Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego
14 maja 2015
Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie nerwowych komórek macierzystych z obszaru przykomorowego dorosłego szczura lub ludzkiego rdzenia kręgowego. Osiąga się to poprzez pobranie rdzenia kręgowego za pomocą laminektomii. Drugim krokiem jest przecięcie rdzenia kręgowego poprzecznie na jednocentymetrowe segmenty i wypreparowanie obszaru przykomorowego z każdego segmentu rdzenia kręgowego.
Następnie zmieloną tkankę kroi się na milimetrowe kawałki, a następnie enzymatycznie dysocjuje. Ostatnim krokiem jest oddzielenie nienaruszonych komórek przez odwirowanie przez nieciągły gradient gęstości i płytkie zawiesinę komórki. Ostatecznie powstawanie sfery nerwicowej i wzrost neurokomórek macierzystych można ocenić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Dzisiaj zamierzam zademonstrować, jak wyizolować nerwowe komórki macierzyste z obszaru przykomorowego rdzenia kręgowego dorosłego szczura. Komórki te mogą być następnie wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nerwowych komórek macierzystych, takie jak to, które czynniki egzogenne sprzyjają ograniczeniu linii lub jak te komórki reagują na różne bodźce lub stres. Na początek należy przygotować posiew, pożywki i preparacyjne zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.
Następnie, po przedawkowaniu środka znieczulającego, wysterylizuj skórę szczura i użyj dużych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć powierzchnię grzbietową, odsłaniając kręgosłup. Trzymaj nożyczki preparacyjne prostopadle do powierzchni grzbietowej i poprzecznie. Przetnij kręgosłup powyżej kończyn tylnych.
Następnie użyj mniejszych nożyczek, aby przeciąć wzdłużnie mięsień grzbietowy leżący nad kręgosłupem w kierunku rostralnym, aby odsłonić wyrostki kolczyste, zaczynając od odsłoniętego końca kolczy. Włóż mały instrument do cięcia kości zewnątrzustnie do bocznej części kanału kręgowego w przestrzeni między rdzeniem kręgowym a kręgosłupem. Umieść ostrze płytko i równolegle do przewodu.
Następnie wykonaj małe nacięcia w blaszce i ostrożnie oderwij blaszkę, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Ten kąt zapobiega uszkodzeniu leżącego pod spodem rdzenia kręgowego. Kontynuuj usuwanie blaszki w kierunku rostralnym.
Aby odsłonić rdzeń kręgowy klatki piersiowej i szyjki macicy za pomocą kleszczy tkankowych, delikatnie podnieś rdzeń kręgowy z kręgosłupa i odetnij korzenie mikronożyczkami Aby uwolnić pępowinę, umieść wycięty rdzeń kręgowy na szalce Petriego zawierającej lodowaty, sterylny bufor do preparowania szczurów. Opłucz tkankę lodowatym buforem preparacyjnym i nożyczkami przetnij rdzeń kręgowy poprzecznie na jednocentymetrowe segmenty. Dla każdego segmentu tkanki użyj cienkich kleszczy, aby przytrzymać tkankę jedną ręką, a drugą ręką użyj mikronożyczek, aby ostrożnie usunąć istotę białą wraz z większością istoty szarej, pozostawiając tylko obszar okołokomorowy rdzenia kręgowego.
Wyciągnij wypreparowaną tkankę okołokomorową na 10-centymetrową sterylną szalkę Petriego zawierającą lodowaty bufor do rozwarstwiania szczurów. Aby rozpocząć izolację nerwowych komórek macierzystych szczura, użyj mikronożyczek, aby zmielić wypreparowaną tkankę komorową na milimetrowe kawałki. Następnie przygotuj enzymatyczny bufor dysocjacyjny, dodając najpierw pięć mililitrów zbilansowanego roztworu soli Earla do fiolki papainy z zestawu do dysocjacji papainy.
