Name: Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Poznaj metodę ELISA do wykrywania białka α-synucleiny w mózgu transgenicznych myszy M83. Technika umożliwia szybką i niezawodną ilościową analizę akumulacji białka w ośrodkowym układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcą podziękować Damienowi Gaillard za inokulacje i nadzór nad eksperymentami na zwierzętach. Ta praca została wsparta przez ANSES (Francuska Agencja ds. Bezpieczeństwa Żywności, Środowiska i Bezpieczeństwa oraz Higieny Pracy) oraz grantem Fundacji France Parkinson.

Wszystkie procedury i protokoły z udziałem zwierząt były zgodne z Dyrektywą WE 86/609/EWG i zatwierdzone przez ComEth, francuski komitet narodowy do spraw etyki w eksperymentach na zwierzętach (protokół 11-0043). Zwierzęta były przetrzymywane i pielęgnowane w zatwierdzonych ośrodkach eksperymentalnych ANSES’s w Lyonie (zatwierdzenie B 69387 0801).
1. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Zabijajcie myszy za pomocą dootrzewnowej iniekcji śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu.</li>
	<li>Wyjmijcie cały mózg z czaszki myszy i umieśćcie go na lodzie w 35 mm plastikowym naczyńku Petriego do czasu ekstrakcji.</li>
	<li>Wyjmijcie rdzeń kręgowy szyjny. 
	UWAGA: Wyjmujcie αS albo z jednej z połówek mózgu po przekrojeniu wzdłużnym albo z przekrojonych mózgów myszy, dostępnych po przeprowadzonych eksperymentach wymienionych w Tabeli 1.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Eksperyment</td>
			<td>Myszy 
			Inoculum (równoważnik mózgu)</td>
			<td>Okres przeżycia 
			(d.p.i.)</td>
			<td>Mediana/maksymalne przeżycie 
			(dni)</td>
			<td>Wykrycie αSd przez ELISA 
			/WB/IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Myszy niezaszczepione</td>
			<td>441 ± 166</td>
			<td>419/736</td>
			<td>8/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Myszy zaszczepione (0,2 mg)</td>
			<td>150 ± 52</td>
			<td>140/241</td>
			<td>9/9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Lista eksperymentów przeprowadzonych na myszach M83. Zaszczepienia przeprowadzano w wieku 6 tygodni dla eksperymentu 2 w obszarze zwojów czworobocznych i kory mózgowej za pomocą 20 µl homogenatu mózgu chorej myszy (1% wt/vol w glukozie 5%), po znieczuleniu 6-tygodniowych homozygotycznych myszy M83 za pomocą inhalacji 3% izofluranu. d.p.i.: dni po inokulacji.
2. Ekstrakcja αS z połówek mózgu
<ol>
	<li>Przekroić mózg wzdłużnie, aby uzyskać dwie połówki. Waga każdej połówki w rurce do ribolizy zawierającej kulki do mielenia.</li>
	<li>Przygotować bufor High Salt (HS) zawierający 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfataz i koktajl inhibitorów proteaz. Dodać bufor High Salt do połówek mózgu, aby uzyskać 20% (waga/objętość) homogenaty.</li>
	<li>Przygotować próbki z połówek mózgu za pomocą mechanicznego homogenizatora z prędkością 6,0 m/s przez 23 sekundy dwa razy. Po pierwszej 23-sekundowej homogenizacji, umieścić rurki z homogenatami na lodzie przez 2 minuty przed drugim 23-sekundowym cyklem.</li>
	<li>Centryfugować próbki przy 1.000 x g przez 5 minut, aby wyeliminować niezmielony fragment mózgu. Odzyskać surnatki, podzielić na 200 µl alikwoty i przechowywać je w temperaturze -80 °C do dalszej analizy ELISA.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja αS z przekrojonych regionów mózgu
<ol>
	<li>Przekrój cały mózg na lodzie w 35 mm plastikowym naczyńku Petriego za pomocą lupy o niskiej mocy (8x powiększenie) przy użyciu dwóch kleszczy, których końce są trzymane razem, z wyjątkiem przecinania hipokampu. Nie przekraczaj 10 minut, aby zachować integralność mózgu. Umieść mózg prawidłową stroną do góry i pobierz następujące regiony mózgu w tej kolejności:
	<ol>
		<li>Oddzielić jedną z dwóch cebulek węchowych za pomocą kleszczy umieszczonych tuż za cebulką. Odłączyć ją od mózgu ruchem w dół. Powtórzyć tę operację dla drugiej cebulki.</li>
		<li>Delikatnie włożyć kleszcze między dwie korty i przesunąć je do przodu, aby ułatwić oddzielenie dwóch korty. Utrzymując mózg w miejscu za pomocą jednych kleszczy, użyj drugich, aby oddzielić korę od hipokampu.</li>
		<li>Umieść kleszcze 2 mm poniżej kory. Utrzymaj delikatne naciśnięcie kleszczami, aż górna część hipokampu będzie widoczna. Oddzielić pierwszą część kory i powtórzyć z drugą częścią. Użyj kleszczy, aby oddzielić dwie korty, zaczynając od hipokampu i przesuwając się w kierunku przedniej części mózgu.</li>
		<li>Umieść otwarte kleszcze wokół jednego z hipokampów. Zamknij kleszcze u dołu hipokampu, a następnie delikatnie je usuń, odzyskuj jak najwięcej. Powtórz procedurę dla drugiego hipokampu.</li>
		<li>Umieść otwarte kleszcze poniżej jednego z zwojów czworobocznych i delikatnie oddzielić go od mózgu. Użyj kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe korty ze zwoju czworobocznego. Powtórz tę procedurę dla drugiego zwoja czworobocznego.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie wcisnąć kontur móżdżku o 2 mm, aby ułatwić oddzielenie móż

