Name: Zastosowanie specyficznego dla DNA barwnika zieleni metylowej w znakowaniu fluorescencyjnym zarodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego barwienia jąder zielenią metylową w zarodkach ryb. Technika umożliwia głębokie obrazowanie konfokalne całych preparatów biologicznych dzięki odporności na fotoblaknięcie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Patxi Jaso za produkcję filmu, PEDECIBA i Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) za częściowe finansowanie.

1. Oczyszczanie barwnika
<ol>
	<li>Przygotować 4% wodny roztwór zieleni metylowej, rozpuszczając 0,4 g bejcy w proszku w 10 ml wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Pod wyciągiem wymieszaj go z co najmniej 2 częściami chloroformu. Ważne jest, aby wcześniej sprawdzić, czy rurki są odporne na chloroform.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać i odwirowywać przez 1 minutę przy 2 000 x g, aby przyspieszyć separację faz.</li>
	<li>Po odwirowaniu otrzymuje się górną fazę wodną z zielenią metylową i dolną fazę organiczną z chloroformem i zwykłym zanieczyszczeniem fioletowym kryształowym.</li>
	<li>Odzyskaj górną fazę i powtarzaj ten krok, aż dolna faza pojawi się całkowicie pozbawiona fioletu krystalicznego.</li>
	<li>Na koniec górna faza jest odzyskiwana i rozcieńczana w wodzie do końcowego stężenia 2% zieleni metylowej. Ten podstawowy roztwór jest stabilny na stole warsztatowym przez wiele miesięcy i nie trzeba go chronić przed światłem.</li>
</ol>
2. Fluorescencyjne barwienie jądrowe całych zarodków danio pręgowanego za pomocą zieleni metylowej
<ol>
	<li>Utrwal zarodki na noc w 4% formaldehydzie (z paraformaldehydu) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). 
	UWAGA: Może to potrwać od kilku godzin do nocy, w zależności od grubości zarodków. W tym przykładzie naprawiliśmy zarodki danio pręgowanego po 48 godzinach po zapłodnieniu (hpf) w ciągu nocy.</li>
	<li>Umyj zarodki trzy razy w PBS-T (1% Triton X-100 w PBS) przez 5 minut. Podwyższone stężenie detergentu przenika przez naskórek.</li>
	<li>Przygotować roztwór zieleni metylowej w proporcjach 1:5 000-1:10 000 (z 2% roztworu podstawowego) w PBS-T. Obecność detergentu podczas inkubacji jest przydatna w przypadku grubych okazów, takich jak zarodki i larwy danio pręgowanego.</li>
	<li>Inkubować zarodki w roztworze przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc. Ponownie, grubość zarodka jest parametrem kalibrującym długość inkubacji.</li>
	<li>Umyj zarodki 3 razy PBS przez 30 minut, aby usunąć nadmiar detergentu. Fluorescencja zieleni metylowej jest widoczna tylko wtedy, gdy jest związana z DNA, stąd tło z niezwiązanej cząsteczki jest znikome.</li>
	<li>Zamontować na wykopanej zjeżdżalni lub domowej komorze z roztworem montażowym (75% glicerol, 0,1 M Tris·HCl pH 8). 
	UWAGA: Jeśli barwienie jądrowe ma być wykonane po znakowaniu immunologicznym, zieleń metylowa może być włączona do roztworu montażowego w stężeniu roboczym, bez konieczności jej zmywania.</li>
	<li>Przechowywać w lodówce lub natychmiast rozpocząć obrazowanie. Obrazowanie należy wykonać za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (lub innego mikroskopu fluorescencyjnego) ze wzbudzeniem przy długości fali 633 nm i filtrami emisyjnymi ustawionymi na rejestrację przy długości fali 650–750 nm, biorąc pod uwagę, że emisja zieleni metylowej osiąga maksimum przy długości fali 677 nm. 
	UWAGA: Jako materiał uzupełniający udostępniamy zmierzone dane profilu emisji zieleni metylowej, które należy załadować do oprogramowania do akwizycji.</li>
</ol>
3. Fluorescencyjne barwienie jądrowe całych zarodków piskląt za pomocą zieleni metylowej
<ol>
	<li>Wysiaduj zapłodnione jaja kurze do etapu zainteresowania. Utrwalić zarodki na noc w 4% formaldehydzie (z paraformaldehydu) w PBS w temperaturze 4 °C. Umyć zarodki 3 razy w PBS-T przez 2 godziny.</li>
	<li>Przygotować roztwór zieleni metylowej w proporcjach 1:5 000-1:10 000 (z 2% roztworu podstawowego) w PBS-T. Inkubować zarodki w roztworze barwiącym przez noc w temperaturze 4 °C. Umyć zarodki 3 razy w PBS po 1 godzinę każdy. Zamontuj w komorze z 75% glicerolem, 0,1 M Tris, pH 8.</li>
</ol>
4. Obrazowanie fluorescencyjnie znakowanych jąder w całych zarodkach
<ol>
	<li>Przygotuj komorę obrazowania, przyklejając kilka warstw taśmy izolacyjnej na szkiełku mikroskopowym i ostrożnie wytnij w niej otwór skalpelem, aby umieścić w niej zarodki. Zapobiegnie to zgniecaniu zarodków podczas obrazowania.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś zarodki do komory obrazowania i napełnij komorę do góry 75% glicerolem, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Przykryj szkiełkiem nakrywkowym #0, unikając lub eliminując przepełnienie medium. Uszczelnij go lakierem do paznokci.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy próbki na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtr wzbudzający 633 lub linię laserową. 
	UWAGA: Filtry emisyjne powinny pokrywać maksimum emisji zieleni metylowej 677.</li>
</ol>

