Name: Znakowanie i przeszczepianie za pośrednictwem wirusów komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj metodę wirusowej transdukcji komórek MGE przed przeszczepieniem do kory mózgowej. Technika ta umożliwia badanie genetycznie modyfikowanych podgrup interneuronów GABAergicznych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla JLRR od: Autism Speaks, Nina Ireland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 i NIMH R37 MH049428. PRW było wspierane przez stypendium Narodowej Rady Nauki Tajwanu. SFS był wspierany przez F32 (MH103003).

Oświadczenie etyczne: Następujące procedury zostały zatwierdzone przez naszą instytucję i protokół dla zwierząt. Upewnij się, że uzyskałeś zgodę na wszystkie procedury obejmujące operacje przetrwania przed rozpoczęciem eksperymentów i sprawdź, czy wszystkie protokoły są aktualne.
1. Przygotowanie do lentiwirusa (krok opcjonalny)
<ol>
	<li>Podziel trzy 10 cm płytki z HEK293T komórek dla każdego lentiwirusa, który ma zostać wykonany, w obecności 10 ml DMEM/10% FBS i osiągnij ~60-70% konfluencji. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Transfekcję następujących plazmidów DNA (łącznie 10 μg) na każdą płytkę przy użyciu dowolnego odczynnika do transfekcji: 6,4 μg wektora lentiwirusowego CAG-Flex-GFP (sekwencja wektora DNA podana w tabeli 1), 1,2 μg pMD2.G (koduje VSV-g), 1,2 μg pRSV-Rev i 1,2 μg pMDLg/pRRE. Trzy wektory opakowania lentiwirusowego są dostępne w handlu (tabela 
	Uwaga: To konkretne podejście wykorzystuje wektory lentiwirusowe 3. generacji, ale wektory 2. generacji i związane z nimi plazmidy również będą działać.</li>
	<li>Przygotuj pojemnik na odpady zawierający 10% roztwór wybielacza w okapie z certyfikatem BSL2, aby dezaktywować wszelkie roztwory lub urządzenia, które miały kontakt z lentiwirusem lub je zawierały. Następnie całkowicie usuń pożywkę 4-6 godzin po transfekcji do roztworu wybielacza, zastąp taką samą objętością nowego podłoża i pozwól komórkom rosnąć.</li>
	<li>Po 4 dniach zebrać pożywkę do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 15 minut, aby osadzać wszelkie resztki komórek. Następnie przefiltrować supernatant przez membranę 0,45 μm. Każdy filtr o niskim poziomie wiązania białek, taki jak PVDF, działa dobrze. Uwaga: w roztworze wybielacza należy umieścić zarówno stałe, jak i płynne odpady wirusowe.</li>
	<li>Załadować 30 ml przefiltrowanego supernatantu do probówek ultrawirówek i do ultrawirówki. Wirować przy 100 000 x g przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C. Otwórz probówki wirówkowe w okapie BSL2 i usuń supernatant do 10% wybielacza. Dodaj ~100 μl PBS do osadu, co daje miano 1x10^7-8 jednostek zakaźnych/ml. Porcję podwielokrotności należy podać następnego dnia i przechowywać w temperaturze -80 °C. Podwielokrotności lentiwirusa są stabilne w temperaturze -80 °C przez co najmniej sześć miesięcy.</li>
	<li>Ważna uwaga: Wiele instytucji ma teraz rdzenie wirusowe. Pozyskać skoncentrowany wirus o minimalnym mianie 1x107 jednostek zakaźnych/ml, aby uzyskać optymalne wyniki.</li>
</ol>
2. Myszy dawcy do sekcji MGE
<ol>
	<li>Najpierw ustaw krycie w czasie między linią zainteresowania wyrażającą Cre a myszą typu dzikiego (WT) lub myszą, która wyrazi reportera po rekombinacji za pośrednictwem Cre. 
	Uwaga: Wiele linii Cre-driver jest transgenicznych i jest utrzymywanych i hodowanych w stanie hemizygotycznym. W związku z tym tylko połowa zarodków będzie zawierała transgen Cre. DNA można szybko przygotować z zarodków do krótkiej reakcji PCR w celu wykrycia allelu Cre. Zarodki Cre+ mogą być następnie pobrane tak, aby wykorzystana została tylko tkanka MGE o pożądanym genotypie. Alternatywnie można użyć osoby zgłaszającej zależnej od Cre, aby wybrać zarodki do sekcji i przeszczepienia MGE.</li>
	<li>Oblicz, który dzień będzie odpowiadał E13.5. Jeśli zwierzęta zostały sparowane poprzedniego wieczoru, dzień wtyczki wynosi 0,5. Zamów myszy w ciąży w ciąży w czasie lub samicę WT ze szczeniętami P1, aby mieć myszy po urodzeniu (P)1 w dniu, w którym tkanka dawcy będzie E13.5. Alternatywnie, należy zorganizować te krycia w domu na tydzień przed sparowaniem zwierząt-dawców. 
	Uwaga: Poprzednia strategia polegająca na generowaniu zarówno zarodków/młodych E13,5, jak i P1 na ten sam dzień jest często trudna do niezawodnego wykonania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mediów, narzędzi i sprzętu.
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki i narzędzia do przygotowania komórek MGE (Tabela 2).
	<ol>
		<li>Przygotuj czystą powierzchnię i umieść na niej czyste kleszcze, nożyczki i nóż mikrochirurgiczny lub cienkie kleszcze (do precyzyjnego wycięcia tkanek).</li>
		<li>Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) do sekcji oraz zmodyfikowaną pożywkę orła (DMEM) firmy Dulbeco z 10% płodowym surem bydlęcym (FBS) do transdukcji.</li>
		<li>Wstępnie inkubować 20-30 ml DMEM/10% FBS w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę. Pokrywę należy poluzować, aby umożliwić wymianę gazową i wyrównanie pH pożywki. 
		Uwaga: Preinkubację pożywki można przygotować tuż przed rozpoczęciem sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek MGE
<ol>
	<li>Złożyć ciężarną mysz w ofierze zgodnie z zatwierdzonym protokołem zwierzęcym i usunąć zarodki na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty HBSS.</li>
	<li>Usuń mózg z każdego zarodka za pomocą lunety preparacyjnej (wykonuj pojedynczo, pozostawiając resztę zarodków w lodowatym HBSS), a następnie przystąp do wycinania tkanki MGE. 
