Name: Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala obserwować odpowiedzi mechanobiologiczne komórek nabłonka płuc myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby, aby podziękowali Fedex Institute of Technology na Uniwersytecie w Memphis za wsparcie. Autorzy pragną podziękować studentom starszej grupy projektowej na Wydziale Inżynierii Mechanicznej Uniwersytetu w Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Danielowi Kohnowi z Wydziału Technologii Inżynieryjnej Uniwersytetu w Memphis ds. Sterowania Silnikami oraz dr Bin Tengowi i Pani Charlean Luellen za ich pomoc w hodowli komórkowej. Prace te były wspierane przez K01 HL120912 (ER) i R01 HL123540 (CMW).

1. Budowa membrany ze ścianami studni do przechowywania pożywki do hodowli komórkowych (zobacz rysunek 1D dla produktu końcowego)
<ol>
	<li>Za pomocą arkuszy polidimetylosiloksanu (PDMS) pokrytych kolagenem I wytnij kontur elastycznej membrany za pomocą skalpela lub matrycy.</li>
	<li>Umieść każdą membranę na szalce Petriego o średnicy 60 mm w celu przechowywania.</li>
	<li>Tworzenie ścian:
	<ol>
		<li>Wymieszać PDMS w stosunku wagowym 10:1 elastomeru A do elastomeru B (utwardzacz).</li>
		<li>Wlać 5 ml całkowicie wymieszanego PDMS do probówek o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Umieść 50 ml probówek z nieutwardzonym PDMS poziomo w piecu do hybrydyzacji.</li>
		<li>Użyj funkcji wirnika, aby pokryć wewnętrzne ścianki rur z prędkością 8 obr./min w czasie utwardzania. W RT PDMS zostanie w pełni utwardzony w ciągu 2 dni.</li>
		<li>Wyjmij PDMS z probówki w sterylnym kapturze do hodowli komórek.</li>
		<li>Za pomocą nowej żyletki podziel cylinder PDMS na sekcje o wysokości 4 mm.</li>
		<li>Umieść sekcje, które będą służyć jako ścianki membrany, w pojemniku na szalkę Petriego, nie dopuszczając do zagniecenia ścianek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz i wyśrodkuj jedną ściankę PDMS na jednej membranie, utrzymując obie na szalce Petriego.</li>
	<li>Delikatnie umieść nieutwardzony PDMS (w stosunku 10:1) na zewnętrznym obwodzie ściany, który ma być użyty jako klej. Zapobiegaj tworzeniu się szczelin między ścianą a membraną, ponieważ ma ona na celu zatrzymanie cieczy.</li>
	<li>Umieścić każdą szalkę Petriego zawierającą gotową membranę i przykryć w suszarce w temperaturze 70 °C na 24 godziny w celu utwardzenia.</li>
</ol>
2. Korelacja obrotów silnika z przemieszczeniem zacisku lub wzrostem promieniowym dla kalibracji (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie sterujące silnikiem.</li>
	<li>Przemieszcz clamps urządzenia za pomocą ręcznego ustawienia w oprogramowaniu silnika.</li>
	<li>Zmierz odległość i zapisz pozycję zliczania silnika między przeciwległymi zaciskami zarówno przy minimalnym, jak i maksymalnym przemieszczeniu zacisków.</li>
	<li>Oblicz procentową zmianę odległości między zaciskami w funkcji liczby silników (~0-75 tys. zliczeń). Będzie to wskazywać maksymalne potencjalne odkształcenie osiągnięte na membranie.</li>
</ol>
3. Zastosowanie rozciągania na linii komórkowej nabłonka płuc myszy (MLE12)
<ol>
	<li>Umieść komórki MLE12 w 2,5 miliona komórek na elastycznej błonie (etap 1) na studzienkę, aby zlały się w ciągu dwóch dni. Gęstość wysiewu może się różnić w zależności od typu komórek.</li>
	<li>Upewnij się, że siłownik mechaniczny znajduje się w całkowicie zrelaksowanej pozycji.
