In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest charakterystyka dynamiki mikrogleju w mysim modelu przewlekłego jaskry za pomocą obrazowania konfokalnego siatkówki in vivo. Osiąga się to poprzez nieinwazyjną, comiesięczną oftalmoskopię konfokalną lub CSLO w celu obserwacji fluorescencyjnego mikrogleju na siatkówce i w obrębie głowy nerwu wzrokowego. Analiza obrazów żywych z wykorzystaniem segmentacji somy komórek opartej na progu oraz analizy morfometrycznej pozwala na ilościowe określenie zmian w liczbie i aktywacji komórek mikrogleju.

Wyniki pokazują, że comiesięczne obrazowanie CSLO u żywych myszy może być wykorzystywane do monitorowania kinetyki rozkładu gęstości komórek mikrogleju oraz ich aktywacji morfologicznej podczas wczesnej progresji przewlekłej neurodegeneracji. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak dwufotonowe obrazowanie konfokalne mikrogleju GFP-dodatniego w mózgu myszy, jest to, że obrazowanie CSLO siatkówki pozwala na bezpośrednią obserwację i monitorowanie komórek mikrogleju w trakcie postępu starczych zaburzeń neurodegeneracyjnych w nienaruszonym organizmie. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie po tym, jak wykazaliśmy exvivo, że mikroglej wykazuje intensywną aktywację i tworzenie skupisk w centralnych obszarach siatkówki młodych myszy DBA/2J w wieku poprzedzającym wykrywalną neurodegenerację.

Aby zbadać, czy te wczesne zmiany w odporności wrodzonej, które poprzedzały wykrywalną jaskrę, doprowadziły do neurodegeneracji, musieliśmy opracować metodę in vivo do śledzenia zmian w mikrogleju. Procedurę akwizycji obrazów na żywo zaprezentuje Caesar Romero, technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć pracę, uruchom system CSLO i wprowadź informacje o sesji. Następnie przygotuj stanowisko do bezpiecznego obrazowania.

Zamocuj czysty obiektyw szerokokątny 55 stopni. Po dwóch minutach od podania środka znieczulającego umieść mysz na platformie obrazującej i rozszerz obie źrenice za pomocą kropli mydriatycznych. Po pięciu minutach potwierdź, że mysz jest znieczulona.

Następnie, wywierając minimalny nacisk, należy przykryć każde oko soczewkami kontaktowymi. Ustawić mysz tak, aby prawe oko znajdowało się przed obiektywem, a orbita była równoległa do soczewki. Zwierzę nie wymaga unieruchomienia, jednak należy utrzymywać je w stałej odległości od obiektywu.

Przez następne 10 do 15 minut, przy wyrównanym oku, mysz nie będzie się poruszać ani mrugać, podczas gdy ruchy jej oka będą śledzone przez system obrazowania na żywo CSLO. Rozpocznij sesję obrazowania od zebrania obrazu dna oka w obrębie wewnętrznej warstwy siatkówki. W tym celu.

Wybierz tryb podczerwieni, który odpowiada długości fali wzbudzenia 820 nanometrów. Następnie ustaw moc lasera na 100%, a czułość w przedziale od 40 do 60%. Następnie, pracując szybko, zlokalizuj oko za pomocą dżojstika, aby zorientować oftalmoskop i przygotować się do wykonania obrazu dna oka z widokiem tarczy nerwu wzrokowego oraz naczyń krwionośnych siatkówki. Sprawdź rogówkę i soczewkę pod kątem obrażeń lub zmętnień.

Z badania należy wykluczyć oczy z wadami lub obrażeniami, które mogą wpłynąć na pozyskiwanie obrazu. Następnie, zbliżając obiektyw do oka, należy zlokalizować obszar tarczy nerwu wzrokowego, czyli powierzchnię głowy nerwu wzrokowego (ONH). Następnie należy wycentrować obraz na ONH.

Prawidłowe ustawienie ONH jest kluczowe dla uzyskania równomiernej ostrości i emisji w całym obrazie. Kolejnym krokiem jest wizualizacja wewnętrznych płaszczyzn siatkówki oraz ONH. Jako referencyjną płaszczyznę ogniskową należy wykorzystać główne naczynia krwionośne znajdujące się na powierzchni witrealowej siatkówki, co odpowiada 59 i 60 dioptriom, lub jeszcze głębiej, przy 55 dioptriach w obszarach wykopanych tarczy nerwu wzrokowego.

