barwienie F-Fodbarwienie). Przeanalizuj frakcję spadku intensywności fluorescencji po nikotynie za pomocą następującego równania:F spadek% =barwienie ΔF/F.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wapnia
<ol>
	<li>Szybko przepłukać kultury (5 - 7 dni in vitro) normalnym HBS, a następnie załadować kultury 5 μM wskaźnikiem Fluo-4 Ca2+ (ester AM) i 0,02% Pluronic F-127 w HBS (2 ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wypłukać roztwór Fluo-4 HBS (3 razy/5 min). Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (37 °C / 5% CO2 ) przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Utrzymuj hodowle w tej samej komorze obrazowania i w tych samych warunkach, jak opisano w sekcji fuzji pęcherzykowej opartej na FM1-43 (patrz krok 3.1).</li>
	<li>Zbieraj obrazy fluorescencyjne Fluo-4 projekcji aksonalnych z mikrowarstw vHipp za pomocą obiektywu planapochromatycznego (60X woda z 1,4 NA, wzbudzenie 488 nm, emisja 530 nm) i kamery CCD.</li>
	<li>Zbierz wyjściowe obrazy fluorescencji Fluo-4 (co 10 sekund przez 2 minuty) jako kontrolę przed nikotyną, zastosuj nikotynę (1 μM) przez szybką perfuzję (2 ml / min) przez 1 minutę, a następnie wypłucz nikotynę koktajlem HBS. Rób zdjęcia poklatkowe przed, w trakcie i po aplikacji nikotyny co 10 sekund przez 30 minut.</li>
	<li>Zapisz wszystkie klatki surowych obrazów fluorescencji fluo-4, wyeksportuj jako serię obrazów w formacie TIFF w celu dalszej analizy.</li>
	<li>Zbierz zintegrowaną intensywność fluorescencji fluo-4 wzdłuż aksonów vHipp przed i po aplikacji nikotyny.</li>
	<li>Znormalizuj zintegrowaną intensywność fluorescencji za pomocą następującego równania: ΔF/F0 = (F-F0)/F0, gdzie F0 to zintegrowana intensywność fluorescencji sprzed nikotyny z korektą tła, a F jest zintegrowaną intensywnością fluorescencji wzdłuż aksonów vHipp w każdym punkcie czasowym po zastosowaniu nikotyny. Analizuj i wykreślaj znormalizowaną zintegrowaną intensywność fluorescencji.</li>
</ol>

