Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D
3 kwietnia 2015
Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie charakterystyki migracji komórek w fizjologicznie istotnych środowiskach 3D. Osiąga się to poprzez najpierw wysiew komórek w wewnętrznym żelu kolagenowym, który jest następnie zamykany w bezkomórkowym zewnętrznym żelu kolagenowym o pożądanych właściwościach matrycy. Następnie komórki mogą indukować i migrować w zewnętrznym żelu, podczas czego mogą być monitorowane i analizowane ilościowo.
Ostatecznie ten koncentryczny test żelowy służy do pokazania, w jaki sposób właściwości biofizyczne macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na zachowanie migracji komórek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak test transferu lub test zadrapania, jest to, że migracja komórki odbywa się w fizjologicznie odpowiednim środowisku traktatowym, którego właściwości strukturalne i biofizyczne są bardzo łatwe do kontrolowania. Wizualna demonstracja tej metody jest dość istotna, ponieważ tworzenie wewnętrznego systemu żelowego koncentratu jest dość delikatne.
Odpowiedni interfejs żelowy jest bardzo ważny dla powodzenia tego eksperymentu, który czasami może być nieco trudny do osiągnięcia. Rozpocznij od hodowli MD MBA 2 31 komórek gotowych do pobrania z kolb T 25 przy płynności 80% CO. Pierwsza trypsyna to komórki przy użyciu mililitra roztworu na kolbę.
Następnie zbierz komórki w postaci osadu, używając siły 200 G przez cztery minuty, wyrzuć snat i ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach hodowli. Media. Teraz zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru i określ objętość potrzebną do 100 milionów komórek na mililitr. Następnie wiruj komórki w temperaturze 200 G przez cztery minuty.
Usunąć sklarowany osad i dokładnie zawiesić osad w wymaganej objętości pożywki hodowlanej wolnej od surowicy. To zawieszenie ma 10-krotność końcowego stężenia siedzenia. Aby rozpocząć zbieranie wymaganych roztworów podstawowych w wiadrze z lodem, zawierają one 10 XPBS wody mlecznej i 0,1 molowego wodorotlenku sodu.
Schłodź również kilka mikroprobówek wirówkowych pod kapturem, zachowując sterylną technikę, dozwielokrotnić ilość kolagenu pożądaną na 50 mikrolitrów 2,4 miligrama na mililitr wewnętrznego roztworu żelu. Następnie powoli dodaj pięć mikrolitrów 10 XPBS do odmierzonego kolagenu. Obracaj probówką podczas dodawania PBS, ale unikaj tworzenia pęcherzyków.
Następnie dostosuj pH mieszaniny do 7,4 za pomocą roztworu podstawowego. Zwykle wystarczy pięć mikrolitrów. Przewodnik rozwiązywania problemów znajduje się w protokole tekstowym.
Na koniec zwiększ objętość do 45 mikrolitrów za pomocą pożywki hodowlanej wolnej od surowicy, pozostawiając miejsce na zawiesinę 10 x komórek. Na początek dodaj pięć mikrolitrów zawiesiny 10 x komórek do roztworu kolagenu i dokładnie zawieś komórki w roztworze bez tworzenia pęcherzyków powietrza. Teraz do wstępnie podgrzanej do szklanej płyty dolnej dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny do środka.
Dobrze, tworząc kroplę w kształcie kopuły, jeśli utworzy się bąbel, szybko ją rozerwij lub zassaj bez robienia bałaganu. Odlewanie żelu we właściwy sposób może być bardzo trudne, zwłaszcza w przypadku bardzo lepkich roztworów, takich jak kolagen. Staraj się unikać wytwarzania pęcherzyków w jak największym stopniu i nie obracaj roztworu, gdy jest gotowy do polimeryzacji, ponieważ pęcznienie może spowodować wyrównanie sztucznych włókien.
Teraz włóż naczynie z powrotem do inkubatora na 45 minut, aby warstwa wewnętrzna uległa polimeryzacji na 15 minut przed zakończeniem inkubacji. Przygotuj 200 mikrolitrów roztworu żelu kolagenowego zewnętrznego na lodzie. Najpierw podziel wymaganą objętość kolagenu zapasowego.