<ol><li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).</li>
<li>Waxman, E. A., Giasson, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+regulation+of+casein+kinase-mediated+phosphorylation+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+inoculation+of+pathological+alpha-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+alpha-synucleinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice.</a> J Exp Med. 209, 975-986 (2012).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34, 521-533 (2002).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Masuda-Suzukake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+pathological+alpha-synuclein+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain.</a> Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+alpha-synuclein+seeds+do+not+invariably+induce+rapid%2C+widespread+pathology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice.</a> Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).</li>
<li>Recasens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+extracts+from+parkinson%27s+disease+brains+trigger+alpha-synuclein+pathology+and+neurodegeneration+in+mice+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys.</a> Ann Neurol. , (2013).</li>
<li>Foulds, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+alpha-synuclein+can+be+detected+in+blood+plasma+and+is+potentially+a+useful+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease.</a> FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).</li>
<li>El-Agnaf, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oligomeric+forms+of+alpha-synuclein+protein+in+human+plasma+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Faseb J. 20, 419-425 (2006).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+alpha-synuclein+with+species+and+multimeric+state+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities.</a> J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).</li>
<li>Unterberger, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+cerebrospinal+fluid%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study.</a> Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).</li>
<li>Betemps, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+spreading+in+M83+mice+brain+revealed+by+detection+of+pathological+alpha-synuclein+by+enhanced+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA.</a> Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).</li>
<li>Osman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+that+recognizes+a+potential+coeliac-toxic+repetitive+pentapeptide+epitope+in+gliadins%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins).</a> Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).</li>
<li>Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinheiro%2C+JC+%22Mixed-Effects+Models+in+S+and+S-PLUS%22">Mixed-Effects Models in S and S-PLUS</a>. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+monoclonal+antibody%2C+against+human+alpha-synuclein%2C+in+a+subpopulation+of+C57BL%2F6J+mice%2C+presenting+a+deletion+of+the+alpha-synuclein+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus.</a> J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).</li>
<li>Specht, C. G., Schoepfer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+alpha-synuclein+locus+in+a+subpopulation+of+C57BL%2F6J+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice.</a> BMC Neurosci. 2, 11(2001).</li>
<li>Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ser129+phosphorylation+of+alpha-synuclein+in+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells.</a> J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).</li>
<li>Perrin, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+and+specificity+of+the+anti-alpha-synuclein+monoclonal+antibody+Syn-1+in+mouse+brain+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines.</a> Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+alpha-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6, e22225(2011).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+prion+strains+in+a+transgenic+mouse+models+overexpressing+human+A53T+mutated+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).</li>
<li>Foulds, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+on+alpha-synuclein+in+blood+plasma+as+a+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease.</a> Sci Rep. 3, 2540(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Wykazano, że wykorzystanie ELISA pozwalało na specyficzne wykrywanie αSD bezpośrednio z homogenatów mózgu myszy w trakcie choroby w modelu myszy transgenicznych M83. Rzeczywiście, ten ELISA mógł łatwo odróżnić chore myszy M83 od zdrowych myszy M83, używając wyłącznie homogenatów całego mózgu w buforze z wysokim stężeniem soli.
Najskryteczniejszymi krokami dla uzyskania pomyślnych wyników przy użyciu tego ELISA są: poprawne wycięcie różnych obszarów mózgu myszy poprzez rozwinięcie ni...