	Uwaga: Poniżej i na rysunku 1 szczegółowo opisano kluczowe kroki pokazujące, jak usunąć MGE. Ponadto na rysunku 2 znajduje się film przedstawiający całą procedurę sekcji.
	<ol>
		<li>Ustaw mózg brzuszną stroną skierowaną do góry (ryc. 1A, A'). Uwaga: nie ma nic złego w tym, aby strona grzbietowa była skierowana do góry. Przetnij mózg na pół wzdłuż płaszczyzny szoskowej, aby uzyskać dwa kawałki. Pokazano przykład mózgu podzielonego na półkę (ryc. 1B, B'), zauważ, że grzbietowe (leżąca nad nim kora) i brzuszne aspekty mózgu pokrywają i otaczają tkankę wypukłości zwojowej (GE).</li>
		<li>Następnie, ręką dominującą, trzymaj albo bardzo cienkie kleszcze, albo nóż kłujący (Tabela 2), jednocześnie unieruchamiając półkulę kleszczami trzymanymi przez rękę niedominującą. (Przyśrodkowy aspekt półkuli powinien być skierowany do góry). Rozłóż tkankę grzbietową i brzuszną za pomocą kleszczy i noża kłującego, aby odsłonić leżącą pod spodem tkankę GE (ryc. 1C i zilustrowana na rycinie 1C'). 
		Uwaga: Usunięcie części pożywki z szalki Petriego może ułatwić stabilizację tkanki podczas wykonywania sekcji MGE.</li>
		<li>Wykonuj proste cięcia nożem lub cienkimi kleszczami, aby oddzielić tkanki CGE, LGE i przegrody (patrz przykładowe cięcia oznaczone czerwonymi przerywanymi liniami, rysunki 1D i D'). Cięcia te mogą być wykonywane w dowolnej kolejności. 
		Uwaga: Wyobraź sobie MGE jako "pudełko", które jest wycięte z otaczającej tkanki. Pomaga to w powtarzalnym wykonywaniu podobnych cięć dla każdej sekcji, zmniejszając w ten sposób zmienność sekcji tkanek.</li>
		<li>Na koniec obróć MGE na bok i odetnij spód (co było bocznym aspektem mózgu). Powoduje to usunięcie strefy płaszcza MGE (odrzucić na rysunkach 1E i 1E') od reszty MGE. Pozostały aspekt MGE zawiera głównie część MGE ze strefą komorową i podkomorową, która zawiera prawie wszystkie komórki progenitorowe MGE. Kontynuuj z tą tkanką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ważna uwaga: Dodanie żelu silikonowego na dno szalki Petriego może służyć jako doskonała powierzchnia do rozwarstwiania, ponieważ chroni delikatne końcówki kleszczy i zapewnia miękką powierzchnię do przypinania tkanki kleszczami.</li>
</ol>
4.3 Dodatkowe strategie dla MGE Dissection.
<ol>
	<li>Przetnij skórę zarodka za pomocą kleszczy jak nożyczek, aby szybko usunąć mózg. Gdy zarodek leży na boku, przytrzymaj tkankę u podstawy głowy za pomocą kleszczy używanych do zakotwiczenia tkanki. Najpierw przetnij przednią brzuszną do mózgu i tylną brzuszną do mózgu, a następnie połącz dwa cięcia wzdłuż boku zarodka. Następnie chwyć płat skóry i przeciągnij go przez górną część mózgu. Mózg można następnie szybko wypreparować z pozostałej tkanki.</li>
	<li>Alternatywnie, zakotwicz tylną część całego mózgu za korą mózgową. W międzyczasie chwyć każdą półkulę w najbardziej grzbietowym ogonowym aspekcie kory i oderwij korę od zakotwiczonej tkanki w kierunku przednim. W ten sposób można usunąć obie korowe i ujawnić obustronne wypukłości zwojowe, nadal przyczepione do reszty tkanki, zachowując anatomię przyśrodkowo-boczną.</li>
	<li>Przełącz się na nóż kłujący, aby wykonywać precyzyjne cięcia wokół MGE na każdej półkuli. Użyj oddzielnego czystego zestawu kleszczyków do pobrania MGE lub pipety z dużą końcówką (np. P1000). 
	nuta: Pobraną tkankę należy trzymać z dala od wszelkiego innego wypreparowanego materiału, ponieważ niektóre podłoża są nieuchronnie przenoszone podczas pobierania MGE.</li>
	<li>Pobrać MGE i umieścić tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej DMEM/10% FBS (objętość 500 μl jest wystarczająca do zebrania MGE). Powtórz dla drugiej półkuli i umieść w tej samej probówce zbiorczej. Próbki należy przechowywać na lodzie do momentu zebrania całej tkanki.</li>
</ol>
5. Znakowanie i przeszczepianie lentiwirusów
<ol>
	<li>Przenieś probówki z tkanką MGE do kaptura z certyfikatem BSL2 i wyjmij nośnik. 
	Uwaga: Tkanka MGE jest wystarczająco duża, aby była widoczna dla oka i osiada na dnie tubki, umożliwiając łatwe i delikatne usunięcie zimnego podłoża.</li>
	<li>Dodaj ~ 500 ul pożywki DMEM/10% FBS, która była wstępnie inkubowana w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C. Następnie dodać polibren, aby ułatwić transdukcję do każdej probówki w końcowym stężeniu 8 μg/ml. Potarytuj tkankę MGE, aby utworzyć zawiesinę pojedynczej komórki, używając końcówki pipety P1000. Na koniec dodaj ~15-20 μl skoncentrowanego lentiwirusa do każdej probówki.</li>
	<li>Ważna uwaga: Tryturacja 10-12 razy jest wystarczająca do rozbicia tkanki MGE z pojedynczego zarodka, ale może być wymagane więcej trituracji, jeśli wiele MGE jest połączonych razem. Wypróbuj różne warunki trituracji, aby określić, co działa najlepiej.</li>
	<li>Dokładnie zamknij każdą probówkę, odwróć do mieszania, a następnie umieść wszystkie probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Inkubować komórki w lentiwirusie przez co najmniej 30 minut i do 1 godziny. Dłuższe czasy spowodowały zmniejszoną żywotność komórek. Odwracaj rurki co 10 minut, aż skończy się czas.</li>
	<li>Po inkubacji z lentiwirusem wyjmij probówki z inkubatora i odwiruj przy ~700 x g przez 3 minuty w celu osadzenia komórek. W okapie BSL2 usuń supernatant i wyrzuć do 10% wybielacza. Następnie dodaj 1 ml DMEM/10% FBS i rozetrzyj osad 2-3 razy w celu umycia, a następnie ponownie odwiruj z tą samą prędkością, aby osadzać komórki. Powtórz ten krok prania jeszcze 2-3 razy, aby usunąć nadmiar wirusa. 