<ol><li>Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+imaging+in+three+dimensions%3A+a+unique+tool+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research.</a> Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Latt, S. A., Stetten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+studies+on+33258+Hoechst+and+related+bisbenzimidazole+dyes+useful+for+fluorescent+detection+of+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).</li>
<li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TO-PRO-3+iodide%3A+a+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li>
<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
<li>Kim, S. K., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+green.+A+DNA+major-groove+binding+drug%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Methyl green. A DNA major-groove binding drug.</a> FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).</li>
<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
<li>Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methyl+green-pyronin+Y+procedures+using+pure+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes.</a> The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).</li>
<li>Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+comprehensive+cell+lineage+reconstructions+in+complex+organisms+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy.</a> Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).</li>
<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Postępujący rozwój technik mikroskopowych w ostatnich dziesięcioleciach, ze szczególnym naciskiem na odmiany mikroskopii fluorescencyjnej, doprowadził do możliwości zbadania dynamiki i struktury nienaruszonych próbek tkanek, w tym całych zarodków10,11. Jednym z głównych ograniczeń jest jednak dostępność dobrej jakości fluoroforów, które można wykorzystać do bezpośredniego i szybkiego barwienia struktur subkomórkowych. 
Najczęściej stosowane fluorescencyjne barwienia DNA, takie jak D...

