Name: Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj skalowalną hodowlę iPSC na płytkach 96-dołkowych przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy. Ta metoda umożliwia efektywne utrzymanie pluripotencji i różnicowanie w kardiomyocyty po ponad 20 pasowaniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo wsparta przez granty NIH, R44 GM087784 i R01 HL109505. Autorzy dziękują zespołowi technicznemu i OEM w Gilson, INC za rozszerzone wsparcie techniczne.

Autorzy MKC, MJG, EEB, NJD i RO są lub byli w czasie prac rozwojowych pracowników InvivoSciences, INC, którzy opracowali i opracowali opisane tutaj protokoły robotyczne. TW jest CSO dla InvivoSciences INC. SH jest pracownikiem Gilson INC.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy metodę hodowli robotycznej do produkcji iPSC, która miniaturyzuje i automatyzuje podawanie i pasaż w formacie 96-dołkowej płytki, umożliwiając jednocześnie efektywne skalowanie. Robot do obsługi cieczy został wykorzystany do rutynowego karmienia kolonii iPSC i przechodzenia przez nie w regularnych odstępach czasu poprzez dysocjację enzymatyczną. Robot został również zaprogramowany do wytwarzania płytek pokrytych żelem macierzy zewnątrzkomórkowej i wykonywania gradientu gęstości wysiewu. Gdy fibroblasty i iPSC pochodzące z tkanki tłuszczowej były hodowane w tym systemie przez ponad 20 pasaży, około 3 miesięcy, pluripotencja została utrzymana, podobnie jak stabilne kariotypy. Obie linie komórkowe były zdolne do różnicowania się w kardiomiocyty. Opisany tutaj zbiór protokołów umożliwia użytkownikom z bardzo małym doświadczeniem w hodowli komórek macierzystych lub ograniczonym dostępem do specjalistycznego sprzętu do hodowli komórek macierzystych hodowlę komórek macierzystych i osiągnięcie wysokiej produkcji komórek lub obsługi wieloliniowej przy minimalnym nakładzie pracy i kosztów.
Opisane tutaj protokoły robotyczne zapewniają metodę ekonomicznego zwiększania skali produkcji i obsługi iPSC. Jedną z zalet jest skalowalna hodowla komórek macierzystych w ustalonym formacie opartym na płytce, którą zademonstrowano tutaj, a wcześniej44,47–49 w celu utrzymania pluripotencji. Podczas gdy inne formaty skalowalnej hodowli komórek macierzystych dają komórki pluripotencjalne20,23,29 , ta metoda oparta na płytkach zasadniczo nie wymaga zmian w formacie hodowli, takich jak adaptacja do zawiesiny, stosowanie przeciwpieniących substancji chemicznych lub długotrwałe stosowanie inhibitora kinazy Rho20. Ta metoda oparta na płytkach może zatem szybko i przewidywalnie dostosować się do nowych linii, ponieważ warunki hodowli są podobne. Wraz ze wzrostem wykorzystania iPSC do modelowania chorób4,6,19,50, stale generowane są nowe linie iPSC. Opisane tutaj techniki najlepiej nadają się do hodowli nowych linii w średnim i dużym wolumenie oraz przepustowości, ponieważ bariera przejścia na format jest niska. Dotyczy to również pracy i sprzętu niezbędnego do utrzymania kolonii. Wreszcie, ponieważ format i obsługa są podobne do środowiska używanego do wyprowadzania i weryfikowania linii iPSC, wydajność hodowli, taka jak ukierunkowane różnicowanie, będzie prawdopodobnie bardziej przewidywalna.
Rysunek 8 ilustruje jedną ze strategii zwiększania skali produkcji komórek macierzystych na płytkach 96-dołkowych. Jedna płytka (cykl 0) służy do automatycznego wysiewu 12 nowych płytek, co daje 12-krotne zwiększenie (cykl 0 do 1). Po kilku dniach karmienia jedna z dwunastu płytek jest pasażowana, aby wysiać kolejny zestaw dwunastu płytek (cykl 1 do cyklu 2). Pozostałe jedenaście płyt jest teraz dostępnych do innych zastosowań i stanowi komponent produkcyjny systemu. W tym tempie przejście jednej płytki zapewni 11 płytek w każdym cyklu lub co 3-4 dni. Metodologia ta może być bardziej skalowana, gdy przechodzi wiele płyt, jak pokazano w przejściu z cyklu 2 do cyklu 3. W cyklu 3 zawsze używa się dwóch szalek do utrzymania kolonii i wysiewu 24 nowych płytek. Pozostałe 22 płytki są następnie dostępne do użycia po każdym cyklu przejścia. W dowolnym momencie cyklu konserwacji użytkownik może wysiać więcej talerzy, aby zwiększyć produkcję. Jednym z przykładów może być przejście przez każdą kolumnę przez dwa cykle wzrostu. Pierwszy fragment przekształca jedną płytkę w dwanaście płytek, a każda z dwunastu płytek jest używana do zasiewu 144 płytek. W tym przypadku użytkownik zaczyna od jednej płytki i po dwóch przejściach, czyli około 1,5-2 tygodniach hodowli, ma 144 płytki. Na przykład linie iPSC fibroblastów i tkanki tłuszczowej dają około 25-75 milionów komórek na 96-dołkową płytkę, gdy są gotowe do przejścia. 144 płytki mogą zatem reprezentować około 4-7 x 109 komórek.