Obecnie stosowanych metod wykrywania związanego z chorobą α-synucleiny (αSD) w eksperymentalnych modelach choroby Parkinsona (PD), takich jak immunohistochemia czy Western blot, jest czasochłonnych i nie są ilościowe. Ta neurodegeneracyjna choroba charakteryzuje się agregacją alfa-synucleiny głównie w postaci inkluzji zawierających skumulowaną formę zwykle rozpuszczalnego presynaptycznego białka αS1,2 (ciałka Lewego i neurofibrile Lewego). Normalnie tylko marginalnie fosforylowana, αS jest nadmiernie fosforylowana w pozycji serynowej 129 w tych inkluzjach3 i może być monitorowana przez przeciwciała skierowane specyficznie przeciw fosforylowanemu w pozycji Ser129 αS, zapewniając tym samym wiarygodny marker patologii.
Ostatnie badania sugerują, że mechanizm „podobny do prionów” mógłby być zaangażowany w propagację agregacji αS w obrębie układu nerwowego u chorego pacjenta4,5. Te badania opisywały przyspieszenie synucleinopatii poprzez inokulację ekstraktów mózgu zawierających αSD do transgenicznego modelu mysiego (M83) ekspresującego zmutowaną ludzką αS białka A53T, związaną z poważnym upośledzeniem ruchowym występującym wraz ze starzeniem się myszy6. W ten sam sposób, inokulacja domózgowa skumulowanego rekombinowanego αS w tym samym modelu myszym M83 potwierdziła przyspieszenie agregacji5. Indukcja osadów fosforylowanego αS została również opisana po inokulacji myszy dzikiego typu C57Bl/6 albo fibrylarnego rekombinowanego αS albo ekstraktów mózgu ludzkich pacjentów z chorobą ciałek Lewego (DLB)7,8. Sacino et al.9 niedawno zwrócili uwagę, że po wstrzyknięciu fibrylarnego ludzkiego αS, rozpowszechniona i progresywna formacja inkluzji αS w mózgu mogłaby zostać wywołana w myszach M83, ale nie w myszach transgennych E46K ani w myszach nietransgennych, w których indukowane inkluzje αS były przejściowe i głównie ograniczone do miejsca wstrzyknięcia. Ostatnie badania na małpach potwierdziły propagację agregatów αS po inokulację ekstraktów pochodzących z choroby Parkinsona w gatunkach bliżej spokrewnionych z ludźmi10.
Powiązanie między zmianami αS a chorobą Parkinsona sugeruje, że αSD jest potencjalnym biomarkerem choroby Parkinsona11. Niedawne badanie wykazało wykrycie oligomerycznych rozpuszczalnych agregatów α-synucleiny w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i osoczu jako potencjalny biomarker choroby Parkinsona na podstawie konwencjonalnego systemu ELISA typu „sandwich” z wykorzystaniem tego samego przeciwciała do wychwytu i wykrycia αS12. Na podstawie tej samej metody, białka multimeryczne zostały rozpoznane w próbkach biologicznych, w tym mózgu, ponieważ istnieje wiele kopii epitopów obecnych w złożonych formach13. Niedawno patologiczne αS w CSF pacjentów z udowodnioną patologią ciałek Lewego zostały wykryte zarówno za pomocą zestawu ELISA z wysoce specyficznym przeciwciałem przeciwko αSD (5G4), jak i za pomocą testu immunoprecypitacyjnego14. Te metody mogą odróżnić pacjentów z PD/DLB od innych rodzajów demenc.
„Prionopodobna” propagacja agregacji αS była dalsze badana w transgennym modelu myszym M83 przy użyciu podejścia ELISA, które zostało zaprojektowane specjalnie do identyfikacji αSD15. W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół ELISA stosowany do ilościowego wykrywania αSD u chorych myszy (czy to zaszczepionych αSD od chorych myszy M83, czy nie) i zwłaszcza w regionach mózgu specyficznie docelowanych przez patologiczny proces w tym transgennym modelu myszym M834.