	Uwaga: Etapy wirowania należy wykonywać w temperaturze 4 °C, jednak nie zaobserwowano zmniejszonej żywotności w przypadku krótkich wirowań w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po ostatnim umyciu usuń jak najwięcej pożywki i połóż każdą tubkę na lodzie. Ze względu na resztki pożywki po bokach probówki, ~2-3 μl pożywki pokryją osad komórkowy do czasu rozpoczęcia procedury przeszczepu.</li>
</ol>
6. Transplantacja i walidacja
<ol>
	<li>Zdobądź szczenięta żywiciela P1 i przygotuj obszar zabiegu, spryskując go 70% etanolem. W celu zachowania sterylności podczas zabiegu zaleca się wykonywanie tych zabiegów w dedykowanym czystym pomieszczeniu zabiegowym. Ponadto użyj autoklawowanych narzędzi chirurgicznych, sterylizuj powierzchnie, z którymi szczenięta będą miały kontakt, używając 70% etanolu. Przykład reprezentatywnego sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia przeszczepów oraz reprezentatywnego obszaru zabiegowego przedstawiono na rysunku 3.</li>
</ol>
Uwaga: Chociaż ta procedura polega na wstrzykiwaniu małych objętości, a nie na zabiegu chirurgicznym, który wymagałby nacięcia, otwartej rany lub szwów, nadal zaleca się, aby dla każdej myszy do wstrzyknięcia była używana nowa mikropipeta. Mikropipety są sterylizowane termicznie po pociągnięciu i ukosowaniu na powierzchni, która została spryskana 70% etanolem i jest przechowywana w szczelnie zamkniętym pojemniku.
<ol>
	<li>Mikropipety należy wytwarzać tak, aby miały średnicę końcówki między 40-80 μm. Przestrzeganie tych wymiarów przyniesie optymalne wyniki. Wysterylizuj na gorąco mikropipety po pociągnięciu i ukosowaniu na powierzchni, a następnie spryskaj 70% etanolem przed przechowywaniem mikropipet w szczelnie zamkniętym pojemniku. 
	Uwaga: Alternatywnie, jeśli dostęp do urządzeń potrzebnych do wytworzenia tych igieł (Tabela 2) jest ograniczony, należy użyć innego urządzenia do wstrzykiwań. Jednak mogą one nie być tak dobrze dopasowane jak mikropipety ze względu na różne średnice.</li>
	<li>Pobrać olej mineralny do strzykawki o pojemności 1 ml i za pomocą igły 30 1/2 G całkowicie napełnić szklaną pipetę olejem mineralnym. Następnie zamontuj tłok na urządzeniu stereotaktycznym, a następnie przymocuj szklaną pipetę do urządzenia stereotaktycznego i załaduj na tłok. Za pomocą napędu hydraulicznego przesunąć tłok mniej więcej do połowy szklanej pipety, usuwając rozlewający się olej mineralny za pomocą czystego ręcznika papierowego.
	<ol>
		<li>Zamiast używać strzykawki, zanurz tylny koniec pipety w oleju mineralnym i napełnij go kapilarnie. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w pipecie, należy utrzymywać nadciśnienie na strzykawce aż do całkowitego wyjęcia ze szklanej pipety. 
		Uwaga: Do skutecznego przeszczepu komórek MGE 14 można użyć innych urządzeń. Każde urządzenie, które może dostarczyć objętość mniejszą lub zbliżoną do 100 nl, dobrze sprawdza się w tej procedurze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie użyj sterylnego ręcznika papierowego lub dowolnego materiału chłonnego, z rogiem skręconym w drobny punkt, aby delikatnie usunąć nadmiar pożywki nad granulką komórek MGE. Ten etap koncentruje gęstość komórek, dzięki czemu można uzyskać mniejsze objętości iniekcji. Następnie użyj pipety o małej objętości (preferowany jest P2), aby powoli wyciągnąć osad komórkowy i rozcierać 1-2 razy przed przeniesieniem zawiesiny komórek na powierzchnię hydrofobową. Objętość powinna wynosić nieco poniżej 1 μl. Wsunąć końcówkę igły do zawiesiny kuwety i za pomocą napędu hydraulicznego wciągnąć zawiesinę do pipety.</li>
	<li> Znieczulić szczeniaka P1 przez hipotermię (zawinąć w lateksową rękawiczkę i położyć na lodzie na ~ 2-4 min). Sprawdź skuteczność znieczulenia szkodliwym bodźcem. Ściśnij skórę między palcami cienkimi kleszczami: szczenię powinno przestać reagować, jeśli zostanie uszczypnięte. Następnie umieść szczeniaka na formie, która znajduje się pod urządzeniem do wstrzykiwania, a następnie napnij skórę, odciągając skórę na głowie i zabezpieczając standardową taśmą laboratoryjną. 
	Uwaga: Chociaż hipotermia jest bardzo skuteczna u nowonarodzonych myszy i powoduje niską śmiertelność, zabiegi należy wykonywać szybko, ponieważ młode zaczną wracać do zdrowia w mniej niż 10 minut. Ponadto 4 minuty na lodzie to górna granica tego, co można tolerować. Proszę próbować wywołać hipotermię tylko raz, jeśli potrzeba więcej czasu na wstrzyknięcia. Jeśli jednak szczenię wcześnie wyzdrowieje, najpierw pozwól mu w pełni wyzdrowieć, zanim ponownie wywołasz hipotermię. Co więcej, wywołaj hipotermię tylko raz jeszcze raz, aby wykonać zastrzyki. Szczenięta wyzdrowieją w ciągu 5-10 minut od hipotermii. Można to ułatwić, umieszczając szczenięta z miotem i mamą lub umieszczając szczenię na ciepłej powierzchni, aby mogło dojść do siebie.</li>
	<li>Za pomocą urządzenia stereotaktycznego umieść końcówkę szklanej pipety na powierzchni głowy szczeniaka, prostopadle do powierzchni głowy. Gdy pipeta styka się z głowicą, należy to uznać za wartość "0". Następnie wepchnij pipetę przez powierzchnię skóry i czaszki do kory mózgowej, a następnie włóż i wsuń pipetę ~ 2 razy przed zatrzymaniem. W celu optymalnego ukierunkowania komórek do kory nowej, iniekcje wykonuje się, gdy mikropipeta znajduje się na głębokości 0,1 mm. Jednak powinno to zostać zoptymalizowane przez użytkownika (patrz uwaga poniżej). 
