Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie funkcjonalnego systemu TED on u danio pręgowanego w celu osiągnięcia warunkowej ekspresji genów specyficznych dla tkanki, jak pokazano w regenerującej się płetwie ogonowej w tym filmie. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie linii transgenicznych aktywatora Tet, które wyrażają indukowany tetracykliną aktywator transkrypcji oznaczony błękitem am w tkance będącej przedmiotem zainteresowania oraz linie odpowiedzi Tet, które zawierają gen znacznika ype pod kontrolą elementów reagujących na Tet. Następnie ustalane są specyficzne kombinacje aktywatora Tet Tet responder podwójnie transgenicznych ryb.

Następnie indukowana jest specyficzna tkankowo ekspresja transgenu odpowiedzi Tet poprzez podanie doksycykliny. Wreszcie, ekspresję transgenu odpowiedzi Tet weryfikuje się poprzez przygotowanie skrawków tkanek regenerujących się płetw. Ostatecznie immunofluorescencja jest wykorzystywana do wizualizacji specyficznej tkankowo ekspresji transgenu odpowiedzi Tet.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekspresja genów wywołana szokiem cieplnym, jest to, że działanie systemu pozwala na indukowalną i odwracalną ekspresję genów w sposób specyficzny dla tkanki. Metoda ta może pomóc w głębszym zrozumieniu molekularnych sieci sygnalizacyjnych kierujących regeneracją płetwy ryby, ponieważ pozwala na analizę szlaku sygnałowego i funkcji genów w poszczególnych tkankach. Chociaż używamy tej technologii do badania regeneracji płetw danio pręgowanego, może ona mieć zasadnicze znaczenie również w wielu innych kontekstach wymagających specyficznej dla tkanek manipulacji funkcją genów.

Po wygenerowaniu linii ryb odpowiadających Tet zgodnie z protokołem tekstowym, oceń integrację linii zarodkowej i indukowalność transgenu poprzez kojarzenie poszczególnych ryb G zero z wcześniej ustaloną linią aktywatora Tet. Następnie zbierz zarodki i podnieś je do etapu, w którym można ocenić indukcję odpowiedzi Tet. Przygotuj 2000 x roztwór podstawowy doksycykliny, używając 50% etanolu do rozpuszczenia doków, aby uzyskać stężenie 50 miligramów na mililitr.

Porcje doków należy przechowywać chronione przed światłem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie należy przygotować pożywkę E trzy zarodki zawierające doki o końcowym stężeniu 25 mikrogramów na mililitr. Następnie zdekantować większość pożywki E three z zarodków.

Zastąp go doz zawierającym pożywkę E trzy i przywróć zarodki do temperatury 28,5 stopnia Celsjusza na co najmniej sześć godzin. Po inkubacji należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego do badania przesiewowego zarodków pod kątem fluorescencji Y pet. Ustal kilka stabilnych transgenicznych linii odpowiedzi Tet od założycieli, którzy właśnie zostali zidentyfikowani.

Wybierz linie, które silnie indukują i wykazują niewielki mozaicyzm w oczekiwanej domenie ekspresji, a także niewielkie różnice między poszczególnymi zarodkami. Po ustaleniu aktywatora TED i linii rybnych reagujących Tet, utwórz nośniki aktywatora Tet z nosicielami odpowiedzi Tet, aby wygenerować podwójną transgeniczność. Ryby wybierają zarodki z transgenem aktywatora Tet poprzez badanie przesiewowe w kierunku fluorescencji cyjanu w mikroskopie stereoskopowym i wychowują zarodki z dodatnim wynikiem cyjanu do dorosłości.

Zidentyfikuj podwójnie transgeniczne dorosłe ryby, które są nosicielami odpowiedzi Tet oprócz aktywatora Tet za pomocą genotypowania opartego na PCR lub przez ich zdolność do indukowania ekspresji Tet Responder w tkance będącej przedmiotem zainteresowania w celu przeprowadzenia znieczulenia Tail Fin Tation dorosłej ryby danio pręgowanego w zlewce wypełnionej wodą dla ryb zawierającą 160 mikrogramów na mililitr trica. Kiedy ryba przestanie się poruszać, użyj pęsety, aby ostrożnie przenieść ją na odwróconą szalkę Petriego i użyj skalpela, aby wykonać częściową amputację płetwy ogonowej, aby leczyć ją docs. Przygotuj pudełka hodowlane z jednym litrem wody z systemu rybnego zawierającej 25 mikrogramów na mililitr doksycykliny.

Jako kontrolę negatywną dodaj 250 mikrolitrów etanolu zamiast doksycykliny do boksów hodowlanych z jednym litrem wody z systemu rybnego, przenieś do 10 podwójnie transgenicznych ryb do każdej skrzynki hodowlanej i umieść pudełka w ciemności, aby zmniejszyć stres. Po co najmniej sześciu godzinach znieczulij i przenieś leczoną rybę do mokrego naczynia pokrytego aros i użyj pęsety, aby rozłożyć ogon. Następnie pod mikroskopem fluorescencyjnym przesiewaj ryby pod kątem pojawienia się Y PET w regenerującej się tkance.