Barwienie fluorescencyjne DNA jest szeroko i rutynowo stosowane zarówno w badaniach biologicznych, jak i w diagnostyce klinicznej, zarówno do szczegółowego badania struktury jądrowej i chromosomalnej, do przeciwbarwienia tkanek i komórek, jak i do badania parametrów cyklu komórkowego1. Chociaż dostępnych jest kilka barwników DNA, najczęściej stosowane są te wzbudzone światłem UV i emitujące na niebiesko, które pasują do zwykłych systemów trzech filtrów stosowanych w większości konwencjonalnych mikroskopów epifluorescencyjnych w połączeniu z fluoroforami emitującymi zielone i pomarańczowo-czerwone, takie jak białka fluorescencyjne lub małe cząsteczki przyłączone do przeciwciał. Wśród tych emitujących niebieski barwnik DNA najczęstsze są DAPI i Hoechst mniejsze środki wiążące rowki2,3. Niemniej jednak, włączenie szerokiej gamy laserowych linii emisyjnych i detekcji spektralnej do laserowych mikroskopów skaningowych pozwoliło naukowcom zdecydować się na zastosowanie barwników jądrowych emitujących daleko czerwoną czerwień, takich jak jodek propidyny (PI) lub TO-PRO 34. Zaletą tych barwników jest to, że rozwiązują one problem autofluorescencji występujący w wielu komórkach i tkankach, szczególnie w zarodkach5, ale wiele z nich ma różne problemy, takie jak szerokie profile emisji lub duża wrażliwość na fotowybielanie6.
Szwajcarski badacz Friedrich Miescher odkrył DNA w 1869 roku, ekstrahując je z jąder białych krwinek znajdujących się w ropie. Nazwał ją nukleiną i wykazał kilka lat później, że tworzy ona osady ze stosunkowo nowym barwnikiem zieleni metylowej. Zieleń metylowa składa się z trzech pierścieni anilinowych o różnym stopniu metylacji i ma dwa dodatnie ładunki, które pozwalają jej silnie wiązać się z głównym rowkiem DNA7,8. Barwienie DNA za pomocą zieleni metylowej bardzo wcześnie okazało się specyficzne, co doprowadziło do opracowania przez Unnę i Pappenheima połączonego barwienia z pyroniną, która specyficznie znakuje RNA. Od tego czasu zieleń metylowa pyronina jest szeroko stosowana w rutynowych technikach histologicznych9.
Do niedawna bardzo mało było wiadomo o właściwościach fluorescencyjnych zieleni metylowej. Nasze wcześniejsze prace ujawniły jednak niektóre z zalet spektralnych zieleni metylowej6, takie jak jej wzbudzenie przy 633 nm, wygodne przesunięcie Stokesa, jej emisja w bliskiej podczerwieni widma elektromagnetycznego, wyższa fotostabilność niż komercyjnie dostępne barwienia DNA o podobnych właściwościach spektralnych i przy bardzo niskich kosztach. Dlatego zdecydowaliśmy się przetestować go pod kątem stosowania jako bardzo wysokiego powinowactwa i specyficznego znacznika fluorescencyjnego dla DNA na tkankach embrionalnych i w całych zarodkach. Co więcej, do tej pory barwienie jądrowe zielenią metylową wykonywano przy niskim pH, co utrudniało łączenie z barwieniem przeciwciałami. Celem opisanej tutaj metody jest posiadanie protokołu barwienia fluorescencyjnego jądrowego DNA, który przezwycięża wyżej wymienione niedogodności poprzez przeprowadzenie procedury barwienia przy fizjologicznym pH, dzięki czemu jest odpowiednim barwnikiem przeciwstawnym do znakowania immunologicznego na skrawkach i całych tkankach.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Zieleń metylowa</td><td>Dr. G. Gr&uuml; Bler</td><td></td><td>Testowany również Sigma-Aldrich 323829, który jest wolny od fioletu krystalicznego</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash; Izotiocyjanian tetrametylorodaminy B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe</td><td>Optyka Esco</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie specyficznego dla dna barwnika zieleni metylowej w znakowaniu fluorescencyjnym zarodków

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Zieleń metylowa od dawna znana jest jako barwnik histologiczny o specyficznym powinowactwie do DNA, chociaż jego właściwości fluorescencyjne do niedawna pozostawały niezbadane. W tym artykule ilustrujemy metodę przygotowania wodnego roztworu podstawowego zieleni metylowej, który po rozcieńczeniu może być stosowany jako bardzo wygodny fluorescencyjny znacznik jądrowy dla utrwalonych komórek i tkanek. Szczegółowo opisano proste procedury znakowania całych zarodków danio pręgowanego i piskląt, a także przedstawiono przykłady uzyskanych obrazów. Zieleń metylowa jest maksymalnie wzbudzana przez światło czerwone, przy 633 nm, i emituje stosunkowo ostre widmo, które osiąga szczyt przy 677 nm. Jest bardzo tani, nietoksyczny, wysoce stabilny w roztworze i bardzo odporny na fotowybielanie po związaniu z DNA. Jego czerwona emisja pozwala na niezmienione skaningowe obrazowanie konfokalne jąder w grubych próbkach w wysokiej rozdzielczości. Wreszcie, ten protokół barwienia zielenią metylową jest kompatybilny z innymi procedurami barwienia komórek, takimi jak znakowanie przeciwciał lub znakowanie filamentów aktynowych falloidyną sprzężoną z fluoroforem.

Barwienie jąder komórkowych w grubych preparatach. Opisany tutaj protokół pozwala na uzyskanie homogenicznego barwienia głębokich struktur w całych embrionach. Jądra komórkowe rozwijającej się soczewki w embrionach zebrafish po 48 hpf są homogenicznie znakowane (Rysunek 1).
Barwienie DNA zielenią metylową pozwala na rozróżnienie zależnych od cyklu komórkowego różnic morfologicznych, takich jak identyfikacja figur mitotycznych lub jąder apoptotycznych (Rysunek 2A</stron...

