Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T
30 maja 2015
Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.
Głównym celem niniejszego eksperymentu jest monitorowanie akumulacji białka alfa-synucleiny związanego z chorobą u transgennej myszy będącej modelem choroby Parkinsona za pomocą ilościowego podejścia Eliza. Osiąga się to poprzez pozwolenie nietraktowaną myszy na normalne starzenie się lub poprzez wstrzyknięcie do mózgu wyciągu z mózgu chorej myszy M 83. Po wystąpieniu objawów choroby u myszy i ich uśmierceniu, wykonuje się dysekcję regionów mózgu.
Następnie przygotowuje się jednorodne próbki z każdego regionu mózgu w buforze o wysokiej zawartości soli, a następnie przeprowadza się test Eliza w celu ilościowego określenia białka alfa-synucleiny związanego z chorobą w każdym regionie mózgu. Wyniki testu Eliza wykazują, że chorobowa forma białka alfa-synucleina głównie akumuluje się w regionach mózgu, w tym śródmózgiu i pniu mózgu, a także w rdzeniach kręgowych myszy. Główną zaletą tej techniki Eliza w porównaniu z wcześniej dostępnymi metodami, takimi jak western blot lub immunohistochemia, jest to, że zapewnia szybkie i niezawodne ilościowe określenie chorobowej alfa synucleiny.
W tym modelu eksperymentalnym, ta metoda może pomóc w monitorowaniu akumulacji i propagacji tego białka w centralnym układzie nerwowym tych trzech myszy. Sugeruje to zaangażowanie mechanizmu przypominającego mózg aż do rozwoju klinicznej choroby. Dalsze rozwijanie tej metody może być brane pod uwagę w przyszłości w celu badania różnych próbek biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy czy krew, które prawdopodobnie zawierają również zmienione formy alfa synucleiny. Demonstracja tej procedury będzie przeprowadzona przez technika z naszego laboratorium.
Wszystkie procedury i protokoły dotyczące zwierząt były zgodne z dyrektywą WE 86 6 0 9 EWG i zatwierdzone przez francuski Komitet Narodowy ds. Etyki i Eksperymentów na Zwierzętach. Zwracając uwagę na etykę i eksperymenty na zwierzętach, myszy były przetrzymywane i pielęgnowane w zatwierdzonych przez A i S instalacjach eksperymentalnych w Leon Young po uśmierceniu myszy i pobraniu mózgu i rdzenia kręgowego. Zgodnie z protokołem tekstowym, umieszcza się cały mózg w naczyniu Petriego na lodzie pod niskim powiększeniem.
Rozpocznij od oddzielenia jednego z dwóch płatów węchowych, umieszczając kleszcze tuż za płatem. Za pomocą ruchu w dół, oddziela się go od mózgu, a następnie usuwa się drugi płat w podobny sposób. Teraz, trzymając mózg za pomocą kleszczy, delikatnie wkłuwa się drugą parę kleszczy między lewym i prawym korą i przesuwa je do przodu, aby oddzielić dwie połówki.
Teraz, nadal trzymając mózg w miejscu. Umieść drugie kleszcze dwa milimetrów za korą i utrzymuj nacisk w górę, aby unieść korę z hipokampu. Następnie zdejmij pierwszą część kory, zaczynając od hipokampu i przesuwając się w kierunku przodu mózgu.
Powtórz z drugą połówką. Następnie umieść otwarte kleszcze wokół jednego z hipokampów. Następnie delikatnie zamknij kleszcze u dołu narządu i delikatnie je usuń.
Powtórz z drugim hipokampem. Umieść kleszcze za jednym z prążków i delikatnie oddziel go od mózgu. Użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą korę z prążka przed usunięciem drugiego prążka, aby oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Użyj kleszczy, aby lekko wcisnąć kontur móżdżku.
Następnie umieść kleszcze za móżdżkiem i przesuń kleszcze do przodu, aby je usunąć. Użyj szerokiej części kleszczy, unieś je jako móżdżek, który składa się z czterech okrągłych struktur, aby wyraźnie zobaczyć, gdzie łączy się z pniem mózgu. Następnie wykonaj pionowe cięcie na styku przed usunięciem pnia mózgu, umieść kleszcze za śródmózgiem i pionowo w rozmiarze, aby całkowicie go oddzielić od pozostałej części mózgu. Aby przygotować jednorodny mózg, dodaj odpowiednią objętość bufora HS do przedyssekcjonowanych regionów mózgu, aby osiągnąć oczekiwany procent homogenatu, jak pokazano w tabeli poniżej.
Używając rozdrabniacza tkankowego składającego się z rury ze szkła krzemianowego i używając tłoczków A i B, wlej region mózgu do zmiażdżenia do rury. Następnie za pomocą tłoczka homogenizuj tkankę 10 razy, aby ją rozdzielić. Następnie przełącz się na tłoczek B i homogenizuj dodatkowe 20 razy.
Za pomocą pipety transferowej przenieś homogenat do 1,5-mililitrowej rury, powtarzając homogenizację z pozostałymi próbkami mózgu. Wyśrodkuj próbki przy 1000 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie zebrane próbki podziel na 200 mikrolitów Ali Watts. Przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy Eliza, aby przeprowadzić test Eliza na jednorodnym mózgu.
Rozpocznij od rozcieńczenia antyciała przeciwko alfa-synucleinie, króliczego poliklonalnego lub monoklonalnego klonu 42 przeciwciała, do 0,01 nanograma na mililitr za pomocą 50 mikromolarnego buforu węglanowo-węglanowego, z 100 mikrolitami roztworu powlekającego przeciwciała. Pokryj dołki 96-dołkowej płytki mikrofalowej i inkubuj
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową ilościową metodę ELISA do wykrywania powiązanej z chorobą α-synukleiny w transgenicznym modelu mysim synukleinopatii. Technika ta pozwala na monitorowanie akumulacji α-synukleiny w różnych obszarach mózgu w miarę postępu choroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Modele transgeniczne
Wstęp
- α-synucleina jest zaangażowana w synukleinopatie, takie jak choroba Parkinsona.
