Name: Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj system TetON do indukowalnej ekspresji genów w tkankach danio pręgowanego podczas regeneracji płetwy ogonowej. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów w wybranych tkankach z wykorzystaniem doksycykliny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Christie Haase, Doris Weber i Brigitte Korte za pomoc techniczną. Prace w laboratorium Weidinger są wspierane przez granty Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223/3-1, WE 4223/4-1 oraz Deutsche Gesellschaft für Kardiologie za pośrednictwem Oskar-Lapp-Stipendium i Klaus-Georg-und-Sigrid-Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dorosły danio pręgowany ma niesamowitą zdolność do skutecznej regeneracji wielu narządów wewnętrznych i przydatków. Dokładne zrozumienie mechanizmów molekularnych i komórkowych wymaga specyficznej tkankowo analizy funkcji genów i szlaków sygnałowych. W tym celu system TetON stanowi skuteczne narzędzie do czasowo kontrolowanej ekspresji genów u embrionalnych i dorosłych ryb danio pręgowanych. Konstrukcje i metodologia systemu TetON opisane w tym manuskrypcie zostały z powodzeniem wykorzystane w niedawnym badaniu naszego l...

Danio pręgowany jest dobrze znanym modelowym organizmem kręgowców do badania wielu aspektów rozwoju, fizjologii, chorób i regeneracji. Wraz z rosnącym zastosowaniem danio pręgowanego jako modelu postembrionalnych procesów biologicznych, coraz ważniejsze stają się narzędzia eksperymentalne do indukowalnej, specyficznej tkankowo manipulacji ekspresją genów lub szlakami sygnałowymi. W szczególności badania nad regeneracją narządów i przydatków u dorosłych ryb danio pręgowanego ucierpiały z powodu braku narzędzi do analizy czasoprzestrzennych wymagań szlaków sygnałowych podczas tych procesów regeneracyjnych.
Obecnie, trzy różne systemy zostały użyte do osiągnięcia warunkowej, specyficznej tkankowo ekspresji genów w regenerujących się organach dorosłego danio pręgowanego: system Cre-lox, mozaikowa ekspresja transgenów indukowanych szokiem cieplnym za pomocą transgenezy somatycznej za pośrednictwem transpozonu, oraz system TetON1-3. TetON odnosi się do wariantu systemu aktywacji transkrypcji kontrolowanego tetracykliną, w którym ekspresja jest aktywowana w obecności antybiotyku tetracykliny lub pochodnej, np. doksycykliny. System Cre-lox, tak jak do tej pory był stosowany u dorosłych ryb, opiera się na kontrolowanej przez tamoksyfen rekombinazie Cre (CreERT2), której ekspresja jest ograniczona przestrzennie przez specyficzne tkankowo elementy regulatorowe. Usunięcie kasety STOP sterowane przez Cre ułatwia ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania, napędzanego przez promotor, który powinien być aktywny we wszystkich typach komórek1. Tworzenie transgenów somatycznych o ekspresji mozaikowej za pośrednictwem transpozonów zapewnia system indukowalnej ekspresji transgenów w poszczególnych liniach komórkowych. Wstrzyknięcie zarodków danio pręgowanego z transpozonem Tol2 przenoszącym gen będący przedmiotem zainteresowania pod kontrolą transkrypcyjną promotora szoku cieplnego powoduje, że chimeryczne osobniki zazwyczaj są nosicielami transgenu tylko w dyskretnych liniach komórkowych regenerującego się narządu2. Podczas gdy oba systemy pozwalają na warunkową ekspresję genów specyficznych dla tkanki, system Cre-lox nie jest odwracalny, a strategia wykorzystująca znakowanie klonalne oparte na transpozonach cierpi ze względu na swoją stochastyczną naturę. W związku z tym my i inni niedawno dostosowaliśmy transgeniczne systemy TetON do stosowania u danio pręgowanego, które ułatwiają czasowo i przestrzennie kontrolowaną ekspresję genów, która jest ponadto dostrajalna i odwracalna3-5.
