Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie funkcjonalnego systemu TED w organizmie zebrafish w celu uzyskania warunkowej, tkankowo specyficznej ekspresji genów, co zostało zademonstrowane w tym filmie na przykładzie regenerującej się płetwy ogonowej. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie transgenicznych linii aktywatora Tet, które wykazują ekspresję indukowanego tetracykliną aktywatora transkrypcyjnego z etykietą am cyan w interesującej nas tkance, oraz linii respondera Tet, które zawierają gen zainteresowania z etykietą ype pod kontrolą elementów odpowiednich dla Tet. Następnie tworzy się specyficzne kombinacje podwójnie transgenicznych ryb aktywatora Tet i respondera Tet.

Następnie indukuje się tkankowo specyficzną ekspresję transgenu Tet responder poprzez podanie doksycykliny. Na koniec weryfikuje się ekspresję transgenu Tet responder poprzez przygotowanie przekrojów tkankowych regeneratów płetw. Ostatecznie do wizualizacji tkankowo specyficznej ekspresji transgenu Tet responder wykorzystuje się immunofluorescencję.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ekspresja genów indukowana szokiem termicznym, jest to, że system ten umożliwia indukowalną i odwracalną ekspresję genów w sposób specyficzny dla danej tkanki. Metoda ta może pomóc w głębszym zrozumieniu molekularnych sieci sygnalizacyjnych kierujących regeneracją płetwy u ryb, ponieważ pozwala na analizę szlaków sygnalizacyjnych i funkcji genów w poszczególnych tkankach. Choć wykorzystujemy tę technologię do badania regeneracji płetwy u danio pręgowanego, może ona być pomocna również w wielu innych kontekstach wymagających specyficznej dla tkanki manipulacji funkcją genów.

Po wygenerowaniu linii ryb Tet responder zgodnie z protokołem tekstowym, należy ocenić integrację z linią zarodkową oraz indukowalność transgenu poprzez krzyżowanie poszczególnych ryb G zero z wcześniej opracowaną linią Tet activator. Następnie należy zebrać embriony i hodować je do stadium, w którym można ocenić indukcję Tet responder. Przygotować roztwór stokowy doksycykliny 2000 x, wykorzystując 50% ethanol do rozpuszczenia doksycykliny w celu uzyskania stężenia 50 mg/mL.

Przechowywać alikwoty docks w ciemności w temperaturze -20°C. Następnie przygotować pożywkę E3 dla embrionów zawierającą docks w stężeniu końcowym 25 µg/mL. Po tym odlać większość pożywki E3 z embrionów.

Zastąp go roztworem zawierającym medium E3 i przenieś embriony z powrotem do temperatury 28,5 °C na minimum sześć godzin. Po inkubacji użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przesiewać embriony pod kątem fluorescencji Y pet. Na podstawie zidentyfikowanych założycieli utwórz kilka stabilnych transgenicznych linii Tet responder.

Należy wybrać linie, które wykazują silną indukcję oraz niewielki mozaicyzm w oczekiwanej domenie ekspresji, a także niewielką zmienność między poszczególnymi embrionami. Po opracowaniu linii ryb z aktywatorem TED i responderem Tet, należy skrzyżować osobniki niosące aktywator Tet z osobnikami niosącymi responder Tet w celu uzyskania linii podwójnie transgenicznych. Embriony niosące transgen aktywatora Tet wyselekcjonowano poprzez screening pod kątem fluorescencji am cyan w stereomikroskopie, a embriony pozytywne na am cyan hodowano do wieku dorosłego.

Zidentyfikuj dorosłe ryby z podwójną transgenią, które poza aktywatorem Tet posiadają również responder Tet, za pomocą genotypowania opartego na PCR lub poprzez ich zdolność do indukowania ekspresji respondera Tet w docelowej tkance, aby przeprowadzić tatuaż płetwy ogonowej. Znieczul dorosłe ryby zebrafish w zlewce wypełnionej wodą dla ryb zawierającą 160 µg/mL tricaina. Gdy ryba przestanie się poruszać, użyj pęsety, aby ostrożnie przenieść ją na odwróconą szalkę Petriego, a następnie użyj skalpela, aby wykonać częściową amputację płetwy ogonowej w celu podania doksycykliny. Przygotuj skrzynki hodowlane z jednym litrem wody z systemu dla ryb zawierającej 25 µg/mL doksycykliny.

Jako kontrolę negatywną dodaj 250 µl etanolu zamiast doksycykliny do pojemników hodowlanych zawierających jeden litr wody z układu rybnego; przenieś do każdego pojemnika do 10 ryb podwójnie transgenicznych i umieść je w ciemności, aby zmniejszyć stres. Po minimum sześciu godzinach znieczul i przenieś potraktowane ryby na naczynie powlekane agarosem i za pomocą pęsety rozszerz płetwę ogonową. Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym, sprawdź u ryb obecność Y PET w obrębie regenerującej tkanki.

