Name: In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj dynamikę aktywacji mikrogleju w jaskrze myszy przy użyciu nieinwazyjnego konfokalnego obrazowania oftalmoskopowego CSLO. Ta metoda umożliwia śledzenie zmian morfologicznych komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Naukowemu Instytutowi Obliczeń i Obrazowania Uniwersytetu Utah za korzystanie z oprogramowania FluoRender (R01GM09815). Prace te były wspierane przez granty z Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation oraz US National Institute of Health, (R01EY020878 i R01EY023621) dla M.L.V. oraz (R01EY017182 i R01EY017950) dla B.K.A.

Obrazowanie in vivo jest wykonywane w obiektach wolnych od patogenów przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Utah. 
UWAGA: Ten protokół obrazowania jest stosowany u myszy reporterowych, u których mikroglej siatkówki i naciekające monocyty/makrofagi wyrażają białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą locus receptora fraktalkiny (CX3CR1).
1. Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki GFP+ za pomocą konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO)
<ol>
	<li>Włącz system ogrzewania sterowany wodą, ustawiony tak, aby ustabilizował temperaturę myszy w zakresie 35-37 ºC podczas zabiegu i podłącz dwie poduszki grzewcze.
	<ol>
		<li>Uruchom system konfokalnego skaningowego oftalmoskopu laserowego (cSLO) (Rysunek 2A). Otwórz program cSLO, wprowadź informacje, które pozwolą zidentyfikować pojedynczą mysz i ustaw krzywiznę rogówki na 2 mm (menu Dane pacjenta).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj się do obrazowania. Bezpiecznie zamontuj czystą soczewkę obiektywu szerokokątnego 55º w gnieździe. Przygotuj platformę do obrazowania oftalmoskopowego, zabezpieczając poduszkę grzewczą pokrytą czystym papierem. Użyj klipsów, aby spłaszczyć podkładkę i papier i nie dopuścić do tego, aby blokowały ruch soczewki obiektywu.</li>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1,3% 2,2,2-tribromoetanolu i 0,8% alkoholu tert-amylowego (250 mg/kg masy ciała; 0,5 ml/25 g masy ciała) za pomocą igły 301/2 G umieszczonej w jednorazowej strzykawce o pojemności 1 ml. Umieść mysz z powrotem w klatce, trzymanej nad poduszką grzewczą. 
	UWAGA: Podawanie środka znieczulającego przez wstrzyknięcie w porównaniu z inhalacją umożliwia łatwiejsze ustawienie myszy do obrazowania i niezakłócony dostęp do oczu, bez stożków nosowych i rurek.</li>
	<li>Gdy zwierzę przestanie się poruszać i nie będzie reagować na szczypanie ogona, należy wywołać rozszerzenie źrenicy za pomocą tropikamidu i fenylefryny (po 0,5%), ustawiając zwierzę w pozycji leżącej i zakrywając oba oczy kroplami na 7 minut.</li>
	<li>Po 5 minutach połóż mysz na brzuchu na środku platformy oftalmoskopowej i załóż soczewki kontaktowe na oba oczy, wywierając minimalny nacisk. 
	UWAGA: Soczewki kontaktowe są małe i delikatne, ale można z nimi ostrożnie obchodzić się palcami, chociaż zamiast nich można użyć kleszczyków40. Stosowanie soczewek kontaktowych jest opcjonalne, ale zalecane, ponieważ minimalizuje suchość oczu i zachowuje przezroczystość rogówki podczas obrazowania.</li>
	<li>Po 7 minutach ustaw mysz tak, aby prawe oko było skierowane w stronę soczewki obiektywu, a orbita była równoległa do soczewki obiektywu, trzymając zwierzę nieskrępowane w pobliżu krawędzi platformy (rysunek 2B). Aby uzyskać obrazy o porównywalnym nasyceniu i orientacji, należy stale utrzymywać odległość od oka do soczewki obiektywu, a także wyrównanie oka do ścieżki światła podczas sesji obrazowania. Przytnij długie wąsy przeszkadzające w obserwacji oka. 
	UWAGA: Przez następne 8-10 minut mysz nie będzie się ruszać ani mrugać i będzie oddychać delikatnymi ruchami, które są śledzone przez tryb cSLO Eye Tracking ART (automatyczny czas rzeczywisty), który dostosowuje pozycję głowicy skanującej na podstawie punktów orientacyjnych dna oka o wysokim kontraście. Po tym czasie myszy zaczynają dyszeć i mrugać, co sprawia, że obrazowanie jest niepraktyczne.</li>
	<li>Jeśli obrazowanie jest wykonywane bez użycia soczewek kontaktowych, krople PBS należy nakładać na oba oczy co 2-3 minuty, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
	<li>Zbierz obraz dna oka układu naczyniowego siatkówki i tarczy nerwu wzrokowego, skoncentrowany na wewnętrznej siatkówce.