Jakie jest obciążenie pracą przy zrobotyzowanym przenoszeniu 144 płytek 96-dołkowych? Jednym z celów tej pracy była skalowalna produkcja komórek macierzystych, która zmniejszyła nakład pracy w porównaniu z tradycyjną (tj. 6-dołkową) hodowlą komórek macierzystych. Robot osiąga to, zmniejszając potrzebę fizycznej obsługi każdej płytki podczas podawania i przejścia. Podczas gdy produkcja płytek 96-dołkowych skaluje się liniowo, tak jak w przypadku tradycyjnych płytek 6-dołkowych, czas spędzany przez technika na pracy z płytkami jest znacznie krótszy przy użyciu hodowli robotycznej. Z tej różnicy wynika wydajność produkcji kultury robotycznej (rysunek 9). Okazało się, że technicy mogą wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora, sprawdzić ją pod mikroskopem, a następnie zassać i podać płytkę w ciągu około 3,5 minuty. Dla porównania, technicy spędzają około 30 sekund na wyjmowaniu 96-dołkowej płytki z inkubatora i sprawdzaniu jej pod mikroskopem pod kątem gęstości i zanieczyszczeń przed umieszczeniem jej na robocie. Dzięki rozszerzonemu protokołowi karmienia, podobnemu do opisanego powyżej, można załadować i podawać sześć 96-dołkowych płytek, co zajmuje około 21 minut, czyli 3,5 minuty na płytkę. Całkowity czas, jaki upłynął do podania płytki, jest porównywalny między metodami zrobotyzowanymi i ręcznymi, ale do ręcznego podawania 6 płytek potrzebny jest technik przez wszystkie 21 minut, podczas gdy technik poświęca tylko 3 minuty na obsługę sześciu płytek dla robota (30-sekundowa kontrola na płytkę). Jak pokazano na rysunku 9 , czas, jaki technik poświęca na obsługę 144 płyt za pomocą robota, wynosi około 1,2 godziny, w przeciwieństwie do 8 godzin ręcznie, a robot nigdy nie popełni błędu podczas obsługi płytek lub przenoszenia płynów.
Opisane tutaj metody hodowli iPSC z 96 dołkami stanowią łatwą platformę do wykonywania złożonych zadań przesiewowych. Ponieważ każda studzienka jest genetycznie identyczna i obsiana tą samą gęstością z tej samej początkowej puli, zmienne mogą być rozprowadzane po płycie i utrzymywane przez robota za pomocą dostępnych na rynku zbiorników w celu segregacji warunków. Byłoby to przydatne w eksperymentach, takich jak opracowywanie pożywek do wzrostu komórek macierzystych34,35,47, testowanie warunków substratu lub hodowli oraz badania toksyczności z wykorzystaniem komórek macierzystych51. Ponieważ każda linia komórek macierzystych jest wyjątkowa pod względem optymalnej wielkości kolonii i wymagań dotyczących pasażu, można użyć tego systemu do modulacji gęstości wysiewu, częstotliwości karmienia i obsługi pasażu poprzez manipulowanie zebranymi kolumnami, mieszaniem mechanicznym podczas pasażu i częstotliwością karmienia. Iteracja przez te zmienne pozwoli użytkownikowi szybko znaleźć zestaw warunków odpowiednich dla hodowli nowej linii lub opracować nowe techniki hodowli. Zrobotyzowany system jest również w stanie utrzymać 96 równoległych, ale niezależnych kolonii komórek macierzystych. Gdy iPSC pochodzą z komórek somatycznych lub są klonowane po manipulacji genetycznej, wiele równoległych klonów jest poddawanych badaniom przesiewowym w celu uzyskania potencjalnych linii iPSC. Gdy pojedyncze komórki zostaną wysiane na 96-dołkowe płytki, system ten może zasilać i przechodzić przez 96-dołkowe płytki, utrzymując każdą kolonię w separacji. Umożliwia to bardzo wysoką przepustowość przy wyborze potencjalnych klonów i eliminuje trudności w fizycznym hodowaniu 96 równoległych linii. Metoda ta pozwala również na zwiększenie skali produkcji każdego klonu, dzięki czemu materiał jest łatwo dostępny do analizy równoległej. Wreszcie, przewidujemy integrację tych technik hodowli z robotycznym systemem transportu płytek, który dostarcza płytki do i z inkubatora, umożliwiając w pełni zautomatyzowaną hodowlę. Można to osiągnąć za pomocą bardziej złożonej robotyki, która pozwala na większą rozbudowę, ponieważ opisane tutaj podstawowe protokoły można przenieść do innych systemów opartych na płytach.