Następnie ryby można wykorzystać do dalszych zabiegów lub zwrócić do systemu utrzymania ryb, aby zakończyć indukcję transgenu respondera po częściowej amputacji płetwy i traktowaniu doksycyliną. Ponownie amputuj regeneraty płetw na wysokości około czterech do pięciu segmentów kostnych proksymalnie względem pierwotnej płaszczyzny amputacji i w punkcie czasowym zależnym od Twojego układu eksperymentalnego, zgodnie z wcześniejszym opisem w tym filmie. Za pomocą pęsety, trzymając wyłącznie część kikutu tkanki, ostrożnie rozłóż regeneraty tkanek płasko w małej szalce Petri zawierającej 4% w/v PFA w PBS i utrwalaj przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia użyj PBS, aby dwukrotnie przemyć regeneraty przed przeniesieniem ich do 0,5 M EDTA-PBS w celu dekalcyfikacji macierzy kostnej w temperaturze 4°C przez noc. Następnie inkubuj regeneraty w serii sacharozy w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut w każdym kroku, a na koniec w równych częściach 30% sacharozy w PBS i medium do mrożenia tkanek przez dodatkowe 30 minut.

Przenieś płetwy do medium do mrożenia tkanek i inkubuj w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwie godziny. Następnie umieść formy do kriotomii na szkiełku mikroskopowym i wypełnij je medium do mrożenia tkanek. Przenieś regeneraty do form do kriotomii i zorientuj tkankę tak, aby uzyskać przekroje podłużne lub poprzeczne.

Należy upewnić się, że regenerat jest prosty, aby ułatwić jego sekcjonowanie. Wraz z szkiełkami przedmiotowymi przenieść formy do krioembeddingu na metalową kratkę umieszczoną na suchym lodzie, aby rozpocząć proces zamrażania. Po zastygnięciu medium przenieść formy do krioembeddingu z powrotem do temperatury pokojowej, aby umożliwić odtajanie medium na styku z tworzywem sztucznym.

Następnie, używając narzędzia takiego jak długopis, wypchnąć zamrożony blok z formy kriogenicznej i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu krojenia przy użyciu kriomikrotomu. Zebrać skrawki o grubości od 10 do 14 µm na szkiełkach przedmiotowych z powłoką adhezyjną i przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Aby scharakteryzować ekspresję respondera Tet w skrawkach płetwy, poddać skrawki działaniu 100% MEOH schłodzonego do -20 °C przez 30 minut.

Ostrożnie usuń nadmiar płynu za pomocą ręcznika papierowego. Następnie przemyj preparaty dwukrotnie w PBT i raz w PBS, przez pięć minut w każdym cyklu. Inkubuj preparaty przez 10 minut w dappy, a następnie przemyj dwukrotnie w PBS przez 10 minut w każdym cyklu.

Następnie należy użyć medium montażowego Antifade oraz szkiełka nakrywkowe do zamocowania próbek, a następnie przeprowadzić obrazowanie z wykorzystaniem konfokalnej lub szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej, po wcześniejszym ustanowieniu funkcjonalnego systemu TET w organizmach rybek danio pręgowanych. System ten może być wykorzystywany do testowania funkcji genów lub szlaków sygnalizacyjnych w poszczególnych tkankach. Jak pokazano tutaj, aktywator tet sterowany promotorem HER 4.3 indukuje ekspresję respondera TED tylko w podzbiorze tkanek regeneratu; fluorescencja YFP jest wykrywana w proliferującym proksymalnym blastemie, podczas gdy dystalny blastem i naskórek są pozbawione ekspresji.

Ekspresja antagonisty WNT beta-kateniny Axin 1 w domenie HER 4.3 zawierającej komórki proliferacyjne blastemy, co było zaskakujące, nie wywarła wpływu na proliferację komórek regeneracyjnych. Sugeruje to, że sygnalizacja Wnt/beta-kateniny w proliferacyjnej proksymalnej części blastemy nie odgrywa istotnej roli w regulacji proliferacji komórek blastemy. W przeciwieństwie do tego, wykorzystanie linii z aktywatorem Tet sterowanym przez promotor ubikwityny w celu indukcji ekspresji Axin 1 we wszystkich tkankach regeneratu płetwy silnie zakłóca proliferację komórek regeneracyjnych.

Ponadto ekspresja axon one w domenie HER 4.3, która nie obejmuje osteoblastów, silnie zakłóca tworzenie kości w regeneracie. Zatem tkankowo specyficzna interferencja z sygnalizacją wind przy użyciu systemu TE on ujawnia nieoczekiwane pośrednie funkcje sygnalizacji wind w regulacji proliferacji komórek i regeneracji kości. Po opanowaniu, technika ta może być wykorzystana do indukowalnej, celowanej ekspresji genów w dowolnej interesującej tkance.

Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do badania tkankowo specyficznych funkcji sygnalizacji nikotynowej w regenerującej się płetwie ogonowej ryby S. Wykorzystanie tej metody pomoże w uzyskaniu bardziej kompleksowego zrozumienia determinant molekularnych regulujących regenerację tkanek.