Po drugie, powoli dodawaj 20 mikrolitrów 10 XPBS, delikatnie mieszając. Następnie dostosuj pH do 7,4 jak poprzednio i doprowadź roztwór do 200 mikrolitrów wodą Milli Q. Teraz wyjmij naczynie z inkubatora i delikatnie dodaj 180 mikrolitrów zewnętrznego roztworu żelu na wierzch wewnętrznej kopuły żelowej.
Powinno to całkowicie zakryć wewnętrzny roztwór i wypełnić studnię. Nie mieszaj roztworu i unikaj dotykania wewnętrznego roztworu żelu. Jeśli podczas wyrzucania roztworu zewnętrznego utworzy się pęcherzyk, należy go szybko rozerwać lub zassać z powrotem do pipety.
Kolejnym ważnym krokiem jest upewnienie się, że uzyskano odpowiedni interfejs żelowy. Kluczem do tego kroku jest dodanie zewnętrznego roztworu żelu. Gdy żel wewnętrzny nie jest jeszcze certyfikowany.
Kinetyka żelowania może się różnić w zależności od warunków polimeryzacji i konieczne jest wcześniejsze zoptymalizowanie tego stanu: Aby umożliwić polimeryzację zewnętrznego żelu, należy umieścić naczynie w inkubatorze na 45 minut. Po 45 minutach żel powinien być dość twardy, ale nadal można go ostrożnie usunąć, dodać dwa mililitry ciepłego podłoża, aby całkowicie zanurzyć żel. Na tym kończy się koncentryczna kultura żelowa dostarczana na świeżą pożywkę co dwa do trzech dni.
W ciągu kilku dni komórki zaczną migrować do zewnętrznej matrycy, aby obserwować swoją migrację, barwić komórki za pomocą fluorescencyjnego trackera. Zastąp dwa mililitry pożywki świeżą pożywką zawierającą pięć mikrolitrów barwnika i inkubuj przez 30 minut po okresie inkubacji, przemyj kulturę za pomocą jednego mililitra PB S3 razy przez dwie do trzech minut na pranie. Po umyciu napełnij naczynie normalnym medium.
Następnie ustaw naczynie na mikroskopie kontrolowanym przez środowisko. Teraz użyj ustawienia głośności użycia, aby zeskanować zewnętrzne obszary żelu obok interfejsu żelu. Zazwyczaj skanuje się w kwadratowych widokach o grubości 647 mikronów i grubości 100 mikronów, używając odstępów pięciu mikronów na stosie ZS.
Następnie zeskanuj obszary pośrednie, a na koniec zeskanuj zewnętrzne obrzeża żelu. Wyklucz obszary w promieniu 50 mikronów od dolnej, górnej lub bocznej powierzchni, aby uniknąć komórek, które mogą cierpieć z powodu efektu krawędzi. Aby przeanalizować ruch komórek na podstawie zebranych danych, najpierw otwórz pliki obrazów w oprogramowaniu do analizy danych, takim jak imas.
Zacznij od wybrania polecenia przewyższ, a następnie powierzchni polecenia. Spowoduje to wyświetlenie opcji śledzenia powierzchni. W miarę upływu czasu wybierz obszar zainteresowania w zestawie danych, czyli współrzędne kartezjańskie i ramy czasowe.
Następnie odejmij tło od obszaru zainteresowania. Aby uniknąć utraty komórki w wyniku eliminacji tła, wybierz największą sferę, która mieści się w obiekcie. Teraz podziel połączone obiekty, wybierając średnicę punktu początkowego i przystąp do klasyfikacji wszystkich punktów początkowych.
Następnym krokiem jest ręczna klasyfikacja powierzchni Now. Grupuj punkty początkowe, które wskazują na ten sam obiekt. Zrób to między wszystkimi punktami czasowymi w interesującym Cię regionie.
Na koniec śledź obiekty po zakończeniu śledzenia, sklasyfikuj ścieżki obiektów, a następnie wyprowadź zestaw danych ilościowych do analizy za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Po kilku dniach koncentrycznych hodowli żelowych komórki naruszyły wewnętrzną zewnętrzną granicę faz żelu i zaczęły atakować zewnętrzny żel. Populacja komórek rozprzestrzeniała się na zewnątrz w przeważającym kierunku promienistym.