	Uwaga: Chociaż głębokość ta niezawodnie celuje w głębsze warstwy kory nowej za pomocą urządzeń opisanych powyżej, kilka głębokości powinno zostać przetestowanych empirycznie. Ponadto należy przetestować zakres głębokości w różnych pozycjach ogonowo-ogonowych i przyśrodkowo-bocznych, aby określić, jaka głębokość jest optymalna w każdym miejscu. Również początkowe nakłucie powinno być szybkie, ponieważ powolna penetracja kory nowej zmniejsza zdolność do czystej penetracji tkanki. Wypróbuj różne prędkości przy pierwszym uruchomieniu tej procedury, aby znaleźć to, co działa najlepiej. Ponadto, do testowania współrzędnych, nic nie zastąpi używania oznaczonych komórek, ponieważ barwniki nie są w stanie oznaczyć pozycji.</li>
	<li>Gdy igła znajdzie się na swoim miejscu, obróć urządzenie hydrauliczne, aby przesunąć tłok do szklanej pipety, wpychając określoną objętość zawiesiny komórek do kory mózgowej. Wstrzyknąć 50-70 jl na miejsce. Powtórz tę procedurę w 3-6 różnych miejscach na różnych poziomach rostralno-ogonowych, jeśli celem jest uzyskanie szerokiego rozmieszczenia komórek w całej korze nowej. 
	Uwaga: Objętości 100 nl lub większe mogą powodować zmiany chorobowe i prowadzić do dużych skupisk wstrzykniętych komórek, które nie są w stanie skutecznie wyemigrować z miejsca wstrzyknięcia. W związku z tym mniejsze objętości iniekcji (~70 nl lub mniej) są optymalne, w większej liczbie miejsc, jeśli pozwala na to czas.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzyknięć usuń szczenię ze sceny i oznacz je (obcinanie palców u nóg jest niezawodnym sposobem późniejszej identyfikacji szczeniąt). Gdy szczenię wyzdrowieje i będzie w stanie samodzielnie się poruszać (następuje to w ciągu kilku minut od usunięcia go ze sceny), umieść je z powrotem z mamą i miotem. 
	Uwaga: Ponieważ jest to procedura minimalnie inwazyjna, nie ma zabiegów pooperacyjnych, gdy szczenię swobodnie się porusza i jest ogrzane. Jednak szczenięta powinny być badane nie tylko po zabiegu, ale także następnego dnia, aby upewnić się, że nie mają oznak pogarszającego się stanu zdrowia.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem procedury na następnym szczeniaku spryskaj obszar 70% etanolem, aby utrzymać sterylne miejsce pracy. Pozwolić młodym, którym wstrzyknięto implanty, rozwinąć się, a następnie ocenić tkankę na odpowiednim etapie rozwoju.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+GABA+innervation+in+the+cerebral+and+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).</li>
<li>Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+of+autism%3A+increased+ratio+of+excitation%2Finhibition+in+key+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+brain%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems.</a> Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).</li>
<li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+migration+from+basal+forebrain+to+neocortex%3A+dependence+on+Dlx+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes.</a> Science. 278 (5337), 474-476 (1997).</li>
<li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).</li>
<li>Gelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Wide+Diversity+of+Cortical+GABAergic+Interneurons+Derives+from+the+Embryonic+Preoptic+Area%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area.</a> J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Bias+in+the+Mitotic+Origins+of+Somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22and+Parvalbumin-Expressing+Interneuron+Subgroups+and+the+Chandelier+Subtype+in+the+Medial+Ganglionic%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin.</a> and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Resource+of+Cre+Driver+Lines+for+Genetic+Targeting+of+GABAergic+Neurons+in+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Bio. 3 (5), e159(2005).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+progenitors+grafted+into+the+adult+epileptic+brain+control+seizures+and+abnormal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).</li>
<li>Braz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+GABAergic+Neuron+Precursors+Integrate+into+Adult+Spinal+Cord+and+Reduce+Injury-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain.</a> Neuron. 74, 663-675 (2012).</li>
<li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+Directly+Regulates+Arx+and+CXCR7+to+Determine+Cortical+Interneuron+Fate+and+Laminar+Position%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position.</a> Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).</li>
<li>Arguello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper+Antagonist+of+Catenin-1+Cooperates+with+Dishevelled-1+during+Postsynaptic+Development+in+Mouse+Forebrain+GABAergic+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67679(2013).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li>
<li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%E2%80%9CMGE+Enhancers%E2%80%9D+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Progenitors+and+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956(2013).</li>
<li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zastosowanie prekursorów interneuronów korowych GABA-ergiczne z eminencji embrionalnych zwojów (GE) w terapiach komórkowych jest obiecujące w przypadku wielu schorzeń 12-1 4. Potrzebne są precyzyjne techniki molekularne do śledzenia i ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania w określonych podgrupach interneuronów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół znakowania embrionalnych komórek MGE lentiwirusami przed przeszczepem i pokazujemy, w jaki sposób ta technika może b...

