In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest scharakteryzowanie dynamiki mikrogleju w mysim modelu przewlekłej jaskry poprzez konfokalne obrazowanie siatkówki in vivo. Osiąga się to za pomocą nieinwazyjnej comiesięcznej oftalmoskopii konfokalnej lub CSLO w celu obejrzenia fluorescencyjnego mikrogleju na siatkówce i głowie nerwu wzrokowego. Analiza obrazu na żywo przy użyciu segmentacji komórek SOMA opartej na progach i morfologii określa ilościowo zmiany liczby komórek mikrogleju i aktywacji.

Wyniki pokazują, że comiesięczne obrazowanie CSLO u żywych myszy może być wykorzystywane do monitorowania kinetyki rozkładu gęstości komórek mikrogleju i aktywacji morfologicznej podczas wczesnej progresji przewlekłej neurodegeneracji. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak dwufotonowe obrazowanie konfokalne mózgu myszy z mikrogleju GFP, jest to, że obrazowanie CSLO siatkówki umożliwia bezpośrednią obserwację i monitorowanie komórek mikrogleju w trakcie progresji zaburzeń neurodegeneracyjnych związanych ze starzeniem się w nienaruszonym organizmie. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody po tym, jak wykazaliśmy exvivo, że mikroglej wykazywał intensywną aktywację i grupowanie w centralnej gotowości młodych DBA przez myszy J w wieku poprzedzającym wykrywalną neurodegenerację.

Aby zapytać, czy te wczesne wrodzone zmiany immunologiczne, które poprzedzały wykrywalną jaskrę, spowodowały jej neurodegenerację, musieliśmy ustalić podejście in vivo do śledzenia zmian mikrogleju. Procedurę pozyskiwania obrazu na żywo zademonstruje Caesar Romero, technik z mojego laboratorium Aby rozpocząć operacje, uruchom system CSLO i wprowadź informacje o sesji. Następnie należy bezpiecznie przygotować się do obrazowania.

Załóż czystą soczewkę obiektywu o szerokim polu widzenia 55 stopni. Umieść kursor myszy na platformie obrazowania dwie minuty po podaniu środka znieczulającego i rozszerz obie źrenice za pomocą moich kropli tatic. Pięć minut później upewnij się, że mysz jest znieczulona.

Następnie, stosując minimalny nacisk, zakryj każde oko soczewkami kontaktowymi. Ustaw mysz tak, aby prawe oko stykało się z soczewką obiektywu, a orbita była równoległa do soczewki. Zwierzę nie musi być krępowane, ale utrzymywane w stałej odległości od soczewki obiektywu.

Gdy oko jest ustawione w jednej linii przez następne 10 do 15 minut, mysz nie będzie się ruszać ani mrugać, podczas gdy ruchy jej gałek ocznych są śledzone przez system obrazowania na żywo CSLO. Rozpocznij sesję obrazowania od pobrania widoku dna oka wewnętrznej siatkówki. Aby to zrobić.

Wybierz tryb podczerwieni, który odpowiada długości fali wzbudzenia 820 nanometrów. Następnie dostosuj moc lasera do 100%, a czułość od 40 do 60% Następnie, pracując z dużą prędkością, zlokalizuj oko za pomocą joysticka, aby zorientować oftalmoskop i przygotuj się do pobrania widoku dna oka tarczy nerwu wzrokowego i unaczynienia siatkówki. Sprawdź rogówkę i soczewkę pod kątem obrażeń lub zmętnienia.

Wykluczyć z badania oczy z wadami lub urazami, które mogą wpływać na akwizycję obrazu. Teraz, zbliżając obiektyw do oka, zlokalizuj obszar tarczy nerwu wzrokowego, który jest powierzchnią głowy nerwu wzrokowego lub ONH. Następnie wyśrodkuj obraz na ONH.

Prawidłowe ustawienie ONH jest kluczem do uzyskania równomiernej ostrości i misji na całym obrazie. Następnym krokiem jest wizualizacja wewnętrznych płaszczyzn siatkówki, a także ONH. Aby uzyskać referencyjną płaszczyznę ogniskową, użyj głównych naczyń krwionośnych znajdujących się na powierzchni ciała szklistego siatkówki, co odpowiada 59 i 60 dioptriom, lub nawet głębiej przy 55 dioptriach w wykopanych obszarach tarczy nerwu wzrokowego.