Pierwszymi krytycznymi krokami, które należy uwzględnić w protokołach, są kroki, które zapobiegają zanieczyszczeniu i sprawdzają je pod kątem zanieczyszczenia, takie jak kroki 1.5 i 4.2. Zanieczyszczenia, jak omówiono powyżej, można skutecznie uniknąć, jeśli zastosuje się dobrą sterylną technikę i zdrowy rozsądek. Niezależnie od formatu hodowli komórek macierzystych, konieczne jest, aby operator sprawdził, czy nie ma zanieczyszczenia, a wykonanie tego w tym protokole na wskazanych etapach znacznie zmniejszy ryzyko zanieczyszczenia. Właściwa aplikacja żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej jest drugim niezbędnym krokiem do ogólnego sukcesu tego protokołu. Bez odpowiedniego pokrycia 96-dołkowych płytek komórki macierzyste nie będą rosły. Jednym z częstych problemów jest niekompletne pokrycie studni. Doświadczenie pokazuje, że pęcherzyki powietrza, przyciąganie elektrostatyczne i działanie kapilarne utrudniają pełne pokrycie studni. Etap wstępnego zwilżania (1.6) został opracowany w celu znacznej poprawy powłoki dna studni i nie należy go pomijać. Ten etap wstępnego zwilżania wydaje się zmniejszać pozorną hydrofobowość plastikowej płytki 96-dołkowej, tak że po nałożeniu powłoki żelowej macierzy zewnątrzkomórkowej jest ona równomiernie rozprowadzana na dnie i bokach studzienki. Zaleca się również delikatne stukanie 96-dołkowymi płytkami w czystą dłoń po pokryciu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie roztworu żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. Parametry dysocjacji są również ważne dla optymalizacji. Przedłużona inkubacja z odczynnikiem dysocjacyjnym na bazie enzymu lub EDTA spowoduje powstanie pojedynczych komórek, które mogą, ale nie muszą, być celem podczas przejścia. Dlatego operator powinien zwrócić szczególną uwagę na to, jak czas dysocjacji, siła rozcierania i powtórzenia płukania wpływają na morfologię i zdrowie kolonii oraz odpowiednio dostosować.
Zrozumienie ograniczeń opisanych tutaj technik ma kluczowe znaczenie dla udanej operacji. Podobnie jak w każdym innym środowisku hodowli komórkowych, stosowanie płytek 96-dołkowych wiąże się ze stosunkowo wysokim ryzykiem zanieczyszczenia. Jak opisano powyżej, technik obsługuje każdą płytkę podczas podawania i pasażu; Na przykład podczas otwierania pokrywy, kładzenia płytki na łożu robota i sprawdzania płytki pod mikroskopem. Dlatego, jak wspomniano po kroku 1.5, konieczne jest, aby nie dotykać wnętrza pokrywy płyty ani nie wystawiać tej części na kontakt z potencjalnie zanieczyszczoną powierzchnią, taką jak nachylone bloki grzewcze lub pionowe kołki na łóżku. Podczas opracowywania protokołu odkryto to ograniczenie, które było impulsem do opracowania stojaka do przechowywania pokrywek płytek w celu utrzymania sterylności. Podobnie, zbiorniki korytowe, końcówki pipet i inne materiały na łożu robota do obsługi cieczy są potencjalnymi źródłami zanieczyszczeń, ponieważ są otwarte na środowisko i obsługiwane przez technika. Dlatego należy stosować dobrą technikę sterylną, taką jak ograniczenie ruchów nad odsłoniętymi materiałami hodowlanymi lub otwartymi płynami. Innym ograniczeniem jest to, że gdy protokół jest skalowany, wizualne sprawdzanie każdego dołka ze >100 96-dołkowymi płytkami jest kłopotliwe. Można sobie z tym poradzić, dokonując wizualnej kontroli całej płyty pod kątem oznak zanieczyszczenia, takich jak mętne media, w celu zidentyfikowania podejrzanych studni. W celu zwiększenia skali działalności w przyszłości zostanie wykorzystany zautomatyzowany mikroskop oraz wskaźnik wzrostu komórek i potencjalnego zanieczyszczenia.
