Zastosowanie specyficznego dla DNA barwnika zieleni metylowej w znakowaniu fluorescencyjnym zarodków
2 maja 2015
Opisano metodę fluorescencyjnego barwienia utrwalonego materiału biologicznego za pomocą specyficznej etykiety DNA o nazwie metylowej. Zieleń metylowa jest stosowana w rozcieńczonym roztworze wodnym i jest bardzo odporna na fotowybielanie. Jego daloka-czerwona emisja pozwala na głębokie obrazowanie próbek, dzięki czemu jest szczególnie odpowiedni dla całych zarodków.
W tym filmie pokażemy, w jaki sposób bardzo powszechne barwienie histologiczne zieleń metylowa może być używane jako niezwykle wygodna etykieta jądrowa w mikroskopii fluorescencyjnej ze specjalnymi zastosowaniami w laserowej mikroskopii konfokalnej grubych próbek biologicznych, takich jak całe zarodki. Po krótkim wprowadzeniu zieleni metylowej jako barwienia specyficznego dla DNA, opiszemy metodę przygotowania roztworów podstawowych i roboczych do barwienia fluorescencyjnego. Następnie pokażemy procedurę eksperymentalną w celu uzyskania barwienia jądrowego i przechowywania kilku zarodków ryb oraz przykładów uzyskanych obrazów konfokalnych.
Na koniec zostaną zademonstrowane i omówione doskonałe właściwości fizykochemiczne zieleni metylowej. Freddy Misha odkrył DNA w 1869 roku i wykazał kilka lat później, że tworzy ono osady ze stosunkowo nowym rocznikiem i barwie na zielono metylową. Zieleń metylowa ma dwa dodatnie ładunki, które pozwalają jej silnie oddziaływać z DNA w jego głównej grupie, preferencyjnie wiążąc się z regionami zasięgu.
Najszerszym zastosowaniem zieleni metylowej było jej połączenie w roztworze do nosa z peryną barwioną RNA, metylologiem opracowanym przez UNA i Poppen Heim na początku XX wieku. Bardzo niewiele zostało jednak przeanalizowanych pod kątem właściwości fluorescencyjnych zieleni metylowej, dlatego zdecydowaliśmy się przetestować możliwość jej zastosowania jako bardzo wysokiego powinowactwa i specyficznego znacznika fluorescencyjnego. Do DNA na komórkach.
Zieleń metylowa to barwnik al metanu z siedmioma korzeniami metylu. Ta siódma grupa łatwo się gubi i powraca do fioletu krystalicznego. Z tego powodu pojawia się ilość fioletu krystalicznego zmieszanego z zielenią metylową w celu usunięcia kryształu.
Roztwór fioletowej zieleni metylowej można przemywać chloroformem w celu ekstrakcji fioletu krystalicznego. Jak zaraz pokażemy w tym celu, przygotowujemy 4%roztwór ACU pod wyciągiem. Mieszamy go z co najmniej dwiema częściami chloroformu i odwirowujemy, aby przyspieszyć separację faz.
Po odcentrowaniu otrzymujemy fazę wodną z zielenią metylową i dolną fazę organiczną z chloroformem i fioletem krystalicznym. Odzyskaliśmy górną fazę i powtarzaliśmy, aż dolna faza stanie się czysta. Na koniec górna faza jest odzyskiwana i rozcieńczana.
Jest to rozwiązanie, które zapewnia stabilność na stole roboczym przez wiele miesięcy. Teraz pokażemy, jak postępować, aby pielęgnować całe MO w warstwie zarodków za pomocą metamfetaminy. Do mikroingu konfokalnego użyjemy zarodka ryb o wysokich przeszczepach.
Na przykład Uzyskaj zarodki danio pręgowanego i zmyj zanieczyszczenia za pomocą sitka. Inkubuj je do pożądanego etapu w wodzie w akwarium lub pożywce zarodkowej. Usuń korium za pomocą cienkiej pęsety, utrwal zarodki w 4% dla formaldehydu na te kilka godzin lub na noc.
Następnie kilkakrotnie umyj zarodki w PBST. Przygotować roztwór roboczy zieleni metylowej, rozcieńczając roztwór podstawowy od pięciu do 10 000 razy w PBST. Inkubować zarodki w roztworze przez co najmniej trzy godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
W tym przykładzie obrazy konfokalne zostaną uzyskane w mniejszym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w detektory spektralne. Maksymalne wzbudzenie osiąga się za pomocą lasera o długości fali 633 nanometrów, a detektor jest ustawiony na szeroki zakres. W czerwonym obszarze widma widzialnego.
Emisja czerwieni metylowej umożliwia uzyskanie dobrej jakości obrazowania jądrowego nawet z głębokich próbek, takich jak całe zarodki, przy minimalnej utracie sygnału. Ta pierwsza seria pokazuje siatkówkę danio pręgowanego, której jądra zostały wybarwione dobrze znanym barwnikiem DNA do pro trzy. Po minucie oddalamy się.
Obszar skanowania ABL staje się widoczny, gdy przeprowadzamy ten sam eksperyment z zielenią metylową, nie widać wyraźnego wybielania. W poniższej serii pokazujemy reprezentatywne wyniki tego, co można uzyskać za pomocą opisanego tutaj protokołu, komórki mitotycznej z naskórka danio pręgowanego, w której można zaobserwować figury mitotyczne. jądro IIC z tego samego egzemplarza, w którym można zobaczyć architekturę jądrową.