<ol><li>Changeux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+nicotinic+receptors%3A+structure+and+regulation%2C+role+in+learning+and+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement.</a> Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).</li>
<li>Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor+subtypes+and+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor subtypes and cognitive function.</a> J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).</li>
<li>Dani, J. A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptors+and+nicotinic+cholinergic+mechanisms+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).</li>
<li>Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+receptors+and+depression%3A+revisiting+and+revising+the+cholinergic+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).</li>
<li>Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+elicits+prolonged+calcium+signaling+along+ventral+hippocampal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons.</a> PloS one. 8 (12), e82719(2013).</li>
<li>McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+enhancement+of+fast+excitatory+synaptic+transmission+in+CNS+by+presynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors.</a> Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).</li>
<li>Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+synaptic+transmission+enhanced+by+low+concentrations+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine.</a> Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).</li>
<li>Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha+7-+and+beta+2-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+modulate+excitatory+amino+acid+release+from+rat+prefrontal+cortex+nerve+terminals+via+distinct+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms.</a> Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).</li>
<li>Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+nicotinic+receptors+evoke+endogenous+glutamate+and+aspartate+release+from+hippocampal+synaptosomes+by+way+of+distinct+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).</li>
<li>Zappettini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+nicotinic+alpha7+and+non-alpha7+receptors+stimulate+endogenous+GABA+release+from+rat+hippocampal+synaptosomes+through+two+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action.</a> PloS one. 6 (2), e16911(2011).</li>
<li>Fabian-Fine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+distribution+of+the+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus.</a> J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).</li>
<li>Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+bungarotoxin-1.4+nm+gold%3A+a+novel+conjugate+for+visualising+the+precise+subcellular+distribution+of+alpha+7%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).</li>
<li>Nashmi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).</li>
<li>Drenan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological%2C+pharmacological%2C+and+molecular+evidence+for+alpha7-nicotinic+acetylcholine+receptors+in+rat+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons.</a> J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).</li>
<li>Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+beta2+subunit-containing+and+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors+differentially+control+glutamatergic+and+cholinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling.</a> J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).</li>
<li>Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+changes+induced+by+different+presynaptic+nicotinic+receptors+in+separate+populations+of+individual+striatal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals.</a> J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).</li>
<li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+alpha4%2A+nicotinic+receptors+revealed+by+superecliptic+phluorin%3A+effects+of+a+beta4+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+mutation+and+chronic+exposure+to+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li>
<li>Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+trafficking+and+up-regulation+of+nicotinic+ACh+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).</li>
<li>St John, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+of+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors.</a> Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+type+III+neuregulin+1+is+required+for+sustained+enhancement+of+hippocampal+transmission+by+nicotine+and+for+axonal+targeting+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).</li>
<li>Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobowitz%2C+DM+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+the+Developing+Mouse+Brain%22">Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain</a>. , CRC Press. New York. (1998).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).</li>
<li>Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+fluorescent+styryl+dye+FM1-43+to+visualize+synaptic+vesicles+exocytosis+and+endocytosis+in+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals.</a> Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).</li>
<li>Garduno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+alpha4beta2+nicotinic+acetylcholine+receptors+increase+glutamate+release+and+serotonin+neuron+excitability+in+the+dorsal+raphe+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus.</a> J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).</li>
<li>Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+and+exogenous+ACh+activates+different+nicotinic+receptors+to+enhance+evoked+glutamatergic+transmission+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus.</a> J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).</li>
<li>Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nicotine+on+spiking+activity+and+Ca2%2B+dynamics+of+dendritic+spines+in+rat+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany preparat do współhodowli rekapituluje brzuszne obwody hipokampa-półleżącego in vitro. Preparat ten pozwala na stosunkowo proste i wiarygodne badanie profili przestrzennych i czasowych, za pomocą których aktywacja presynaptycznych nAChR wywołuje zwiększoną transmisję glutaminergiczną5, 21.
Hodowle kologiczne definiuje się jako wzrost różnych określonych typów komórek w jednym naczyniu, które mogą zapewnić warunki fizjologiczne in vitro , aby wykazać funkcję<...