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Za pomocą stempli biopsyjnych o średnicy 1,5 mm przebij dwa otwory w każdym z sześciu zacisków (patrz rysunek 1D) wypustek membrany. Promieniowe rozmieszczenie otworów określa stopień naprężenia wstępnego, jakiego membrana doświadcza na początku. Przebić otwory w promieniu 20.5 mm na zaczepach membrany, jeśli nie jest wymagane naprężenie wstępne.</li>
		<li>Umieść membranę na noszach tak, aby wybite otwory pokrywały się z kołkami w zaciskach. Umieść górne clamps na miejscu. Dokręcaj pojedynczo naprzemiennie.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu, centrując środek membrany ze ścieżką światła.</li>
	<li>Użyj taśmy lub magnesów (jeśli to możliwe), aby przymocować urządzenie do sceny. Po zamocowaniu kontroluj płaszczyznę wewnętrzną (równoległą do membrany) i pionową (kierunek z) urządzenia mechanicznego za pomocą sterownika stolika mikroskopu.</li>
	<li>Zastosuj rozciąganie za pomocą oprogramowania dostarczonego przez producenta, ręcznie kontrolując pozycję i prędkość obrotową silnika20.</li>
</ol>
4. Pomiar mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS)
<ol>
	<li>Gdy komórki zlewają się, dodaj 1-2 ml RT DMEM ze wskaźnikiem ponadtlenkowym mitochondriów (stężenie końcowe 5 μM) bezpośrednio na komórki.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie buforem podgrzanym w łaźni wodnej do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Natychmiast umieścić elastyczną membranę na noszach (krok 2.2) już na miejscu pod pionowym mikroskopem konfokalnym.</li>
	<li>Dodać 1 ml DMEM z pożywką wolną od czerwieni fenolowej i 25 mM HEPES.</li>
	<li>Ustaw filtry wzbudzenia/emisji na 510/580 nm.</li>
	<li>Obrazuj wiele pól co 15 minut, aby stworzyć pożądany przebieg czasowy produkcji ponadtlenków mitochondriów.</li>
	<li>Na podstawie przechwyconych obrazów zapisz histogramy intensywności fluorescencji w każdym przedziale czasowym za pomocą oprogramowania zdolnego do ilościowego określenia intensywności fluorescencji.</li>
</ol>
5. Zastosowanie mikroskopii rozciągania i sił atomowych (AFM)
UWAGA: Te kroki są przewidziane dla konkretnej kombinacji AFM i mikroskopu optycznego (Rysunek 4 i Lista materiałów).
<ol>
	<li>Przygotuj AFM do eksperymentu.
	<ol>
		<li>Zwiększ wysokość głowicy AFM do maksymalnego położenia w kierunku z.</li>
		<li>Umieść przedłużacze na nogach AFM, aby podnieść płaszczyznę, w której wspornik AFM styka się z próbką. Próbka i głowica AFM muszą zostać podniesione, aby dostosować się do wysokości urządzenia mechanicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mikroskop optyczny (jeśli jest dostępny).
