Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja roli naprężeń mechanicznych w mechanobiologii komórek w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Osiąga się to poprzez zbudowanie najpierw systemu z elastycznymi błonami, na których rosną i rozciągają się komórki. W drugim kroku rozciągnij membranę, aby skalibrować liczbę silników z odkształceniem membrany.

Następnie komórki nabłonka płuc myszy są rozciągane i obrazowane są jądra. Aby pokazać, że naprężenie błony jest przenoszone na komórki, nosze zostały następnie włączone do A FM w celu wgłębienia nano w celu zmierzenia sztywności poszczególnych komórek przed i po rozciągnięciu. Wyniki wskazują na bezpośrednie uszkodzenia komórek spowodowane zastosowanym rozciąganiem.

Na podstawie obrazowania fluorescencyjnego wykazano również, że produkcja reaktywnych form tlenu wzrasta wraz z rozciąganiem. Cóż, ta metoda może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mechanicznej płuc, takie jak to, czy komórki nabłonkowe mogą zostać uszkodzone za pomocą wentylacji mechanicznej. Metoda ta może zapewnić wgląd w komórkę płuc, biologię mechaniczną, a także może być stosowana do innych tkanek miękkich, takich jak wątroba lub plastry płytki wzrostu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z powodu niekonwencjonalnej kombinacji narzędzi używanych w tych eksperymentach, takich jak mikroskop sił atomowych. Na początek przygotuj pokrytą kolagenem membranę PDMS zmodyfikowaną do stosowania w hodowli komórkowej, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wysiewaj komórki nabłonka płuc myszy w ilości 2,5 miliona komórek na studzienkę na sterylną, elastyczną membranę pokrytą kolagenem.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwa dni, aż komórki osiągną zgodność. Następnie użyj 1,5-milimetrowego stempla do biopsji, aby przebić dwa otwory w każdym z sześciu zakładek zaciskowych, 20,5 milimetra od środka konstrukcji, jeśli nie jest wymagane napięcie wstępne. I usuń pożywkę do hodowli komórkowych.

Upewnij się, że siłownik mechaniczny znajduje się w pozycji zerowego naprężenia i umieść membranę na noszach tak, aby otwory dziurkacza pokrywały się ze sworzniami i zaciskami. Umieść górne clamps na miejscu, a następnie dokręcaj pojedynczo, naprzemiennie z różnych stron. Dodaj jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych przed umieszczeniem urządzenia na stoliku mikroskopu.

Wyśrodkuj urządzenie na ścieżce światła. Następnie przymocuj urządzenie do sceny. Skoncentruj się na membranie, regulując położenie w płaszczyźnie i pionie urządzenia mechanicznego za pomocą sterownika stopnia mikroskopu w docelowym bloku wejściowym.

Wprowadź wartość liczby silnika, która odpowiada żądanemu poziomowi odkształcenia, który ma zostać zastosowany. Następnie ustaw wartość w bloku wejściowym prędkości na 10 obr./min lub mniej, aby obserwować to samo pole przed i po rozciągnięciu, ponieważ pole może się przesunąć w stosunku do obiektywu mikroskopu i może być konieczne dostosowanie stolika mikroskopu podczas rozciągania. Gdy wszystko zostanie ustawione, kliknij idź.

Zacznij od dokonania regulacji mikroskopu sił atomowych. Zwiększ wysokość głowicy FM do jej maksymalnego położenia w kierunku Z. Następnie umieść przedłużacze na nogach, aby podnieść płaszczyznę, w której wspornik FM styka się z próbką.

Następnie wyjmij płytkę skanera A FM i żądany obiektyw z mikroskopu. Dodaj podkładkę dystansową do obiektywu, a następnie zamontuj ją z powrotem na mikroskopie. Następnie umieść płytkę skanera z powrotem na A FM. Wysokość dystansu będzie zależeć od obiektywu i konkretnej konfiguracji FM, ale konieczne jest użycie dystansu, jeśli pożądane jest obrazowanie optyczne, ponieważ plan obserwacji zostanie przesunięty w kierunku Z.

Następnie uruchom oprogramowanie A FM, oprogramowanie mikroskopu optycznego i wszystkie niezbędne źródła światła, w tym źródło światła do pomiarów fluorescencji. Zamontuj chip z belką wspornikową o sztywności 200 niutonów piko na nanometr lub mniej do pomiaru modułu sprężystości komórek pod napięciem na A FM. Następnie ustaw laser w jednej linii, następnie zamontuj szklaną szkiełko nakrywkowe na urządzeniu i użyj jej do kalibracji sztywności wspornika zgodnie z zaleceniami producenta. Bezpośrednio przed zamontowaniem membrany do urządzenia rozciągającego przyciąć ściany do około jednego milimetra wysokości.

Zmniejsza to zakłócenia występujące między ściankami membrany a ogniwem obciążnikowym. Następnie wyjmij pożywkę do hodowli komórkowych i zamontuj membranę na urządzeniu mechanicznym. Umieść urządzenie mechaniczne z adapterem na skanerze za pomocą oprogramowania.

Rozciągnij membranę do pożądanego poziomu odkształcenia rozciągającego przed nanowgłębieniem. Dodaj 0,5 mililitra lub mniej pożywki na komórki, aby je nawodnić, ale uważaj również, aby uniknąć rozlania, które może uszkodzić skaner FM lub mikroskop. Następnie sprzęgnij belkę wspornikową z membraną.

Postępuj zgodnie z protokołem konkretnego urządzenia A FM, aby zeskanować obszary zainteresowania. Gdy 20% szczep został zastosowany do komórek wysianych na błonie, komórki przemieściły się o 20%, jak wskazano tutaj, wpływ komórek na produkcję reaktywnych form tlenu mierzono w komórkach nabłonka oskrzeli za pomocą skumulowanego mitochondrialnego czujnika ponadtlenkowego, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. W przypadku braku mechanicznego rozciągania, produkcja ROS nie wzrosła znacząco w ciągu 60 minut, gdy zastosowano i utrzymano pojedynczy 17% rozciąg.

Nastąpił wzrost mitochondrialnych ROS, który utrzymywał się przez kolejne 60 minut po włączeniu noszy mechanicznych do mikroskopu sił atomowych. Moduł sprężystości, mapy komórek nabłonka płuc myszy przed i po 10% odkształceniu rozciągającym uzyskano z przedstawionych tutaj regionów. Zarejestrowano 300 indywidualnych krzywych wymuszonego ugięcia na obszarze o wymiarach 40 na 40 mikrometrów, co wykazało zmianę lokalizacji obszarów wysokiego modułu przy zastosowaniu odkształcenia.

Po opanowaniu rozciąganie komórek można wykonać w 15 minut. Podczas gdy wgłębienie FM nano może zająć dwie godziny prawidłowego działania Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o ostrożnym, ale szybkim obchodzeniu się z ogniwami, ponieważ na wyniki może mieć negatywny wpływ mieszanie i długotrwała ekspozycja powietrza w pomieszczeniu przed podaniem danych. Nie zapominaj, że praca z FM może być niezwykle trudna.

Podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak trzymanie wszystkich płynów z dala od skanera.