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Antibody detekcyjny 1/2,000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Produced at Anses</td><td></td><td>Antibody detekcyjny 1/1,000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Antibody detekcyjny 1/2,000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Antibody detekcyjny 1/3,000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Antibody detekcyjny 1/1,000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Antibody detekcyjny 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Antibody powlekający i detekcyjny (1/2,000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Provided by Dr. Anderson</td><td></td><td>Antibody detekcyjny 1/2,000</td></tr><tr><td>polyclonal anti-&alpha;syn antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Antibody powlekający</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>HS buffer</td><td></td><td></td><td>Adjust at pH 7.5 and keep at 4 &#176;C</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Adjust at pH 7.5</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Roztwór macierzysty 100 mM, toksyczny</td></tr><tr><td>1% phosphatase cocktail</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50x skoncentrowany</td></tr><tr><td>Microplate MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampon carbonate 50 mM pH 9.6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2.86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3.36 g/L, pH&nbsp;9.6</td></tr><tr><td>Superblock T20 PBS blocking buffer</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10x skoncentrowany</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Używany do ELISA</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>Używany do mapowania epitopów</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>Przechowywać na lodzie na tym etapie</td></tr><tr><td>Grinding tubes</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Plate washer</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>Low power magnifier&nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>Powiększenie 8X</td></tr><tr><td>Forceps Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>Do etapów sekcji</td></tr><tr><td>Transfer pipette 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu elisa w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją a53t

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Oprócz uznanych metod, takich jak Western blot, potrzebne są nowe metody, aby szybko i łatwo zmierzyć chorobowo związaną α-synucleinę (αSD) w eksperymentalnych modelach synucleinopatii. W tym badaniu wykorzystano linię myszy transgenicznych (M83), nadmiernie ekspresującą ludzką αS A53T i spontanicznie rozwijającą dramatyczny fenotyp kliniczny między ósmym a 22. miesiącem życia, charakteryzujący się objawami, w tym utratą masy ciała, prostracją i ciężkim upośledzeniem ruchowym. Do molekularnych analiz αSD (chorobowo związana αS) u tych myszy zaprojektowano test ELISA, aby specyficznie zmierzyć αSD u chorych myszy. Analiza ośrodkowego układu nerwowego w tym modelu myszym wykazała obecność αSD głównie w ogonowych regionach mózgu i rdzeniu kręgowym. Nie było różnic w dystrybucji αSD między różnymi warunkami eksperymentalnymi prowadzącymi do choroby klinicznej, tj. u nieszczepionych i normalnie starzejących się myszy transgenicznych oraz u myszy szczepionych ekstraktami z mózgu chorych myszy. Specyficzne wykrywanie immunoreaktywności αSD za pomocą przeciwciała przeciw fosforylowanemu Ser129 αS przez test ELISA w zasadzie korelowało z tym uzyskanym przez Western blot i immunohistochemikę. Nieoczekiwanie, podobne wyniki obserwowano z kilkoma innymi przeciwciałami przeciwko C-końcowej części αS. Propagacja αSD, sugerująca zaangażowanie "prionopodobnego" mechanizmu, może być więc łatwo monitorowana i zmierzyna w tym modelu myszym przy użyciu podejścia ELISA.