	<ol>
		<li>Wybierz tryb podczerwieni (IR) i dostosuj ustawienia do wzbudzenia 820 nm, 100% mocy lasera, 40-60% czułości (rysunek 2C).</li>
		<li>Pracując w trybie dużej prędkości (12,6 klatki/s), zlokalizuj oko za pomocą joysticka do sterowania oftalmoskopem. Przy małym powiększeniu należy sprawdzić rogówkę i soczewkę pod kątem uszkodzeń lub zmętnienia i wykluczyć z badania oczy z wadami lub urazami, które będą miały wpływ na obrazowanie siatkówki (ryc. 3A).</li>
		<li>Zlokalizuj obszar tarczy nerwu wzrokowego (powierzchnia głowy nerwu wzrokowego, ONH), zbliżając obiektyw do oka, a następnie wyśrodkuj na nim obraz i zablokuj tę pozycję, przykręcając joystick. To ustawienie oka względem oftalmoskopu jest kluczem do uzyskania równomiernej ostrości i emisji na obrazie.</li>
		<li>Wizualizuj wewnętrzne płaszczyzny siatkówki, a także ONH, używając głównych naczyń krwionośnych znajdujących się na powierzchni ciała szklistego siatkówki jako referencyjnej płaszczyzny ogniskowej (59 i 60 D) lub głębiej (55 D) w oczach pokazujących wykopane tarcze nerwu wzrokowego. Optymalna ostrość powinna rozdzielić krążące krwinki w głównych naczyniach krwionośnych, z wyraźnie wyraźnym światłem i ścianami.</li>
		<li>Zoptymalizuj nasycenie obrazu, regulując pokrętło na panelu sterowania ekranu dotykowego, aż biała aureola równomiernego oświetlenia obejmie większość pola dna oka 55º wokół tarczy nerwu wzrokowego (przy niewielkim prześwietleniu). Następnie zmniejsz nasycenie, aby zoptymalizować kontrast, aż do momentu, gdy komórki krwi poruszające się wzdłuż głównych naczyń krwionośnych będą mogły być wyraźnie rozdzielone. Jeśli ciemne obszary ogniskowe utrzymują się, nie z powodu uszkodzenia siatkówki, ustaw oko w aparacie, aż uzyskasz jednolicie jasny obraz. Ta regulacja ma zasadnicze znaczenie dla uchwycenia powtarzalnych zestawów obrazów w pozycji i jakości.</li>
		<li>Zbierz obraz w podczerwieni centralnej siatkówki (o średnicy 1,4-1,7 mm, w zależności od wieku), średnio 30 klatek w czasie rzeczywistym (4,7 klatki/s; znormalizowane), aby poprawić stosunek sygnału do szumu (rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast uzyskaj obraz fluorescencyjny mikrogleju GFP+ i/lub naciekających monocytów zlokalizowanych w wewnętrznych płaszczyznach siatkówki i ONH. 
	UWAGA: Optymalizacja obrazu dna siatkówki w podczerwieni określa rozdzielczość obrazu fluorescencyjnego komórek GFP+, a także zakres wewnętrznej siatkówki. Brak skupienia wewnętrznych płaszczyzn siatkówki, który można wykryć przez słabą rozdzielczość układu krwionośnego, spowoduje przyciemnienie widoków komórek GFP+ (Figura 3B). Brak prawidłowej i równomiernej regulacji nasycenia IR wpływa na obraz fluorescencyjny (FA), wprowadzając sztuczne zmiany w intensywności i wielkości komórek GFP+ (Figura 3C).
	<ol>
		<li>Przełącz na tryb obrazowania fluorescencyjnego (FA) na panelu ekranu dotykowego, używając niebieskiego wzbudzenia laserowego 488 nm (zestaw filtrów barierowych 460-490 nm) i ustawień akwizycji (100% mocy lasera i czułości 100-125%), które są utrzymywane na stałym poziomie dla wszystkich myszy (rysunek 2E).</li>
		<li>Zbierz pojedynczy, dwuwymiarowy obraz fluorescencyjny siatkówki w punkcie xy i natychmiast uchwyć obraz dna oka w identycznej pozycji (średnia ze skanu 100x; kąt skanowania 55º dla obu obrazów; Rysunek 2F).</li>
		<li>Uchwyć obraz wielopunktowy, wybierając opcję "kompozyt" na panelu sterowania (Rysunek 2G) i przesuwając oftalmoskop w prawo i w lewo, przesuwając siatkówkę w poprzek osi nosowo-skroniowej (Rysunek 2H). 
		UWAGA: Po zeskanowaniu pojedynczego obrazu w punkcie xy (średnia ze skanu 100x) oprogramowanie automatycznie uśrednia nowe skany tych samych i nowych obszarów (oznaczonych zielonym kółkiem podczas optymalnego skanowania lub czerwonym, gdy skanowanie jest niewykonalne) i łączy wszystkie pozycje xy w czasie rzeczywistym. Uzyskany obraz złożony ma zakres 1,5-1,7 mm w osi poziomej x 3-4 mm w osi pionowej (kąt skanowania 55º x 120-124º).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pełne obrazowanie każdej myszy w ciągu 15 minut po wywołaniu znieczulenia, przed mrugnięciem i ponownym uruchomieniem ruchu.</li>
	<li>Zdejmij soczewki kontaktowe, nawilż oczy PBS i włóż zwierzę z powrotem do ogrzanej klatki, sprawdzając zachowanie, aż do pełnego odzyskania ruchliwości.</li>
	<li>W przypadku badań podłużnych z zastosowaniem przerywanych sesji obrazowania cSLO u tej samej myszy, należy powtórzyć obrazowanie w odstępie nie krótszym niż 3 dni, aby uniknąć skumulowanej toksyczności znieczulenia, a także podrażnienia rogówki.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie i analiza obrazu na żywo
<ol>
	<li>Sekwencyjne wyrównywanie obrazu:
	<ol>