	<ol>
		<li>Zdejmij płytkę skanera AFM. Usuń żądany obiektyw.</li>
		<li>Dodaj przekładkę do obiektywu. Wysokość elementu dystansowego zależy od obiektywu i konkretnej konfiguracji AFM, ale jest konieczna, jeśli pożądane jest obrazowanie optyczne, ponieważ płaszczyzna obserwacji zostanie przesunięta w kierunku z o wartość równą wysokości noszy i adaptera (rysunek 5A). Należy pamiętać, że AFM zwykle zapewnia obrazowanie w małym powiększeniu ze ścieżki optycznej znajdującej się nad urządzeniem.</li>
		<li>Zamontuj żądany cel z powrotem w jego miejscu. Umieść skaner z powrotem na AFM.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie AFM. Uruchom wszystkie niezbędne źródła światła, w tym źródło światła, do pomiarów fluorescencji.</li>
		<li>Zamontuj wiór z belką wspornikową, która jest odpowiednia do żądanych pomiarów. Sztywność 200 pN/nm lub mniejsza jest preferowana przy pomiarze modułu sprężystości komórek pod napięciem.</li>
		<li>Ustaw laser i skalibruj sztywność wspornika zgodnie z zaleceniami producenta na szklanym szkiełku nakrywkowym zamontowanym na urządzeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj membranę jak w kroku 1, ale z następującymi modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed zamontowaniem membrany na urządzeniu naciągowym należy przyciąć ścianki do wysokości około 1 mm. Zapobiega to interferencji między ściankami membrany a ogniwem obciążnikowym.</li>
		<li>Zamontować membranę na urządzeniu mechanicznym zgodnie z opisem w ppkt 3.2.1-3.2.3.</li>
		<li>Usuń pożywkę do hodowli komórkowych, aby zapobiec uszkodzeniu skanera AFM w przypadku rozlania.</li>
		<li>Połącz urządzenie z adapterem (Rysunek 5A). Umieść urządzenie mechaniczne z adapterem na skanerze.</li>
		<li>Rozciągnąć membranę do pożądanego poziomu odkształcenia przy rozciąganiu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nano-wgłębienie rozciągniętych komórek.
	<ol>
		<li>Dodaj ograniczoną (<0,5 ml) objętość pożywki na komórki, aby uniknąć uszkodzenia skanera AFM lub mikroskopu z powodu rozlania.</li>
		<li>Sprzęgnij belkę wspornikową z membraną.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem konkretnego urządzenia AFM, aby zeskanować obszary zainteresowania. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+new+opportunities+in+lung+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology.</a> J Biomech. 43, 99-107 (2010).</li>
<li>Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+CM+%22Comprehensive+Physiology%22">Comprehensive Physiology</a>. , John Wiley, & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Sensitivity+and+Mechanotransduction+during+Heart+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development.</a> Current Biology. 24, R495-R501 (2014).</li>
<li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475, 316-323 (2011).</li>
<li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+across+the+cell-surface+and+through+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton.</a> Science. 260, 1124-1127 (1993).</li>
<li>Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force-induced+signal+transduction+in+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical force-induced signal transduction in lung cells.</a> Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).</li>
<li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in mechanotransduction.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).</li>
<li>Chapman, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cyclic+opening+and+closing+at+low-+and+high-volume+ventilation+on+bronchoalveolar+lavage+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Car+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines.</a> Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).</li>
<li>Tschumperlin, D., Margulies, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equibiaxial+deformation-induced+injury+of+alveolar+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro.</a> Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).</li>
<li>Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+failure+in+ventilator-injured+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular stress failure in ventilator-injured lungs.</a> Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).</li>
<li>Roan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia+alters+the+mechanical+properties+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).</li>
<li>Gamerdinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+load+and+mechanical+integrity+of+lung+cells+-+Experimental+mechanostimulation+of+epithelial+cell-+and+fibroblast-monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).</li>
<li>Hayashi, K., Naiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+remodeling+of+vascular+wall%3B+biomechanical+response+to+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).</li>