Porównano ruch komórek w żelu zewnętrznym o różnej gęstości kolagenu. Obrazowanie przeprowadzono w ciągu ośmiu godzin, a z każdej próbki obliczono około 200 trajektorii komórek. Komórki w najcieńszej macierzy przemieściły się na najmniejszą odległość.
W obliczeniach wzięto pod uwagę wszystkie komórki, a nie tylko komórki migrujące promieniście na zewnątrz. We wszystkich przypadkach łączna przebyta odległość była większa niż przemieszczenie netto. Jako oczekiwana trwałość została obliczona jako stosunek przemieszczenia do odległości.
Wartość trwałości wynosząca 0,4 sugeruje, że komórki te miały z natury słabą migrację kierunkową. Obliczenia średniej prędkości wykazały, że gęstość kolagenu nie wpływała na prędkość komórek. Możliwe, że wielkość porów macierzy i gęstość kolagenu, które są odwrotnie powiązane, miały odwrotny wpływ na szybkość migracji, a tym samym wzajemnie się kompensowały.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować koncentryczny system żelowy i jak badać tę migrację komórek w środowisku 3D. Postępując zgodnie z tą procedurą, możesz zrobić wiele innych rzeczy, takich jak ekstrakcja komórek, analiza mikromacierzy, gdzie możesz spróbować odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, ile niektórych białek ulega ekspresji w różnych punktach czasowych migracji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę in vitro służącą do badania charakterystyki migracji komórek w fizjologicznie istotnych środowiskach 3D. Metoda ta umożliwia monitorowanie i ilościową analizę zachowania migracyjnego komórek pod wpływem biofizycznych właściwości macierzy pozakomórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Migracja komórek
- Właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej
- Systemy hodowli 3D
Wstęp
- Właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na migrację komórek.
- Zrozumienie zachowania komórek w środowiskach 3D jest kluczowe dla badań biologicznych.
- Istniejące metody mają ograniczenia w naśladowaniu warunków fizjologicznych.
- Niniejsze badanie wprowadza nowatorski test żelu koncentrycznego w celu lepszej kontroli nad właściwościami macierzy.
Cel badania
- Zbadanie, w jaki sposób właściwości biofizyczne macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na migrację komórek.
- Przedstawienie niezawodnej metody badania zachowania komórek w kontrolowanym środowisku.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki komórek w hodowlach 3D.
Zastosowane metody
- Wysiewanie komórek w wewnętrznym żelu kolagenowym.
- Zamykanie wewnętrznego żelu w zewnętrznym żelu kolagenowym wolnym od komórek.
- Umożliwienie komórkom inwazji i migracji w żelu zewnętrznym.
- Monitorowanie i ilościowa analiza zachowania migracyjnego komórek.
Główne wyniki
- Test żelu koncentrycznego skutecznie demonstruje migrację komórek w środowisku istotnym fizjologicznie.
- Zachowanie migracyjne komórek zmienia się znacząco w zależności od właściwości macierzy.
- Metoda ta oferuje zalety w porównaniu z tradycyjnymi testami, takimi jak test transferowy oraz testy zarysowania.
- Wizualna prezentacja metody jest kluczowa ze względu na delikatną naturę systemu żelowego.
Wnioski
- Test żelu koncentrycznego jest cennym narzędziem do badania migracji komórek w środowiskach 3D.
- Zrozumienie wpływu właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Metoda ta zwiększa możliwość kontrolowania warunków eksperymentalnych w badaniach nad migracją komórek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie, w jaki sposób biofizyczne właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na migrację komórek w 3D, ma kluczowe znaczenie dla ograniczania ryzyka w hipotezach dotyczących celów terapeutycznych w onkologii i gojeniu ran. Ten test z żelem koncentrycznym umożliwia ilościową i powtarzalną ocenę dynamiki migracji w fizjologicznie istotnych mikrośrodowiskach, co zwiększa pewność predykcyjną w procesach walidacji celów i screeningu fenotypowego. Poprzez izolację zmiennych zależnych od macierzy, metoda ta wspomaga mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz priorytetyzację portfolio w odniesieniu do szlaków mechanotransdukcji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez powiązanie mechaniki macierzy z fenotypami migracji komórek, co umożliwia funkcjonalną walidację celów w 3D systemach istotnych dla danej choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe odczyty dynamiki inwazji, które wspierają ograniczanie ryzyka biologicznego i wybór celów w oparciu o postawione hipotezy.