Rekonstrukcja 3D części komórki naskórka larwy danio pręgowanego oznaczonej zielonym amaliną metylową, bardziej panoramiczny widok różnych kształtów jądrowych w ciągu 48 godzin zapłodnienia portem, rybik cukrowy, siatkówka br. Pokazaliśmy tutaj łatwy sposób przygotowania niezwykle niedrogiego fluorescencyjnego barwnika DNA, który można wykorzystać w etykiecie jądrowej, chociaż pokazujemy tylko jako przykład, że z posiada kilka. Technika ta może mieć zastosowanie do zarodków lub tkanek, zarówno całych, jak i wycinkowych.
Może być również stosowany do barwienia DNA w żelach oraz do oznaczania DNA w roztworze za pomocą fotometrii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę barwienia fluorescencyjnego utrwalonego materiału biologicznego przy użyciu zieleni metylowej, która jest znacznikiem specyficznym dla DNA. Emisja zieleni metylowej w obszarze dalekiej czerwieni umożliwia głębokie obrazowanie preparatów, co czyni tę metodę odpowiednią do badania całych embrionów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Barwienie histologiczne
- Obrazowanie biologiczne
Wstęp
- Zieleń metylowa jest powszechnie stosowanym barwnikiem histologicznym.
- Silnie oddziałuje z DNA, wiążąc się preferencyjnie z regionami bogatymi w AT.
- Została odkryta w kontekście badań nad DNA pod koniec XIX wieku.
- Barwnik ten jest odporny na fotoblaknięcie, co zwiększa jego użyteczność w mikroskopii.
Cel badania
- Wykazanie zastosowania zieleni metylowej jako znacznika jąder komórkowych w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Przedstawienie metody przygotowania roztworów zapasowych i roboczych do barwienia.
- Zaprezentowanie obrazowania konfokalnego grubych próbek biologicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów zapasu i roztworów roboczych zieleni metylowej.
- Barwienie fluorescencyjne utrwalonego materiału biologicznego.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej.
- Obrazowanie całych embrionów i analiza obrazów konfokalnych.
Główne wyniki
- Pomyślne barwienie jąder komórkowych embrionów ryb przy użyciu zieleni metylowej.
- Wykazanie doskonałych możliwości obrazowania wynikających z właściwości zieleni metylowej.
- Uzyskane obrazy konfokalne wykazują wyraźne znakowanie jąder.
- Potwierdzono odporność zieleni metylowej na fotowyblakanie.
Wnioski
- Zieleń metylowa jest skutecznym znacznikiem jąder komórkowych w mikroskopii fluorescencyjnej.
- Jej właściwości sprawiają, że nadaje się ona do obrazowania grubych preparatów biologicznych.
- Metodę tę można zastosować w różnych kontekstach badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Fluorescencyjne znakowanie jąder komórkowych przy użyciu zieleni metylowej umożliwia obrazowanie jąder w wysokiej rozdzielczości w grubych preparatach biologicznych, co wspiera procesy wczesnego odkrywania oraz walidacji celów terapeutycznych. Jej stabilność, specyficzność względem DNA oraz kompatybilność z mikroskopią konfokalną zapewniają wiarygodność predykcyjną analiz na poziomie komórkowym i tkankowym. Możliwość ta usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio poprzez umożliwienie solidnego i powtarzalnego obrazowania w złożonych systemach modelowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną wizualizację jąder komórkowych w badaniach opartych na hipotezach w utrwalonych komórkach i tkankach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez umożliwienie wyraźnej identyfikacji architektury jądra.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach komórkowych dzięki specyficznemu znakowaniu DNA.
- Umożliwia pewną selekcję potencjalnych celów w oparciu o wysokowiercze dane obrazowania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych procesów obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging).
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe znakowanie jąder komórkowych, niezbędne do standaryzacji testów.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy dzięki stabilności i niskim kosztom zieleni metylowej.
- Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez minimalizację fotowyblakania i utraty sygnału.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami systemowymi istotnymi dla przebiegu chorób, umożliwiając obrazowanie całych embrionów oraz grubych tkanek.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki stabilnemu znakowaniu jąder komórkowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka w procesie rozwoju poprzez dostarczanie spójnych wyników obrazowania w różnych modelach.
- Usprawnia predykcyjną redukcję ryzyka dzięki kompatybilności z protokołami barwienia multipleksowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Fluorescencyjne znakowanie metylową zielenią integruje się z kontinuum procesów badawczych, od wczesnego testowania hipotez po obrazowanie przedkliniczne, wspierając przepływy pracy wymagające precyzyjnej wizualizacji jąder komórkowych w złożonych preparatach.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez specyficzne dla DNA obrazowanie jąder komórkowych.
- Screening: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne znakowanie jąder do zastosowania na platformach screeningu wysokotrywalnego (high-content screening).
- Analityka: Dostarcza ilościowych, fotostabilnych odczytów do analiz porównawczych stanów komórkowych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i zachowanie ciągłości w modelach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje stabilne i kosztowo efektywne rozwiązanie do znakowania, które można zaadaptować w różnych programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w obrazowaniu jądrowym.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w procesach obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu generowania rzetelnych danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroskopii konfokalnej oraz technik obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymagany jest dostęp do detektorów spektralnych i kompatybilnych źródeł wzbudzenia laserowego (np. 633 nm).
- Konieczna jest standaryzacja protokołów barwienia i obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych systemach modeli utrwalonych, w tym w całych embrionach i przekrojach tkanek.
- Metoda jest ograniczona do preparatów utrwalonych; nie nadaje się do obrazowania jąder komórkowych w żywych komórkach.
