Name: Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Poznaj metodę koncentrycznego żelu kolagenowego do badania migracji komórek w środowisku 3D. Technika umożliwia kontrolę właściwości biofizycznych macierzy pozakomórkowej i precyzyjną analizę zachowań migracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują W. Sunowi i K. Jansenowi za krytyczne dyskusje oraz dziękują za wsparcie ze strony Laboratorium Biomechaniki Nano na Narodowym Uniwersytecie Singapuru. N.A.K. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium Marie Curie IIF.

1. Zbiór komórek
<ol>
	<li>Wyjąć komórki MD-MBA-231 z inkubatora ustawionego na 37 °C i 5% CO2. Oddzielić komórki od płytki do hodowli tkanek, używając 0,5% roztworu Trypsyny-EDTA. W przypadku komórek hodowanych w kolbie T25 należy zużyć 1 ml roztworu Trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Zbić komórki w stożkowej probówce 15 ml poprzez wirowanie przy 200 × g przez 4 min, odessać nadosad i resuspendować komórki w 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Oznaczyć gęstość komórek, ρ, za pomocą hemocytometru. 
	Uwaga: W celu przygotowania wewnętrznego żelu z zasianymi komórkami, zawiesina komórkowa zostanie później rozcieńczona 10-krotnie, aby osiągnąć końcową gęstość zasiewu. W związku z tym wymagana jest 10-krotnie skoncentrowana zawiesina komórkowa.</li>
	<li>Obliczyć objętość pożywki wymaganą do uzyskania 10-krotnego stężenia komórek: 
	<img alt="Równanie objętości dla przygotowania pożywki; schemat z formułą zawierającą zmienne gęstości i stężenia." fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
	Uwaga: Dla komórek MD-MBA-231 zalecana jest końcowa gęstość zasiewu komórek, cfinal, na poziomie około 2 × 106 komórek/ml, co zostało zastosowane w niniejszym protokole. W przypadku innych typów komórek można zastosować inne gęstości zasiewu.</li>
	<li>Ponownie zbić komórki w stożkowej probówce 15 ml poprzez wirowanie przy 200 × g przez 4 min i odessać nadosad.</li>
	<li>Dokładnie resuspendować komórki w wymaganej ilości (Vmedium obliczonej w kroku 1.3) bezserwatkowej pożywki do hodowli komórkowej, aby zminimalizować tworzenie się aglomeratów komórkowych. 
	Uwaga: Czerwień fenolowa wykazuje autofluorescencję i może zakłócać obrazowanie fluorescencyjne/refleksyjne. W celu uzyskania najlepszej jakości obrazu można rozważyć zastosowanie pożywki bez czerwieni fenolowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów kolagenu
<ol>
	<li>Należy przygotować roztwór Collagen stock, bufor 10× PBS oraz wodę Milli-Q H2wodę, 0,1 M NaOH oraz kilka probówek do mikrowirówki. Wszystkie odczynniki należy przechowywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu, oraz zachować warunki sterylne.</li>
	<li>Urównoważyć sterylną szalkę z szklanym dnem poprzez jej uprzednie ogrzanie w 37 °C inkubator 
	Uwaga: Wszystkie objętości w niniejszym protokole zostały zoptymalizowane dla szalki z szklanym dnem o średnicy dołka 12 mm. W przypadku zastosowania innego rodzaju szalki należy odpowiednio dostosować objętości.</li>
	<li>Oblicz objętość wymaganą do przygotowania 50 µl 2,4 mg/ml roztworu kolagenu do żelu wewnętrznego (roztwór I), w zależności od stężenia roztworu stokowego kolagenu. 
	Uwaga: Można zastosować również inne stężenia kolagenu dla żelu wewnętrznego.</li>
	<li>W środowisku sterylnym (zazwyczaj w komorze z laminarnym przepływem powietrza), powoli dodać 5 µl dodaj 10× bufor PBS do wymaganej ilości roztworu zapasu kolagenu (obliczonej w kroku 2.3), delikatnie mieszając ruchem wirowym. Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Dostosuj pH mieszaniny do wartości 7,4 za pomocą 0,1 M NaOH, korzystając z skalibrowanego pH-metru. Jako przybliżoną wytyczną przyjmij około 5 µl aby zbliżyć pH do wartości 7,4 (ilość zależy od stężenia i pH roztworu stokowego). 