- Wartość prognostyczna: Generuje wskaźniki trwałości i prędkości, które informują o decyzjach dotyczących kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez wczesne ujawnienie zależnych od macierzy zachowań migracyjnych na etapie odkrywania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza danych o migracji z rozdzielczością czasowo-przestrzenną na podstawie obrazowania żywych komórek, co umożliwia standaryzację testów w odniesieniu do gęstości kolagenu i składu ECM.
- Wartość operacyjna: Wspiera rozwój skalowalnej i powtarzalnej platformy do przesiewania związków, w której właściwości macierzy są zmiennymi kontrolowanymi.
- Gotowość testu: Generuje ilościowe zestawy danych trajektorii odpowiednie do analizy wysokotreściowej (high-content analysis) oraz potwierdzania trafień w kampaniach skoncentrowanych na migracji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje z etapu odkryć z modelami przedklinicznymi poprzez utrzymanie fizjologicznie istotnych mikrośrodowisk 3D, które naśladują oddziaływania stromalne in vivo.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Izoluje zmienne biofizyczne, aby wyjaśnić, czy zaobserwowane efekty migracji są specyficzne dla celu, czy też zależne od macierzy, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas identyfikacji wiodących kandydatów.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko poprzez korelację wzorców migracji in vitro ze znanym potencjałem metastatycznym w modelach takich jak MDA-MB-231.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od weryfikacji hipotezy dotyczącej celu molekularnego po identyfikację związku wiodącego, dostarczając wglądów mechanistycznych, które pomagają w opracowywaniu testów oraz na etapach walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez kwantyfikację wpływu biofizycznych parametrów macierzy na fenotypy migracji, co pozwala wyjaśnić udział konkretnych szlaków w procesach inwazji.
- Screening: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanemu formowaniu żelu i protokołom obrazowania ilościowego, które zapewniają powtarzalne wskaźniki migracji w różnych warunkach.
- Analityka: Generuje spatiotemporalne zestawy danych, w tym analizę trajektorii, współczynniki trwałości oraz obliczenia średniej prędkości, co pozwala na porównawczą ocenę warunków.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność kliniczną poprzez wykorzystanie komórek przerzutowego raka piersi w regulowanych macierzach 3D, co zapewnia ciągłość w odniesieniu do przedklinicznych modeli przerzutowania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania fenotypów zależnych od macierzy w wielu projektach, co ogranicza redundantny rozwój testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez ograniczanie niejednoznaczności mechanistycznej w fenotypach migracyjnych dzięki kontrolowanym zmiennym macierzy.
- Wartość operacyjna: Poprawia odtwarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom polimeryzacji żelu oraz ilościowym parametrom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej identyfikacji artefaktów zależnych od macierzy, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach programów onkologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez odróżnianie rzeczywistych efektów pośredniczonych przez cel od zmian migracyjnych napędzanych przez mikrośrodowisko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie trójwymiarowych hodowli komórkowych (3D), obrazowania komórek żywych oraz obsługi oprogramowania do analizy obrazu w celu śledzenia powierzchni i klasyfikacji obiektów.
- Zależy od precyzyjnej kontroli stężenia kolagenu, regulacji pH oraz warstwowania żelu, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i zapewnić prawidłowe uformowanie interfejsu.
- Wymaga standaryzacji gęstości wysiewu, czasu inkubacji oraz protokołów wymiany medium pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Wymaga dostosowania składu zewnętrznego żelu podczas badania macierzy niekolagenowych, wraz z walidacją kinetyki żelowania i stabilności interfejsu.
- Ograniczone przez konieczność starannego ręcznego odlewania żelu w celu uniknięcia artefaktów, szczególnie w przypadku roztworów lepkich, oraz konieczność wykluczenia obszarów brzegowych podczas analizy.