<li>Villemure, I., Stokes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+mechanics+and+mechanobiology.+A+survey+of+present+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding.</a> J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).</li>
<li>Waters, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+impose+prescribed+homogenous+strains+on+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells.</a> J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).</li>
<li>Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+simultaneous+live+cell+imaging+during+uni-axial+mechanical+strain+or+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression.</a> J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).</li>
<li>Dassow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+measure+mechanical+properties+of+pulmonary+epithelial+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).</li>
<li>SmartMotor User's Guide v523. , Animatics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf ">http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf </a> (2011).</li>
<li>Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+increases+reactive+oxygen+species+production+in+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).</li>
<li>Turrens, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial formation of reactive oxygen species.</a> J Physiol. 552, 335-344 (2003).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+single+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in single mitochondria.</a> Cell. 134, 279-290 (2008).</li>
<li>Pouvreau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flashes+in+mouse+skeletal+muscle+are+produced+by+discrete+arrays+of+active+mitochondria+operating+coherently%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Yalcin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+on+epithelial+cell+injury+during+cyclic+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).</li>
<li>Jacob, A. M., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atelectrauma+disrupts+pulmonary+epithelial+barrier+integrity+and+alters+the+distribution+of+tight+junction+proteins+ZO-1+and+claudin+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4.</a> J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).</li>
<li>DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+magnitude+and+frequency-dependent+actin+cytoskeleton+remodeling+in+alveolar+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opracowano unikalne urządzenie do obrazowania żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego; To urządzenie zostało użyte w protokole do badania mechanobiologii komórek nabłonka płuc. We wstępnych badaniach stwierdzono, że pojedynczy trzymany odcinek stymulował produkcję mitochondrialnego ponadtlenku w komórkach nabłonka oskrzeli. Ponadto wykazano, że zwiększony poziom naprężeń mechanicznych spowodował bezpośrednie uszkodzenie integralności monowarstwy komórek nabłonka pęcherzyków płucnych.
...

Komórki są poddawane obciążeniom mechanicznym w wielu tkankach, a ta mechaniczna stymulacja sprzyja zmianom we wzorcach ekspresji genów, uwalnianiu czynników wzrostu, cytokinach lub przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej i cytoszkieletu1-4. Sygnały wewnątrzkomórkowe przekazywane z takich bodźców mechanicznych zachodzą w procesie mechanotransdukcji5-7. W układzie oddechowym jednym ze skutków mechanotransdukcji jest wzrost reaktywnych form tlenu (ROS)8,9 i cytokin prozapalnych10 w komórkach nabłonka płuc w obecności cyklicznego naprężenia rozciągającego. Mocne dowody sugerują również, że nadmierne obciążenie rozciągające prowadzi do bezpośredniego uszkodzenia nabłonka wyrostka zębodołowego, oprócz odpowiedzi biochemicznych komórek11-14. Chociaż nacisk kładziony jest tutaj przede wszystkim na odpowiedź komórek płuc na deformację mechaniczną, szlaki indukowane przez mechanotransdukcję odgrywają kluczową rolę w podstawowej funkcji wielu tkanek w ludzkim ciele, w tym w regulacji napięcia naczyniowego15 i rozwoju płytki wzrostowej16.

Rosnące zainteresowanie mechanotransdukcją zaowocowało rozwojem licznych urządzeń do nakładania fizjologicznie istotnych obciążeń mechanicznych na hodowane komórki i tkanki. W szczególności popularne są urządzenia wykorzystujące naprężenie rozciągające, które jest powszechną formą obciążenia mechanicznego doświadczanego przez tkankę, 11,17-19. Jednak wiele z dostępnych urządzeń jest albo zaprojektowanych jako bioreaktory do zastosowań w inżynierii tkankowej, albo nie sprzyja obrazowaniu w czasie rzeczywistym z rozciągnięciem. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania narzędzi i metod, które mogą wizualizować komórki i tkanki w napięciu, aby ułatwić badanie szlaków mechanotransdukcji.