System TetON używany tutaj składa się z transgenicznej linii sterującej (TetActivator), w której indukowany doksycykliną (DOX) aktywator transkrypcji (ulepszony odwrotny transaktywator tetracykliny, irtTA, w skrócie TetA) jest pod kontrolą specyficznych dla tkanek genomowych sekwencji regulatorowych. Po drugie, wymaga transgenicznej linii odpowiedzi (TetResponder), która zawiera gen będący przedmiotem zainteresowania pod kontrolą transkrypcyjną operatora tetracykliny (element odpowiedzi Tet; TetRE) (rysunek 1A). W związku z tym zastosowanie specyficznych kombinacji linii TetActivator i TetResponder pozwala na warunkową specyficzną tkankowo manipulację ekspresją genów.
Ostatnio wykorzystaliśmy system TetON do zbadania specyficznych dla tkanek funkcji sygnalizacji Wnt/beta-kateniny w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej zebry3. W przedstawionym tutaj protokole opisano przebieg pracy związany z konfiguracją i użytkowaniem systemu TetON u danio pręgowanego, w szczególności w badaniach nad regeneracją płetw. Zawiera on szczegółowe instrukcje, jak generować stabilne transgeniczne linie TetActivator i TetResponder oraz protokół indukcji transgenów u zarodków i dorosłych danio pręgowanego. Ponadto opisano techniki weryfikacji specyficznej tkankowo ekspresji genów w regeneracji płetwy, w tym protokół przygotowania kriosekcji dorosłych płetw grybo. Dodatkowo omawiamy zagadnienia dotyczące projektowania transgenu TetActivator, wyboru metody transgenezy i wykrywania ekspresji TetResponder. W związku z tym ogólnym celem tego protokołu jest posłużenie jako plan stworzenia funkcjonalnego systemu TetON u danio pręgowanego w celu osiągnięcia warunkowej ekspresji genów specyficznej dla tkanki, którą można zastosować do dowolnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
Stworzyliśmy wektor TetActivator, który pozwala na generowanie stabilnych linii TetActivator za pośrednictwem I-SceI lub Tol2 przy użyciu krótkich genomowych sekwencji regulatorowych (fragmenty wzmacniacza; Baza danych plazmidów laboratorium Weidingera nr 1247; Rysunek 1B). Ten konstrukt zawiera kasetę TetActivator składającą się ze zmutowanego wariantu M2 odwróconej domeny represora Tet połączonej z pochodną domeny transaktywacyjnej wirusa opryszczki pospolitej VP16 3F [irtTAM2(3F)]. Ekspresja TetActivatora (TetA) może być łatwo monitorowana, ponieważ ulega on jednoczesnej ekspresji z fluoroforem AmCyan z tej samej otwartej ramki odczytu; peptyd p2a pośredniczy w pomijaniu rybosomów, co powinno skutkować wytwarzaniem TetA i AmCyan jako oddzielnych białek w stosunku 1:15,6. Konstrukt zawiera również poylinker 5' kasety TetActivator, aby ułatwić wprowadzanie interesujących sekwencji regulatorowych genomu przy użyciu konwencjonalnych metod klonowania.
Dodatkowo, stworzyliśmy konstrukcję składającą się z wyżej opisanej kasety TetActivator oraz kasety selekcyjnej Kanamycyny (baza danych plazmidów Weidinger lab nr 1180; Figura 1C), który można rekombinować w sztuczny chromosom bakteryjny (BAC) zawierający duży region genomu (zwykle do kodonu start genu, którego wzorzec ekspresji ma być naśladowany przez transgen). Oba konstrukty są dostępne w laboratorium Weidinger na życzenie.