W niniejszym badaniu zastosowano testy ELISA, które specyficznie identyfikowały związane z chorobą αS (αSD) w homogenatach mózgu przygotowanych w buforze z wysoką zawartością soli od chorych myszy M83. Zastosowanie przeciwciała specyficznie rozpoznającego pSer129 αS (p = 0,0074) pozwoliło testowi ELISA na łatwe odróżnienie starych, chorych myszy (> 8 miesięcy) od młodych (2-5 miesięcy), zdrowych myszy M83 (Rysunek 1). Kilka innych przeciwciał wykazało podobnie wysokie sygnały (> 0,6 OD) tylko ...

Opisano zostało ELISA oferujące nowatorskie podejście ilościowe. Specyficznie wykrywa związane z chorobą α-synukleina (αSD) w transgennym modelu myszym (M83) synucleinopatii za pomocą kilku przeciwciał skierowanych albo przeciw fosforylowanej w Ser129 formie αS, albo przeciwko C-końcowej części białka.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

Głównym celem niniejszego eksperymentu jest monitorowanie akumulacji białka alfa-synucleiny związanego z chorobą u transgennej myszy będącej modelem choroby Parkinsona za pomocą ilościowego podejścia Eliza. Osiąga się to poprzez pozwolenie nietraktowaną myszy na normalne starzenie się lub poprzez wstrzyknięcie do mózgu wyciągu z mózgu chorej myszy M 83. Po wystąpieniu objawów choroby u myszy i ich uśmierceniu, wykonuje się dysekcję regionów mózgu.Następnie przygotowuje się jednorodne próbki z każdego regionu mózgu w buforze o wysokiej zawartości soli, a następnie przeprowadza się test Eliza w celu ilościowego określenia białka alfa-synucleiny związanego z chorobą w każdym regionie mózgu. Wyniki testu Eliza wykazują, że chorobowa forma białka alfa-synucleina głównie akumuluje się w regionach mózgu, w tym śródmózgiu i pniu mózgu, a także w rdzeniach kręgowych myszy. Główną zaletą tej techniki Eliza w porównaniu z wcześniej dostępnymi metodami, takimi jak western blot lub immunohistochemia, jest to, że zapewnia szybkie i niezawodne ilościowe określenie chorobowej alfa synucleiny.W tym modelu eksperymentalnym, ta metoda może pomóc w monitorowaniu akumulacji i propagacji tego białka w centralnym układzie nerwowym tych trzech myszy. Sugeruje to zaangażowanie mechanizmu przypominającego mózg aż do rozwoju klinicznej choroby. Dalsze rozwijanie tej metody może być brane pod uwagę w przyszłości w celu badania różnych próbek biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy czy krew, które prawdopodobnie zawierają również zmienione formy alfa synucleiny. Demonstracja tej procedury będzie przeprowadzona przez technika z naszego laboratorium.Wszystkie procedury i protokoły dotyczące zwierząt były zgodne z dyrektywą WE 86 6 0 9 EWG i zatwierdzone przez francuski Komitet Narodowy ds. Etyki i Eksperymentów na Zwierzętach. Zwracając uwagę na etykę i eksperymenty na zwierzętach, myszy były przetrzymywane i pielęgnowane w zatwierdzonych przez A i S instalacjach eksperymentalnych w Leon Young po uśmierceniu myszy i pobraniu mózgu i rdzenia kręgowego. Zgodnie z protokołem tekstowym, umieszcza się cały mózg w naczyniu Petriego na lodzie pod niskim powiększeniem.Rozpocznij od oddzielenia jednego z dwóch płatów węchowych, umieszczając kleszcze tuż za płatem. Za pomocą ruchu w dół, oddziela się go od mózgu, a następnie usuwa się drugi płat w podobny sposób. Teraz, trzymając mózg za pomocą kleszczy, delikatnie wkłuwa się drugą parę kleszczy między lewym i prawym korą i przesuwa je do przodu, aby oddzielić dwie połówki.Teraz, nadal trzymając mózg w miejscu. Umieść drugie kleszcze dwa milimetrów za korą i utrzymuj nacisk w górę, aby unieść korę z hipokampu. Następnie zdejmij pierwszą część kory, zaczynając od hipokampu i przesuwając się w kierunku przodu mózgu.Powtórz z drugą połówką. Następnie umieść otwarte kleszcze wokół jednego z hipokampów. Następnie delikatnie zamknij kleszcze u dołu narządu i delikatnie je usuń.Powtórz z drugim hipokampem. Umieść kleszcze za jednym z prążków i delikatnie oddziel go od mózgu. Użyj kleszczy, aby usunąć pozostałą korę z prążka przed usunięciem drugiego prążka, aby oddzielić móżdżek od reszty mózgu. Użyj kleszczy, aby lekko wcisnąć kontur móżdżku.Następnie umieść kleszcze za móżdżkiem i przesuń kleszcze do przodu, aby je usunąć. Użyj szerokiej części kleszczy, unieś je jako móżdżek, który składa się z czterech okrągłych struktur, aby wyraźnie zobaczyć, gdzie łączy się z pniem mózgu. Następnie wykonaj pionowe cięcie na styku przed usunięciem pnia mózgu, umieść kleszcze za śródmózgiem i pionowo w rozmiarze, aby całkowicie go oddzielić od pozostałej części mózgu. Aby przygotować jednorodny mózg, dodaj odpowiednią objętość bufora HS do przedyssekcjonowanych regionów mózgu, aby osiągnąć oczekiwany procent homogenatu, jak pokazano w tabeli poniżej.Używając rozdrabniacza tkankowego składającego się z rury ze szkła krzemianowego i używając tłoczków A i B, wlej region mózgu do zmiażdżenia do rury. Następnie za pomocą tłoczka homogenizuj tkankę 10 razy, aby ją rozdzielić. Następnie przełącz się na tłoczek B i homogenizuj dodatkowe 20 razy.Za pomocą pipety transferowej przenieś homogenat do 1,5-mililitrowej rury, powtarzając homogenizację z pozostałymi próbkami mózgu. Wyśrodkuj próbki przy 1000 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie zebrane próbki podziel na 200 mikrolitów Ali Watts. Przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy Eliza, aby przeprowadzić test Eliza na jednorodnym mózgu.Rozpocznij od rozcieńczenia antyciała przeciwko alfa-synucleinie, króliczego poliklonalnego lub monoklonalnego klonu 42 przeciwciała, do 0,01 nanograma na mililitr za pomocą 50 mikromolarnego buforu węglanowo-węglanowego, z 100 mikrolitami roztworu powlekającego przeciwciała. Pokryj dołki 96-dołkowej płytki mikrofalowej i inkubuj