W tym celu zaprojektowano mechaniczne urządzenie do rozciągania w płaszczyźnie i opracowano protokoły umożliwiające stosowanie wielu form naprężeń na tkankach i komórkach, umożliwiając jednocześnie obrazowanie reakcji biochemicznych i mechanicznych w czasie rzeczywistym (Rysunek 1A-D). Urządzenie wykorzystuje sześć równomiernie rozmieszczonych zacisków rozmieszczonych na obwodzie, aby uchwycić elastyczną membranę i zastosować w płaszczyźnie, promieniowe rozciągnięcie do około 20% (rysunek 1B). Urządzenie uruchamiające można umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych na dłuższy czas, podczas gdy silnik (rysunek 1C) jest umieszczony na zewnątrz inkubatora i sterowany przez zastrzeżone oprogramowanie dostarczone przez dostawcę silnika. Silnik jest połączony ze sterownikiem liniowym, który obraca wewnętrzną krzywkę, napędzając sześć zacisków noszy równomiernie w napięciu i rozluźnieniu.
Oprócz urządzenia mechanicznego, z dostępnych na rynku membran gotowych do hodowli komórkowych stworzono dostosowane elastyczne membrany do wykorzystania w systemie mechanicznym. Następnie wykonano okrągłe ścianki (o średnicy około 28 mm) i przymocowano je do elastycznej membrany, tak aby komórki mogły być hodowane tylko w tym obszarze o dobrze opisanym profilu szczepu. W celu ustalenia, czy umieszczenie tych membran w urządzeniu uruchamiającym zapewni równomierne i izotropowe odkształcenie w środku elastycznej membrany, przeprowadzono analizę metodą elementów skończonych przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania (rysunek 1E-F). Elastyczna membrana została zamodelowana z symetrycznymi warunkami brzegowymi i z wykorzystaniem wszystkich elementów czworobocznych dla siatki. Koncentryczne pierścienie widoczne na wykresie konturowym maksymalnego głównego odkształcenia pokazanego na rysunku 1F wskazują izotropowy rozkład odkształcenia.
Odkształcenie doświadczane przez membranę zostało zmierzone poprzez rejestrowanie obrazów oznaczeń poprzez obciążenie (Rysunek 2). Rysunek 2D pokazuje, że średnie odkształcenie membrany mierzone w kierunku promieniowym i osiowym było w przybliżeniu liniowe w odniesieniu do zastosowanej liczby silników do maksymalnego odkształcenia liniowego wynoszącego 20%. Nie stwierdzono istotnej różnicy między poziomami obciążenia mierzonymi podczas rozdęcia w porównaniu z poziomami mierzonymi podczas cofania z powrotem do pozycji spoczynkowej. Następnie zmierzono przemieszczenie ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (16HBE) i ich jąder hodowanych na niestandardowej elastycznej błonie. Znakowane fluorescencyjnie (DAPI) jądra komórek 16HBE zobrazowano za pomocą obiektywu 20X pod mikroskopem konfokalnym, podczas gdy przemieszczenie całych komórek mierzono za pomocą obrazów z kontrastem fazowym zarejestrowanych za pomocą mikroskopu cyfrowego. Jak widać na rysunku 3, odkształcenie mierzone przez przemieszczenie jąder było podobne do tego mierzonego przez przemieszczenie oznaczeń na błonie, do ~20% odkształcenia liniowego. Potwierdza to, że szczep zastosowany na błonach został przeniesiony do przylegających komórek. Protokoły opisujące użycie niestandardowego urządzenia na tradycyjnym mikroskopie i mikroskopie sił atomowych są przedstawione w następujących krokach.