	Uwaga: Należy pamiętać, że objętości stosowane w tym kroku są zbyt małe, aby można było użyć standardowego pH-metru. Należy zastosować jeden z poniższych sposobów:
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory kolagenu dla wielu próbek. Dostosować pH całej partii roztworu za pomocą standardowego pH-metru, a następnie rozdzielić roztwory kolagenu pomiędzy poszczególne próbki.</li>
		<li>Alternatywnie można dostosować pH roztworu kolagenu o większej objętości (i.e., objętość umożliwiająca zastosowanie standardowego pH-metru). Odnotować ilość NaOH niezbędną do uzyskania docelowego pH. Zmniejszyć objętości i zastosować odpowiednią ilość NaOH w eksperymencie. Potwierdzić wartość pH za pomocą papierka lakmusowego.</li>
		<li>W przeciwnym razie należy użyć mikroelektrody pH, aby dokładniej dostosować pH niewielkich ilości roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopełnić roztwór do objętości 45 µl przy użyciu H2O. Wszystkie etapy należy przeprowadzać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.</li>
</ol>
3. Tworzenie koncentrycznej hodowli żelowej
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora wstępnie ogrzaną szalkę z szklanym dnem (patrz krok 2.2).</li>
	<li>Do roztworu I dodać 5 µl 10-krotnie skoncentrowanej zawiesiny komórek (przygotowanej w kroku 1.5). Dokładnie resuspender, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Mieszanina ma obecnie objętość 50 µl i zawiera końcowe stężenie kolagenu (2.4 mg/ml) oraz gęstość komórek (cfinal = 2 × 106 cells/ml).</li>
	<li>Powoli dodać 20 µl zawierającego komórki roztworu I do centrum dołka, tak aby utworzyła się kropla w kształcie kopuły (Rycina 1A). Na tym etapie należy unikać powstawania pęcherzyków. Jeśli powstanie pęcherzyk, należy go ostrożnie, lecz szybko przebić lub odessać końcówką pipety. Ostrożnie umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze, aby pozwolić na polimeryzację wewnętrznego żelu przez 45 min.</li>
	<li>Przygotować roztwór O (dla zewnętrznego, acellularnego żelu kolagenowego) około 15 min przed końcem tego etapu inkubacji. 
	Uwaga: Warunki żelu zewnętrznego można modyfikować pod kątem stężenia kolagenu i pH polimeryzacji, aby uzyskać sieci o różnych mikrostrukturach10. W niniejszym protokole skupiono się na żelu kolagenowym o stężeniu 1.5 – 4.0 mg/ml polimeryzowanym przy pH 7.4.
	<ol>
		<li>Na podstawie stężenia roztworu stokowego kolagenu obliczyć objętość wymaganą do przygotowania 200 µl roztworu kolagenu O o końcowym stężeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do wymaganej ilości roztworu stokowego kolagenu (obliczonej w kroku 3.4) powoli dodać 20 µl 10× buforu PBS, delikatnie mieszając ruchem wirowym. Dostosować pH mieszaniny do końcowego pH za pomocą 0.1 M NaOH przy użyciu skalibrowanego pH-metru. Patrz uwaga do kroku 2.5 dotycząca regulacji pH.</li>
	<li>Dopełnić roztwór do końcowej objętości 200 µl za pomocą H2O. Wszystkie kroki należy wykonywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.</li>
	<li>Wyjąć szalkę z inkubatora po 45 min polimeryzacji żelu wewnętrznego (patrz krok 3.3). Ostrożnie dodać 180 µl roztworu O na wierzch żelu wewnętrznego, tak aby roztwór całkowicie go przykrył i wypełnił dołek (Rycina 1B).