		<li>Wyrównaj obrazy dna oka dla serii czasowej tego samego oka, używając układu naczyniowego i tarczy nerwu wzrokowego jako punktów orientacyjnych. Otwórz wszystkie obrazy w komercyjnym programie do prezentacji pokazów slajdów, przeciągając każdy obraz na poprzedni, aż ich tarcze wzrokowe zrównają się na płaszczyźnie xy (górny obraz wydaje się półprzezroczysty podczas przeciągania), a następnie obróć górny obraz, aż jego główne naczynia krwionośne nałożą się na unaczynienie na obrazie poniżej (skup się na naczyniach najbardziej oddalonych od tarczy nerwu wzrokowego). Zapisz kąt obrotu dla każdego obrazu i zapisz ten szereg czasowy do wykorzystania w przyszłości, śledząc tożsamość myszy i oka.</li>
		<li>Wyrównaj odpowiednią serię obrazów fluorescencyjnych z pojedynczym punktem xy, stosując zarejestrowany kąt, aby skorygować obrót x-y w każdym punkcie czasowym, za pomocą programu do edycji grafiki rastrowej. Dodatkowo dostosuj rozdzielczość do 300 dpi (bez przeskalowania) i tło (w trybie RGB wybierz Poziomy i pobierz światło naczynia krwionośnego jako czarne). Zapisz te obrazy jako pliki TIF, dodając "wyrównany" do ich nazw.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Segmentacja komórek mikrogleju:
	<ol>
		<li>Aby zidentyfikować komórki GFP+ w centralnej siatkówce, otwórz w FluoRender "wyrównany" plik TIF odpowiadający najwcześniejszemu punktowi czasowemu/wiekowi. Powiększ obraz, aby dopasować go do ekranu, a następnie zdefiniuj widok renderowania (kompozytowy, ortogonalny, interpolowany) i jego właściwości (gamma 0,58, punkt nasycenia 255, luminancja 255, 195 alfa i 1,00 cieniowanie), zaznaczając oba kanały RG jako widoczne (ukryj kanał B, klikając go dwukrotnie w ramce przestrzeni roboczej; Rysunek 4A).</li>
		<li>Aby zaznaczyć poszczególne komórki, należy określić próg kanału koloru czerwonego (musi być podświetlony w ramce obszaru roboczego), zwiększając dolny próg do momentu, aż większość komórek zostanie zamaskowana (kolor biały) z minimalnym nakładaniem się i procesami komórkowymi (kolor niebieskozielony), zachowując stały wysoki próg (255). Dolna wartość progowa waha się od 100 do 170, w zależności od intensywności fluorescencji (rysunek 4B).</li>
		<li>Zapisz ten widok z widocznym tylko czerwonym kanałem (polecenie Przechwyć) jako nowy plik TIF, dodając "cellsegm" do jego oryginalnej nazwy (Rysunek 4C). Korzystając z ogólnego edytora grafiki rastrowej, odwróć skalę szarości i dostosuj rozdzielczość do 300 dpi, jak powyżej, a następnie zapisz ponownie jako RGB (Rysunek 4D). 
		UWAGA: Usuń foldery (projekty) utworzone automatycznie przez FluoRender i zapisz zastosowany próg do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Segmentacja i morfometria somy mikrogleju:
	<ol>
		<li>Aby zidentyfikować somaty komórkowe GFP+ w celu ilościowego określenia obszaru, należy użyć oprogramowania do analizy obrazu z automatycznymi pomiarami intensywności i możliwościami progowymi, a także zliczaniem i pomiarem obiektów na podstawie progów. Otwórz plik TIF "cellsegm" i wybierz metodę przeskalowania (splajn) oraz czerwony kanał (kliknij czerwoną zakładkę w RGB). Popraw wizualizację, usuwając zaznaczenie opcji "wyświetl kanał w kolorze" (kliknij prawym przyciskiem myszy czerwoną kartę RGB) i wybierając opcję "uzupełnij kolory" (Obraz/Dostosuj obraz), aby odwrócić skalę szarości i zobaczyć komórki na szarym/czarnym tle na białym tle (Rysunek 4E).</li>
		<li>Skalibruj obraz do 1,4-1,7 mm w zależności od wieku, rysując poziomą linię w poprzek całego obrazu (Kalibracja, Szybka kalibracja).</li>
		<li>Segmentuj somaty poszczególnych komórek, stosując progowanie intensywności (ryc. 4B). W tym celu należy popracować nad czerwonym kanałem RGB i otworzyć funkcję Threshold Intensity (Object Count; wybór polecenia "count update") w celu śledzenia parametrów dwuwymiarowych dla każdego progowego obszaru zainteresowania (ROI) reprezentującego poszczególne somaty.</li>
		<li>Zdefiniuj próg intensywności na histogramie intensywności, wybierając najniższe 50-60% z 255 poziomów i doprecyzowując ostateczną wartość progową, wizualnie oceniając nakładanie się progowej maski koloru (niebieski) i obwodu somy komórki (szary) w poszczególnych komórkach (rysunek 4E).</li>
		<li>Oszacuj dokładność masek soma komórek w celu odwzorowania wymiarów somalnych, mierząc obszar przed i po segmentacji w 10 komórkach i zaakceptuj wybrany zakres progowy, jeśli pomiary różnią się o mniej niż 10% (użyj paska narzędzi binarnych i pomiarów z adnotacjami).</li>
		<li>Ręcznie zidentyfikuj somalne ROI, które zawierają wiele komórek, i oddziel te elementy (wyeliminuj lub oddziel ROI za pomocą kontrolek binarnego paska narzędzi lub katalogu obiektów), jednocześnie włączając/wyłączając plik binarny w celu bezpośredniej wizualizacji komórek (Rysunek 4F).</li>
		<li>Sklasyfikuj komórki mikrogleju jako ROI z obszarami somalnymi większymi i mniejszymi niż 50-60 μm2, aby rozróżnić somaty komórkowe odpowiadające odpowiednio aktywowanemu i dezaktywowanemu mikroglejowi, stosując ograniczenie obszaru. 