Następnie dostosuj nasycenie obrazu za pomocą pokrętła na panelu dotykowym, aż biała aureola oświetlenia obejmie większość dna oka wokół tarczy nerwu wzrokowego. Następnie wybierz niższe nasycenie, które tworzy jednolitą aureolę wskazującą optymalny kontrast dla tego oka. Może być konieczne ponowne wyrównanie aparatu, jeśli ciemne obszary nadal się utrzymują.

Teraz zbierz obraz dna oka centralnej siatkówki w wysokiej rozdzielczości, uzyskując średnio 30 klatek wykonanych w czasie rzeczywistym, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Odpowiada to 4,7 klatkom na sekundę, znormalizowanym natychmiast i w tej samej pozycji przygotowanym do zebrania obrazu fluorescencyjnego komórek GFP dodatnich. Przełącz się w tryb obrazowania fluorescencyjnego na panelu dotykowym, który wybiera niebieski laser z wzbudzeniem lasera 488 nanometrów i zestawem filtrów barierowych od 460 do 490 nanometrów i ustawia akwizycję na 100% mocy lasera i czułość od 100 do 125%.

Teraz zbierz pojedynczy dwuwymiarowy obraz fluorescencyjny punktu XY ONH średnio 100 x skanów. Następnie uchwyć wielopunktowy obraz siatkówki wokół kompozytu ONH select na panelu sterowania, a następnie przesuń oftalmoskopem w poprzek osi skroniowej nosa. Oprogramowanie automatycznie uśrednia nowo zeskanowane obszary i zszywa je w czasie rzeczywistym.

Jeśli jakość obrazu obszarów siatkówki jest niewystarczająca, aby umożliwić uśrednienie, zielone kółko identyfikujące skanowany obszar zmieni kolor na czerwony. Uzyskany w ten sposób złożony obraz obejmuje obszar o wymiarach do 1,7 na cztery milimetry. Należy zachować ostrożność podczas pozyskiwania obrazu kompozytowego.

Obrazy w wysokiej rozdzielczości mogą zostać utracone przez zbyt szybkie przesuwanie obiektywu przed zakończeniem uśredniania skanów i łączenia obrazów. Kiedy znieczulenie zaczyna słabnąć, sesja obrazowania musi się zakończyć, ponieważ mysz zaczyna ciężko oddychać, a obrazowanie staje się niewykonalne. Zacznij od sekwencyjnego wyrównania obrazów dna oka dla szeregu czasowego, używając układu naczyniowego i tarczy nerwu wzrokowego jako punktów orientacyjnych.

Korzystając z konwencjonalnego oprogramowania do edycji obrazów, wyrównaj wszystkie obrazy, aż ich O hs nałożą się na siebie. Górny obraz będzie półprzezroczysty podczas przeciągania. Następnie obracaj każdy obraz w sekwencji, aż jego główne naczynia krwionośne nałożą się na naczynia krwionośne na poprzednim obrazie i zachowaj układ do wykorzystania w przyszłości.

Zapisz skorygowany kąt dla każdego obrazu i zastosuj go do odpowiedniego obrazu fluorescencji z pojedynczym punktem XY. Teraz możliwe jest zidentyfikowanie pojedynczych komórek mikrogleju GFP zlokalizowanych w centralnej siatkówce, otwierając wyrównane pliki TIFF w renderze Fluor. Aby zwizualizować wszystkie komórki, wypełnij ekran obrazem i zdefiniuj widok renderowania złożony ortogonalny i interpolowany.

Następnie zdefiniuj właściwości: 0,58, gamma 255, punkt nasycenia, 255, luminancja: 195, alfa przy 1,00 cieniowania. Zakończ wybieranie, wybierając oba kanały RG jako widoczne. Ukryj kanał B, klikając go dwukrotnie w ramce przestrzeni roboczej, aby podzielić poszczególne komórki na segmenty.

Wybierz i proguj kanał czerwony, zwiększając dolny próg, aż większość komórek zostanie zamaskowana z minimalnym nakładaniem się i wykluczając procesy komórkowe, utrzymując stały wysoki próg. Na koniec zapisz plik z zamaskowanymi komórkami za pomocą polecenia przechwytywania. Otwórz obraz z zamaskowanymi komórkami w tamtejszym edytorze grafiki rastrowej.

Odwróć skalę szarości, aby uzyskać bezpośrednią obserwację i dostosuj rozdzielczość do 300 DPI lub więcej. Obraz RGB jest zapisywany jako plik TIF. Kolejnym krokiem analizy obrazu na żywo jest mikroglej, a więc segmentacja i morfo w celu zidentyfikowania SATA do kwantyfikacji obszaru.