	<ol>
		<li>Wykonać ten krok ostrożnie, nie mieszając roztworu, co mogłoby prowadzić do niejednorodnej orientacji włókien w żelu zewnętrznym. Należy uważać, aby nie dotknąć żelu wewnętrznego końcówką pipety oraz unikać powstawania pęcherzyków lub kieszonek powietrznych. Jeśli powstanie pęcherzyk, należy go ostrożnie, lecz szybko przebić lub odessać końcówką pipety. Ostrożnie umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze, aby pozwolić na polimeryzację żelu zewnętrznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć szalkę z inkubatora po 45 min polimeryzacji. Żel powinien być w tym momencie już dość ścięty, choć wciąż może odkleić się od powierzchni dna przy gwałtownym obchodzeniu się z nim.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wlać do szalki 2 ml ogrzanej pożywki do hodowli komórek (Rycina 1C). Upewnić się, że żel jest całkowicie zanurzony w pożywce. Wymieniać pożywkę co 2 – 3 dni przez cały czas trwania hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w funkcję długoterminowego obrazowania żywych komórek. Urządzenie powinno posiadać wbudowaną komorę inkubacyjną z kontrolą temperatury (37 °C) i stężenia CO2 (5%). Włączyć mikroskop i rozgrzać stolik co najmniej 1 hr przed rozpoczęciem eksperymentu. 
	Uwaga: Należy użyć obiektywu o dużej odległości roboczej, aby zoptymalizować obserwację i lokalizację komórek w żelach 3D.</li>
	<li>Inkubować żel w medium zawierającym 5 µl fluorescencyjnego barwnika do śledzenia komórek przez 30 min, aby umożliwić dokładną lokalizację komórek w systemie 3D. Następnie usunąć niezwiązany barwnik poprzez trzykrotne przemycie 1× PBS. Po tym czasie dodać do naczynia medium hodowlane.</li>
	<li>Wyjąć naczynie z inkubatora i umieścić je na stoliku mikroskopu (Rysunek 1D). 
	Uwaga: Obrazowanie żywych komórek może teoretycznie rozpocząć się bezpośrednio po polimeryzacji żelu zewnętrznego. Jednak na tym etapie komórki w żelu wewnętrznym nie zdążyły się jeszcze rozprzestrzenić. Aby zbadać migrację pierwszych komórek, które wniknęły do żelu zewnętrznego, obrazowanie żywych komórek można rozpocząć 24 hr (w zależności od typu komórek) po zainicjowaniu hodowli. Jako orientacyjną wskazówkę: w przypadku większości komórek z żelu wewnętrznego potrzeba około 12 - 14 dni hodowli, aby wniknęły one do żelu zewnętrznego.</li>
	<li>Wybrać objętości widzenia (Volumes of View, VoV) w obszarach żelu zewnętrznego otaczających żel wewnętrzny. Po 24 hr inkubacji populacja komórek rozprzestrzeni się, przekroczy granicę między żelem wewnętrznym a zewnętrznym i zacznie wnikać do żelu zewnętrznego.
	<ol>
		<li>W ramach VoV należy uwzględnić obszary żelu bezpośrednio sąsiadujące z granicą żeli, obszary pośrednie oraz obszary bliskie obrzeżom żelu zewnętrznego7. Należy wykluczyć obszary znajdujące się w odległości mniejszej niż 50 µm od powierzchni dolnej i bocznych, a także od górnej części żelu, aby uniknąć możliwych efektów brzeżnych. Każdy VoV ma zazwyczaj wymiary 647 × 647 × 100 µm3 (odpowiednio w kierunkach x, y i z), z odstępem 5 µm w stosie z (z-stack).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnić się, że tryby obrazowania, kanały/filtry, czasy ekspozycji i rozdzielczości obrazów zostały prawidłowo wybrane. W celu bezznacznikowego obrazowania sieci kolagenowej należy równocześnie z obrazowaniem żywych komórek w czasie (time-lapse) stosować konfokalną mikroskopię refleksyjną.</li>
	<li>Wykonać obrazy próbne, wykreślić histogramy intensywności i dostosować wzmocnienie (gain) oraz przesunięcie (offset), aby uzyskać wystarczający sygnał i uniknąć nasycenia, upewniając się, że histogram mieści się między zerem a maksymalną intensywnością. Nie zmieniać tych ustawień przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Wyonać obrazy time-lapse wybranych VoV z odstępem czasu Δt wynoszącym 10 min przez 8 hrs (lub dłużej, jeśli jest to konieczne).</li>
</ol>
5. Śledzenie komórek i analiza danych
<ol>
	<li>Przeprowadzić ilościowe postprocesowanie obrazów ze stosu z, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić segmentację obrazów time-lapse, aby automatycznie wyznaczyć trójwymiarowe pozycje komórek w układzie (x,y,z,t).</li>