		UWAGA: Każdy podzbiór somalny komórki jest identyfikowany za pomocą innej pseudokolorowej warstwy binarnej i może być dalej charakteryzowany dla innych parametrów morfologicznych (obwód, okrągłość itp.), a także określany ilościowo w dyskretnych sektorach siatkówki (Figura 4G). Zapisz analizowany obraz jako plik ND2.</li>
		<li>Zweryfikuj proces i złożoność rozgałęzień w poszczególnych aktywowanych komórkach mikrogleju, nakładając maskę somalną i pojedynczy obraz punktu xy (kontrast zwiększony o 50%; Rysunek 4H). Ręcznie policz procesy bezpośrednio wychodzące z somy komórki lub zmierz średnicę wielokąta obejmującego trzpień (użyj paska narzędzi binarnych i pomiarów z adnotacjami). 
		UWAGA: Aktywowane komórki nie mają wyrostków lub mają niewiele (<4) i krótkich (<2x średnica somalna), w przeciwieństwie do nieaktywowanych procesów komórkowych, które obejmują rozgałęzioną i rozległą altanę (> 3-10x średnicę somalną) otaczającą ich stosunkowo małą somę.</li>
		<li>Ręczna identyfikacja komórek z somatami mniejszymi niż <20μm2 i/lub ekspresją GFP poniżej granicy wykrywalności, które w związku z tym nie są wykrywane przez progi intensywności. Użyj polecenia Taksonomia w adnotacjach, aby policzyć ręcznie zidentyfikowane elementy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Monitorowanie na żywo liczby komórek mikrogleju i aktywacji morfologicznej podczas choroby neurodegeneracyjnej wymaga zastosowania nieinwazyjnych metod obrazowania, które pozwalają na szczegółową wizualizację cech komórek. Po zobrazowaniu komórki mikrogleju muszą zostać wyizolowane (podzielone na segmenty) w celu przeprowadzenia analizy morfometrycznej przy użyciu wielu etapów progowych w celu oceny wielkości somalnej i/lub złożoności procesu jako odczytów dla aktywacji mikrogleju. W tym protokole opisujemy metody pozysk...

Mikroglej to komórki neuroimmunologiczne, które znajdują się wyłącznie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) od wczesnego rozwoju embrionalnego i przez cały okres dorosłości. Wyposażone w złożony repertuar receptorów, aktywność mikrogleju i niejednorodność regionalna są regulowane przez ich dwukierunkowe oddziaływanie z sąsiednimi neuronami, glejem, barierą krew-mózg i naciekającymi komórkami neurozapalnymi1,2. Podstawowe funkcje mikrogleju przyczyniają się do fizjologicznego utrzymania i naprawy, ponieważ pobierają próbki ze swojego terytorium pod kątem zaburzeń homeostazy3,4. Podczas uszkodzenia lub choroby OUN mikroglej jako pierwszy reaguje na sygnały neuronalne, które następnie wyzwalają ich przejście do reaktywnego fenotypu, zwanego "aktywowanym mikroglejem2,5-7. Aktywacja mikrogleju obejmuje skomplikowany cykl ekspresji genów i białek, które są sprzężone z somą komórkową i procesem zmiany rozmiaru i przebudowy6-9. Aktywacji mikrogleju, a także redystrybucji i grupowaniu komórek może towarzyszyć lokalny ogólny wzrost liczby komórek (określany jako mikroglejoza). Może to wynikać z proliferacji i samoodnawiania komórek, z rekrutacją lub bez rekrutacji monocytów pochodzących z krwi3,4,7,10-14. W szerokim zakresie zależnych od wieku, przewlekłych chorób OUN, utrzymująca się mikroglejoza i aktywacja mikrogleju przebiegają równolegle z progresją choroby15-19. To, w jaki sposób mikroglej wpływa na neurodegenerację, pozostaje niejasne, głównie dlatego, że odgrywają zarówno neuroprotekcyjne, jak i szkodliwe role, które mogą mieć różny wpływ na początek i postęp choroby. Badania obrazowe na żywo mające na celu zrozumienie przewlekłej choroby OUN monitorowały zachowanie mikrogleju w uszkodzonym OUN modeli zwierzęcych i ludzi oraz wykazały, że zmiany mikrogleju są wykrywalne już we wczesnych stadiach choroby15-17,19,20. W związku z tym tak ważne jest opracowanie metod wykrywania i monitorowania aktywacji mikrogleju in vivo.
Nieinwazyjne wykrywanie regionalnych zmian w aktywacji mikrogleju w mózgu zostało uznane za ważny wskaźnik in vivo postępu choroby neurodegeneracyjnej, przy użyciu obrazowania molekularnego lub bioluminescencji i pozytonowej tomografii emisyjnej lub rezonansu magnetycznego18,21,22. Te wysoce ilościowe i nieinwazyjne metody obrazowania molekularnego i jądrowego wykrywają glejozę z rozdzielczością regionalną. Alternatywnie, dwufotonowe obrazowanie konfokalne u myszy CX3CR1GFP / + pozwoliło na obserwację mikrogleju mózgu z rozdzielczością komórkową3,4,9,20,23-28. Jednak takie podejście ogranicza długotrwałą i powtarzającą się obserwację przewlekłych zmian mikrogleju, biorąc pod uwagę potencjalne ryzyko zakłócenia ich zachowania przez nawet minimalnie inwazyjne procedury obrazowania mózgu29. Alternatywnie, siatkówka oferuje optymalne warunki do bezpośredniej wizualizacji in vivo i wielokrotnego monitorowania mikrogleju w nienaruszonej niszy OUN przez cały okres starzenia, po ostrym urazie i potencjalnie podczas przewlekłych chorób neurodegeneracyjnych. W związku z tym ostatnie badania dowiodły wykonalności obrazowania w wysokiej rozdzielczości mikrogleju siatkówki wykazującego ekspresję GFP poprzez dostosowanie konfokalnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (cSLO) do obrazowania żywych myszy CX3CR1GFP / +. Zostało to wykorzystane do śledzenia tygodniowych zmian liczby komórek GFP+ u poszczególnych myszy przez okres do 10 tygodni po ostrym urazie lub nadciśnieniu ocznym30-36.