Opisano metodę fluorescencyjnego barwienia utrwalonego materiału biologicznego za pomocą specyficznej etykiety DNA o nazwie metylowej. Zieleń metylowa jest stosowana w rozcieńczonym roztworze wodnym i jest bardzo odporna na fotowybielanie. Jego daloka-czerwona emisja pozwala na głębokie obrazowanie próbek, dzięki czemu jest szczególnie odpowiedni dla całych zarodków.

Zastosowanie specyficznego dla DNA barwnika zieleni metylowej w znakowaniu fluorescencyjnym zarodków

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

W tym filmie pokażemy, jak bardzo powszechne barwienie histologiczne zielenią metylową może zostać wykorzystane jako niezwykle wygodny marker jąder komórkowych w mikroskopii fluorescencyjnej, ze szczególnym zastosowaniem w konfokalnej mikroskopii laserowej grubych preparatów biologicznych, takich jak całe embriony. Po krótkim przedstawieniu zieleni metylowej jako barwnika specyficznego dla DNA, opiszemy metodę przygotowania roztworów zapasowych i roboczych do barwienia fluorescencyjnego. Następnie zaprezentujemy procedurę eksperymentalną pozwalającą na uzyskanie barwienia jąder, a także pokażemy kilka embrionów ryb oraz przykłady uzyskanych obrazów konfokalnych.Na koniec zostaną zaprezentowane i omówione doskonałe właściwości fizykochemiczne zieleni metylowej. Friedrich Miescher odkrył DNA w 1869 roku i wykazał kilka lat później, że tworzy ono osady z relatywnie nowym wówczas barwnikiem i odczynnikiem – zielenią metylową. Zieleń metylowa posiada dwa ładunki dodatnie, które pozwalają jej na silne oddziaływanie z DNA w obrębie jego głównego rowka, wiążąc się preferencyjnie z obszarami bogatymi w adeninę.Najszersze zastosowanie zieleni metylowej polegało na jej łączeniu w roztworze donosowym z barwnikiem RNA perine, opracowanym przez UNA i Poppen Heima na początku XX wieku. Bardzo mało jednak przeanalizowano w kwestii właściwości fluorescencyjnych zieleni metylowej, dlatego postanowiliśmy zbadać możliwość jej wykorzystania jako wysoce powinowatego i specyficznego znacznika fluorescencyjnego dla DNA w komórkach.Zieleń metylowa jest barwnikiem metanowym z siedmioma grupami metylowymi. Siódma grupa jest łatwo usuwana, co prowadzi do powrotu do formy fioletu krystalicznego. Z tego powodu do zieleni metylowej dodaje się niewielką ilość fioletu krystalicznego, aby zapobiec krystalizacji.Roztwór fioletu metylowego można przemyć chloroformem w celu wyekstrahowania fioletu krystalicznego. Jak wykażemy w dalszej części, w tym celu przygotowujemy pod wyciągiem roztwór 4%ACU. Mieszamy go z co najmniej dwiema częściami chloroformu i wirujemy, aby przyspieszyć rozdzielenie faz.Po wirowaniu otrzymujemy fazę wodną z zielenią metylową oraz dolną fazę organiczną z chloroformem i fioletem krystalicznym. Odzyskiwaliśmy górną fazę i powtarzaliśmy czynność do momentu, aż dolna faza stała się klarowna. Na koniec górna faza zostaje odzyskana i rozcieńczona.Ten roztwór pozostaje stabilny na blacie laboratoryjnym przez wiele miesięcy. Teraz pokażemy, jak przystąpić do barwienia całej warstwy embrionów MO zielenią metylową. Do mikroskopii konfokalnej wykorzystamy zarodki ryb o wysokim stopniu transplantacji.Jako przykład: należy pozyskać zarodki rybki danio i usunąć zanieczyszczenia za pomocą sitka. Inkubować je do pożądanego stadium w wodzie z akwarium lub medium do zarodków. Usunąć chorion za pomocą precyzyjnej pęsety, a następnie utrwalić zarodki w 4% formaldehydzie przez kilka godzin lub przez noc.Następnie należy kilkukrotnie przemyć embriony w PBST. Przygotować roboczy roztwór zieleni metylowej, rozcieńczając roztwór stokowy od 5 do 10 000 razy w PBST. Inkubować embriony w roztworze przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.W tym przykładzie obrazy konfokalne zostaną uzyskane przy użyciu mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektory spektralne. Maksymalne wzbudzenie uzyskano za pomocą lasera o długości fali 633 nanometrów, a detektor ustawiono na szeroki zakres w czerwonej części widma widzialnego.Emisja zieleni metylowej z czerwienią pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazowania jąder komórkowych nawet w przypadku głębokich preparatów, takich jak całe embriony, przy minimalnej utracie sygnału. Ta pierwsza seria przedstawia siatkówkę danio pręgowanego, której jądra zostały zabarwione uznanym barwnikiem DNA do poziomu trzech. Po jednej minucie wykonujemy oddalenie.Region skanowania ABL staje się widoczny, gdy przeprowadzamy ten sam eksperyment z użyciem zieleni metylowej, wówczas nie obserwuje się wyraźnego wybielania. W poniższej serii przedstawiamy reprezentatywne wyniki, jakie można uzyskać stosując opisany tutaj protokół: komórkę mitotyczną z naskórka danio pręgowanego, w której można zaobserwować figury mitotyczne oraz jądro IIC z tego samego preparatu, w którym widoczna jest architektura jądrowa.Rekonstrukcja 3D fragmentu komórki naskórka larwy zebrafish znakowanej metylową zielenią amaliną; bardziej panoramiczny widok różnych kształtów jąder komórkowych w siatkówce oka zarodka zebrafish w 48. godzinie po zapłodnieniu. Przedstawiliśmy tutaj prosty sposób przygotowania niezwykle taniego fluorescencyjnego barwnika DNA, który może być wykorzystany do znakowania jąder komórkowych; choć pokazaliśmy tylko jeden przykład, istnieje ich wiele. Technikę tę można zastosować do embrionów lub tkanek, zarówno w preparatach całych, jak i w przekrojach.Może być również stosowane do barwienia DNA w żelach oraz do oznaczania DNA w roztworze za pomocą fotometrii.