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34: Seria 3400</td><td>MOOG Animatiki</td><td>SM3416D</td><td>Zintegrowany silnik, sterownik, wzmacniacz, enkoder i magistrala komunikacyjna</td></tr><tr><td>Membrana Flexcell (powlekana kolagenem I)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3,5"&nbsp; x&nbsp; 5,25"&nbsp; x&nbsp; 0.020"</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>10:1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Bejca Sigma-Aldrich</td><td>H1399</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>MitoSOX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>Tiron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7389&nbsp;</td><td>Etykieta mitochondrialna ponadtlenkowa</td></tr><tr><td>Inhibitor ponadtlenkowy</td> <td>DMEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td>Do stworzenia obszaru do obrazowania można użyć dowolnej probówki wirówkowej.</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>Komórki nabłonkowe płuc myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>16HBE cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2741</td><td>Ludzkie komórki</td></tr><tr> nabłonka oskrzeli <td colspan="4">AFM Eksperymenty z wcięciami</td></tr><tr><td>Cantilever Belki do nano-wgłębień Czujniki</td><td>budżetowe</td><td>Si-Ni30</td><td></td></tr><tr><td>AFM&nbsp;</td><td>Mikroskop Asylum Research</td><td>MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Olympus</td><td></td><td>IX-71</td><td>Mikroskop odwrócony z obiektywami 20X i 40X.</td></tr><tr><td>AFM Leg Extenders</td><td>Asylum Research</td><td>Niedostępne Mikroskop</td><td></td></tr><tr> AFM<td colspan="4">Analizy elementów skończonych</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mikroskopy</td></tr><tr><td>Digital mikroskop</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS XL Core</td><td>Początkowo niezależna firma, obecnie należąca do Life Technologies.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>2-fotonowy mikroskop pionowy</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

Obecnie istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem, jak komórki i tkanki reagują na bodźce mechaniczne, ale obecne podejścia mają ograniczone możliwości mierzenia odpowiedzi w czasie rzeczywistym w żywych komórkach lub żywotnych tkankach. Opracowano protokół z wykorzystaniem aktywatora komórkowego do dyskwalifikacji żywych komórek wyhodowanych na elastycznym podłożu lub tkanek przyczepionych do elastycznego podłoża podczas obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sił atomowych (AFM). Wstępne badania wykazują, że toniczne rozciąganie ludzkich komórek nabłonka oskrzeli spowodowało znaczny wzrost produkcji ponadtlenku mitochondriów. Ponadto, przy użyciu tego protokołu, komórki nabłonka pęcherzyków płucnych zostały rozciągnięte i zobrazowane, co wykazało bezpośrednie uszkodzenie komórek nabłonka przez nadmierne rozdęcie symulujące jedną z form uszkodzenia płuc in vitro. Dostępny jest również protokół do przeprowadzania nano-wgłębień AFM na rozciągniętych komórkach.

Reaktywne formy tlenu i deformacja
Poprzednie badania wykazały wzrost poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach nabłonka dróg oddechowych i pęcherzyków pęcherzykowych w odpowiedzi na cykliczne rozciąganie21. Reaktywne formy tlenu obejmują cząsteczki i wolne rodniki pochodne tlenu cząsteczkowego o wysokiej reaktywności w stosunku do lipidów, białek, polisacharydów i kwasów nukleinowych22-24. ROS służą jako wspólny sygnał wewnątrzkomórkowy regulujący funkcję...