<table><tbody><tr><td>Pudełka hodowlane</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Złożony mikroskop fluorescencyjny</td>, <td>np. Leica, Zeiss</td><td>różni się w zależności od producenta</td>, <td>aby obrazować fluorescencyjne skrawki tkanek</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>, np. Leica, Zeiss</td><td>różni się w zależności od producenta</td>, <td>aby obrazować fluorescencyjne skrawki tkanek</td></tr><tr><td>Kriostat</td>, <td>np. Leica, Thermo-Scientific</td><td>różni się w zależności od producent</td><td>do kriosekcji</td></tr><tr><td>4', 6-diamidino-2-fenylonolol (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>użyj 1/5,000 w PBS do wizualizacji jąder</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>przygotuj zapasy w 50% EtOH w stężeniu 50 mg/ml (97 mM) do indukcji TetResponder</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (w/v) paraformaldehyd w PBS, pH 7,5 do utrwalania</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna z buforem fosforanowym + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS z 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe adhezyjne Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>do pobierania skrawków tkanek</td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny</td>, <td>np. Leica, Zeiss</td><td>różni się od producenta</td><td>do genotypowania opartego na fluorescencji</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>, np. Biorad, Applied Biosystems</td><td>różni się od producenta</td><td>do genotypowania opartego na PCR</td></tr><tr><td>Pożywka do zamrażania tkanek (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>do osadzania tkanek próbki</td></tr><tr><td>Trikainy (L-etylo-m-amino-benzoesanosulfonian metanu/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>do znieczulenia stosować w dawce 1 mg/ml w pożywce dla zarodków E3</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie systemu teton do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Danio pręgowany stał się bardzo ważnym organizmem modelowym do badania rozwoju kręgowców, fizjologii, chorób i regeneracji tkanek. Dokładne zrozumienie mechanizmów molekularnych i komórkowych wymaga narzędzi eksperymentalnych, które pozwalają na indukowalną, specyficzną tkankowo manipulację ekspresją genów lub szlakami sygnałowymi. Dlatego my i inni niedawno dostosowaliśmy system TetON do stosowania u danio pręgowanego. System TetON ułatwia czasowo i przestrzennie kontrolowaną ekspresję genów, a ostatnio użyliśmy tego narzędzia do zbadania specyficznych dla tkanek funkcji sygnalizacji Wnt/beta-kateniny podczas regeneracji płetwy ogonowej danio pręgowanego. W tym miejscu opisujemy przebieg pracy przy użyciu systemu TetON w celu uzyskania indukowalnej, specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego. Obejmuje to generowanie stabilnych transgenicznych linii TetActivator i TetResponder, indukcję transgenu oraz techniki weryfikacji ekspresji genów specyficznych dla tkanek w regeneracji płetwy. W związku z tym protokół ten służy jako plan do stworzenia funkcjonalnego systemu TetON u danio pręgowanego i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania regeneracji płetw.

Aby stworzyć funkcjonalny system TetON do tkankowo specyficznej, indukowalnej ekspresji genów, należy wygenerować transgeniczne linie TetActivator i TetResponder (Rysunek 1A). Osiąga się to poprzez mikroiniekcję konstruktów TetActivator (Rysunek 1B-C) lub TetResponder (Rysunek 1E) do wczesnych embrionów zebrafish oraz późniejszą integrację z linią zarodkową. Funkcjonalne konstrukty TetActivator można wygenerować albo poprzez klonowanie krótkich sekwencji...

