Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja komórek macierzystych układu nerwowego z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego dorosłego szczura lub człowieka. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie rdzenia kręgowego za pomocą laminektomii. W drugim kroku rdzeń kręgowy przecina się w poprzek na jednocentymetrowe segmenty, a następnie z każdego segmentu rdzenia kręgowego wypreparowuje się obszar okołokomorowy.

Następnie posiekaną tkankę tnie się na fragmenty o wielkości 1 mm, a następnie poddaje dysocjacji enzymatycznej. Końcowym etapem jest oddzielenie nienaruszonych komórek poprzez wirowanie w nieciągłym gradiencie gęstości i wysianie zawiesiny komórkowej. Ostatecznie formowanie neurosfer oraz wzrost neuroblastów można ocenić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Dzisiaj zaprezentuję sposób izolacji neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego dorosłego szczura. Komórki te mogą być następnie wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuralnych komórek macierzystych, takie jak to, które czynniki egzogenne promują restrykcję linii komórkowej lub w jaki sposób komórki te reagują na różne bodźce lub stres. Na początek należy przygotować hodowlę, pożywki oraz bufory do sekcji zgodnie z opisem zawartym w towarzyszącym protokole tekstowym.

Następnie, po podaniu przedawkowanej dawki środka znieczulającego, wysterylizuj skórę szczura i za pomocą dużych nożyczek anatomicznych usuń powierzchnię grzbietową, odsłaniając kręgosłup. Trzymaj nożyczki anatomiczne prostopadle i poprzecznie do powierzchni grzbietowej. Przetnij kręgosłup powyżej kończyn tylnych.

Następnie za pomocą mniejszych nożyczek nacinamy wzdłużnie mięsień grzbietowy pokrywający kręgosłup w kierunku rostralnym, aby odsłonić wyrostki kolczyste, zaczynając od odsłoniętego końca ogona. Wprowadza się niewielki, tępy instrument do cięcia kości pozajamowo do bocznej części kanału kręgowego, w przestrzeń między rdzeniem kręgowym a kręgosłupem. Ostrze należy umieścić płytko i równolegle do rdzenia.

Następnie należy wykonać niewielkie nacięcia w łuku kręgu i ostrożnie go oddzielić, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Taki kąt cięcia zapobiega uszkodzeniu leżącego poniżej rdzenia kręgowego. Kontynuuj usuwanie łuku kręgu w kierunku rostralnym.

Aby odsłonić rdzeń kręgowy w odcinku piersiowym i szyjnym, należy za pomocą tępych pincet tkankowych delikatnie unieść rdzeń kręgowy z kanału kręgowego i przeciąć korzenie mikronożyczkami. Aby uwolnić rdzeń, należy umieścić wycięty rdzeń kręgowy w szalce Petriego zawierającej lodowaty, sterylny bufor do sekcji szczura. Tkankę należy przepłukać lodowatym buforem do sekcji, a następnie za pomocą nożyczek przeciąć rdzeń kręgowy w poprzek na segmenty o długości 1 cm. W przypadku każdego segmentu tkanki należy jedną ręką przytrzymać ją precyzyjną pincetą, a drugą ręką za pomocą mikronożyczek ostrożnie usunąć istotę białą wraz z większością istoty szarej, pozostawiając jedynie obszar okołokomorowy rdzenia kręgowego.

Przenieś wypreparowaną tkankę okołokomorową do sterylnej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów, zawierającej lodowaty bufor do sekcji szczura. Aby rozpocząć izolację neuralnych komórek macierzystych szczura, użyj mikronóżnic do rozdrobnienia wypreparowanej tkanki okołokomorowej na kawałki o wymiarach jednego milimetra sześciennego. Następnie przygotuj bufor do dysocjacji enzymatycznej, dodając najpierw pięć mililitrów zrównoważonego roztworu soli Earla do fiolki z papainą z zestawu do dysocjacji papainą.

Umieść fiolkę w temperaturze 37 °C na 10 minut, aż papaina całkowicie się rozpuści, a roztwór stanie się przejrzysty. Następnie dodaj 500 µL zrównoważonego roztworu soli Earl'a do fiolki z DNA z zestawu do dysocjacji. Po delikatnym wymieszaniu dodaj 250 µL roztworu DNA do fiolki zawierającej papainę i delikatnie wymieszaj.

Następnie do probówki należy dodać około 0,2 grama rozdrobnionej tkanki, a następnie umieścić probówkę na platformie kołyszącej w temperaturze 37°C na od 45 minut do jednej godziny. Po inkubacji mieszaninę należy potryturować za pomocą pipety 10 ml, aby rozbić pozostałe fragmenty tkanki i uzyskać mętna zawiesinę komórkową. Zawiesinę komórkową należy przenieść do sterylnej stożkowatej probówki 15 ml i odwirować z prędkością 300 G przez pięć minut.

W temperaturze pokojowej podczas wirowania przygotować roztwór OVO moid, mieszając 2,7 ml zrównoważonego roztworu soli Earla z 300 µl zrekonstytuowanego roztworu inhibitora albuminy OVO MOID. Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml dodać 150 µL wcześniej przygotowanego roztworu DNA do roztworu oval moid i wymieszać poprzez odwrócenie probówki, odrzucić nadsącz z osadu komórkowego, a następnie niezwłocznie resuspendować pellet komórkowy w rozcieńczonej mieszaninie inhibitora albuminy i DNA. Następnie przygotować nieciągły gradient gęstości, dodając pięć ml roztworu inhibitora albuminy do probówki o pojemności 15 ml, a następnie za pomocą pipety o pojemności pięciu ml delikatnie i powoli nanieść zawiesinę komórkową na powierzchnię roztworu inhibitora albuminy.

Wirować próbkę z prędkością 70 ×g przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 1 mL podgrzanego medium EFH dla szczura, przygotowanego zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Oznaczyć gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru, a następnie zasiać komórki do kolby hodowlanej T 25 w gęstości 10 komórek na µL w medium EFH.

Inkubować kolby w temperaturze 37 °C w 5% carbon dioxide, pozwalając kulturom rosnąć niezakłóconie przez jeden tydzień, aby uniknąć agregacji sfer. Przedstawiono tutaj przekrój poprzeczny rdzenia kręgowego szczura, który został zabarwiony luxal fast blue, a także hematyną i eozyną, aby ukazać granice istoty białej i szarej. Przerywana linia wyznacza wypreparowaną pozostałą tkankę okołokomorową, która została wyizolowana w ramach niniejszego protokołu z tego regionu.

Neurosfery, takie jak te przedstawione tutaj, rosną w formie wolno zawieszonych agregatów w hodowli suspensyjnej (widok przy dużym powiększeniu). Można zauważyć mikrokolce wystające z neurosfer. Neurosfery proliferują, co potwierdza pozytywne barwienie na KI 67 w próbkach, w których neurosfery zostały rozdzielone i wysiane w dołkach pokrytych Matrigelem. Dodatkowo wykazują one przede wszystkim ekspresję Nestina, który jest markerem dla komórek prekursorowych układu nerwowego.

Po przeprowadzeniu tej procedury do hodowanych komórek można dodać czynniki egzogenne w celu promowania ich różnicowania. Dorosłe neuralne komórki macierzyste lub ich potomstwo mogą być również przeszczepiane do różnych modeli zwierzęcych, aby ocenić ich zdolność do regeneracyjnej naprawy. Mam nadzieję, że ten film okaże się przydatny, i życzę powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.