Korzystaj z oprogramowania zdolnego do pomiarów intensywności i zliczania obiektów na podstawie progu. Otwórz plik TIFF z podzielonymi na segmenty komórkami i wybierz przeskalowanie splajnu w celu uzyskania maksymalnej rozdzielczości oraz kanał czerwony jako czarno-biały dla lepszej wizualizacji. Następnie skalibruj obraz, definiując jego średnicę poziomą jako od 1,4 do 1,7 milimetra w zależności od wieku, aby podzielić poszczególne komórki.

Więc MA, zastosuj próg intensywności na kanale czerwonym. Otwórz funkcję intensywności progowej w poleceniu liczby obiektów i aktualizacji konta. Ta funkcja służy do śledzenia parametrów dwuwymiarowych dla każdego progu obszaru zainteresowania reprezentującego jednostkę.

Następnie zdefiniuj próg intensywności na histogramie intensywności. Wybierz najniższe 50 do 60% z 255 poziomów i doprecyzuj ostateczną wartość progową poszczególnych komórek. Oceń wizualnie nakładanie się progowej maski kolorów w kolorze niebieskim i obwodu komórki soma w kolorze szarym za pomocą kontrolek binarnego paska narzędzi lub katalogu obiektów.

Ręczna identyfikacja obszarów somalnych zainteresowania za pomocą wielu komórek. Oddziel te elementy, oddzielając obszary zainteresowania. Robiąc to, użyj przełącznika, aby bezpośrednio wizualizować komórki teraz, korzystając z ograniczenia obszaru.

Klasyfikuj komórki mikrogleju jako aktywowane. Jeśli ich obszary somatów są większe niż 50 do 60 mikronów kwadratowych. Sklasyfikuj mikroglej jako dezaktywowany, jeśli ma mniejsze somaty.

Na koniec zweryfikuj proces i sprawdź złożoność rozgałęzień w każdej aktywowanej komórce mikrogleju, nakładając maskę somalną i obraz pojedynczego punktu XY z kontrastem zwiększonym o 50%Opisany protokół został wykorzystany do wizualizacji komórek mikrogleju na dużym obszarze centralnej siatkówki. U młodych DBA dwóch myszy J heterozygotycznych z ekspresją CX, trzech C, jednego GFP, wysoka rozdzielczość komórek w połączeniu z obrazem na żywo, progowaniem i analizą morfometryczną pozwoliła na automatyczną segmentację poszczególnych komórek GFP, a więc komórki są dyskryminowane na podstawie obszaru DBA dwie myszy J modelują przewlekłą jaskrę i były obrazowane co miesiąc w celu monitorowania rozwoju lokalnej mikroglejozy i aktywacji mikrogleju w wieku przebiegającym wykrywalna neurodegeneracja zgodna ze zmienną progresja neurodegeneracji w poszczególnych oczach. Analiza ta ujawniła zmiany w aktywacji mikrogleju siatkówki i mikroglejozie w czasie.

W ramach analizy wykryto również dynamiczne zmiany w gęstości całkowitego i aktywowanego mikrogleju w poszczególnych siatkówkach. Zagęszczenie populacji mikrogleju nie było sprzężone ze zmianami gęstości komórek wyrażającej GFP zgodną z innymi wynikami. W związku z tym analiza CSLO może być wykorzystana jako wskaźnik wczesnej progresji choroby.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o starannej optymalizacji poziomów nasycenia obrazu fluorescencyjnego GFP plus mikrogleju, zlokalizowanej wewnętrznej siatkówki, odtwarzalności obrazów CSLO centralnej siatkówki, a także spójnych szczegółów komórkowych wykrytych w centralnej siatkówce zależy krytycznie od tego kroku Po jego opracowaniu. Ten protokół obrazowania na żywo jest stosowany w naszym laboratorium, naprawdę uspokaja potencjalny związek między wczesnymi zmianami w mikrogleju siatkówki i nerwu wzrokowego głowy a późniejszym postępem jaskry w DBA do JM i w innych modelach przewlekłego zwyrodnienia siatkówki. Ta strategia obrazowania na żywo może również umożliwić wczesne wykrycie innych przewlekłych patologii, które również są ukierunkowane na siatkówkę i nerw wzrokowy w celu zwyrodnienia, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera i Parkinsona.