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie funkcjonalnego systemu TED w organizmie zebrafish w celu uzyskania warunkowej, tkankowo specyficznej ekspresji genów, co zostało zademonstrowane w tym filmie na przykładzie regenerującej się płetwy ogonowej. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie transgenicznych linii aktywatora Tet, które wykazują ekspresję indukowanego tetracykliną aktywatora transkrypcyjnego z etykietą am cyan w interesującej nas tkance, oraz linii respondera Tet, które zawierają gen zainteresowania z etykietą ype pod kontrolą elementów odpowiednich dla Tet. Następnie tworzy się specyficzne kombinacje podwójnie transgenicznych ryb aktywatora Tet i respondera Tet.Następnie indukuje się tkankowo specyficzną ekspresję transgenu Tet responder poprzez podanie doksycykliny. Na koniec weryfikuje się ekspresję transgenu Tet responder poprzez przygotowanie przekrojów tkankowych regeneratów płetw. Ostatecznie do wizualizacji tkankowo specyficznej ekspresji transgenu Tet responder wykorzystuje się immunofluorescencję.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekspresja genów indukowana szokiem termicznym, jest to, że system ten umożliwia indukowalną i odwracalną ekspresję genów w sposób specyficzny dla danej tkanki. Metoda ta może pomóc w głębszym zrozumieniu molekularnych sieci sygnalizacyjnych kierujących regeneracją płetwy u ryb, ponieważ pozwala na analizę szlaków sygnalizacyjnych i funkcji genów w poszczególnych tkankach. Choć wykorzystujemy tę technologię do badania regeneracji płetwy u danio pręgowanego, może ona być pomocna również w wielu innych kontekstach wymagających specyficznej dla tkanki manipulacji funkcją genów.Po wygenerowaniu linii ryb Tet responder zgodnie z protokołem tekstowym, należy ocenić integrację z linią zarodkową oraz indukowalność transgenu poprzez krzyżowanie poszczególnych ryb G zero z wcześniej opracowaną linią Tet activator. Następnie należy zebrać embriony i hodować je do stadium, w którym można ocenić indukcję Tet responder. Przygotować roztwór stokowy doksycykliny 2000 x, wykorzystując 50% ethanol do rozpuszczenia doksycykliny w celu uzyskania stężenia 50 mg/mL.Przechowywać alikwoty docks w ciemności w temperaturze -20°C. Następnie przygotować pożywkę E3 dla embrionów zawierającą docks w stężeniu końcowym 25 µg/mL. Po tym odlać większość pożywki E3 z embrionów.Zastąp go roztworem zawierającym medium E3 i przenieś embriony z powrotem do temperatury 28,5 °C na minimum sześć godzin. Po inkubacji użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przesiewać embriony pod kątem fluorescencji Y pet. Na podstawie zidentyfikowanych założycieli utwórz kilka stabilnych transgenicznych linii Tet responder.Należy wybrać linie, które wykazują silną indukcję oraz niewielki mozaicyzm w oczekiwanej domenie ekspresji, a także niewielką zmienność między poszczególnymi embrionami. Po opracowaniu linii ryb z aktywatorem TED i responderem Tet, należy skrzyżować osobniki niosące aktywator Tet z osobnikami niosącymi responder Tet w celu uzyskania linii podwójnie transgenicznych. Embriony niosące transgen aktywatora Tet wyselekcjonowano poprzez screening pod kątem fluorescencji am cyan w stereomikroskopie, a embriony pozytywne na am cyan hodowano do wieku dorosłego.Zidentyfikuj dorosłe ryby z podwójną transgenią, które poza aktywatorem Tet posiadają również responder Tet, za pomocą genotypowania opartego na PCR lub poprzez ich zdolność do indukowania ekspresji respondera Tet w docelowej tkance, aby przeprowadzić tatuaż płetwy ogonowej. Znieczul dorosłe ryby zebrafish w zlewce wypełnionej wodą dla ryb zawierającą 160 µg/mL tricaina. Gdy ryba przestanie się poruszać, użyj pęsety, aby ostrożnie przenieść ją na odwróconą szalkę Petriego, a następnie użyj skalpela, aby wykonać częściową amputację płetwy ogonowej w celu podania doksycykliny. Przygotuj skrzynki hodowlane z jednym litrem wody z systemu dla ryb zawierającej 25 µg/mL doksycykliny.Jako kontrolę negatywną dodaj 250 µl etanolu zamiast doksycykliny do pojemników hodowlanych zawierających jeden litr wody z układu rybnego; przenieś do każdego pojemnika do 10 ryb podwójnie transgenicznych i umieść je w ciemności, aby zmniejszyć stres. Po minimum sześciu godzinach znieczul i przenieś potraktowane ryby na naczynie powlekane agarosem i za pomocą pęsety rozszerz płetwę ogonową. Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym, sprawdź u ryb obecność Y PET w obrębie regenerującej tkanki.Następnie ryby można wykorzystać do dalszych zabiegów lub zwrócić do systemu utrzymania ryb, aby zakończyć indukcję transgenu respondera po częściowej amputacji płetwy i traktowaniu doksycyliną. Ponownie amputuj regeneraty płetw na wysokości około czterech do pięciu segmentów kostnych proksymalnie względem pierwotnej płaszczyzny amputacji i w punkcie czasowym zależnym od Twojego układu eksperymentalnego, zgodnie z wcześniejszym opisem w tym filmie. Za pomocą pęsety, trzymając wyłącznie część kikutu tkanki, ostrożnie rozłóż regeneraty tkanek płasko w małej szalce Petri zawierającej 4% w/v PFA w PBS i utrwalaj przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia użyj PBS, aby dwukrotnie przemyć regeneraty przed przeniesieniem ich do 0,5 M EDTA-PBS w celu dekalcyfikacji macierzy kostnej w temperaturze 4°C przez noc. Następnie inkubuj regeneraty w serii sacharozy w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut w każdym kroku, a na koniec w równych częściach 30% sacharozy w PBS i medium do mrożenia tkanek przez dodatkowe 30 minut.Przenieś płetwy do medium do mrożenia tkanek i inkubuj w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwie godziny. Następnie umieść formy do kriotomii na szkiełku mikroskopowym i wypełnij je medium do mrożenia tkanek. Przenieś regeneraty do form do kriotomii i zorientuj tkankę tak, aby uzyskać przekroje podłużne lub poprzeczne.Należy upewnić się, że regenerat jest prosty, aby ułatwić jego sekcjonowanie. Wraz z szkiełkami przedmiotowymi przenieść formy do krioembeddingu na metalową kratkę umieszczoną na suchym lodzie, aby rozpocząć proces zamrażania. Po zastygnięciu medium przenieść formy do krioembeddingu z powrotem do temperatury pokojowej, aby umożliwić odtajanie medium na styku z tworzywem sztucznym.Następnie, używając narzędzia takiego jak długopis, wypchnąć zamrożony blok z formy kriogenicznej i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu krojenia przy użyciu kriomikrotomu. Zebrać skrawki o grubości od 10 do 14 µm na szkiełkach przedmiotowych z powłoką adhezyjną i przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Aby scharakteryzować ekspresję respondera Tet w skrawkach płetwy, poddać skrawki działaniu 100% MEOH schłodzonego do -20 °C przez 30 minut.Ostrożnie usuń nadmiar płynu za pomocą ręcznika papierowego. Następnie przemyj preparaty dwukrotnie w PBT i raz w PBS, przez pięć minut w każdym cyklu. Inkubuj preparaty przez 10 minut w dappy, a następnie przemyj dwukrotnie w PBS przez 10 minut w każdym cyklu.Następnie należy użyć medium montażowego Antifade oraz szkiełka nakrywkowe do zamocowania próbek, a następnie przeprowadzić obrazowanie z wykorzystaniem konfokalnej lub szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej, po wcześniejszym ustanowieniu funkcjonalnego systemu TET w organizmach rybek danio pręgowanych. System ten może być wykorzystywany do testowania funkcji genów lub szlaków sygnalizacyjnych w poszczególnych tkankach. Jak pokazano tutaj, aktywator tet sterowany promotorem HER 4.3 indukuje ekspresję respondera TED tylko w podzbiorze tkanek regeneratu; fluorescencja YFP jest wykrywana w proliferującym proksymalnym blastemie, podczas gdy dystalny blastem i naskórek są pozbawione ekspresji.Ekspresja antagonisty WNT beta-kateniny Axin 1 w domenie HER 4.3 zawierającej komórki proliferacyjne blastemy, co było zaskakujące, nie wywarła wpływu na proliferację komórek regeneracyjnych. Sugeruje to, że sygnalizacja Wnt/beta-kateniny w proliferacyjnej proksymalnej części blastemy nie odgrywa istotnej roli w regulacji proliferacji komórek blastemy. W przeciwieństwie do tego, wykorzystanie linii z aktywatorem Tet sterowanym przez promotor ubikwityny w celu indukcji ekspresji Axin 1 we wszystkich tkankach regeneratu płetwy silnie zakłóca proliferację komórek regeneracyjnych.Ponadto ekspresja axon one w domenie HER 4.3, która nie obejmuje osteoblastów, silnie zakłóca tworzenie kości w regeneracie. Zatem tkankowo specyficzna interferencja z sygnalizacją wind przy użyciu systemu TE on ujawnia nieoczekiwane pośrednie funkcje sygnalizacji wind w regulacji proliferacji komórek i regeneracji kości. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do indukowalnej, celowanej ekspresji genów w dowolnej interesującej tkance.Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do badania tkankowo specyficznych funkcji sygnalizacji nikotynowej w regenerującej się płetwie ogonowej ryby S. Wykorzystanie tej metody pomoże w uzyskaniu bardziej kompleksowego zrozumienia determinant molekularnych regulujących regenerację tkanek.