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja roli odkształcenia mechanicznego w mechanobiologii komórek w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Osiąga się to najpierw poprzez skonstruowanie układu z elastycznymi membranami, na których hoduje się i rozciąga komórki. W drugim kroku membranę rozciąga się, aby skalibrować liczbę zliczeń silnika z odkształceniem membrany.Następnie rozciągnięto komórki nabłonka płuc myszy i wykonano obrazowanie jąder komórkowych. Aby wykazać, że odkształcenie błony jest przekazywane do komórek, urządzenia do rozciągania zintegrowano z AFM w celu nanoindentacji, aby zmierzyć sztywność poszczególnych komórek przed i po rozciąganiu. Wyniki wykazują bezpośrednie uszkodzenia komórek spowodowane zastosowanym rozciąganiem.Na podstawie obrazowania fluorescencyjnego wykazano również, że produkcja reaktywnych form tlenu wzrasta wraz z rozciąganiem. Ta metoda pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mechanicznej płuc, np. czy komórki nabłonkowe mogą ulec uszkodzeniu w wyniku wentylacji mechanicznej. Metoda ta umożliwia pogłębienie wiedzy na temat biologii mechanicznej komórek płuc i może być zastosowana również do innych tkanek miękkich, takich jak przekroje wątroby lub płytki wzrostu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na niekonwencjonalne połączenie narzędzi wykorzystywanych w tych eksperymentach, takich jak mikroskop sił atomowych. W pierwszej kolejności należy przygotować membranę PDMS powleczoną kolagenem, zmodyfikowaną do hodowli komórkowej, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie należy zasiać komórki nabłonka płuc myszy w zagęszczeniu 2,5 miliona komórek na studzienkę na sterylną, elastyczną membranę powleczoną kolagenem.Inkubuj komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez dwa dni, aż osiągną one pełną konfluencję. Następnie użyj wycinaka do biopsji o średnicy 1,5 mm, aby wykonać dwa otwory w każdej z sześciu wypustek zacisku, w odległości 20,5 mm od środka konstrukcji, jeśli nie jest wymagane wstępne naprężenie. Usuń pożywkę hodowlaną.Upewnij się, że siłownik mechaniczny znajduje się w pozycji zerowego odkształcenia, a następnie umieść membranę na rozciągaczu tak, aby otwory na wybijaki pokrywały się z pinami i zaciskami. Załóż górne zaciski, a następnie dokręcaj śruby pojedynczo, naprzemiennie z różnych stron. Dodaj 1 mL pożywki do hodowli komórkowej przed umieszczeniem urządzenia na stoliku mikroskopu.Ustaw urządzenie centralnie na drodze światła. Następnie przymocuj urządzenie do stolika. Ustaw ostrość na błonie, regulując pozycję urządzenia w płaszczyźnie oraz w pionie za pomocą kontrolera stolika mikroskopu w docelowym bloku wejściowym.Wprowadź wartość liczby obrotów silnika, która odpowiada pożądanemu poziomowi przyłożonego odkształcenia. Następnie ustaw wartość w bloku wejściowym prędkości na 10 RPM lub mniej, aby obserwować to samo pole przed i po rozciąganiu, ponieważ pole może przesunąć się względem obiektywu mikroskopu i podczas rozciągania konieczna może być regulacja stolika mikroskopu. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij go.Zacznij od przeprowadzenia regulacji mikroskopu sił atomowych. Zwiększ wysokość głowicy AFM do maksymalnej pozycji w kierunku Z. Następnie zamontuj przedłużki na nóżkach, aby podnieść płaszczyznę, na której wspornik AFM styka się z próbką.Następnie należy zdjąć płytkę skanera AFM oraz wybrany obiektyw z mikroskopu. Do obiektywu należy dołożyć podkładkę, a następnie zamontować go z powrotem w mikroskopie. Następnie należy ponownie umieścić płytkę skanera w AFM. Wysokość podkładki zależy od obiektywu i konkretnej konfiguracji AFM, jednak jej zastosowanie jest niezbędne w przypadku chęci obrazowania optycznego, ponieważ płaszczyzna obserwacji zostanie przesunięta w kierunku Z.Następnie uruchom oprogramowanie A FM, oprogramowanie mikroskopu optycznego oraz wszystkie niezbędne źródła światła, w tym źródło światła do pomiarów fluorescencji. Zamontuj w A FM chip z belką wspornikową o sztywności 200 pN/nm lub mniejszej, przeznaczoną do pomiaru modułu sprężystości żywych komórek. Następnie ustaw laser, zamontuj na urządzeniu szklaną lamellkę i wykorzystaj ją do kalibracji sztywności wspornika zgodnie z zaleceniami producenta. Bezpośrednio przed zamocowaniem membrany w urządzeniu