- Tradycyjne metody, takie jak western blotting i immunohistochemia, mają ograniczenia w zakresie ilościowego oznaczania.
- Metoda ELISA stanowi szybką i niezawodną alternatywę dla ilościowego oznaczania białek.
- Transgeniczny model myszy M83 jest wykorzystywany do badania postępu choroby.
Cel badania
- Aby ilościowo ocenić gromadzenie się związanej z chorobą α-synukleiny w określonych obszarach mózgu.
- Aby porównać skuteczność metody ELISA z metodami tradycyjnymi.
- Aby pogłębić zrozumienie rozkładu α-synukleiny w synukleinopatii.
Zastosowane metody
- Myszy transgeniczne pozostawiono nieinokulowane lub inokulowano je ekstraktami z mózgu.
- Pozwolono myszom na starzenie się lub rozwój objawów klinicznych choroby przed uśmierceniem.
- Regiony mózgu wypreparowano i zhomogenizowano w buforze wysokosolnym.
- Przeprowadzono analizę ELISA w celu określenia poziomu α-synuclein w próbkach.
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczną akumulację α-synucleiny związanej z chorobą w tylnych obszarach mózgu.
- Wysokie poziomy wykryto w śródmózwiu, pniu mózgu i rdzeniach kręgowych.
- Metoda ELISA zapewniła szybką i wiarygodną kwantyfikację w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Wyniki te potwierdzają zasadność stosowania metody ELISA do badania α-synucleiny w synucleinopatiach.
Wnioski
- Nowoczesna metoda ELISA jest skuteczna w ilościowym oznaczaniu α-synukleiny w modelach transgenicznych.
- Podejście to może ułatwić dalsze badania nad synukleinopatiami.
- Przyszłe badania mogą zgłębiać interwencje terapeutyczne ukierunkowane na akumulację α-synukleiny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe wykrywanie α-synukleiny związanej z chorobą ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w procesie odkrywania leków na synukleinopatie. Podejście oparte na metodzie ELISA umożliwia szybkie i niezawodne oznaczanie ilościowe w różnych obszarach mózgu, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w programach przedklinicznych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną, zapewniając skalowalne i powtarzalne odczyty dla badań mechanistycznych oraz monitorowania interwencji terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie patologii α-synukleiny jako celu terapeutycznego w modelach choroby Parkinsona.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe, swoiste dla przeciwciał odczyty w celu wyjaśnienia stopnia związania z celem oraz modulacji szlaku.
- Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez korelację akumulacji molekularnej z fenotypowym postępem choroby.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowane, kompatybilne z wysoką przepustowością oznaczanie ilościowe α-synukleiny związanej z chorobą.
- Wartość operacyjna: Do detekcji wymagane jest jedynie 10 μg równoważnika tkanki mózgowej, co zwiększa wydajność analizy w porównaniu z metodą Western blot.
- Wartość powtarzalności: Wykazuje spójne wyniki w różnych warunkach inokulacji i starzenia, co umożliwia niezawodne monitorowanie podłużne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia monitorowanie propagacji prionopodobnej w OUN, dostarczając danych do mechanistycznych modeli rozprzestrzeniania się choroby.
- Wartość operacyjna: Wykrywa akumulację w tylnych obszarach mózgu i rdzeniu kręgowym, co jest zgodne z obrazem patologii klinicznej.
- Wartość translacyjna: Wspiera prace nad kwalifikacją biomarkerów poprzez dostarczenie mierzalnych wyników dotyczących białek powiązanych z chorobą.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ELISA wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po przedkliniczne testy skuteczności, umożliwiając iteracyjną ocenę związków modulujących α-synukleinę.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących agregacji α-synucleiny i neurotoksyczności w modelach transgenicznych.
- Przesiewanie: Umożliwia tworzenie gotowych do analizy systemów biologicznych z wynikami ilościowymi do oceny bibliotek związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary absorbancji przy 450 nm, co pozwala na statystyczne porównanie efektów terapii w różnych regionach mózgu.
- Badania translacyjne: Łączy detekcję molekularną z wynikami fenotypowymi, wspierając decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy zestandaryzowaną platformę do kwantyfikacji α-synucleiny, którą można zastosować w wielu modelach chorób i modalnościach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez specyficzne, ilościowe wykrywanie α-synukleiny związanej z chorobą.
- Wartość operacyjna: Oferuje szybkie wyniki (w ciągu kilku godzin) w porównaniu do wielu dni w przypadku Western blot, co przyspiesza harmonogramy projektów.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o mechanizm działania.
- Wpływ na portfolio: Poprawia efektywność kapitałową poprzez priorytetyzację związków z wykazanym oddziaływaniem z celem in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu optymalizacji testów ELISA, walidacji przeciwciał oraz homogenizacji tkanek mózgu.
- Metoda jest zależna od przygotowania buforu o wysokim stężeniu soli oraz dostępu do czytnika mikropłytek do pomiaru absorbancji.
- Konieczna jest standaryzacja działań między zespołami w celu zapewnienia spójności w obchodzeniu się z próbkami i protokołach inkubacji.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać walidacji swoistości przeciwciał i dostępności epitopu.
- Ograniczenie praktyczne: detekcja sygnału zależy od wystarczającej akumulacji α-synuclein związanej z chorobą, co może różnić się w zależności od modelu i wieku.