application-dna-specific-stain-methyl-green-fluorescent-labeling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zastosowanie barwnika specyficznego dla DNA, metylowej zieleni, w fluorescencyjnym oznakowaniu zarodków

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Opisujemy szereg metod wstrzykiwania barwników, wektorów DNA, wirusów i komórek w celu monitorowania zarówno losu komórek, jak i fenotypu endogennych i szczepionych komórek pochodzących z komórek embrionalnych lub pluripotencjalnych w embrionalnych zarodkach myszy w dniu embrionalnym (E)9.5 i późniejszych etapach rozwoju.

Znakowanie i wstrzykiwanie komórek w rozwijających się embrionalnych sercach myszy

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Informujemy tutaj o solidnej i efektywnej ekspresji białek fluorescencyjnych po wstrzyknięciu mRNA do niezapłodnionych oocytów Branchiostoma lanceolatum. Opracowanie techniki mikroiniekcji w tym podstawowym strunacie utoruje drogę dla dalekosiężnych innowacji technicznych w tym powstającym systemie modelowym, w tym obrazowania in vivo i manipulacji specyficznych dla genów.

Ekspresja białek fluorescencyjnych w Branchiostoma lanceolatum przez wstrzyknięcie mRNA do niezapłodnionych oocytów

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Protokół opisuje specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych za pomocą komercyjnie dostępnego barwnika żelowego DNA, akwizycję serii poklatkowych żywych znakowanych komórek za pomocą super-rozdzielczej mikroskopii oświetlenia strukturalnego (SR-SIM) oraz automatyczne śledzenie ruchu nukleoidów.

Specyficzne znakowanie nukleoidów mitochondrialnych dla poklatkowej mikroskopii oświetlenia strukturalnego

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Opisujemy metody wizualizacji początkowej transkrypcji podczas aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach we wczesnej embriogenezie.

Wizualizacja aktywacji genomu zygotycznego w pojedynczych komórkach wczesnych zarodków

Poznaj metodę fluorescencyjnego barwienia jąder zielenią metylową w zarodkach ryb. Technika umożliwia głębokie obrazowanie konfokalne całych preparatów biologicznych dzięki odporności na fotoblaknięcie.

Zastosowanie specyficznego dla DNA barwnika zieleni metylowej w znakowaniu fluorescencyjnym zarodków

Przeglądaj więcej filmów