detection-disease-associated-synuclein-enhanced-elisa-brain

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Inkubuj z enzymem proteolitycznym w celu trawienia normalnych prionów, pozostawiając nienaruszone odporne agregaty.

Wykrywanie nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białkowych prionów w tkance mózgowej myszy za pomocą Western Blotting

Źródło: Bétemps, D.,  i wsp.,  Wykrywanie α-synukleiny związanej z chorobą za pomocą wzmocnionego testu ELISA w mózgu myszy transgenicznych z nadekspresją ludzkiej zmutowanej α-synukleiny A53T. J. Vis. Exp. (2015). Ten film przedstawia procedurę wykrywania białka związanego z chorobą neurodegeneracyjną α-synukleiny w tkance mózgowej myszy transgenicznych za pomocą testu ELISA. Etapy obejmują homogenizację tkanek, wirowanie i wykrywanie ELISA białka α-synukleiny w celu ilościowego określenia...

Wykrywanie białka α-synukleiny związanego z chorobą neurodegeneracyjną za pomocą testu ELISA

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób lokalne dostarczanie genów za pośrednictwem wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym.  Protokół określa wszystkie kluczowe kroki w celu wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego dla choroby Parkinsona.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Poznaj metodę ELISA do wykrywania białka α-synucleiny w mózgu transgenicznych myszy M83. Technika umożliwia szybką i niezawodną ilościową analizę akumulacji białka w ośrodkowym układzie nerwowym.

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie białka α-synucleiny związanego z chorobą za pomocą ulepszonego testu ELISA w mózgu transgenicznych myszy nadmiernie ekspresujących ludzkie α-synucleinę z mutacją A53T

Przeglądaj więcej filmów