		<li>W każdej klatce ręcznie sprawdzić dokładność lokalizacji i usunąć wyniki fałszywie dodatnie wynikające z obecności detrytów komórkowych oraz wypustek komórkowych, które mogły zostać błędnie zidentyfikowane jako komórki. Wykluczyć komórki proliferujące z analizy oraz rozdzielić nakładające się lub połączone komórki na odrębne obiekty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygenerować trójwymiarowe ścieżki przemieszczania się komórek w czasie na podstawie współrzędnych komórek (x,y,z,t) uzyskanych w poprzednim kroku, łącząc położenie każdej komórki w sekwencji czasowej.</li>
	<li>Wyeliminować szum losowy i systemowy poprzez usunięcie ścieżek krótszych niż progowa długość ścieżki (zazwyczaj 20 min).</li>
	<li>Jeśli jest to konieczne, skorygować dryft próbki poprzez odjęcie całkowitego przemieszczenia wypadkowego od ścieżek.</li>
	<li>Obliczyć przemieszczenie komórki, <img alt="Δd=|dn⃗−d0⃗|; wzór na odległość wektorową; równanie algebraiczne; pojęcie matematyczne." fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq2.jpg" width="80" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2">, oraz dystans migracji komórki, <img alt="Równanie do obliczania dystansu, formuła sumy Σ, arytmetyka wektorowa, pojęcie matematyczne." fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3">, na podstawie zaobserwowanych trajektorii komórek, gdzie wektor reprezentuje trójwymiarowe położenie komórki w czasie, a n jest całkowitą liczbą punktów czasowych.
	<ol>
		<li>Obliczyć prędkość komórki jako S = d/(n • Δt), gdzie Δt jest odstępem czasu między klatkami. Obliczyć kierunkowość (lub persistencję) migracji komórek, korzystając ze wzoru P = Δd/d. Ta prosta miara persistencji oznacza, że dla P = 0 przemieszczenie wypadkowe wynosi zero, a dla P = 1 trajektoria jest linią prostą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+dimensions+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li>
<li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li>
<li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering%3A+the+effects+of+pH%2C+temperature+and+ionic+strength+on+gelation%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li>
<li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stiffening+and+softening+of+collagen%3A+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li>
<li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638(2014).</li>
<li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+limits+of+cell+migration%3A+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration%3A+a+mechanistic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li>
<li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li>
<li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model.+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li>
<li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li>
<li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisujemy test in vitro w celu zbadania zachowania migracyjnego 3D komórek w środowiskach macierzowych, które topologicznie przypominają ECM napotkane in vivo. Istnieją trzy główne zalety tego testu w porównaniu z innymi obecnie dostępnymi metodami. Po pierwsze, test ten pozwala na jednoczesne badanie mechanizmów migracji komórek zarówno na poziomie populacji, jak i na poziomie poszczególnych komórek. Otwiera to możliwości badania zbiorowej migracji komórek13, która do tej por...

Migracja komórek odgrywa kluczową rolę w różnych reakcjach fizjologicznych, takich jak rozwój embrionalny, hemostaza i odpowiedź immunologiczna, a także w procesach patologicznych, takich jak choroby naczyniowe, stany zapalne i rak1. Analiza czynników biochemicznych i biofizycznych leżących u podstaw migracji komórek ma zatem fundamentalne znaczenie nie tylko dla zrozumienia podstawowych zasad funkcjonowania komórek, ale także dla rozwoju różnych zastosowań biomedycznych, takich jak inżynieria tkankowa, leki przeciwprzerzutowe i opracowywanie leków przeciwzapalnych. Ponieważ obserwacja in vivo jest wyzwaniem technicznym, wiele wysiłków skupiono na rekapitulacji migracji komórek in vitro.