GABAergiczne interneurony korowe stanowią ~20-30% neuronów w korze nowej ssaków, podczas gdy reszta odpowiada pobudzającym, glutaminergicznym neuronom głównym. Interneurony są bardzo zróżnicowane pod względem właściwości elektrofizjologicznych, morfologii aksonów i dendrytów oraz ukierunkowania synaptycznego 1, a przypuszcza się, że nierównowaga w tonie pobudzającym/hamującym leży u podstaw niektórych fenotypów zaburzeń neurologicznych/neuropsychiatrycznych, w tym autyzmu, schizofrenii i epilepsji 2. Ogólnym celem opisanego w niniejszym dokumencie protokołu jest zapewnienie środków do skutecznej genetycznej modyfikacji komórek progenitorowych interneuronów kory GABA-ergicznej przed przeszczepem do analiz in vivo.
Korowe interneurony GABA-ergiczne rodzą się w wypukłościach przyśrodkowych i ogonowych (odpowiednio MGE i CGE) 3,4 oraz w obszarze przedwzrokowym 5. Komórki progenitorowe interneuronów korowych przechodzą długodystansową migrację styczną, po której następuje migracja radialna, aby osiągnąć swoje ostateczne cele. Po dotarciu do miejsca przeznaczenia te interneurony korowe muszą prawidłowo zintegrować się z istniejącą siecią neuronalną, a każda unikalna podgrupa interneuronów będzie przyczyniać się do obwodów korowych w określony sposób. Na podstawie markerów molekularnych można wyróżnić cztery główne podgrupy: podgrupy somatostatyny (SST)+ i parwalbuminy (PV)+ pochodzące z MGE oraz wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP)+ i reelina+ pochodzące z CGE; SST - podgrupy 6. Różne podgrupy interneuronów korowych rodzą się w różnym czasie rozwoju embrionalnego w MGE i CGE 7, 8. Te i inne korowe markery interneuronów GABA-ergiczny zostały wykorzystane do wygenerowania specyficznych linii sterownika Cre dla wielu z tych podgrup 9-11.
Przeszczep progenitorów MGE pojawił się jako potencjalna terapia komórkowa do leczenia zaburzeń, które mogą być spowodowane brakiem równowagi w pobudzeniu/hamowaniu 12–24. Te korzyści terapeutyczne mogą wynikać częściowo z unikalnej zdolności progenitorów MGE (do rozpraszania, różnicowania i integracji z mózgiem gospodarza) lub potencjalnie z tego, że wiele okołosomatycznych komórek hamujących PV+ pochodzi z MGE. Komórki MGE mogą być również szybko i skutecznie transdukowane lentiwirusami przed przeszczepem 15, co pozwala na badanie in vivo komórek, które są genetycznie modyfikowane in vitro. Uzasadnieniem dla opracowania tego podejścia było pokonanie przeszkód w badaniu rozwoju i dojrzewania interneuronów kory mózgowej GABA-ergiczne. W szczególności przeszczep MGE pozwolił naukowcom na zbadanie rozwoju zmutowanych komórek in vivo, podczas gdy w przeciwnym razie zmutowana mysz zmarłaby we wczesnym czasie. Co więcej, wprowadzając interesujące geny przed przeszczepem, można było skutecznie ocenić wpływ określonych genów na zmutowany fenotyp.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół transdukcji komórek MGE za pomocą lentiwirusów przed przeszczepem. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób technikę tę można dostosować do ekspresji interesującego genu w określonych podgrupach interneuronów z heterogenicznej grupy prekursorów interneuronów korowych, wykorzystując kombinację lentiwirusów o ekspresji Cre i dostępnych linii myszy Cre-driver. Co więcej, protokół ten wprowadza techniki i platformę dla naukowców do genetycznej modyfikacji prekursorów interneuronów korowych GABA-ergiczne do badań in vivo w unikalny sposób. Jedną z zalet tej techniki w porównaniu z innymi obecnymi podejściami jest to, że przeszczepione komórki MGE rozpraszają się z dala od miejsca wstrzyknięcia. Ponadto, w przeciwieństwie do ogniskowych zastrzyków wirusowych, po rozproszeniu komórek MGE ich morfologia jest łatwiejsza do oceny. Podejście to można wykorzystać do zbadania wpływu wprowadzenia interesujących genów do komórek typu dzikiego lub zmutowanego, wprowadzenia reportera specyficznego dla typu komórki w celu oceny morfologii lub potencjalnie do zbadania wpływu alleli choroby in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki i sprzęt do przeszczepu komórek MGE</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>30 1/2 G</td><td>igła 305106</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjny otwór do dostarczania 5 &mikro; l (w zestawie z tłokiem)</td> <td>5-000-1005</td> Firma <td></td><td>naukowa Drummond</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy ze statywem **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Digital tylko dla myszy instrument stereotaktyczny **</td><td>51725D</td><td>Firma</td><td></td>Stoelting</tr><tr><td>Jednoosiowy mikromanipulator olejowo-hydrauliczny **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Ukosowanie obrotowe z powłoką diamentową</td><td>produkcji własnej</td><td></td>Ściągacz do pipet igłowych 730 Kopf <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> instrumenty</td><td></td></tr><tr><td>Olej</td><td></td> mineralny <td>Każda apteka lub apteka</td><td></td></tr><tr><td>Dowolna pipeta i końcówki, które mogą polegać na pomiarze 1 i mikro; l objętości</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** To są konkretne modele, których używamy, ale wiele innych konfiguracji powinno działać</td></tr><tr><td colspan="4">Opcjonalne odczynniki (do produkcji lentiwirusów)</td></tr><tr><td>25 mm, 0,45 i mikro; m filtr</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe (25 x 89 mm)</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (rozmiar 1,5 ml)</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inne dostępne na rynku materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE kodowanie plazmidu gag/pol</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>kodowanie plazmidu pRSV-Rev Rev</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>kodowanie plazmidu pMD2.G VSVG</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgene</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie i przeszczepianie za pośrednictwem wirusów komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (mge) do badań in vivo

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

GABAergiczne interneurony korowe, wywodzące się z eminencji przyśrodkowej i ogonowej (MGE i CGE), są funkcjonalnie i morfologicznie zróżnicowane. Poczyniono postępy w zrozumieniu ról różnych podgrup interneuronów korowych, jednak nadal istnieje wiele mechanizmów do opracowania, które mogą przyczynić się do rozwoju i dojrzewania różnych typów komórek GABA-ergicznych. Co więcej, zmieniona sygnalizacja GABA-ergiczna może przyczyniać się do fenotypów autyzmu, schizofrenii i epilepsji. Specyficzne linie sterujące Cre zaczęły rozdzielać funkcje unikalnych podgrup interneuronów. Pomimo postępów w modelach mysich, często trudno jest skutecznie badać progenitory interneuronów korowych GABA-ergiczne za pomocą podejść molekularnych in vivo. Jedną z ważnych technik stosowanych do badania autonomicznego programowania tych komórek jest przeszczepianie komórek MGE do kory gospodarza. Te przeszczepione komórki migrują intensywnie, różnicują się i integrują funkcjonalnie. Ponadto komórki MGE mogą być skutecznie transdukowane lentiwirusem bezpośrednio przed przeszczepem, co pozwala na wiele podejść molekularnych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej transdukcji komórek MGE przed przeszczepem do analizy in vivo, przy użyciu dostępnych linii sterownika Cre i wektorów ekspresyjnych zależnych od Cre. Takie podejście jest korzystne, ponieważ łączy precyzyjną manipulację genetyczną ze zdolnością tych komórek do dyspersji po przeszczepie, co pozwala na większą rozdzielczość specyficzną dla typu komórki in vivo.

Ponieważ komórki MGE posiadają unikalną zdolność do migracji i integracji po przeszczepieniu do neokory gospodarza 16, stanowią one doskonały system modelowy do manipulacji genetycznych przed badaniami in vivo. W niniejszej pracy pokazujemy, w jaki sposób można wyizolować tkankę MGE z embrionów E13.5 (Ryciny 1 i 2), która może być następnie transdukowana lentiwirusami albo in vitro, albo w sposób szybki przed przeszczepieniem do badań in vivo. Znakowanie MGE za pomoc...