Umieścić fiolkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, tak aby papaina całkowicie się rozpuściła, a roztwór okazał się klarowny. Następnie dodaj 500 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Earla do fiolki z DNA z zestawu do dysocjacji. I delikatnie wymieszaj, dodaj 250 mikrolitrów roztworu DNA do fiolki zawierającej papainę i delikatnie wymieszaj.
Następnie dodaj zmieloną tkankę około 0,2 grama do fiolki i umieść fiolkę na platformie kołyskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut do jednej godziny. Po inkubacji trzykrotnie nanieść mieszaninę za pomocą 10-mililitrowej pipety w celu dysocjacji pozostałych fragmentów tkanki w celu uzyskania mętnej zawiesiny komórek. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować w temperaturze 300 G przez pięć minut.
W temperaturze pokojowej podczas wirowania przygotuj roztwór OVO moid, mieszając 2,7 mililitra roztworu soli Earla z 300 mikrolitrami odtworzonego roztworu inhibitora albuminy OVO. W stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów dodać 150 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu DNA do owalnego roztworu moidu i wymieszać, odwracając probówkę, wyrzucić supernatant z granulowanych komórek i natychmiast zawiesić osad komórkowy w rozcieńczonej mieszaninie inhibitorów albuminy DNA. Następnie przygotuj nieciągły gradient gęstości, dodając pięć mililitrów roztworu inhibitora albuminy do 15-mililitrowej probówki i używając pięciomililitrowej pipety, delikatnie i powoli ułóż zawiesinę komórkową na wierzchu roztworu inhibitora albuminy.
Odwirować próbkę o masie 70 g przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki EFH dla szczurów, która jest przygotowana zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i umieść komórki w kolbie hodowlanej T 25 o gęstości 10 komórek na mikrolitr w EFH.
Kolby należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i pozostawić kulturom niezakłócony wzrost przez tydzień, aby uniknąć agregacji kulek. Pokazany tutaj jest poprzeczny przekrój rdzenia kręgowego szczura, który został zabarwiony luksusowym szybkim niebieskim kolorem, a także hematyną i eoiną, aby pokazać granice istoty białej i szarej. Przerywany kontur oznacza wypreparowaną pozostałą tkankę okołokomorową, która została wyizolowana w tym protokole z tego regionu.
Neurosfery, takie jak te pokazane tutaj, będą swobodnie unosić się w kulturze zawiesinowej przy dużym powiększeniu. Można zobaczyć mikrokolce wystające z neurosfer, neurosfery proliferują, jak pokazano w dodatnim barwieniu KI 67, w którym neurosfery zostały zdysocjowane i posiane na dołkach pokrytych matryżelem. Dodatkowo będą przede wszystkim wyrażać gniazdo, w którym znajduje się marker neuronalnych komórek prekursorowych.
Po tej procedurze do hodowanych komórek można dodać czynniki egzogenne w celu promowania różnicowania. Dorosłe nerwowe komórki macierzyste lub ich potomstwo można również przeszczepić do różnych modeli zwierzęcych w celu oceny ich zdolności do naprawy regeneracyjnej. Mam nadzieję, że ten film okaże się przydatny i życzę powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje izolację i hodowlę neuronalnych komórek macierzystych/progenitorowych (NSPCs) z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego dorosłych szczurów oraz ludzkich dawców organów do transplantacji. Procedura obejmuje pobieranie materiału, dysocjację enzymatyczną oraz ocenę tworzenia neurosfer.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wstęp
- Rdzenie kręgowe dorosłych ssaków zawierają NSPCs.
- NSPCs mogą być namnażane w kulturze do celów badawczych.
- Techniki izolacji są niezbędne do badania tych komórek.
- Zrozumienie NSPCs może przyczynić się do rozwoju medycyny regeneracyjnej.
Cel badania
- Izolacja NSPCs z rdzenia kręgowego osobników dorosłych.
- Ocena potencjału wzrostu i różnicowania tych komórek.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy.