Metody in vitro do badania migracji komórek zostały w dużej mierze zaprojektowane do testów na dwuwymiarowych (2D) powierzchniach, w szczególności do testów zadrapań lub gojenia się ran2. Takie testy oferują prostą konfigurację eksperymentalną, łatwe obrazowanie żywych komórek i dostarczają przydatnych informacji na temat różnych mechanizmów biochemicznych leżących u podstaw migracji komórek. Jednak testy te nie uwzględniają architektury i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które są krytycznymi aspektami w zrozumieniu migracji in vivo. Ostatnio coraz bardziej docenia się fakt, że model hodowli 3D, często w matrycach na bazie kolagenu3, stanowi platformę, która lepiej przypomina sytuację in vivo. Rzeczywiście, komórki wykazują dynamikę migracji, która różni się od tej na powierzchniach 2D, zwłaszcza ze względu na różną wymiarowość środowiska4. Ponadto właściwości biofizyczne i mechaniczne macierzy wrażliwie wpływają na migrację komórek5, w tym w kontekście inwazji komórek nowotworowych6.
Tutaj prezentujemy metodę badania migracji komórek 3D w ECM z właściwościami biofizycznymi, które można łatwo zmieniać w zależności od warunków przygotowania. Komórki są zasiane w "wewnętrznym żelu" i pozwala im się uciec i zaatakować początkowo bezkomórkowy "żel zewnętrzny". Metoda opiera się na zdolności komórki do rozpoznawania obecności i skłonności do migracji do regionów wolnych od komórek w zewnętrznym żelu, co jest ściśle związane z mechanodetekcją komórki7. W tym badaniu wykorzystujemy sieci kolagenowe jako ECM zaatakowane przez wysoce inwazyjne komórki raka piersi, MD-MBA-231. Właściwości mechaniczne i mikrostrukturę zarówno żeli wewnętrznych, jak i zewnętrznych można dostroić8 i scharakteryzować9 w celu uzyskania fizjologicznie istotnych warunków. Rekonstrukcja i analiza śladów komórkowych pozwala na szczegółowe ilościowe badanie zachowań migracyjnych w przestrzeni czasowej zarówno na poziomie populacji, jak i na poziomie poszczególnych komórek. Co ważne, konfiguracja koncentrycznego systemu żelowego naśladuje topologię tkanek in vivo, z którą borykają się migrujące komórki, zwłaszcza atakujące komórki nowotworowe, oferując w ten sposób ważny wgląd w fizyczne mechanizmy migracji komórek i przerzutów.

<table><tbody><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>Model: 371, S/No 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon A1R</td><td></td><td>Odwrócony konfokalny laserowy mikroskop skaningowy wyposażony w komorę inkubatora</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny barwnik CellTracker CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>Naczynie o średnicy 35 mm ze szklanym dnem o średnicy 12 mm</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td><td></td></tr> <tr><td>Mikroprocesorowy pH-metr</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>Nutragen Collagen</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>#5010-D</td><td>Kolagen bydlęcy typu I rozpuszczalny w kwasie (pH fabryczne ~ 2)</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8,2-6,9mm, NA 0,45.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Sartorius</td><td>S/No 29153352</td><td>Podstawowy pH-metr PB-11</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3d

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Zdolność komórek do migracji jest kluczowa w wielu różnych funkcjach komórek przez całe życie, od rozwoju embrionalnego i gojenia się ran po przerzuty nowotworów i nowotworów. Pomimo intensywnych wysiłków badawczych, podstawowe biochemiczne i biofizyczne zasady migracji komórek nadal nie są w pełni poznane, zwłaszcza w fizjologicznie istotnych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach. W tym miejscu opisujemy test in vitro zaprojektowany w celu umożliwienia ilościowego badania zachowań związanych z migracją komórek 3D. Metoda wykorzystuje zdolność mechanosensoryczną komórki i skłonność do migracji do wcześniej niezajętej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Jako układ modelowy wykorzystujemy inwazję wysoce inwazyjnych komórek raka piersi, MDA-MB-231, w żelach kolagenowych. Rozprzestrzenianie się populacji komórek i dynamika migracji poszczególnych komórek w ciągu tygodni hodowli mogą być monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek i analizowane w celu wyodrębnienia danych o rozdzielczości czasowo-przestrzennej. Co więcej, metodę tę można łatwo dostosować do różnych macierzy zewnątrzkomórkowych, oferując w ten sposób prosty, ale skuteczny sposób badania roli czynników biofizycznych w mikrośrodowisku na migrację komórek.