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zastosowanie systemu TetON w badaniach nad molekularnymi mechanizmami regeneracji u rybek zebra

Opisujemy metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego podczas regeneracji płetwy u dorosłych ryb zebrafish. Technika ta polega na mikroiniekcji i elektroporacji antysensownych oligonukleotydów morpholino do tkanki płetwy, co pozwala na badanie roli białka w różnych etapach regeneracji płetwy, w tym podczas gojenia rany, tworzenia blastemy oraz regeneracyjnego wzrostu.

In vivo elektroporacja morfolin do regenerującej płetwy ogonowej dorosłego zebrafisha

Przedstawiona tutaj metoda obejmuje precyzyjne uszkadzanie żywych zarodków rybek danio (*zebrafish*) za pomocą wysokenergetycznych impulsów laserowych oraz późniejszą analizę tych obrażeń i ich regeneracji w czasie. Pokazujemy również, w jaki sposób można śledzić pojedyncze lub grupy genetycznie znakowanych komórek mięśni szkieletowych podczas i po uszkodzeniu indukowanym światłem laserowym.

Laserowe uszkodzenie szkieletowej muskulatury embrionów danio-ostrolepnego

Po przecięciu kręgosłupa, dorosłe rybki pręgowane wracają do stanu funkcjonalnego w ciągu sześciu tygodni po urazie. Aby wykorzystać przezroczystość larw i szybszy powrót do zdrowia, przedstawiamy metodę transekcji rdzenia kręgowego larwy. Po przecięciu obserwujemy regenerację czuciową rozpoczynającą się po 2 dniach od urazu i ruch zgięcia C po 3 dniach od urazu.

Przekrój rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Adaptowalna metoda odwrotnej genetyki dla danio pręgowanego do oceny funkcji genów podczas późniejszych etapów rozwoju i fizjologicznej homeostazy, takich jak regeneracja tkanek za pomocą dokomorowych iniekcji specyficznych dla genu morpholinos.

Odwrotne podejście genetyczne morpholino za pomocą wstrzyknięcia do komory serca w celu transfekcji wielu trudnych do namierzenia tkanek u larwy danio pręgowanego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Opisano model mechanicznego uszkodzenia mózgu u dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać mechanizmy molekularne regulujące ich wysoką zdolność regeneracyjną. Metoda wyjaśnia, jak stworzyć ranę kłutą w tektum nerwu wzrokowego wielu gatunków małych ryb w celu oceny odpowiedzi regeneracyjnych za pomocą fluorescencyjnego barwienia immunologicznego.

Model rany kłutej dorosłego nerwu wzrokowego z wykorzystaniem danio pręgowanego i medaka do analizy porównawczej zdolności regeneracyjnych

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Poznaj system TetON do indukowalnej ekspresji genów w tkankach danio pręgowanego podczas regeneracji płetwy ogonowej. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów w wybranych tkankach z wykorzystaniem doksycykliny.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów