Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest powtarzalne stworzenie skalowalnej hodowli komórek pluripotencjalnych. Osiąga się to poprzez użycie najpierw wstępnie zaprogramowanego robota do obsługi cieczy do wysiewu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych o różnej gęstości. Na płytce 96-dołkowej w drugim etapie studzienki o optymalnej gęstości kolonii są wizualnie identyfikowane do pakowania.

Indukowane ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste są następnie wysiewane na nowe płytki w celu automatycznego karmienia i dalszego pakowania. Ostatecznie procedura ta pozwala na wybór najlepszych gęstości wysiewu do namnażania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu ich ostatecznego różnicowania w kardiomiocyty. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku rozwoju terapii spersonalizowanych i regeneracyjnych w skali średniej.

Robot do hodowli silnych komórek macierzystych URI nadaje się do produkcji kilkuset milionów silnych komórek macierzystych URI w ciągu kilku dni, które można następnie różnicować w różne komórki w celu spersonalizowanego testowania leków lub terapii implantologicznej komórek i tkanek. Chociaż metoda ta została zastosowana do badania przesiewowego gęstości wysiewu w celu optymalnej ekspansji hodowli komórek pluripotencjalnych, może być również stosowana do optymalizacji i identyfikacji nowych protokołów różnicowania dla różnych innych typów komórek. Procedurę zademonstrują naukowcy farmaceutyczni, Neil Daily z mojego laboratorium Przed rozpoczęciem procedury karmienia sprawdź 96 pęczniejących komórek macierzystych pod kątem zanieczyszczenia i potwierdź, że kolonia komórkowa jest poniżej idealnej gęstości pasażu.

Jeśli komórki są w dobrym stanie, umieść płytkę w łóżku. Umieść trzy na nachylonej pod kątem 37 stopni Celsjusza rampie robota do obsługi cieczy i załaduj stojak na końcówki do łóżka. Umieść jedną z końcówkami do pipet o temperaturze pokojowej 200 mikrolitrów.

Umieść koryto z czterema dołkami w pozycji drugiego łóżka i napełnij dobrze trzecie koryto ośmioma mililitrami świeżej pożywki do wzrostu komórek macierzystych o temperaturze pokojowej bez inhibitora kinazy RO. Następnie przenieś płytkę krwi do stojaka na płytki krwi i za pomocą panelu dotykowego sterowania robotem kolejno wybierz Uruchom protokół kolonii podaj jedną płytkę, a następnie naciśnij uruchom test, aby użyć kreatora krok po kroku do wstępnego przetestowania wybranego programu. Gdy protokół zostanie zatwierdzony, wybierz opcję uruchom protokół Po karmieniu odzyskaj 96-dołkową płytkę kolonii komórek macierzystych.

Następnie zapisz szczegóły dotyczące karmienia na pokrywie płytki i umieść ją z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny, do następnego karmienia lub pasażu. Wybór studni do podziału zależy od gęstości kolonii. Kilka dni po ustawieniu gradientu gęstości wysiewu na tej płycie, widzimy studnię, która jest zbyt gęsta, aby ją podzielić, idealną gęstość do rozłupywania i studnię zbyt rzadką, aby przejść po kilku cyklach karmienia.

Upewnij się, że przestrzeń między większością kolonii w płytce 96-dołkowej wynosi 25% średnicy sąsiedniej kolonii, w przeciwnym razie późniejsze karmienie skutkowałoby zrośnięciem się kolonii ze sobą. Następnie, jeśli kolonia nie jest zanieczyszczona, umieść płytkę w łóżku. Ustaw trzy na rampie pod kątem 37 stopni i załaduj stojak na końcówki do łóżka.

Umieść jedną z końcówkami do pipet o temperaturze pokojowej 200 mikrolitrów. Umieść koryto z czterema studzienkami w drugiej pozycji łóżka, a następnie pozostawiając koryto z czterema studniami pustymi, dozuj 8,5 mililitra wzrostu komórek macierzystych. Pożywkę uzupełnioną inhibitorem kinazy rzędowej Y 2, 7, 6, 3, 2 do trzech studni 3,5 mililitra 30% odczynnika dysocjacji litycznej proteolitycznej i kolagenowej do studni dwóch i 4,5 mililitra PBS do studni.

W następnym miejscu, nowa wstępnie rozgrzana, pokryta żelem w temperaturze 37 stopni Celsjusza płytka z 96 dołkami w łóżku, pozycja piąta i przeniesienie starych i nowych pokrywek płytek do stojaka na pokrywki płytek. Teraz użyj panelu dotykowego sterowania robotem, aby sekwencyjnie wybrać opcję uruchom kolonię protokołu, podziel jedną na 12 kolumn jeden, a następnie następny. Następnie wybierz przebieg testowy, aby użyć kreatora krok po kroku w celu wstępnego przetestowania wybranego programu, a następnie uruchomienia protokołu.

Po zakończeniu protokołu przejścia odzyskaj obie płytki. Oznacz nową płytkę odpowiednimi informacjami i włóż płytki z powrotem do inkubatora. Przez 24 godziny komórki i kolonie powinny przyczepiać się do płytki w ciągu dwóch do trzech godzin od podziału, wyglądając na bardzo rozproszone z powodu obecności inhibitora kinazy RO.

Po pierwszym karmieniu wolnym od inhibitora kinazy RO komórki ulegną kondensacji i wykażą charakterystyczną morfologię komórek macierzystych bruku. Nieprawidłowości chromosomowe są powszechnie obserwowane podczas hodowli komórek macierzystych, ale mogą nie wpływać na dystrybucję markerów pluripotencji, takich jak te pokazane na tych obrazach, czy rzeczywiście analiza kariotypu komórek hodowanych za pomocą właśnie zademonstrowanego protokołu wykazała, że obie indukowane przez robota linie pluripotencjalnych komórek macierzystych miały 46 normalnych chromosomów, co sugeruje, że metoda hodowli robotycznej nie wprowadziła niestabilności chromosomowej poza to, co mogłoby normalnie wystąpić. Aby zbadać ustalone markery ekspresji genów komórek macierzystych w hodowanych robotycznie indukowalnych liniach pluripotencjalnych komórek macierzystych, zebrano również całkowite RNA.

Obie indukowalne pluripotencjalne linie komórek macierzystych w tym eksperymencie wykazywały podobną ekspresję markerów pluripotencji, podczas gdy kardiomiocyty zróżnicowane z każdej linii nie wykazywały takiej ekspresji, podobnie jak oddzielna linia ludzkich fibroblastów skórnych. Co więcej, gdy obie indukowalne pluripotencjalne linie komórek macierzystych zostały zróżnicowane w kardiomiocyty, wykazywały one wyraźną formację sarkomerową. Łącznie dane te sugerują, że trzy miesiące i ponad 20 pasaży hodowli robotycznej spowodowały, że chromosomalnie normalne komórki wykazywały program transkrypcji zgodny z pluripotencją, które były również zdolne do różnicowania się w kardiomiocyty.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tego lub podobnego robota do obsługi płynów do hodowli komórek pluripotencjalnych w skalowalny sposób.