Przedstawiony tutaj test żelu koncentrycznego został przeprowadzony przykładowo z wykorzystaniem wysoce inwazyjnych komórek raka piersi MDA-MB-231, przy zastosowaniu wewnętrznego żelu kolagenowego o stężeniu 2,4 mg/ml i gęstości zasiewu komórek = 2 × 106 komórek/ml. Jak pokazano na Rysunku 2, zazwyczaj po kilku dniach hodowli komórki przekroczyły granicę między żelem wewnętrznym a zewnętrznym i zaczęły naciekać żel zewnętrzny. Populacja komórek rozprzestrzeniała się głównie promieniście na zew...

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie charakterystyki migracji komórek w fizjologicznie istotnych środowiskach 3D. Osiąga się to poprzez najpierw wysianie komórek w wewnętrznym żelu kolagenowym, który następnie zostaje zamknięty w zewnętrznym, wolnym od komórek żelu kolagenowym o pożądanych właściwościach macierzy. Następnie pozwala się komórkom na naciekanie i migrację w żelu zewnętrznym, podczas czego mogą być one monitorowane i poddane analizie ilościowej.Ostatecznie ten test z wykorzystaniem żelu koncentrycznego służy do wykazania, w jaki sposób zachowanie migracyjne komórek jest modyfikowane przez biofizyczne właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test transferowy czy testy gojenia rany (scratch assay), jest fakt, że migracja komórek odbywa się w fizjologicznie istotnym środowisku, którego właściwości strukturalne i biofizyczne są bardzo łatwe do kontrolowania. Wizualna prezentacja tej metody jest niezbędna, ponieważ formowanie systemu koncentrycznego żelu wewnętrznego i zewnętrznego jest procesem dość delikatnym.Prawidłowy interfejs żelowy jest bardzo ważny dla powodzenia tego eksperymentu, co czasami może być nieco trudne do osiągnięcia. Należy rozpocząć od hodowli komórek MD MBA 2 31 gotowych do zbioru z kolb T 25 przy 80% konfluencji. W pierwszej kolejności komórki należy potraktować trypsyną, używając jednego mililitra roztworu na kolbę.Następnie zebrać komórki w formie osadu, wirując je z siłą 200 G przez cztery minuty, odlać nadsącz i zawiesić komórki ponownie w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej. Teraz zmierzyć gęstość komórek za pomocą hemocytometru i określić objętość potrzebną do uzyskania stężenia 100 milionów komórek na mililitr. Następnie odwirować komórki przy 200 G przez cztery minuty.Usunąć nadsącz i dokładnie zawiesić osad w wymaganej objętości bezzserwatkowego pożywki hodowlanej. Zawiesina ta ma stężenie 10-krotnie wyższe od końcowego stężenia wysiewu. Na początek należy przygotować w wiaderku z lodem niezbędne roztwory stokowe, do których należą 10 XPBS, woda milq oraz 0,1 M wodorotlenku sodu.Należy również schłodzić kilka probówek do mikrocentryfugi w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zachowując zasady sterylności, a następnie odmierzyć ilość kolagenu potrzebną do przygotowania 50 µL wewnętrznego roztworu żelu o stężeniu 2,4 mg/mL. Następnie do odmierzonego kolagenu należy powoli dodać 5 µL 10x PBS. Probówkę należy delikatnie obracać podczas dodawania PBS, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.Następnie należy dostosować pH mieszaniny do wartości 7.4 za pomocą roztworu zasady. Zazwyczaj wystarczy pięć 5 µL. Przewodnik rozwiązywania problemów znajduje się w protokole tekstowym.Na koniec uzupełnić objętość do 45 µL za pomocą pożywki hodowlanej bez surowicy, pozostawiając miejsce na zawiesinę komórkową 10x. Aby rozpocząć, dodać pięć µL zawiesiny komórkowej 10x do roztworu kolagenu i dokładnie resuspendować komórki w roztworze, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie na podgrzaną wcześniej płytkę z szklanym dnem nanieść 20 µL zawiesiny na środek.Po uformowaniu kropli w kształt kopuły, w przypadku szybkiego powstania pęcherzyka powietrza, należy go bezzwłocznie przebić lub odessać, unikając przy tym zanieczyszczenia otoczenia. Odpowiednie odlewanie żelu może być bardzo trudne, szczególnie w przypadku roztworów o wysokiej lepkości, takich jak kolagen. Należy starać się maksymalnie unikać powstawania pęcherzyków powietrza i nie mieszać roztworu po przygotowaniu go do polimeryzacji, ponieważ wirowanie może doprowadzić do sztucznego wyrównania włókien.Następnie należy przenieść naczynie z powrotem do inkubatora na 45 minut, aby wewnętrzna warstwa spolimeryzowała się na 15 minut przed zakończeniem inkubacji. Przygotować 200 µL zewnętrznego roztworu żelu kolagenowego na lodzie. W pierwszej kolejności należy odmierzyć wymaganą objętość roztworu kolagenu.Po drugie, powoli dodaj 20 µL 10 XPBS, delikatnie mieszając zawirowaniem. Następnie skoryguj pH do 7.4 w taki sam sposób jak wcześniej i uzupełnij objętość roztworu do 200 µL wodą Milli Q. Teraz wyjmij szalkę z inkubatora i delikatnie nanieś 180 µL roztworu żelu zewnętrznego na kopułkę żelu wewnętrznego.Powinno to całkowicie przykryć wewnętrzny roztwór i wypełnić studzienkę. Nie należy mieszać roztworu i unikać dotykania wewnętrznego roztworu żelu. Jeśli podczas dozowania zewnętrznego roztworu powstanie pęcherzyk powietrza, należy go szybko przebić lub wciągnąć z powrotem do pipety.Kolejnym ważnym krokiem jest upewnienie się, że uzyskano odpowiedni interfejs żelowy. Kluczowe w tym etapie jest dodanie zewnętrznego roztworu żelu, zanim żel wewnętrzny całkowicie stężeje.Kinetyka żelowania może się różnić w zależności od warunków polimeryzacji, dlatego niezbędna jest ich wcześniejsza optymalizacja. Aby umożliwić polimeryzację zewnętrznego żelu, należy zwrócić szalkę do inkubatora na 45 minut. Po 45 minutach żel powinien być dość twardy, lecz wciąż może ulec przemieszczeniu; ostrożnie należy dodać 2 mL ciepłego medium, aby całkowicie zanurzyć żel. Tym samym kończy się proces przygotowania koncentrycznej hodowli żelowej; świeże medium należy dostarczać co dwa do trzech dni.W ciągu kilku dni komórki zaczną migrować do zewnętrznej macierzy. Aby zaobserwować ich migrację, należy zabarwić komórki fluorescencyjnym markerem. Należy zastąpić 2 mL pożywki świeżą pożywką zawierającą 5 µL barwnika i inkubować przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji kulturę należy przemyć 1 mL PBS 3 razy, przez 2–3 minuty podczas każdego płukania. Po przemyciu naczynie należy ponownie napełnić standardową pożywką.Następnie umieść szalkę na mikroskopie z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi. Teraz użyj ustawienia objętości skanowania, aby przeskanować zewnętrzne obszary żelu sąsiadujące z interfejsem żelu. Zazwyczaj skanowanie wykonuje się w polach o wymiarach 647 µm kwadrat, o grubości 100 µm, stosując 5 µm odstępy w stosie ZS.Następnie przeskanuj obszary pośrednie, a na koniec obrzeża żelu. Wyklucz obszary w odległości 50 mikronów od dolnej, górnej lub bocznych powierzchni, aby uniknąć komórek, które mogą podlegać efektowi brzegowemu. Aby przeanalizować ruch komórek na podstawie zebranych danych, najpierw otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu do analizy danych, takim jak imas.Zacznij od wybrania polecenia surpass, a następnie polecenia surface. Spowoduje to wyświetlenie opcji śledzenia powierzchni. Następnie wybierz interesujący Cię obszar w zbiorze danych, określając współrzędne kartezjańskie oraz przedział czasowy.Następnie odejmij tło z obszaru zainteresowania. Aby uniknąć utraty komórki podczas eliminacji tła, wybierz największą sferę, która mieści się w