do rozciągania, przytnij ścianki do wysokości około 1 mm.Zmniejsza to zakłócenia występujące między ściankami membrany a ogniwem pomiarowym. Następnie należy usunąć pożywkę hodowlano-komórkową i zamocować membranę w urządzeniu mechanicznym. Za pomocą oprogramowania umieść urządzenie mechaniczne z adapterem w skanerze.Przed nanoindentacją rozciągnij membranę do pożądanego poziomu odkształcenia rozciągającego. Dodaj 0,5 ml lub mniej pożywki na komórki, aby utrzymać ich nawodnienie, dbając jednocześnie o to, by nie dopuścić do rozlania cieczy, co mogłoby uszkodzić skaner FM lub mikroskop. Następnie wprowadź belkę wspornikową w kontakt z membraną.Należy postępować zgodnie z protokołem konkretnego urządzenia AFM w celu zeskanowania obszarów zainteresowania. Gdy do komórek wysianych na membranie przyłożono odkształcenie 20%, komórki przemieściły się o 20%, jak wskazano tutaj; wpływ komórek na produkcję reaktywnych form tlenu mierzono w komórkach nabłonka oskrzeli z wykorzystaniem kumulacyjnego sensora anionorodnika ponadtlenkowego mitochondrialnego, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. W przypadku braku rozciągania mechanicznego, produkcja ROS nie wzrosła znacząco w ciągu 60 minut po jednorazowym przyłożeniu i utrzymaniu rozciągnięcia 17%.Odnotowano wzrost mitochondrialnych ROS, który utrzymywał się przez kolejne 60 minut po włączeniu mechanicznego rozciągacza do mikroskopu sił atomowych. Moduł sprężystości oraz mapy komórek nabłonka płuc myszy przed i po 10% odkształceniu rozciągającym uzyskano z obszarów zaznaczonych tutaj. Zarejestrowano 300 indywidualnych krzywych ugięcia wymuszonego na obszarze 40 na 40 mikrometrów, co wykazało zmianę lokalizacji obszarów o wysokim module po zastosowaniu odkształcenia.Po opanowaniu techniki rozciąganie komórek można przeprowadzić w 15 minut. Z kolei nanoindentacja FM może zająć dwie godziny, aby została wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o ostrożnym, lecz szybkim obchodzeniu się z komórkami, ponieważ wyniki mogą ulec pogorszeniu wskutek wstrząsów i przedłużonej ekspozycji na powietrze pokojowe przed zarejestrowaniem danych. Należy pamiętać, że praca z FM może być niezwykle wymagająca.Podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak trzymanie wszystkich cieczy z dala od skanera.

live-cell-imaging-during-mechanical-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obrazowanie komórek żywych podczas rozciągania mechanicznego

Powszechnie wiadomo, że siły mechaniczne w organizmie mogą wpływać na różnicowanie i proliferację komórek. Przedstawiamy protokół wideo demonstrujący zastosowanie bioreaktora zbudowanego na zamówienie do przykładania jednowymiarowego cyklicznego odkształcenia rozciągającego do komórek macierzystych hodowanych na elastycznych podłożach z mikrowzorami.

Mechaniczna stymulacja komórek macierzystych z wykorzystaniem cyklicznego odkształcenia jednowymiarowego

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Siły mechaniczne odgrywają kluczową rolę w rozwoju płuc oraz w ich uszkadzaniu. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji komórek nabłonkowych typu II oraz fibroblastów z płuc płodowych gryzoni i poddawania ich stymulacji mechanicznej przy użyciu systemu in vitro.

Układ eksperymentalny do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Przedstawiamy tutaj nowatorskie urządzenie, które stosuje fale izotropowe i jednoosiowe odkształcenia na komórkach, wspierając hodowlę na substratach o regulowanej sztywności i konfigurowalnych macierzach białkowych. Ta prosta, ekonomiczna platforma umożliwia badaczom badanie, jak mechaniczne sygnały regulują funkcjonowanie komórek zarówno w badaniach podstawowych, jak i w kontekstach związanych z chorobą.

Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala obserwować odpowiedzi mechanobiologiczne komórek nabłonka płuc myszy.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Przeglądaj więcej filmów