GABAergiczne pregenty interneuronów korowych rozpraszają się, rozwijają i synaptycznie integrują z korą gospodarza po przeszczepie. Komórki te mogą być łatwo transdukowane przed przeszczepem do badań in vivo genetycznie zmodyfikowanych prekursorów GABA-ergicznych. Tutaj pokazujemy techniki znakowania wirusów w celu ukierunkowania na określone podgrupy interneuronów przy użyciu istniejących linii Cre i reporterów zależnych od Cre.

Znakowanie i przeszczepianie za pośrednictwem wirusów komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka transdukcja wirusowa progenitorów neuronów GABAergicznych z komórek MGE przed ich transplantacją do organizmu biorcy w celu przeprowadzenia badań in vivo. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie komórek MGE z zarodka dawcy dodatniego pod kątem Cree. Drugim krokiem jest szybkie i wydajne znakowanie wyizolowanych komórek MGE wirusem zaprojektowanym w konkretnym celu, takim jak znakowanie określonego typu komórek.Następnie komórki poddane transdukcji są przeszczepiane do organizmu gospodarza i pozostawione do rozwoju in vivo. W odpowiednim czasie można zastosować mikroskopię lub inne techniki w celu oceny przetransdukowanych i przeszczepionych komórek. Jedną z głównych zalet tego podejścia w porównaniu z innymi technikami, takimi jak bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa, jest fakt, że komórki MGE migrują na znaczną odległość od miejsca wstrzyknięcia, które jest miejscem urazu, co umożliwia badanie komórek w bardziej naturalnym środowisku.Ponieważ komórki MGE są progenitorami neuronów korowych, a typ komórek ten jest zaangażowany w zaburzenia neuropsychiatryczne, w tym autyzm, schizofrenię i epilepsję, uważamy, że techniki opisane w niniejszym materiale pomogą w rzeczywistości zgłębić biologiczne podstawy niektórych z tych chorób neuropsychiatrycznych. Dodatkowo technika ta zapewnia szybki sposób genetycznej modyfikacji tych komórek na potrzeby badań in vivo. Po przygotowaniu lentiwirusa i wypreparowaniu MGE, zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym, należy zebrać obie półkule MGE i umieścić tkankę w dwóch probówkach do zbierania o pojemności 1.5 ml zawierających 500 µL DMEM z 10% FBS. Próbki należy przechowywać w lodzie do momentu zebrania całej tkanki.Następnie przenieś probówki do certyfikowanego dygestorium klasy BSL 2. Ostrożnie odessij pożywkę, nie naruszając osiadłej na dnie probówki tkanki MGE. Następnie dodaj około 500 µL podgrzanej wcześniej pożywki DMEM z 10% FBS.Dodaj poly brain do stężenia końcowego 8 µg/mL i trituruj za pomocą końcówki pipety P 1000, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie dodaj od 15 do 20 µL skoncentrowanego lentiwirusa do każdej probówki. Następnie szczelnie zamknij każdą probówkę, odwróć w celu wymieszania, a następnie umieść wszystkie probówki w inkubatorze w temperaturze 37 °C.Inkubuj komórki z lentiwirusem przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż godzinę, ponieważ dłuższy czas inkubacji prowadził do zmniejszenia żywotności komórek. Przez cały czas inkubacji odwracaj probówki co 10 minut.Wyjmij probówki z inkubatora i wiruj przy 700 ×g w temperaturze 4 °C przez trzy minuty. Aby odwirować komórki w komorze BSL 2, usuń nadsącz i wlej go do 10% wybielacza. Następnie dodaj 1 mL DMEM z 10% FBS i retro.Po wirowaniu osad należy wypłukać dwa lub trzy razy. Podobnie jak poprzednio, należy powtórzyć to płukanie dwa lub trzy razy, aby usunąć nadmiar wirusa. Po ostatnim płukaniu należy usunąć jak najwięcej medium, a następnie umieścić każdą probówkę na lodzie z uwagi na resztki medium na ściankach probówki.Do momentu rozpoczęcia procedury transplantacji, około dwóch do trzech mikrolitrów pożywki będzie pokrywać pellet komórkowy. Zachowując sterylność podczas całego procesu, nabierz olej mineralny do strzykawki o pojemności jednego mililitra, a następnie, używając igły o rozmiarze 30,5 G, całkowicie wypełnij szklaną pipetę olejem mineralnym. Następnie przymocuj szklaną pipetę do urządzenia stereotaktycznego i, z pomocą asystenta, zamocuj ją na tłoku za pomocą napędu hydraulicznego.Wsuń tłok do pipety szklanej mniej więcej do połowy, usuwając wypływający olej mineralny za pomocą czystego ręcznika papierowego. Następnie skręć róg sterylnego ręcznika papierowego w cienki czubek i użyj go do delikatnego usunięcia nadmiaru medium nad granulatem komórek mge. Pozwoli to zwiększyć gęstość komórek, co umożliwi zastosowanie mniejszych objętości iniekcji.Następnie, używając pipety P2, powoli pobierz osad komórkowy i pipetuj go jeden do dwóch razy przed naniesieniem na powierzchnię hydrofobową. Objętość powinna wynosić nieco mniej niż 1 µL. Przenieś końcówkę igły do zawiesiny komórkowej i za pomocą napędu hydraulicznego pobierz zawiesinę komórkową do pipety.Po znieczuleniu zwierzęcia za pomocą hipotermii należy sprawdzić skuteczność znieczulenia. Po uciśnięciu pęsetą skóry między palcami nie powinna wystąpić żadna reakcja. Następnie umieść zwierzę na formie znajdującej się pod urządzeniem do iniekcji i naciągnij skórę na głowie, a następnie ją unieruchom.Za pomocą standardowej taśmy laboratoryjnej, sprawnie manipulując ramieniem stereotaktycznym, ustaw końcówkę szklanej pipety na głowie szczeniaka prostopadle do jej powierzchni. Moment, w którym pipeta styka się z głową, przyjmij jako punkt zero. Następnie wprowadź pipetę przez skórę i czaszkę do kory mózgowej.Następnie należy dwukrotnie wprowadzić i wycofać pipetę przed zakończeniem targetowania komórek do neocortex. Iniekcje wykonuje się, gdy mikropipeta znajduje się na głębokości 0.1 millimeter. Po ustawieniu igły w odpowiedniej pozycji należy obrócić urządzenie hydrauliczne, aby przesunąć tłok do szklanej pipety i wstrzyknąć od 50 do 70 nanoliters w każdym miejscu.Powtórz tę procedurę w trzech do sześciu różnych miejscach na różnych rostralnych poziomach rdzenia. Jeśli wymagany jest szeroki rozkład komórek przekształconych w całej nowokorze, po zakończeniu iniekcji zdejmij szczenię ze stołu i oznakuj je zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. Gdy szczenię dojdzie do siebie i będzie w stanie samodzielnie się poruszać, umieść je z powrotem u laktującej samicy wraz z resztą miotu.Po zabiegu oraz następnego dnia należy sprawdzić szczenięta, aby upewnić się, że w tym eksperymencie nie występują oznaki pogorszenia stanu zdrowia. Komórki MGE z embrionów E 13.5, dodatnie pod kątem somatostatyny i iris crew, AI 14 flock plus, zostały przeszczepione lub transdukowane lentiwirusem CAG flex GFP przed przeszczepieniem do neocortexów typu dzikiego i ocenione siedem dni po przeszczepieniu. Te obrazy immunofluorescencyjne neocortexów w siedem lub 35 dni po przeszczepieniu przedstawiają reprezentatywne przeszczepione komórki MGE dodatnie pod kątem tomato; tutaj przedstawiono obrazy immunofluorescencyjne komórek MGE transdukowanych lentiwirusem CAG flex GFP i ocenionych w 7 DPT.Ten histogram przedstawia ilościowe oznaczenie proporcji komórek dodatnich pod kątem 2D tomato, które wykazaly ekspresję GFP w siódmej dobie po transplantacji. W przypadku następujących obrazów, komórki MGE pobrano od myszy E 13.5 somatostatin IRIS CRE pozytywnych, następnie poddano transdukcji lentivirusem CAG flex GFP i przeszczepiono do neocortex gospodarzy typu dzikiego w wieku P 1 przed oceną. W 35. dobie po transplantacji ten reprezentatywny obraz z neocortex przeszczepionych gospodarzy wykazuje ekspresję GFP z wektora Flex.Tutaj tkanka została poddana barwieniu na somatostatynę w celu określenia koekspresji GFP i neuronów GABAergicznych wykazujących ekspresję somatostatyny, a tutaj tkanka została zabarwiona na paralbuminę. Te nałożone obrazy, zabarwione również DAPI, wykazują zakres kolokalizacji GFP z somatostatyną i paralbuminą. Na koniec, ten histogram przedstawia ilościowe określenie proporcji komórek GFP, które koekspresowały somatostatynę lub paralbuminę. Postępując zgodnie z metodami opisanymi w tej procedurze, do znakowania komórek w badaniach in vivo można użyć innych narzędzi molekularnych, na przykład wirusa zależnego od adenowirusa. Należy pamiętać, że praca z lentiwirusami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej i praca w warunkach BSL.