Cholinergiczna modulacja pobudliwości obwodów przyczynia się do fundamentalnych aspektów poznania, a zmieniona modulacja cholinergiczna jest cechą zaburzeń neurodegeneracyjnych i neuropsychiatrycznych, w tym choroby Alzheimera, choroby Parkinsona, schizofrenii i uzależnień1-4. Ustalonym mechanizmem cholinergicznego ułatwiania przekaźnictwa synaptycznego w OUN jest bezpośrednia aktywacja nAChR zlokalizowanych w miejscach presynaptycznych. Aktywacja tych receptorów presynaptycznych prowadzi do zwiększenia wewnątrzkomórkowego Ca2+ ([Ca2+]i) w zakończeniach presynaptycznych – zarówno bezpośrednio, ze względu na stosunkowo wysoką przewodność wapniową niektórych podtypów nAChR, jak i pośrednio, poprzez wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne5, zwiększając w ten sposób uwalnianie neuroprzekaźników. W rzeczywistości aktywacja presynaptycznych nAChR została powiązana ze zmianami w uwalnianiu szerokiej gamy neuroprzekaźników, w tym glutaminianu, GABA, ACh i dopaminy6-10. Chociaż proces ten był badany pośrednio przy użyciu metod elektrofizjologicznych w różnych synapsach, optyczne reportery [Ca2 +] i recykling pęcherzyków synaptycznych pozwalają na bardziej bezpośredni i czasowo precyzyjny pomiar zjawisk presynaptycznych.
Presynaptyczna lokalizacja nAChR została przekonująco zademonstrowana dzięki bezpośredniemu immuno-złotemu znakowaniu nAChR na poziomie mikroskopu elektronowego (EM)11,12. Kilka innych technik zostało również wykorzystanych do pośredniego rozwiązania problemu lokalizacji nAChR, w tym wykrywanie lokalizacji chimer białkowych podjednostki nAChRs w hodowanych neuronach13,14, elektrofizjologiczny zapis prądów nAChR w zakończeniach synaptycznych15,16, monitorowanie zmian wywołanych nikotyną w [Ca2 +] i w synaptycznych zakończeniach nerwowych za pomocą obrazowania żywych komórek17oraz pośrednie monitorowanie uwalniania neuroprzekaźników w terminalu synaptycznym za pomocą technik obrazowania żywych komórek ze wskaźnikami fluorescencyjnymi, w tym egzocytozy pęcherzyków synaptycznych oglądanej za pomocą styrylowych amfipatycznych barwników FM (FM1-43 i FM4-64) lub synapto-pHluorin oraz za pomocą specyficznych reporterów neuroprzekaźników fluorescencyjnych, takich jak CNiFER dla ACh i iGluSnFr dla glutaminianu18–20. Ogólnie rzecz biorąc, obecne podejścia do identyfikacji presynaptycznej lokalizacji nAChR są skomplikowane i wymagają specjalnych systemów i technik, aby umożliwić wiarygodną identyfikację i fizjologiczne monitorowanie aktywności presynaptycznej.
Tutaj opisujemy protokoły i sprzęt do systemu kohodowli in vitro obwodu brzusznego hipokampa (vHipp) – jądra półleżącego (nAcc), który zapewnia bezpośredni dostęp do identyfikacji i analizy zarówno pre-, jak i postsynaptycznych komponentów transmisji synaptycznej. Pokazujemy przykłady presynaptycznej lokalizacji nAChR i obrazowania żywych komórek sygnalizacji Ca2 + za pośrednictwem nAChR i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż aksonów vHipp. Naturalnym (i prostym) rozszerzeniem przedstawionego tu protokołu jest przygotowanie kontaktów pre- i postsynaptycznych złożonych z neuronów o różnych genotypach. W ten sposób można bezpośrednio ocenić udział danego produktu genowego w pre- i/lub postsynaptycznych mechanizmach modulacji.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Pożywki hodowlane (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>Suplementy B-27</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. środki myjące (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. Sól fizjologiczna buforowana HEPES&nbsp; (HBS)&nbsp; &nbsp; pH=7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Sigma glukozy</td><td></td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. HBS Koktajl do obrazowania na żywo pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,Sigma</td><td></td> <td>C1016&nbsp;</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Sigma glukozy</td><td></td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tetrodotoksyna&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 &mikro; M</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 & mikro; M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 & mikro; M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 & mikro; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Nie zawiera wapnia&nbsp; HBS&nbsp; &nbsp; pH=7,3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Sigma glukozy</td><td></td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Potas ACSF pH=7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1,3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2,5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26,2 mM</td></tr><tr><td>Sigma glukozy</td><td></td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Trwałe wzmocnienie sygnalizacji aksonalnej i zwiększone uwalnianie neuroprzekaźników poprzez aktywację pre-synaptycznych nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) jest ważnym mechanizmem neuromodulacji przez acetylocholinę (ACh). Trudności w dostępie do sondowania mechanizmów sygnalizacyjnych w nienaruszonych aksonach i zakończeniach nerwowych zarówno in vitro, jak i in vivo ograniczyły postęp w badaniu presynaptycznych składników plastyczności synaptycznej. Tutaj wprowadzamy genowo-chimeryczne przygotowanie obwodu brzusznego hipokampa (vHipp)-półleżącego (nAcc) in vitro, które umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy zarówno pre-, jak i postsynaptycznych składników transmisji, przy jednoczesnej selektywnej różnicowaniu profilu genetycznego neuronów pre- i postsynaptycznych. Pokazujemy, że projekcje z mikroplasterków vHipp, jako presynaptyczne wejście aksonalne, tworzą wiele, niezawodnych synaps glutaminergiczny z celami postsynaptycznymi, rozproszonymi neuronami z nAcc. Wykrywana jest presynaptyczna lokalizacja różnych podtypów nAChR, a presynaptyczna transmisja synaptyczna za pośrednictwem sygnalizacji nikotynowej jest monitorowana przez jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie żywych komórek. Preparat ten zapewnia również informacyjne podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów glutaminergicznego plastyczności synaptycznej in vitro.

Zastosowany preparat składa się z chimerycznych kokultur genetycznych obwodów vHipp–nAcc in vitro. Projekcje wychodzące z mikropłatków vHipp, stanowiące presynaptyczny wkład aksonalny, mogą tworzyć kontakty synaptyczne z celami postsynaptycznymi, którymi są rozproszone neurony nAcc. Nikotyna wywołała trwałe (≥ 30 min) ułatwienie transmisji glutaminergicznej z neuronów nAcc unerwionych przez aksony vHipp21 oraz przedłużone sygnalizowanie wapniowe wzdłuż aksonów vHipp5 za pośrednictwem presyn...

Opracowaliśmy genowo-chimeryczny preparat brzusznego obwodu hipokamp – półleżący in vitro, który umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy presynaptycznych mechanizmów transmisji synaptycznej za pośrednictwem nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR). Preparat ten zapewnia również pouczające podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów plastyczności synaptycznej.

Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie w układzie in vitro preparatu chimerycznego genu dla obwodu brzusznego hipokampa i jądra półleżącego, który umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu identyfikacji i analizy komponentów przed- i postsynaptycznych przekazywania synaptycznego. Cel ten osiąga się poprzez wycięcie w pierwszej kolejności pasków tkanki brzusznej części hipokampa zawierających obszar CA1. W drugim kroku paski brzusznej części hipokampa przecina się na małe, cienkie plastry, a następnie wysiewa te mikroplastry na środku szkiełka podstawowego w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek i inkubuje przez noc.Następnie wypreparuj jądro półleżące z tkanek mózgu. Ostatnim krokiem jest dysocjacja pasków jądra półleżącego do postaci rozproszonych neuronów przy użyciu trypsyny, a następnie dodanie neuronów jądra półleżącego do szkiełek podstawowych z posianymi implantami brzusznej części hipokampa i inkubacja przez pięć do siedmiu dni. Ostatecznym celem jest analiza presynaptycznej lokalizacji nikotynowych receptorów acetylocholiny oraz zależnego od tych receptorów sygnalizowania wapniowego i uwalniania neuroprzekaźników.Aksony brzusznego hipokampa można zidentyfikować i monitorować za pomocą obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Główną zaletą tej techniki jest to, że preparat kokultury neuronów z mikropłatków tkanek pozwala na łatwe rozpoznanie ich przedsynaptycznych aksonów oraz postsynaptycznych celów. Preparat kokultury odtwarza in vitro obwód brzusznego hipokampa do jądra akumens.Umożliwia to bezpośrednie obrazowanie na żywo przedsynaptycznego i postsynaptycznego przedziału lub obu jednocześnie. Ta preparatyka synaptyczna in vitro pozwala na obrazowanie z wysoką rozdzielczością przestrzennych i czasowych efektów aktywacji receptorów presynaptycznych w transmisji synaptycznej glutaminergicznej. W rezultacie można uzyskać informacje o mechanizmach przed- i postsynaptycznych przyczyniających się do plastyczności synaptycznej glutaminergicznej przed pobraniem tkanki.Przed inkubacją umieścić 12 milimetrowe szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej z 500 µL pożywki hodowlanej w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut. Następnie usunąć pożywkę przed wysianiem mikropłatków w celu pobrania tkanki do hodowli. Usunąć sklepienie czaszki, aby odsłonić cały mózg każdego uśpionego szczenięcia pod mikroskopem stereoskopowym.Zaczynając od miejsca, w którym kory mózgowe rozdzielają się od siebie, wykonaj przekrój czołowy obejmujący tylne części kory, w tym brzuszne pola hipokampa. Następnie wypreparuj tkanki brzusznego hipokampa zawierające regiony CA1. Po tym czasie przenieś tkanki do 35 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej zimne medium hodowlane.Następnie pokrój tkanki na mniejsze, cienkie plasterki. Przenieś plasterki wypaloną nad ogniem pipetą pasterską na środek szkiełka nakrywkowego. Dodaj 50 µL pożywki, aby ułatwić przyleganie eksplantów.Następnie nanieś mikroplastry brzusznej części hipokampa na szkiełko nakrywkowe. Po tym, jak eksplantaty X osiądą na szkiełku, ostrożnie dodaj 100 µL dodatkowej pożywki przy ściance, tak aby poziom medium był wystarczająco wysoki, by całkowicie pokryć eksplantaty na obwodzie, ale nie te w centrum szkiełka. Następnie inkubuj eksplantaty przez noc w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przed dyspersją neuronów jądra półleżącego. Teraz pobierz tkanki jądra półleżącego od myszy linii wild-type z okresu od 18. dnia embrionalnego do pierwszego dnia po urodzeniu, potnij je na małe kawałki, a następnie przenieś do probówki o pojemności 15 ml.Tkaniny traktować 2 mL 0,25% trypsyny przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie tkaniny przemyć trzykrotnie 5 mL pożywki do mycia w temperaturze 4 °C, pozwalając zawiesinie odpocząć przez 5 minut w każdym etapie płukania. Następnie tkaniny przemyć w 5 mL pożywki hodowlanej w temperaturze 4 °C.Następnie zdysocjuj komórki poprzez delikatne potraktowanie ich dwiema mililitrami pożywki hodowlanej za pomocą lekko wypalonej pipety Pasteura. Po tym etapie przenieś zawiesinę komórkową do innej probówki o pojemności 15 mililitrów i wiruj przy 2000 RPM przez pięć minut. Po pięciu minutach usuń supernatant i resuspenduj komórki w pożywce hodowlanej w ilości jeden mililitr na sześć pups, a następnie rozprosz komórki, delikatnie pipetując pożywkę kilka razy wypaloną pipetą Pasteura.Na koniec nanieś 25 ml zawiesiny komórek z jądra odpowiedzialnych za przyleganie na każde szkiełko podstawowe z eksplantami brzusznej części hipokampa. Umieść płytki hodowlane na zwilżonych, sterylnych gazikach, aby mechanicznie je ustabilizować i utrzymać wilgotność w celu ułatwienia tworzenia się synaps. Następnie inkubuj płytki w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C.W tej procedurze należy przenosić hodowle do komory obrazowania pojedynczo. Zamocuj komorę w konfokalnym mikroskopie z dyskiem wirującym. Przez cały czas przepływu perfunduj próbkę koktajlem HBS z prędkością 1 ml/min w temperaturze pokojowej.Następnie należy zatrzymać perfuzję i zabarwić kulturę 10 µM FM 1 43 w 56 mM potasowym A CSF przez 90 sekund. Potem należy wypłukać barwnik zewnętrzny przez 15 minut za pomocą HBS wolnego od wapnia, zawierającego 0,1 mM ADVASE 7. Po tym czasie należy odstymulować kulturę 56 mM potasowym A CSF bez FM 1 43 przez 120 sekund.Do detekcji. Ponownie załaduj kulturę barwnikiem FM 1 43 w tych samych warunkach i ponownie przemyj bezwapniowym buforem HBS zawierającym A-D-V-A-S-E-P seven przez 15 minut. Następnie wykonaj obrazy fluorescencyjne FM 1 43 za pomocą konfokalnego mikroskopu dyskowego (spinning disk) wyposażonego w obiektyw plan-apochromatyczny i zarejestruj obrazy za pomocą kamery CCD.Należy zarejestrować bazowe obrazy fluorescencyjne FM 1 43 co dwie sekundy przez jedną minutę w ramach kontroli przed podaniem nikotyny. Następnie należy podać nikotynę w stężeniu 1 µM poprzez szybką perfuzję z przepływem 2 mL/min przez jedną minutę, a następnie wypłukać nikotynę koktajlem HBS. Należy kontynuować rejestrację obrazów w trybie time-lapse przed, w trakcie i po podaniu nikotyny co dwie sekundy przez pięć minut.Na tym etapie szybko opłucz kultury zwykłym HBS. Następnie inkubuj kultury z pięciomikromolarnym wskaźnikiem wapnia fluo-4 i 0,02%onic F1 27 w 2 mL HBS przez 30 minut w temperaturze 37°C i przy 5% CO2. Po tym czasie wypłucz roztwór fluo-4 za pomocą HBS, powtarzając tę czynność 3 razy, przy czym każde płukanie powinno trwać pięć minut.Przenieś hodowle z powrotem do inkubatora na co najmniej 30 minut. Następnie przenoś hodowle pojedynczo do komory obrazowania. Postępuj w tych samych warunkach, które opisano w procedurach fuzji pęcherzykowej opartych na FM 1 43.Należy zebrać bazowe obrazy fluorescencyjne axonal projections z brzusznych mikroskrawków hipokampa przy użyciu flu oh four jako kontrolę przed podaniem nikotyny. Następnie należy podać 1 µM nikotyny poprzez szybką perfuzję z przepływem 2 mL/min przez 1 minutę, a następnie wypłukać nikotynę koktajlem HBS. Obrazy time-lapse należy rejestrować przed, w trakcie i po podaniu nikotyny co 10 sekund przez 30 minut.Rysunek ten bezpośrednio wykazuje, że projekcje z brzusznych mikrokrawków hipokampa są glutaminergiczne i że kontakty są nawiązywane z rozproszonymi neuronami GABAergicznymi. W neuronach kolczystych średniej wielkości z jądra półleżącego stwierdzono obecność zarówno receptorów nikotynowych acetylocholiny alpha seven, jak i nie alpha seven wzdłuż aksonów brzusznego hipokampa, a konkretnie w miejscach, w których projekcje brzusznego hipokampa kontaktują się z neuronami jądra półleżącego. Należy zauważyć, że rozproszone neurony z jądra półleżącego nie wykazują ekspresji receptorów nikotynowych acetylocholiny alpha seven, co oznacza, że skupiska receptorów w miejscach kontaktów są ściśle presynaptyczne.Obrazy poklatkowe fluorescencji wapniowej Fluo-4 wzdłuż aksonów brzusznej części hipokampa zarejestrowano za pomocą obiektywu immersyjnego z wodą o powiększeniu 60x co 10 sekund przez 30 minut przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Pozyskane obrazy przedstawiono w skali pseudokolorów i odtworzono w formie wideo z prędkością dwóch klatek na sekundę. Niniejszy materiał wideo przedstawia indukowaną aplikacją nikotyny trwałą aktywność fluorescencji wapniowej Fluo-4 wzdłuż żywych aksonów brzusznej części hipokampa u osobników typu dzikiego.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wysiewaniu mikrofragmentów brzusznej części hipokampa w minimalnej objętości pożywki oraz o utrzymywaniu płytek hodowlanych na wilgotnych podkładkach wzrostowych. Kroki te są krytyczne dla przylegania mikrofragmentów, wyrastania projekcji oraz tworzenia synaps. Dzięki temu współhodowla pozwala na oddzielną modyfikację genotypów wlotów presynaptycznych oraz ich celów postsynaptycznych.Ponadto pozwala to na selektywną ekspresję genów egzogennych w każdym z przedziałów niezależnie. Stwarza to ogromny potencjał dla analizy mechanizmów plastyczności synaptycznej w obrębie elementów presynaptycznych i postsynaptycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, w jaki sposób generować chimeryczne kokultury synaptyczne, które odtwarzają obwód łączący brzuszną część hipokampa z jądrem półleżącym.Następnie można zastosować techniki obrazowania na żywo, aby przeanalizować neurony przed- i postsynaptyczne.