Rozszerzyliśmy to podejście, aby wykonywać długoterminowe obrazowanie przez kilka miesięcy i ilościowo śledzić zmiany w aktywacji mikrogleju na podstawie wielkości somy za pomocą analizy morfometrycznej. Wielkość somalna została zdefiniowana jako użyteczny wskaźnik aktywacji mikrogleju w badaniach obrazowania na żywo przy użyciu dwufotonowej mikroskopii konfokalnej w wycinkach korowych w celu wykonania obrazowania in vivo mikrogleju CX3CR1-GFP+9. Te i inne badania wykazały również korelację między wielkością somalną a poziomem ekspresji białka Iba1, która również wzrasta wraz z aktywacją9,37. W ten sposób aktywowany mikroglej można zidentyfikować u żywych myszy, a jego liczbę i rozmieszczenie monitorować w czasie podczas zdrowia i choroby OUN.
Ten protokół opisuje metody pozyskiwania i analizy obrazów na żywo cSLO w celu monitorowania liczby komórek mikrogleju, dystrybucji i aktywacji morfologicznej podczas degeneracji komórek zwojowych siatkówki (RGC) (Rysunek 1). W związku z tym w badaniu wykorzystano: 1) mysi model jaskry dziedzicznej (DBA/2J), który ulega zależnej od wieku neurodegeneracji nerwu wzrokowego i siatkówki oraz wykazuje niezwykłą zmienność w postępie choroby między 5 a 10 miesiącem życia38,39, 2) miesięczne obrazowanie cSLO in vivo do długoterminowej wizualizacji komórek GFP+ w siatkówce i niezmielinizowanym nerwie wzrokowym heterozygotycznego Cx3cr1GFP/+ Myszy DBA / 2J w wieku 3-5 miesięcy, 3) analiza obrazowania na żywo poprzez segmentację i progowanie w celu wyizolowania somatów komórkowych i zmierzenia ich powierzchni. Strategie te są stosowane do oceny kinetyki stanów aktywacji mikrogleju siatkówki we wczesnych stadiach jaskry przewlekłej.

<table><tbody><tr><td>Myszy DBA/2J i CX3CR1-GFP/+</td><td>Myszy Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td>000671 i 00582</td><td>są hodowane w domu, wprowadzając nowych hodowców co 3-4 pokolenia, aby zapobiec dryfowi genetycznemu.</td></tr><tr><td>30&frac12; Igła G i strzykawka tuberkulinowa o pojemności 1 ml</td><td>BD, East Rutherford, NJ</td><td>305106 i 309659</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoetanol, alkohol tert-amylowy 99% i bukrem fosforanowy w tabletkach soli</td><td>fizjologicznej Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T48402, 152463 i P4417</td><td>Roztwór avertin (pH 7,3, sterylnie przefiltrowany) muszą być świeżo przygotowanym roztworem lub przechowywanym w temperaturze 4 stopni Celsjusza; C przez okres do 1 tygodnia.</td></tr><tr><td>Terapia cieplna T / Pump</td><td>Gaymar Industries, Orchard Park, NY</td><td>TP-650</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamid 1%</td> <td>Bausch & Lomb, Rochester, NY</td><td>NDC 24208-585-64</td><td></td></tr><tr><td>Soczewki kontaktowe PMMA, krzywa bazowa 1,70, średnica całkowita 3,2 mm, środek o grubości 0,40 mm</td><td>Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, Wielka Brytania</td><td>G003709</td><td>Soczewki są płukane sterylnym PBS i przechowywane w pudełkach polipropylenowych.</td></tr><tr><td>Skaning konfokalny HRA/Spectralis oftalmoskop laserowy i oprogramowanie Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA</td><td>Wersja 1.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>PowerPoint</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>Wersja 14.4.3</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>Wersja CS3</td><td></td></tr><tr><td>FluoRender</td><td>Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah</td><td>Wersja 2.13</td><td>Darmowe oprogramowanie. <a href="http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html" target="_blank">http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html</a></td></tr><tr><td>NIS-Elements C</td><td>Nikon, Melville, NY</td><td>Wersja 4.30.01</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo)dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Mikroglej, które są komórkami neuroimmunologicznymi rezydującymi w OUN, przekształcają swoją morfologię i rozmiar w odpowiedzi na uszkodzenie OUN, przechodząc do stanu aktywowanego z odrębnymi funkcjami i profilami ekspresji genów. Rola aktywacji mikrogleju w zdrowiu, urazach i chorobach pozostaje nie w pełni poznana ze względu na ich dynamiczną i złożoną regulację w odpowiedzi na zmiany w ich mikrośrodowisku. Dlatego tak ważne jest nieinwazyjne monitorowanie i analizowanie zmian w aktywacji mikrogleju w czasie w nienaruszonym organizmie. Badania in vivo aktywacji mikrogleju zostały opóźnione przez ograniczenia techniczne w śledzeniu zachowania mikrogleju bez zmiany środowiska OUN. Jest to szczególnie trudne w przypadku przewlekłej neurodegeneracji, gdzie konieczne jest śledzenie długoterminowych zmian. Siatkówka, narząd OUN podatny na nieinwazyjne obrazowanie na żywo, oferuje potężny system do wizualizacji i charakteryzowania dynamiki aktywacji mikrogleju podczas chorób przewlekłych.