Następnie ryby mogą być wykorzystane do dalszego leczenia lub powrócić do systemu utrzymania ryb w celu zakończenia indukcji transgenu odpowiadającego po częściowej amputacji płetwy i leczeniu docs reamputowana płetwa regeneruje się w około czterech do pięciu segmentach kostnych proksymalnie do początkowej płaszczyzny amputacji i w określonym punkcie, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej, jak opisano wcześniej w tym filmie, za pomocą pęsety i dotykania tylko kikutowej części tkanki, ostrożnie ułóż zregenerowaną tkankę płasko na małej szalce Petriego zawierającej 4% wagowo na objętość PFA w PBS i utrwal przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia. Użyj PBS, aby dwukrotnie przepłukać regeneraty przed przeniesieniem ich do 0,5 molowego E-D-T-A-P-B-S, aby odwapnić macierz kostną w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie inkubować regeneruje się w serii sacharozy PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut każdy, a na koniec równe części 30% sacharozy PBS i pożywki do zamrażania tkanek przez dodatkowe 30 minut.

Przenieść żebra do pożywki do zamrażania tkanek i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Następnie umieść formy kriogeniczne na szkiełku mikroskopowym i wypełnij je środkiem do zamrażania tkanek. Przenieś regeneratory do form kriogenicznych i ustaw tkankę tak, aby uzyskać przekroje podłużne lub poprzeczne.

Upewnij się, że regeneracja jest prosta, aby ułatwić cięcie. Wraz ze szkiełkiem mikroskopowym przenieś formy kriogeniczne na metalowy stojak umieszczony na łóżku z suchego lodu, aby rozpocząć proces zamrażania. Gdy podłoże jest stałe, przenieś formy kriogeniczne z powrotem do temperatury pokojowej, aby umożliwić rozmrożenie medium na granicy plastikowych mediów.

Następnie za pomocą przyrządu, takiego jak długopis, wypchnij zamrożony blok z formy kriogenicznej i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu pocięcia za pomocą mikrotomu kriogenicznego. Zbierz od 10 do 14 skrawków mikrometrów na szkiełkach mikroskopu adhezyjnego i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne. Aby scharakteryzować ekspresję osoby odpowiadającej Tet na odcinkach żeber, potraktuj odcinki 100% MEOH schłodzonym do minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Ostrożnie usuń płyn za pomocą ręcznika papierowego. Następnie umyj skrawki dwukrotnie PBT i raz PBS przez pięć minut każda. Inkubuj skrawki przez 10 minut w dappy przed użyciem PBS do dwukrotnego mycia po 10 minut każda.

Następnie użyj środka montażowego Antifa i szkiełka nakrywkowego, aby zamontować próbki przed użyciem konfokalnej lub szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej do zobrazowania próbek, które ustaliły funkcjonalny system TET u danio pręgowanego. System ten może być używany do badania funkcji genów lub szlaków sygnałowych w poszczególnych tkankach. Jak pokazano tutaj, aktywator tet napędzany promotorem HER 4.3 indukuje ekspresję odpowiedzi TED tylko w podzbiorze tkanek regenerowanej fluorescencji YFP wykrywa się w proliferacyjnej bliższej blasie, podczas gdy dystalna blasa i naskórek są pozbawione ekspresji.

Ekspresja antagonisty beta-kateniny WINT działa w jednej domenie HER 4.3 zawierającej komórki proliferacyjne blasa, zaskakująco nie ma wpływu na proliferację komórek regeneracyjnych. Sugeruje to, że wiatr, betaina i sygnalizacja w proliferacyjnej proksymalnej blastemie nie odgrywają istotnej roli w regulacji proliferacji komórek ML blastów. W przeciwieństwie do tego, użycie linii aktywatora Tet napędzanej przez promotor ubikwityny do indukowania ekspresji aksyny w wszystkich tkankach regeneracji płetwy silnie zakłóca proliferację komórek regeneracyjnych.

Ponadto ekspresja aksonu pierwszego w domenie HER 4.3, która nie obejmuje osteoblastów, silnie zakłóca tworzenie kości w regeneracji. W ten sposób specyficzna tkankowo interferencja z sygnalizacją wiatru za pomocą systemu TE on ujawnia nieoczekiwane pośrednie funkcje sygnalizacji wiatru w regulacji proliferacji komórek i regeneracji kości. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do indukowalnej ukierunkowanej ekspresji genów w dowolnej tkance będącej przedmiotem zainteresowania.

Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do zbadania specyficznych dla tkanek funkcji sygnalizacji nikotyny w łożu wiatrowym w regenerującej się płetwie ogona rybiego S. Zastosowanie tej metody pomoże uzyskać pełniejsze zrozumienie molekularnych uwarunkowań regulujących regenerację tkanek.