Podsumowując, opisana tutaj wysokoprzepustowa platforma oparta na 96 dołkach oferuje powtarzalną, bardzo wierną metodę hodowli i produkcji komórek macierzystych w formacie płytki. Metoda ta zmniejsza wymagane doświadczenie, niezbędny sprzęt i czas pracy poświęcony hodowli komórek macierzystych przy jednoczesnym zachowaniu korzyści płynących z tradycyjnej hodowli adherentnej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) znacznie wzrosło od czasu ich wyprowadzenia w 2007 roku1 do testowania związków, medycyny regeneracyjnej i modelowania chorób 2-6. Zapotrzebowanie to wynika ze zdolności iPSC do wytwarzania dużej liczby komórek pluripotencjalnych, które można różnicować w komórki somatyczne w niezrównanej ilości. Wraz z poprawą technik ukierunkowanego różnicowania 7-10 i rozwojem modelowania ludzkich komórek lub tkanek oraz terapią komórkową wzrostem11-14, rośnie również zapotrzebowanie na masową produkcję wysokiej jakości iPSC. Powszechnie uważa się, że wśród innych dolegliwości, zawał mięśnia sercowego lub funkcjonalna wymiana komórek B będzie wymagała setek milionów do miliardów komórek somatycznych pochodzących z iPSC15-18. Co więcej, coraz bardziej złożone modelowanie tkanek 3D w celu odkrywania i terapii leków będzie wymagało dużej liczby komórek9,13,19. We wszystkich tych przykładach zdefiniowane, jednolite i powtarzalne iPSC muszą być dostępne i łatwe do wyprodukowania.
Aby produkować biofarmaceutyki pochodzące z komórek macierzystych oraz komórki do inżynierii tkankowej i transplantacji, niezbędna jest opłacalna technologia produkcji komórek. Skalowana produkcja iPSC skupiła się na hodowli zawiesiny20–25 lub zawiesinie z użyciem substratów mikronośnikowych26–28, częściowo dlatego, że techniki te są z powodzeniem stosowane w produkcji eukariotycznej na dużą skalę, bez iPSC. Kilka grup zademonstrowało systemy hodowli zawiesinowych, które dają pluripotencjalne komórki macierzyste20,21,23,24,29. Jednak podejścia te wykorzystują drogie i złożone systemy, które nie są łatwo dostępne dla naukowców opracowujących nowatorskie programy różnicowania, kierujących inżynierią tkankową i prowadzących badania na skalę laboratoryjną. Ponadto hodowle iPSC w zawiesinie i mikronośniku wymagają adaptacji i technik lub substancji chemicznych, które nie występują w tradycyjnych, przylegających kulturach iPSC, takich jak ciągłe stosowanie inhibitora kinazy Rho, środków przeciwpieniących i filtracji w celu regulacji agregacji. Naprężenia fizyczne w komórkach są bardziej rozpowszechnione w hodowli zawiesiny, wprowadzane przez mieszanie mechaniczne, a także podczas zderzenia mikronośników. Problemy te ograniczają przewidywalność i szybkość, z jaką nowo wygenerowane linie komórek macierzystych mogą być hodowane w zawiesinie. Inne firmy opracowały zrobotyzowane systemy obsługi płytek, które naśladują techniki hodowli płytek30,31, ale oprócz podstawowych wyzwań związanych z hodowlą komórek macierzystych platformy te wymagają znacznych inwestycji w sprzęt i wiedzę specjalistyczną.
Poniższa praca opisuje rozwój i praktykę skalowalnego systemu hodowli iPSC, który wykorzystuje samodzielny, standardowy 8-kanałowy robot do obsługi cieczy i 96-dołkowe płytki. Metoda ta została opracowana w celu połączenia hodowli iPSC na skalę laboratoryjną i produkcji iPSC na dużą skalę (np. 107 – 1,5 x 109 komórek tygodniowo na technika), umożliwiając osobom opracowującym nowe technologie iPSC łatwe zwiększenie skali produkcji bez dużych inwestycji w sprzęt lub pracę. Ta metoda jest stosunkowo niedroga w konfiguracji, wymaga niewielkiej lub żadnej hodowli komórek macierzystych, programowania lub doświadczenia inżynieryjnego, zajmuje niewiele miejsca na sprzęt bez potrzeby stosowania dedykowanego kaptura do hodowli komórkowych i wykorzystuje standardowy sprzęt do hodowli komórek, aby umożliwić zautomatyzowaną produkcję komórek o średniej i wysokiej przepustowości. Celem było opracowanie systemu zdolnego do skalowalnej hodowli komórek macierzystych, który mógłby być wykorzystany przez laboratoria nowe w hodowli komórek macierzystych, tych, dla których ręczna hodowla stanowi przeszkodę w rozwijaniu swoich pomysłów lub tych, którzy chcą ekonomicznego sposobu na produkcję dużej liczby komórek macierzystych. Przedstawiona tutaj platforma eliminuje wpływ techników na hodowlę komórek macierzystych i normalizuje procedury karmienia i pasażu, aby umożliwić stałą produkcję komórek macierzystych.

<table><tbody><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96-dołkowe; Objętość studni: 360&nbsp; &#956; l; Obszar wzrostu komórek: 0,32&nbsp; cm2; Indywidualnie pakowane</td></tr><tr><td>koryto Seahorse</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Zbiornik 4 Przezroczysta część Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Końcówki</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 stojaków Gilson 96 końcówek Końcówki D200</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>proszek DMEM/F12.&nbsp; Zawiesić w 1 l oczyszczonej wody klasy do hodowli komórkowych i sterylnym filtrze.</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu o obniżonym współczynniku wzrostu Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Określany w tekście jako "żel do macierzy zewnątrzkomórkowej". Matrigel GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Kompletny zestaw do konserwacji hES.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Zestaw do konserwacji hESC/hiPSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Inhinitor skalny Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innowacyjne technologie komórkowe</td><td>ACCUTAZA</td><td>W tekście określany jako "odczynnik dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej". Accutase 500&nbsp; ml sterylny roztwór komórek</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS w/o Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

skalowalna hodowla i produkcja ipsc na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Ciągły postęp w hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych wypełnia lukę między stanowiskiem a szpitalem do wykorzystania tych komórek w medycynie regeneracyjnej, odkrywaniu leków i testowaniu bezpieczeństwa. Aby móc produkować biofarmaceutyki i komórki komórkowe pochodzące z komórek macierzystych oraz komórki do inżynierii tkankowej i transplantacji, niezbędna jest opłacalna technologia produkcji komórek. Utrzymanie pluripotencji i stabilnej wydajności komórek w dalszych zastosowaniach (np. różnicowanie komórek) w czasie ma kluczowe znaczenie dla produkcji komórek na dużą skalę. Jednak może to być trudne do osiągnięcia, zwłaszcza jeśli komórki są hodowane ręcznie, gdzie operator może wprowadzić znaczną zmienność, a także być zbyt kosztownym w zwiększaniu. Aby umożliwić wysokowydajną produkcję komórek macierzystych na dużą skalę i wyeliminować wpływ operatora, opracowano nowatorskie protokoły hodowli komórek macierzystych przy użyciu stacjonarnego wielokanałowego robota do obsługi cieczy, które wymagają minimalnego zaangażowania techników lub doświadczenia. Dzięki tym protokołom ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) hodowano w warunkach wolnych od karmienia bezpośrednio z zamrożonego stada i utrzymywano na 96-dołkowych płytkach. W zależności od linii komórkowej i pożądanego tempa skalowania, operator może łatwo określić, kiedy przejść przez linię na podstawie serii obrazów pokazujących optymalne zagęszczenie kolonii do podziału. Następnie przygotowuje się niezbędne odczynniki do przeprowadzenia podziału kolonii na nowe płytki bez etapu wirowania. Po 20 pasażach (~3 miesiące) dwie linie iPSC utrzymywały stabilne kariotypy, wykazywały ekspresję markerów komórek macierzystych i różnicowały się w kardiomiocyty z wysoką wydajnością. System może przeprowadzać późniejsze wysokoprzepustowe badania przesiewowe nowych protokołów różnicowania lub manipulacji genetycznej przeznaczonych dla płytek 96-dołkowych. Technologia ta zmniejszy nakład pracy i obciążenia techniczne związane z produkcją dużej liczby identycznych komórek macierzystych do niezliczonych zastosowań.

Opisane protokoły pozwalają laboratoriom na przeprowadzanie skalowalnych, przylegających hodowli komórek macierzystych z dużą wydajnością przy minimalnym nakładzie pracy, doświadczenia i inwestycji w sprzęt przy użyciu programowalnego robota do obsługi cieczy i 96-dołkowych płytek. iPSC pasażowane ponad 20 razy w tym systemie utrzymywały pluripotencję, prawidłowe kariotypy i różnicowały się w kardiomiocyty.

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest powtarzalne przygotowanie skalowalnej hodowli komórek pluripotencjalnych. Osiąga się to najpierw poprzez wykorzystanie zaprogramowanego robota do obsługi cieczy w celu wysiania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w różnych gęstościach. W drugim kroku, na płytce 96-dołkowej, wizualnie identyfikuje się dołki o optymalnej gęstości kolonii w celu ich zapakowania.Następnie indukowane ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste wysiewa się na nowe płytki w celu automatycznego zasilania i dalszego pasażowania. Ostatecznie procedura ta pozwala na dobór optymalnych gęstości wysiewu do namnażania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z myślą o ich późniejszym różnicowaniu w kardiomiocyty. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na rozwój terapii spersonalizowanych i regeneracyjnych w skali średniej.Robot do hodowli komórek pluripotencjalnych URI nadaje się do produkcji kilkuset milionów pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu kilku dni, które mogą następnie zostać zróżnicowane w różne rodzaje komórek do spersonalizowanego testowania leków lub terapii implantacyjnej komórkami i tkankami. Choć metoda ta została zastosowana do przesiewania gęstości wysiewu w celu optymalizacji ekspansji hodowli komórek pluripotencjalnych, może być ona również wykorzystana do optymalizacji i identyfikacji nowych protokołów różnicowania dla wielu innych typów komórek. Procedurę zaprezentuje naukowiec z zakresu farmacji, Neil Daily z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury dokarmiania należy sprawdzić 96-dołkową płytkę z koloniami komórek macierzystych pod kątem kontaminacji oraz potwierdzić, że gęstość kolonii komórek jest niższa od idealnej gęstości pasażowania.Jeśli komórki są w dobrym stanie, umieść płytkę w gnieździe. Ustaw ją na nachylonej rampie o temperaturze 37 °C robota do obsługi cieczy i załaduj do gniazda rack z końcówkami. Użyj końcówek do pipet o pojemności 200 µL w temperaturze pokojowej w pozycji pierwszej.Umieść korytko czterodołkowe w pozycji gniazda dwa i napełnij trzeci dołek korytka ośmioma mililitrami świeżego, w temperaturze pokojowej medium do wzrostu komórek macierzystych bez inhibitora kinazy RO. Następnie przenieś płytkę do statywu na płytki i korzystając z panelu sterowania robotem, wybierz sekwencyjnie Run the protocol colony feed one plate, a następnie next, po czym naciśnij test run, aby użyć kreatora krok po kroku w celu przetestowania wybranego programu. Po zatwierdzeniu protokołu wybierz run protocol. Po karmieniu odzyskaj 96-dołkową płytkę z koloniami komórek macierzystych.Następnie należy zapisać szczegóły karmienia na pokrywie płytki i umieścić ją z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny, aż do następnego karmienia lub pasażowania. Wybór studni do rozdzielenia zależy od gęstości kolonii. Kilka dni po ustanowieniu gradientu gęstości wysiewu na tej płytce, widzimy studnię, która jest zbyt gęsta do rozdzielenia, studnię o optymalnej gęstości do rozdzielenia oraz studnię zbyt rzadką, aby przeprowadzić pasaż po kilku cyklach karmienia.Należy potwierdzić, że odstęp między większością kolonii na płytce 96-dołkowej wynosi 25% średnicy sąsiedniej kolonii; w przeciwnym razie kolejne karmienie spowoduje zrastanie się kolonii. Jeśli kolonie nie są zanieczyszczone, należy umieścić płytkę w gnieździe. Ustawić trzy z nich na rampie o temperaturze 37 °C i załadować kasetę z końcówkami do gniazda.Umieść końcówki do pipety 200 µL w temperaturze pokojowej w pozycji pierwszej. W pozycji drugiej platformy umieść korytko czterodołkowe, a następnie, pozostawiając czwarty dołek pusty, dozuj do dołka trzeciego 8,5 mL pożywki do wzrostu komórek macierzystych uzupełnionej o inhibitor kinazy Rho Y 2 7 6 3 2, do dołka drugiego 3,5 mL 30% odczynnika do dysocjacji proteolitycznej i kolagenolitycznej oraz do dołka pierwszego 4,5 mL PBS.W kolejnym kroku umieść nową, podgrzaną do 37 °C płytkę 96-dołkową pokrytą żelem z macierzy zewnątrzkomórkowej w gnieździe numer pięć, a stare i nowe pokrywki płytek przenieś do statywu na pokrywki. Następnie za pomocą panelu sterowania robotem kolejno wybierz „run a protocol colony split one to 12 column one”, a potem opcję „next”. Następnie wybierz „test run”, aby skorzystać z kreatora krok po kroku w celu wstępnego przetestowania wybranego programu, a na koniec wybierz „run protocol”.Po zakończeniu protokołu pasażowania należy wyjąć obie płytki. Nową płytkę należy opisać odpowiednimi informacjami i umieścić obie płytki z powrotem w inkubatorze. Przez 24 godziny komórki i kolonie powinny przylegać do płytki w ciągu dwóch do trzech godzin od rozdzielenia, wykazując znaczne rozpłaszczenie z powodu obecności inhibitora kinazy RO.Po pierwszym karmieniu bez inhibitora kinazy RO, komórki skondensują się i wykażą charakterystyczną morfologię komórek macierzystych przypominającą brukowanie. Nieprawidłowości chromosomalne są powszechnie obserwowane podczas hodowli komórek macierzystych, ale mogą nie wpływać na rozkład markerów pluripotencji, takich jak te pokazane na tych obrazach; rzeczywiście analiza kariotypu komórek hodowanych zgodnie z zaprezentowanym protokołem wykazała, że obie robotycznie pasażowane linie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych posiadały 46 prawidłowych chromosomów, co sugeruje, że zrobotyzowana metoda hodowli nie wprowadziła niestabilności chromosomalnej ponad to, co może wystąpić w normalnych warunkach. W celu zbadania ustalonych markerów ekspresji genów komórek macierzystych w robotycznie hodowanych liniach indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, pobrano również całkowite RNA.Obie indukowalne linie pluripotentowych komórek macierzystych w tym eksperymencie wykazały podobną ekspresję markerów pluripotencji, czego nie zaobserwowano w przypadku kardiomiocytów zróżnicowanych z każdej z tych linii, ani w oddzielnej linii ludzkich fibroblastów skóry. Co więcej, po zróżnicowaniu obu indukowalnych linii pluripotentowych komórek macierzystych w kardiomiocyty, wykazano w nich wyraźne tworzenie sarkomerów. Wspólnie dane te sugerują, że trzy miesiące i ponad 20 pasaży w kulturze robotycznej doprowadziły do uzyskania chromosomalnie prawidłowych komórek wykazujących program transkrypcyjny zgodny z pluripotencją, które były również zdolne do zróżnicowania w kardiomiocyty.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wykorzystać ten lub podobny robot do pipetowania w celu skalowalnej hodowli komórek pluripotencjalnych.