Ten protokół przedstawia metody długoterminowego, in vivo obrazowania mikrogleju siatkówki, przy użyciu oftalmoskopii konfokalnej (cSLO) i myszy reporterowych CX3CR1GFP/+, do wizualizacji mikrogleju z rozdzielczością komórkową. Opisujemy również metody ilościowego określania miesięcznych zmian w aktywacji i gęstości komórek w dużych podzbiorach komórek (200-300 komórek na siatkówkę). Potwierdzamy użycie obszaru somalnego jako użytecznego wskaźnika do śledzenia na żywo aktywacji mikrogleju w siatkówce, stosując zautomatyzowaną analizę morfometryczną opartą na progach obrazów in vivo. Wykorzystujemy te strategie pozyskiwania i analizy obrazów na żywo do monitorowania dynamicznych zmian w aktywacji mikrogleju i mikrogleju we wczesnych stadiach neurodegeneracji siatkówki w mysim modelu przewlekłej jaskry. Takie podejście powinno być przydatne do zbadania wpływu mikrogleju na spadek neuronów i aksonów w przewlekłych zaburzeniach OUN, które wpływają na siatkówkę i nerw wzrokowy.

Nasze ostatnie badania in vivo wykorzystały te metody akwizycji i analizy obrazów na żywo w celu wizualizacji i śledzenia kinetyki oraz wzorców zmian mikrogleju w obrębie ONH i siatkówki we wczesnych stadiach przewlekłej jaskry oraz ich związku z późną neurodegeneracją59. Tutaj przedstawiamy protokół akwizycji obrazów cSLO do wizualizacji komórek mikrogleju na dużym obszarze centralnej siatkówki w poszczególnych siatkówkach młodych heterozygotycznych myszy Cx3CR1-GFP DBA/2J (Rycina 5)...

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest charakterystyka dynamiki mikrogleju w mysim modelu przewlekłego jaskry za pomocą obrazowania konfokalnego siatkówki in vivo. Osiąga się to poprzez nieinwazyjną, comiesięczną oftalmoskopię konfokalną lub CSLO w celu obserwacji fluorescencyjnego mikrogleju na siatkówce i w obrębie głowy nerwu wzrokowego. Analiza obrazów żywych z wykorzystaniem segmentacji somy komórek opartej na progu oraz analizy morfometrycznej pozwala na ilościowe określenie zmian w liczbie i aktywacji komórek mikrogleju.Wyniki pokazują, że comiesięczne obrazowanie CSLO u żywych myszy może być wykorzystywane do monitorowania kinetyki rozkładu gęstości komórek mikrogleju oraz ich aktywacji morfologicznej podczas wczesnej progresji przewlekłej neurodegeneracji. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak dwufotonowe obrazowanie konfokalne mikrogleju GFP-dodatniego w mózgu myszy, jest to, że obrazowanie CSLO siatkówki pozwala na bezpośrednią obserwację i monitorowanie komórek mikrogleju w trakcie postępu starczych zaburzeń neurodegeneracyjnych w nienaruszonym organizmie. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie po tym, jak wykazaliśmy exvivo, że mikroglej wykazuje intensywną aktywację i tworzenie skupisk w centralnych obszarach siatkówki młodych myszy DBA/2J w wieku poprzedzającym wykrywalną neurodegenerację.Aby zbadać, czy te wczesne zmiany w odporności wrodzonej, które poprzedzały wykrywalną jaskrę, doprowadziły do neurodegeneracji, musieliśmy opracować metodę in vivo do śledzenia zmian w mikrogleju. Procedurę akwizycji obrazów na żywo zaprezentuje Caesar Romero, technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć pracę, uruchom system CSLO i wprowadź informacje o sesji. Następnie przygotuj stanowisko do bezpiecznego obrazowania.Zamocuj czysty obiektyw szerokokątny 55 stopni. Po dwóch minutach od podania środka znieczulającego umieść mysz na platformie obrazującej i rozszerz obie źrenice za pomocą kropli mydriatycznych. Po pięciu minutach potwierdź, że mysz jest znieczulona.Następnie, wywierając minimalny nacisk, należy przykryć każde oko soczewkami kontaktowymi. Ustawić mysz tak, aby prawe oko znajdowało się przed obiektywem, a orbita była równoległa do soczewki. Zwierzę nie wymaga unieruchomienia, jednak należy utrzymywać je w stałej odległości od obiektywu.Przez następne 10 do 15 minut, przy wyrównanym oku, mysz nie będzie się poruszać ani mrugać, podczas gdy ruchy jej oka będą śledzone przez system obrazowania na żywo CSLO. Rozpocznij sesję obrazowania od zebrania obrazu dna oka w obrębie wewnętrznej warstwy siatkówki. W tym celu.Wybierz tryb podczerwieni, który odpowiada długości fali wzbudzenia 820 nanometrów. Następnie ustaw moc lasera na 100%, a czułość w przedziale od 40 do 60%. Następnie, pracując szybko, zlokalizuj oko za pomocą dżojstika, aby zorientować oftalmoskop i przygotować się do wykonania obrazu dna oka z widokiem tarczy nerwu wzrokowego oraz naczyń krwionośnych siatkówki. Sprawdź rogówkę i soczewkę pod kątem obrażeń lub zmętnień.Z badania należy wykluczyć oczy z wadami lub obrażeniami, które mogą wpłynąć na pozyskiwanie obrazu. Następnie, zbliżając obiektyw do oka, należy zlokalizować obszar tarczy nerwu wzrokowego, czyli powierzchnię głowy