Następnie należy dostosować nasycenie obrazu za pomocą pokrętła na panelu dotykowym, aż biała aureola oświetlenia obejmie większość dna oka wokół tarczy nerwu wzrokowego. Następnie należy wybrać niższe nasycenie, które zapewni jednorodną aureolę wskazującą na optymalny kontrast dla danego oka. Jeśli nadal występują ciemne obszary, może być konieczne ponowne ustawienie kamery.

Następnie należy zebrać obraz dna oka o wysokiej rozdzielczości w obszarze centralnej siatkówki poprzez uśrednienie 30 klatek zarejestrowanych w czasie rzeczywistym, aby poprawić stosunek sygnału do szumu. Odpowiada to 4,7 klatkom na sekundę, znormalizowanym natychmiast i w tej samej pozycji, w celu przygotowania do rejestracji obrazu fluorescencyjnego komórek pozytywnych pod kątem GFP. Należy przełączyć panel dotykowy w tryb obrazowania fluorescencyjnego, co spowoduje wybór niebieskiego lasera z wzbudzeniem laserowym 488 nanometr oraz zestawu filtrów barierowych od 460 do 490 nanometr, a następnie ustawić parametry akwizycji na 100% mocy lasera i od 100 do 125% czułości.

Następnie należy zebrać pojedynczy dwuwymiarowy obraz fluorescencyjny punktu XY w obszarze ONH, uśredniając 100 skanów w osi X. W kolejnym kroku należy wykonać obraz wielopunktowy siatkówki wokół ONH, wybierając opcję composite w panelu sterowania, a następnie przesuwać oftalmoskop wzdłuż osi nosowo-skroniowej. Oprogramowanie automatycznie uśrednia nowo zeskanowane obszary i składa je w czasie rzeczywistym.

Jeśli jakość obrazu obszarów siatkówki jest niewystarczająca, aby umożliwić uśrednianie, zielone koło identyfikujące skanowany obszar zmieni kolor na czerwony. Powstały obraz kompozytowy obejmuje obszar o wymiarach do 1,7 na 4 mm. Podczas pozyskiwania obrazu kompozytowego należy zachować szczególną ostrożność.

Obrazy o wysokiej rozdzielczości mogą zostać utracone w wyniku zbyt szybkiego przesunięcia obiektywu przed zakończeniem uśredniania skanów i zszywania obrazów. Gdy działanie znieczulenia zaczyna ustępować, sesję obrazowania należy zakończyć, ponieważ mysz zaczyna ciężko oddychać, co sprawia, że obrazowanie staje się niewykonalne. Rozpocznij od sekwencyjnego dopasowania obrazów dna oka dla serii czasowej, wykorzystując naczynia krwionośne i tarczę nerwu wzrokowego jako punkty orientacyjne.

Używając konwencjonalnego oprogramowania do edycji obrazów, wyrównaj wszystkie obrazy tak, aby ich O hs na siebie nachodziły. Górny obraz będzie półprzezroczysty podczas przeciągania. Następnie obróć każdy obraz w sekwencji, aż jego główne naczynia krwionośne pokryją się z układem naczyniowym na poprzednim obrazie, a następnie zapisz taką konfigurację do późniejszego wykorzystania.

Zapisz skorygowany kąt dla każdego obrazu i zastosuj go do odpowiadającego mu pojedynczego obrazu fluorescencji w punkcie XY. Teraz, po otwarciu wyrównanych plików TIFF w programie Fluor render, możliwe jest zidentyfikowanie poszczególnych komórek mikrogleju wykazujących ekspresję GFP, zlokalizowanych w centralnej części siatkówki. Aby zwizualizować wszystkie komórki, wypełnij ekran obrazem i ustaw widok renderowania na composite orthogonal oraz interpolated.

Następnie zdefiniuj właściwości: 0,58 gamma, 255 punkt nasycenia, 255 luminancja, 195 alpha przy 1,00 cieniowaniu. Zakończ wybory, zaznaczając oba kanały RG jako widoczne. Ukryj kanał B, klikając go dwukrotnie w ramce obszaru roboczego, aby przeprowadzić segmentację poszczególnych komórek.

Wybierz kanał czerwony i przeprowadź progowanie, zwiększając próg dolny do momentu, aż większość komórek zostanie zamaskowana z minimalnym nakładaniem się i z wykluczeniem wypustek komórkowych, utrzymując stały próg górny. Na koniec zapisz plik z zamaskowanymi komórkami za pomocą polecenia capture. Otwórz uzyskany obraz z zamaskowanymi komórkami w edytorze grafiki rastrowej.

Odwróć skalę szarości dla bezpośredniej obserwacji i ustaw rozdzielczość na 300 DPI lub wyższą. Obraz RGB jest zapisywany jako plik TIF. Kolejnym krokiem analizy obrazów żywych jest analiza mikrogleju, zatem przeprowadzona zostanie segmentacja i analiza morfologiczna w celu identyfikacji SATA do kwantyfikacji powierzchni.