Zastosowane metody
- Laminektomia w celu pobrania rdzenia kręgowego.
- Poprzeczne cięcie rdzenia kręgowego na segmenty.
- Disekcja obszaru okołokomorowego z segmentów.
- Dysocjacja enzymatyczna rozdrobnionej tkanki i separacja komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja NSPCs z rdzeni kręgowych szczura i człowieka.
- Obserwacja tworzenia się neurosfer w hodowli.
- Ocena wzrostu komórek przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Protokół zapewnia niezawodną metodę do badań nad NSPCs.
Wnioski
- Protokół umożliwia badanie NSPC z rdzenia kręgowego osobników dorosłych.
- Izolowane NSPC mogą być wykorzystywane w różnych zastosowaniach eksperymentalnych.
- Dalsze badania nad NSPC mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia procesów naprawy rdzenia kręgowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja i ekspansja komórek macierzystych i progenitorowych układu nerwowego (NSPCs) z rdzenia kręgowego dorosłego szczura oraz człowieka stanowią solidną platformę do badania potencjału linii neuronalnych i mechanizmów regeneracyjnych. Możliwość ta umożliwia predykcyjną ocenę wpływu czynników egzogennych na różnicowanie neuronalne, co wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w portfelach badań nad neuroregeneracją. Opisana metoda pozwala zespołom badawczym na generowanie powtarzalnych, ekspansywnych systemów komórkowych do późniejszych badań przesiewowych oraz badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie ograniczeń linii komórkowych oraz sygnałów różnicowania w kontrolowanym, rozszerzalnym systemie.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie odpowiedzi NSPC na potencjalne czynniki lub stresory.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez manipulacje in vitro oraz analizę markerów.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, multipotentne kultury NSPC do standaryzowanego opracowywania testów.
- Umożliwia powtarzalne tworzenie neurosfer oraz ilościowe odczyty immunofluorescencyjne.
- Wspiera skalowalne przygotowanie typów komórek neuronalnych dla procesów przesiewowych związków chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie różnicowania NSPC in vitro do populacji komórek neuronalnych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Umożliwia przeprowadzenie badań nad transplantacją w modelach zwierzęcych w celu oceny potencjału regeneracyjnego.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację strategii naprawy układu nerwowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół izolacji NSPC łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących różnicowania neuronalnego oraz zdolności regeneracyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych dotyczących wpływu czynników egzogennych na los i proliferację NSPC.
- Screening: Zapewnia powtarzalne hodowle neurosfer i przylegających NSPC w celu standaryzacji analiz.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki immunofluorescencji i markerów komórkowych do porównania warunków.
- Badania translacyjne: Umożliwia przedkliniczną transplantację i ocenę regeneracji w modelach zwierzęcych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku, rozszerzalną platformę NSPC dla iteracyjnych cykli B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do różnicowania neuronalnego i hipotez regeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i ekspansję NSPC w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów neuroregeneracji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację strategii naprawy i różnicowania neuronalnego z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach preparatyki tkanek nerwowych oraz hodowli komórkowych.
- Niezbędny jest dostęp do odczynników do dysocjacji enzymatycznej, materiałów do gradientu gęstości oraz infrastruktury do hodowli komórkowych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów immunofluorescencji i analizy markerów pomiędzy zespołami.
- Możlina jest konieczność adaptacji metody dla różnych gatunków lub obszarów rdzenia kręgowego.
- Wydajność i potencjał różnicowania mogą się różnić w zależności od jakości tkanki dawcy i sposobu jej obchodzenia.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Harvesting and Dissection of Adult Rat Periventricular Spinal Cord Tissue
3:43
Isolation and Culturing of Adult Rat Neural Stem/Progenitor Cells from the Spinal Cord
6:51
Results: Isolated Neurospheres Express Ki67 and Nestin by Passage 3
7:50
Conclusion