nerwu wzrokowego (ONH). Następnie należy wycentrować obraz na ONH.Prawidłowe ustawienie ONH jest kluczowe dla uzyskania równomiernej ostrości i emisji w całym obrazie. Kolejnym krokiem jest wizualizacja wewnętrznych płaszczyzn siatkówki oraz ONH. Jako referencyjną płaszczyznę ogniskową należy wykorzystać główne naczynia krwionośne znajdujące się na powierzchni witrealowej siatkówki, co odpowiada 59 i 60 dioptriom, lub jeszcze głębiej, przy 55 dioptriach w obszarach wykopanych tarczy nerwu wzrokowego.Następnie należy dostosować nasycenie obrazu za pomocą pokrętła na panelu dotykowym, aż biała aureola oświetlenia obejmie większość dna oka wokół tarczy nerwu wzrokowego. Następnie należy wybrać niższe nasycenie, które zapewni jednorodną aureolę wskazującą na optymalny kontrast dla danego oka. Jeśli nadal występują ciemne obszary, może być konieczne ponowne ustawienie kamery.Następnie należy zebrać obraz dna oka o wysokiej rozdzielczości w obszarze centralnej siatkówki poprzez uśrednienie 30 klatek zarejestrowanych w czasie rzeczywistym, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Odpowiada to 4,7 klatkom na sekundę, znormalizowanym natychmiast i w tej samej pozycji, w celu przygotowania do rejestracji obrazu fluorescencyjnego komórek pozytywnych pod kątem GFP. Należy przełączyć panel dotykowy w tryb obrazowania fluorescencyjnego, co spowoduje wybór niebieskiego lasera z wzbudzeniem laserowym 488 nanometr oraz zestawu filtrów barierowych od 460 do 490 nanometr, a następnie ustawić parametry akwizycji na 100% mocy lasera i od 100 do 125% czułości.Następnie należy zebrać pojedynczy dwuwymiarowy obraz fluorescencyjny punktu XY w obszarze ONH, uśredniając 100 skanów w osi X. W kolejnym kroku należy wykonać obraz wielopunktowy siatkówki wokół ONH, wybierając opcję composite w panelu sterowania, a następnie przesuwać oftalmoskop wzdłuż osi nosowo-skroniowej. Oprogramowanie automatycznie uśrednia nowo zeskanowane obszary i składa je w czasie rzeczywistym.Jeśli jakość obrazu obszarów siatkówki jest niewystarczająca, aby umożliwić uśrednianie, zielone koło identyfikujące skanowany obszar zmieni kolor na czerwony. Powstały obraz kompozytowy obejmuje obszar o wymiarach do 1,7 na 4 mm. Podczas pozyskiwania obrazu kompozytowego należy zachować szczególną ostrożność.Obrazy o wysokiej rozdzielczości mogą zostać utracone w wyniku zbyt szybkiego przesunięcia obiektywu przed zakończeniem uśredniania skanów i zszywania obrazów. Gdy działanie znieczulenia zaczyna ustępować, sesję obrazowania należy zakończyć, ponieważ mysz zaczyna ciężko oddychać, co sprawia, że obrazowanie staje się niewykonalne. Rozpocznij od sekwencyjnego dopasowania obrazów dna oka dla serii czasowej, wykorzystując naczynia krwionośne i tarczę nerwu wzrokowego jako punkty orientacyjne.Używając konwencjonalnego oprogramowania do edycji obrazów, wyrównaj wszystkie obrazy tak, aby ich O hs na siebie nachodziły. Górny obraz będzie półprzezroczysty podczas przeciągania. Następnie obróć każdy obraz w sekwencji, aż jego główne naczynia krwionośne pokryją się z układem naczyniowym na poprzednim obrazie, a następnie zapisz taką konfigurację do późniejszego wykorzystania.Zapisz skorygowany kąt dla każdego obrazu i zastosuj go do odpowiadającego mu pojedynczego obrazu fluorescencji w punkcie XY. Teraz, po otwarciu wyrównanych plików TIFF w programie Fluor render, możliwe jest zidentyfikowanie poszczególnych komórek mikrogleju wykazujących ekspresję GFP, zlokalizowanych w centralnej części siatkówki. Aby zwizualizować wszystkie komórki, wypełnij ekran obrazem i ustaw widok renderowania na composite orthogonal oraz interpolated.Następnie zdefiniuj właściwości: 0,58 gamma, 255 punkt nasycenia, 255 luminancja, 195 alpha przy 1,00 cieniowaniu. Zakończ wybory, zaznaczając oba kanały RG jako widoczne. Ukryj kanał B, klikając go dwukrotnie w ramce obszaru roboczego, aby przeprowadzić segmentację poszczególnych komórek.Wybierz kanał czerwony i przeprowadź progowanie, zwiększając próg dolny do momentu, aż większość komórek zostanie zamaskowana z minimalnym nakładaniem się i z wykluczeniem wypustek komórkowych, utrzymując stały próg górny. Na koniec zapisz plik z zamaskowanymi komórkami za pomocą polecenia capture. Otwórz uzyskany obraz z zamaskowanymi komórkami w edytorze grafiki rastrowej.Odwróć skalę szarości dla bezpośredniej obserwacji i ustaw rozdzielczość na 300 DPI lub wyższą. Obraz RGB jest zapisywany jako plik TIF. Kolejnym krokiem analizy obrazów żywych jest analiza mikrogleju, zatem przeprowadzona zostanie segmentacja i analiza morfologiczna w celu identyfikacji SATA do kwantyfikacji powierzchni.Należy użyć oprogramowania umożliwiającego pomiar intensywności oraz zliczanie obiektów na podstawie progu odcięcia. Otwórz plik