Należy użyć oprogramowania umożliwiającego pomiar intensywności oraz zliczanie obiektów na podstawie progu odcięcia. Otwórz plik TIFF z segmentowanymi komórkami, wybierz metodę przeskalowania spline dla uzyskania maksymalnej rozdzielczości oraz ustaw kanał czerwony jako czarno-biały w celu lepszej wizualizacji. Następnie skalibruj obraz, definiując jego średnicę poziomą na 1.4 do 1.7 mm w zależności od wieku, aby przeprowadzić segmentację poszczególnych komórek.

Następnie w programie MA zastosuj progowanie intensywności dla kanału czerwonego. Otwórz funkcję progowania intensywności w menu liczenia obiektów i aktualizacji konta. Użyj tej funkcji do śledzenia parametrów dwuwymiarowych dla każdego progu w obszarze zainteresowania reprezentującym pojedynczą jednostkę.

W następnym kroku należy zdefiniować próg intensywności na histogramie intensywności. Wybierz najniższe 50 do 60% z 255 poziomów i doprecyzuj końcową wartość progu dla poszczególnych komórek. Oceń wizualnie pokrycie się niebieskiej maski kolorystycznej progu z szarym obrysem somy komórki, korzystając z elementów sterujących paska narzędzi binarnych lub katalogu obiektów.

Ręcznie zidentyfikuj obszary zainteresowania w obrębie somy zawierające wiele komórek. Oddziel te elementy poprzez wyodrębnienie poszczególnych obszarów zainteresowania. Podczas wykonywania tej czynności użyj przełącznika, aby bezpośrednio wizualizować komórki za pomocą ograniczenia obszaru.

Komórki mikrogleju należy sklasyfikować jako aktywne, jeżeli powierzchnia ich somy jest większa niż 50 do 60 µm². Mikroglej należy sklasyfikować jako nieaktywny, jeżeli posiada mniejsze somata.

Na koniec zweryfikowano proces i sprawdzono złożoność rozgałęzień w każdej aktywowanej komórce mikrogleju poprzez nałożenie maski somy i pojedynczego obrazu punktowego XY przy zwiększonym kontraście o 50%. Opisany protokół wykorzystano do wizualizacji komórek mikrogleju na dużym obszarze centralnej siatkówki. U młodych myszy DBA two J heterozygotycznie wykazujących ekspresję CX three C one GFP, wysoka rozdzielczość komórkowa w połączeniu z obrazowaniem na żywo, progowaniem i analizą morfometryczną umożliwiła automatyczną segmentację poszczególnych komórek GFP-dodatnich, dzięki czemu komórki zostały rozróżnione na podstawie pola powierzchni. Model myszy DBA two J służy do badania chronicznej jaskry; obrazowanie przeprowadzano co miesiąc, aby monitorować rozwój lokalnej mikrogliozy i aktywacji mikrogleju w wieku poprzedzającym wykrywalną neurodegenerację, co jest zgodne ze zmiennym postępem neurodegeneracji w poszczególnych oczach. Analiza ta ujawniła zmiany w aktywacji mikrogleju siatkówki i mikrogliozie w czasie.

Analiza wykazała również dynamiczne zmiany w gęstości całkowitej oraz aktywowanej mikroglej w poszczególnych siatkówkach. Gęstość populacji mikrogleju nie była powiązana ze zmianami gęstości komórek wykazujących ekspresję GFP, co jest zgodne z innymi wynikami. Zatem analiza CSLO może służyć jako wskaźnik wczesnego postępu choroby.

Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o starannej optymalizacji poziomów nasycenia obrazu fluorescencyjnego GFP oraz mikrogleju zlokalizowanego w wewnętrznej warstwie siatkówki; powtarzalność obrazów CSLO centralnej części siatkówki, a także spójność detali komórkowych wykrywanych w tym obszarze, zależą krytycznie od tego etapu po jego opracowaniu. Ten protokół obrazowania na żywo jest stosowany w naszym laboratorium w celu zbadania potencjalnego związku między wczesnymi zmianami w mikrogleju siatkówki i głowy nerwu wzrokowego a późniejszą progresją jaskry u myszy DBA/2J oraz w innych modelach przewlekłej degeneracji siatkówki. Ta strategia obrazowania na żywo może również umożliwić wczesne wykrywanie innych schorzeń przewlekłych, w których degeneracji ulega siatkówka i nerw wzrokowy, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera i choroba Parkinsona.