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Medialne ośrodki ganglionarne (MGE) znakowania i przeszczepienia za pośrednictwem wirusów do badań in vivo

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Ten film demonstruje znakowanie wirusowe i przeszczepianie komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo. Przedstawiono w nim etapy związane z transdukcją komórek MGE za pomocą reportera wirusa, przeszczepianiem tych transdukowanych komórek do kory młodego myszy i umożliwianiem ekspresji reporterowej w określonych podtypach interneuronów.

Znakowanie wirusowe i przeszczepianie komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju przyśrodkowego do badań in vivo

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół ma na celu generowanie bezpośrednio przeprogramowanych interneuronów in vivo, przy użyciu systemu wirusowego opartego na AAV w mózgu i reportera GFP sterowanego przez synapsynę FLEX, który pozwala na identyfikację komórek i dalszą analizę in vivo.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Przedstawiamy ulepszone protokoły transdukcji retrowirusowej receptorów transportowych i konkurencyjnego naprowadzania w celu zbadania lokalizacji limfocytów specyficznych dla narządów i mikrośrodowisk za pośrednictwem receptorów. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów transportu komórek odpornościowych i ma potencjalne zastosowania w przyszłych badaniach podstawowych i terapeutycznych.

Wydajna transdukcja retrowirusowa i konkurencyjne naprowadzanie do badania lokalizacji limfocytów T za pośrednictwem GPCR w różnych mikrośrodowiskach tkankowych

Poznaj metodę wirusowej transdukcji komórek MGE przed przeszczepieniem do kory mózgowej. Technika ta umożliwia badanie genetycznie modyfikowanych podgrup interneuronów GABAergicznych in vivo.

Znakowanie i przeszczepianie za pośrednictwem wirusów komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo

Przeglądaj więcej filmów