TIFF z segmentowanymi komórkami, wybierz metodę przeskalowania spline dla uzyskania maksymalnej rozdzielczości oraz ustaw kanał czerwony jako czarno-biały w celu lepszej wizualizacji. Następnie skalibruj obraz, definiując jego średnicę poziomą na 1.4 do 1.7 mm w zależności od wieku, aby przeprowadzić segmentację poszczególnych komórek.Następnie w programie MA zastosuj progowanie intensywności dla kanału czerwonego. Otwórz funkcję progowania intensywności w menu liczenia obiektów i aktualizacji konta. Użyj tej funkcji do śledzenia parametrów dwuwymiarowych dla każdego progu w obszarze zainteresowania reprezentującym pojedynczą jednostkę.W następnym kroku należy zdefiniować próg intensywności na histogramie intensywności. Wybierz najniższe 50 do 60% z 255 poziomów i doprecyzuj końcową wartość progu dla poszczególnych komórek. Oceń wizualnie pokrycie się niebieskiej maski kolorystycznej progu z szarym obrysem somy komórki, korzystając z elementów sterujących paska narzędzi binarnych lub katalogu obiektów.Ręcznie zidentyfikuj obszary zainteresowania w obrębie somy zawierające wiele komórek. Oddziel te elementy poprzez wyodrębnienie poszczególnych obszarów zainteresowania. Podczas wykonywania tej czynności użyj przełącznika, aby bezpośrednio wizualizować komórki za pomocą ograniczenia obszaru.Komórki mikrogleju należy sklasyfikować jako aktywne, jeżeli powierzchnia ich somy jest większa niż 50 do 60 µm². Mikroglej należy sklasyfikować jako nieaktywny, jeżeli posiada mniejsze somata.Na koniec zweryfikowano proces i sprawdzono złożoność rozgałęzień w każdej aktywowanej komórce mikrogleju poprzez nałożenie maski somy i pojedynczego obrazu punktowego XY przy zwiększonym kontraście o 50%. Opisany protokół wykorzystano do wizualizacji komórek mikrogleju na dużym obszarze centralnej siatkówki. U młodych myszy DBA two J heterozygotycznie wykazujących ekspresję CX three C one GFP, wysoka rozdzielczość komórkowa w połączeniu z obrazowaniem na żywo, progowaniem i analizą morfometryczną umożliwiła automatyczną segmentację poszczególnych komórek GFP-dodatnich, dzięki czemu komórki zostały rozróżnione na podstawie pola powierzchni. Model myszy DBA two J służy do badania chronicznej jaskry; obrazowanie przeprowadzano co miesiąc, aby monitorować rozwój lokalnej mikrogliozy i aktywacji mikrogleju w wieku poprzedzającym wykrywalną neurodegenerację, co jest zgodne ze zmiennym postępem neurodegeneracji w poszczególnych oczach. Analiza ta ujawniła zmiany w aktywacji mikrogleju siatkówki i mikrogliozie w czasie.Analiza wykazała również dynamiczne zmiany w gęstości całkowitej oraz aktywowanej mikroglej w poszczególnych siatkówkach. Gęstość populacji mikrogleju nie była powiązana ze zmianami gęstości komórek wykazujących ekspresję GFP, co jest zgodne z innymi wynikami. Zatem analiza CSLO może służyć jako wskaźnik wczesnego postępu choroby.Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o starannej optymalizacji poziomów nasycenia obrazu fluorescencyjnego GFP oraz mikrogleju zlokalizowanego w wewnętrznej warstwie siatkówki; powtarzalność obrazów CSLO centralnej części siatkówki, a także spójność detali komórkowych wykrywanych w tym obszarze, zależą krytycznie od tego etapu po jego opracowaniu. Ten protokół obrazowania na żywo jest stosowany w naszym laboratorium w celu zbadania potencjalnego związku między wczesnymi zmianami w mikrogleju siatkówki i głowy nerwu wzrokowego a późniejszą progresją jaskry u myszy DBA/2J oraz w innych modelach przewlekłej degeneracji siatkówki. Ta strategia obrazowania na żywo może również umożliwić wczesne wykrywanie innych schorzeń przewlekłych, w których degeneracji ulega siatkówka i nerw wzrokowy, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera i choroba Parkinsona.

in-vivo-dynamics-retinal-microglial-activation-during

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne badanie okulistyczne i morfometria komórek w jaskry mysiego

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Tutaj prezentujemy protokół indukcji nadciśnienia ocznego w mysim oku, który powoduje utratę komórek zwojowych siatkówki, co obserwuje się w jaskrze. Mikrogranulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory i przyciągane do kąta tęczówkowo-rogówkowego za pomocą magnesu, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej.

Magnetyczny model okluzji mikrokulek do wywoływania jaskry zależnej od nadciśnienia ocznego u myszy

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Poznaj dynamikę aktywacji mikrogleju w jaskrze myszy przy użyciu nieinwazyjnego konfokalnego obrazowania oftalmoskopowego CSLO. Ta metoda umożliwia śledzenie zmian morfologicznych komórek w czasie rzeczywistym.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Przeglądaj więcej filmów