obiekcie. Teraz rozdziel połączone obiekty, wybierając średnicę punktu nasienia, a następnie przejdź do klasyfikacji wszystkich punktów nasienia.Kolejnym krokiem jest ręczna klasyfikacja powierzchni. Pogrupuj punkty startowe, które wskazują na ten sam obiekt. Wykonaj tę czynność dla wszystkich punktów czasowych w obszarze zainteresowania.Na koniec, po zakończeniu śledzenia, prześledź obiekty, sklasyfikuj ich trajektorie, a następnie wyeksportuj ilościowy zestaw danych do analizy w arkuszu kalkulacyjnym. Po kilku dniach hodowli w żelu koncentrycznym komórki przebiły granicę między wewnętrznym a zewnętrznym żelem i zaczęły naciekać żel zewnętrzny. Populacja komórek rozprzestrzeniała się na zewnątrz, głównie w kierunku radialnym.Porównano ruch komórek w zewnętrznym żelu o różnych gęstościach kolagenu. Obrazowanie prowadzono przez okres ośmiu godzin, a z każdej próbki obliczono około 200 trajektorii komórek. Komórki w najcieńszej macierzy przebyły najmniejszy dystans.Obliczenie to uwzględniało wszystkie komórki, a nie tylko te migrujące radialnie na zewnątrz. We wszystkich przypadkach całkowity przebyty dystans był większy niż przemieszczenie wypadkowe. Zgodnie z oczekiwaniami, persistencję obliczono jako stosunek przemieszczenia do dystansu.Wartość persistencji wynosząca 0,4 sugeruje, że komórki te wykazywały wewnętrznie słabą migrację kierunkową. Obliczenia średniej prędkości wykazały, że gęstość kolagenu nie wpływała na prędkość komórek. Możliwe jest, że rozmiar porów macierzy i gęstość kolagenu, które są ze sobą odwrotnie powiązane, miały przeciwstawny wpływ na prędkość migracji, przez co znosiły się wzajemnie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak zbudować koncentryczny system żelowy oraz jak badać migrację komórek w środowisku 3D. Postępując zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić wiele innych czynności, takich jak ekstrakcja komórek czy analiza mikromacierzy, co pozwala na próbę odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące poziomu ekspresji określonych białek w różnych punktach czasowych podczas migracji.I.

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

System żelowo-współosiowy do badania roli biofizycznej mikrośrodowiska matrycy w migracji komórek 3D

Procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, były tradycyjnie badane na dwuwymiarowych, sztywnych powierzchniach plastikowych. Niniejszy raport opisuje technikę bezpośredniej wizualizacji lokalizacji białek oraz analizy dynamiki białek w komórkach migrujących w bardziej fizjologicznie istotnej macierzy trójwymiarowej.

Obrazowanie żywych komórek migrujących, wykazujących ekspresję białek z fluorescencyjnym znacznikiem, w macierzy trójwymiarowej

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Poniższy protokół opisuje procedurę składania kultur podobnych do kanapek, które mają być używane jako etap pośredni między dwuwymiarowymi (2D) i trójwymiarowymi (3D) środowiskami komórkowymi. Opracowane systemy mogą znaleźć zastosowanie w badaniach mikroskopii, biomechaniki, biochemii i biologii komórki.

Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Protokół do ilościowej oceny migracji komórek 3D w obrębie i do interfejsu granulowanych hydrożeli jest przedstawiony tutaj.

Kwantyfikacja trójwymiarowej migracji komórek w obrębie i do granulowanych biomateriałów hydrożelowych

Poznaj metodę koncentrycznego żelu kolagenowego do badania migracji komórek w środowisku 3D. Technika umożliwia kontrolę właściwości biofizycznych macierzy pozakomórkowej i precyzyjną analizę zachowań migracyjnych.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Przeglądaj więcej filmów