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Skalowalna kultura i produkcja iPSC w oparciu o 96-dołkową płytkę za pomocą robotycznego systemu manipulacji płynami

Opisano konstrukcję biblioteki fosmidów z genomowego DNA środowiskowego, wyizolowanego z pionowego kontinuum głębokości sezonowo hipoksycznego fiordu. Powstała biblioteka klonów zostaje przeniesiona do płytek 384-dołkowych i zarchiwizowana w celu późniejszego sekwencjonowania oraz przesiewania funkcjonalnego przy użyciu zautomatyzowanego systemu wybierania kolonii.

Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

Ilościowa Analiza Przystosowania (QFA) to komplementarna seria metod eksperymentalnych i obliczeniowych służąca do szacowania przystosowania kultur mikrobiologicznych. QFA pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych, leków lub innych zastosowanych zabiegów na wzrost drobnoustrojów. Możliwe jest zaprojektowanie eksperymentów o skali od ukierunkowanej analizy pojedynczych kultur po tysiące kultur prowadzonych równolegle.

Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

Przedstawiono protokół do zrobotyzowanego drukowania sferoid komórek rakowych na wysokoprzepustowej 96-dołkowej płytce przy użyciu wodnego systemu dwufazowego.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Ten protokół służy jako obszerny samouczek do ustandaryzowanego i powtarzalnego mieszania lepkich materiałów za pomocą nowatorskiej technologii automatyzacji open source. Znajdują się tam szczegółowe instrukcje dotyczące obsługi nowo opracowanej stacji roboczej typu open source, korzystania z projektanta protokołów open source oraz walidacji i weryfikacji w celu identyfikacji powtarzalnych mieszanin.

Platforma technologiczna typu open source do produkcji modeli kultur 3D na bazie hydrożelu w zautomatyzowany i ustandaryzowany sposób

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Protokół ten dokumentuje wytwarzanie i montaż SPOT, wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach, w formatach 96- i 384-dołkowych. Szczegółowo opisuje również proces wysiewu dla SPOT, zarówno ręczny, jak i przy użyciu dostępnego na rynku urządzenia do obsługi cieczy.

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Poznaj skalowalną hodowlę iPSC na płytkach 96-dołkowych przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy. Ta metoda umożliwia efektywne utrzymanie pluripotencji i różnicowanie w kardiomyocyty po ponad 20 pasowaniach.

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Przeglądaj więcej filmów