live-imaging-nicotine-induced-calcium-signaling-neurotransmitter

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie na żywo sygnału wapniowego indukowanego nikotyną i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż wentralnych aksonów hipokampu

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Ten film pokazuje proces przygotowania tkanek brzusznego hipokampa i jądra półleżącego z mózgów myszy do wspólnej hodowli. Neurony wydłużają projekcje, tworząc połączenia synaptyczne między tkankami brzusznego hipokampa i jądra półleżącego. Metoda ta pozwala na badanie interakcji neuronalnych między tymi dwoma regionami mózgu, oferując wgląd w funkcje poznawcze, zachowanie i zaburzenia neurologiczne.

Współhodowla brzusznego hipokampa i jądra półleżącego

Ten film pokazuje, jak aktywacja nikotynowych receptorów acetylocholiny w brzusznym hipokampie myszy za pośrednictwem nikotyny powoduje trwałą sygnalizację wapniową wzdłuż aksonów.

Obrazowanie sygnalizacji wapniowej indukowanej nikotyną wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa w kokulturach synaptycznych

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Źródło: Lark, A. R., et. al., Podejście do funkcjonalnego obrazowania mózgu in vivo oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin. J. Vis. exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą Greena bioluminescencja białka fluorescencyjnego i aequoryny w głębokich strukturach mózgu .

Obrazowanie bioluminescencyjne do badania stanów przejściowych wapnia w strukturach mózgu Drosophila

Ten artykuł przedstawia metodę badania nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) w wycinkach mózgu myszy poprzez uwalnianie nikotyny. W połączeniu z jednoczesnym rejestrowaniem za pomocą klamry krosowej i 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, odblokowanie nikotyny łączy funkcję receptora nikotynowego z morfologią komórki, zapewniając głębsze zrozumienie neurobiologii cholinergicznej.

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę obrazowania na żywo sygnalizacji wapnia indukowanej nikotyną i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa. Technika ta umożliwia analizę mechanizmów pre- i postsynaptycznych w obwodzie hipokampowo-łuskowym.

Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

Przeglądaj więcej filmów