In vivo (in vivo) Obrazowanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego znakowanych technetem-99m w tendinopatii koni

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest nieinwazyjne śledzenie dystrybucji i losów znakowanych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego po ich wstrzyknięciu za pomocą scyntygrafii gamma. Los komórek macierzystych po wstrzyknięciu jest słabo poznany. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość nieinwazyjnego śledzenia komórek macierzystych w wielu narządach po podaniu oraz krótki okres półtrwania A osteo, który zapewnia jego eliminację z organizmu w ciągu 48 godzin.

Choć pozwoliło to na lepsze zrozumienie zastosowania komórek macierzystych w terapii naturalnie występujących tendinopatii, metoda ta może zostać wykorzystana również do badania terapii chorób kostnych i kardiologicznych. Zazwyczaj wyzwaniem dla osób rozpoczynających pracę z tą metodą jest koordynacja komórek, zestaw do znakowania oraz przygotowanie pacjenta. Aby natychmiast zastosować komórki, należy zacząć od nałożenia żelu sprzęgającego akustycznie na unieruchomioną kończynę, a następnie użyć przetwornika liniowego do systematycznego skanowania całego obszaru śródręcza strony dłoniowej w celu uzyskania seryjnych przekrojów poprzecznych i podłużnych, aby zidentyfikować strefę maksymalnego uszkodzenia.

Po podaniu znieczulenia miejscowego należy przemyć miejsce implantacji chirurgicznym roztworem chlorheksydyny przez co najmniej pięć minut, a następnie przetrzeć gazikiem nasączonym etanolem. Po przygotowaniu zwierzęcia i założeniu rękawiczek, należy odwirować alikwot 1 × 10⁷ komórek mezenchymalnych macierzystych szpiku kostnego w 1 ml supernatantu szpiku kostnego. Następnie, za pomocą strzykawki 2 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 18 lub 19 G, należy odessać supernatant, pozostawiając w probówce około 100 µl roztworu.

Przenieś supernatant do probówki do mikrocentryfugi na lodzie, a następnie delikatnie potrząśnij probówką, aby resuspendować komórki w pozostałych 100 µL supernatantu. Upewnij się, że komórki zostały całkowicie resuspendowane i nie ma widocznych grudek tkanki. Następnie pozostaw komórki w temperaturze pokojowej.

Teraz wymieszać 1 mL technetium Protec nutate w fiolce H-M-P-A-O. Po pięciu minutach, używając strzykawki 1 mL z igłą, potraktować mezenchymalne komórki macierzyste całą porcją TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Następnie zamknąć probówkę zakrętką, wymieszać komórki poprzez delikatne potrząsanie i umieścić probówkę w temperaturze pokojowej za osłoną ołowianą.

Po 30 minutach otwórz probówkę za pomocą pęsety i użyj strzykawki o pojemności 1 mL wyposażonej w igłę 21G, aby dodać 1 mL PBS do komórek. Zakręć probówkę i wymieszaj komórki. Następnie odwiruj komórki i za pomocą strzykawki 2 mL ostrożnie przenieś nadsącz do odpowiednio zabezpieczonej probówki oznaczonej jako płukanie 1.

Następnie wypłucz osad w kolejnym mililitrze PBS, tak jak właśnie pokazano. Po drugim płukaniu przenieś zawartość do odpowiednio oznaczonej probówki z osłoną z etykietą W2. Dokładnie resuspenduj komórki w pozostałym PBS i dodaj porcję lodowatego nadsączu z szpiku kostnego, trzymając przetwornik równolegle do igły.

Powoli wprowadź igłę 20G o długości 1,5 lub dwóch cali do strefy maksymalnego uszkodzenia w centrum zmiany, w orientacji podłużnej. Następnie, stosując odpowiednią osłonę, odessań komórki do strzykawki typu Luer-Lock o pojemności dwóch mililitrów wyposażonej w igłę 20G i usuń igłę, uważając, aby nie utracić żadnej ilości płynu. Po podłączeniu strzykawki do uprzednio umieszczonej w ścięgnie igły, ustaw głowicę ultradźwiękową pod igłą w taki sposób, aby tor igły w tkance był wyraźnie widoczny, i wstrzyknij komórki do zmiany w powolnym, ale stałym tempie.

Po podaniu wszystkich komórek należy potwierdzić w obrazie USG, że ciecz wtryskiwana do zmiany jest widoczna jako ciecz hipoechogenna zawierająca hiperechogeniczne pęcherzyki powietrza, a następnie wycofać igłę. W oprogramowaniu do przetwarzania obrazu należy użyć opcji „acquire study” oraz „bone static”, aby pozyskać obrazy statyczne, każdy z czasem trwania 60 sekund. Następnie, w określonych odstępach czasu, należy wykonać obrazy boczne obszaru zmiany, od nadgarstka do dystalnej części kończyny, analogicznego obszaru kończyny przeciwległej, lewego pola płucnego oraz lewej tarczycy.

Następnie należy wybrać narzędzia do zaznaczania obszaru zainteresowania i elipsy, a następnie odpowiednio zmienić kształt maski zaznaczenia nad obszarem zmiany chorobowej. Na koniec należy wybrać opcję dodania dwóch statystyk, aby uzyskać wartości liczbowe dla obszaru zainteresowania. Należy zadbać o to, aby dla każdego zwierzęcia w różnych punktach czasowych rejestrowane były obszary zainteresowania o tej samej wielkości.

Po podaniu domięśniowym w obrębie zmiany komórki będą widoczne jako ogniskowy obszar sygnału z ograniczonym rozprzestrzenieniem się komórek do otaczającej tkanki ścięgna w czasie. W przeciwieństwie do tego, podczas podawania komórek drogą perfuzji regionalnej przez cyfrową żyłę Palmera obserwuje się stopniowy zanik sygnału w miejscu wstrzyknięcia. Z czasem pola płucne są zazwyczaj ujemne po wstrzyknięciu domięśniowym, jednak w wczesnych punktach czasowych może być wykryty bardzo ogniskowy sygnał, który z czasem staje się bardziej uogólniony.

Tarczyca pozostaje również nieaktywna przy tej drodze podania. Perfuzja regionalna wykazuje także ogniskowy sygnał w płucach, który z czasem staje się bardziej rozlany, choć sygnał ten jest znacznie intensywniejszy w porównaniu z tym obserwowanym przy podaniu wewnątrzzmianowym. Z tarczycą, która również często wykazuje sygnał ogniskowy, całkowitą początkową licznością radioizotopu w komórkach w czasie zero przed wstrzyknięciem oraz licznością z początkowego gamagramu w obszarze zainteresowania.

Wartości w punkcie czasowym zero po wstrzyknięciu mogą zostać wykorzystane do obliczenia procentowego spadku liczby zliczeń w każdym punkcie czasowym po iniekcji, aby określić przewidywany rozpad TC 99 M w stosunku do zliczeń początkowych. Można następnie obliczyć trwałość komórek pozostających w miejscu wstrzyknięcia w każdym punkcie czasowym po iniekcji. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne drogi podawania komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zdolności homingu mezenchymalnych komórek macierzystych po ich opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny medycyny regionalnej do eksploracji metod poprawiających retencję komórek w obrębie urazów ścięgien. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak znakować komórki oraz rejestrować ich rozkład i stężenie w różnych układach organów. Należy pamiętać, że praca z promieniowaniem jonizującym może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury niezbędne jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak stosowanie osobistego sprzętu ochronnego, monitorów radiacyjnych oraz osłon ołowianych, a także prawidłowa utylizacja odpadów skażonych.