Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest synteza i charakterystyka nanopartykuł szczepionkowych opartych na lipidach oraz ocena ich zdolności do wywoływania ekspansji swoistych dla antygenu cytotoksycznych limfocytów T in vivo. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie imitujących patogeny, sieciowanych wielowarstwowych pęcherzyków z przeplatającymi się warstwami, czyli I CMVs, współładowanych antygenem i adiuwantem do szczepienia naiwnych myszy. Następnie przeprowadzono adoptywny transfer antygenowo swoistych limfocytów T CD8+ wykazujących ekspresję lucyferazy.

W drugim kroku ekspansję swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ ocenia się za pomocą obrazowania in vivo całego organizmu zwierzęcia. Komórki mononuklearne krwi obwodowej pobrane od zwierząt uodpornionych na ICMV barwi się następnie tetramerami znakowanymi fluorescencyjnie i analizuje metodą cytometrii przepływowej, aby określić częstotliwość występowania endogennych swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ w układzie systemowym. Ostatecznie obrazowanie bioluminescencyjne może zostać wykorzystane do śledzenia ekspansji swoistych dla antygenu cytotoksycznych limfocytów T w odpowiedzi na szczepienie nanocząsteczkami.

Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe wstępne pytania dotyczące projektowania szczepionek, takie jak: jaki jest zakres ekspansji cytotoksycznych limfocytów T i w jaki sposób komórki te migrują do różnych tkanek w odpowiedzi na szczepienie nanocząsteczkami? Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza komórek T in situ po nekropsji tkanek, jest fakt, że obrazowanie odpowiedzi komórek TT in vivo jest nieinwazyjne. Pozwala to na monitorowanie podłużne tego samego zwierzęcia. Rozpocznij od zmieszania DOPC i MPB w chloroformie w stosunku molowym jeden do jednego, zachowując całkowitą ilość lipidów wynoszącą 1,26 micromoles na partię w szklanej fiolce o pojemności 20 milliliter.

Następnie do roztworu lipidów dodaje się ładunek lipofilowy w pożądanym stężeniu i przepłukuje roztwór nadmiarowo suchym azotem, aby całkowicie usunąć rozpuszczalnik organiczny. Próbkę pozostawia się w próżni na noc; następnego ranka dodaje się 200 µL 10 mM BTP zawierającego interesujący ładunek rozpuszczalny w wodzie w celu hydratacji filmu lipidowego, a otrzymany roztwór miesza się w wstrząsarku wierzchowej (vortex) przez 10 sekund co 10 minut przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zawartość przenosi się do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.

Następnie umieść probówkę w kąpieli wodnej z lodem, poddając ją ciągłej sonikacji przy ustawieniu intensywności 40% za pomocą sondy ultradźwiękowej o mocy 125 watt i częstotliwości 20 kilohertz. Po pięciu minutach dodaj do probówki cztery µL 150 mM DTT, wymieszaj na wortexie i odwirowuj próbkę w mikro wirówce. Następnie dodaj do próbki 40 µL 200 mM chlorku wapnia, a następnie przeprowadź sieciowanie warstw lipidowych zawierających MPB z DTT w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Po zakończeniu inkubacji odwiruj roztwór trzy razy, dodając 200 µl wody podwójnie destylowanej podczas drugiej i trzeciej centrifugacji, aby usunąć z naddatku pozostały chlorek wapnia, niezareagowany DTT oraz nieenkapsulowane materiały ładunku. Po ostatnim wirowaniu zawieszamy I CMV w 100 µl świeżo przygotowanego pegolu przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie pęcherzyki przemywamy jeszcze dwa razy wodą podwójnie destylowaną.

Resuspenduj końcowy osad w PBS i przechowuj ICM VS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby scharakteryzować cząsteczki, wymieszaj zimną zawiesinę ICMV przed rozcieńczeniem niewielkiej porcji próbki do całkowitej objętości jednego mililitra dwukrotnie destylowanej wody. Następnie umieść ICMV w komórce zeta sizer i użyj systemu pomiarowego dynamicznego rozpraszania światła oraz potencjału zeta, aby zmierzyć indeks polidyspersyjności wielkości cząstek i potencjał zeta próbek zgodnie z instrukcjami producenta.

W celu izolacji komórek T CD8+ wykazujących ekspresję lucyferazy specyficznej dla OVA, najpierw pobierz śledziony od myszy transgenicznych OT-I lucyferazy. Umieść tkanki w 5 ml lodowatego PBS z 2% FBS, a następnie przenieś je do komory z laminarnym przepływem powietrza.

Za pomocą tłoka z strzykawki 3 ml rozetrzyj do trzech śledzion jednocześnie przez sitko 70 µm do probówki stożkowej 15 ml. Przepłucz tłok oraz sitko roztworem PBS i 2% FBS. Następnie uzupełnij całkowitą objętość zawiesiny komórkowej do 10 ml na jedną śledzionę.

Wyznaczyć całkowitą liczbę komórek, a następnie poddać je wirowaniu. Następnie, zgodnie z instrukcją producenta, użyć dostępnego komercyjnie zestawu do magnetycznej selekcji negatywnej w celu wyizolowania komórek śledziony CD8+. Następnie przemyć limfocyty T w PBS.

Policz komórki i inkubuj od 2 do 3 × 10⁵ komórek w 20 µL blokującego przeciwciała przeciwko mysiemu CD 1632. Po 10 minutach dodaj do komórek 20 µL przeciwciała anty-CD8 APC na 30 minut, a następnie za pomocą cytometrii przepływowej oceń czystość populacji komórek T CD8+ wyizolowanych za pomocą kulek magnetycznych. Następnie przeprowadź transfer adopcyjny od 1 do 10 × 10⁵ komórek T CD8+ OT1 z lucyferazą do naiwnych, ogolonych myszy albinosów C57BL/6 w 200 µL PBS poprzez wstrzyknięcie dożylne do żyły ogonowej. 24 godziny później, w odpowiednim dniu po szczepieniu, podaj szczepionkę.

Po 10 minutach wstrzyknij zwierzętom Lucifer w dawce 150 mg/kg, a następnie przez okres od 5 do 10 minut rejestruj sygnał bioluminescencji za pomocą systemu obrazowania całego organizmu, aby zwizualizować komórki T CD8+ OT-1 Lucifer i określić liczbę antygenowo swoistych komórek T CD8+ w odpowiednim czasie. Po szczepieniu pobierz około 100 µl krwi od zaszczepionych myszy metodą pobierania podżuchwowego do probówki powlekanej EDTA potasem, a następnie kilkakrotnie odwróć probówkę, aby zapobiec krzepnięciu. Następnie przenieś 100 µl krwi do probówki do mikrowirówki i dodaj 1 ml buforu lizującego CK.

Po dwóch do trzech minutach odwiruj komórki i usuń supernatant. Przemyj pozostałe pbmc w 1 ml buforu fax i zablokuj nieswoiste wiązanie za pomocą CD 1632, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Po 10 minutach podziel zawiesinę komórkową do probówek fax o okrągłym dnie o pojemności 4 ml i dodaj do każdej próbki 20 µL roztworu H two KB over tetramer syn fecal PE, zgodnie ze specyfikacją producenta.

Po 30 minutach w lodzie dodać 20 µL odpowiedniego koktajlu przeciwciał do każdej próbki doświadczalnej oraz pojedyncze przeciwciała kontrolne fluoro-four do każdej próbki kontrolnej dla każdego tetrameru lub przeciwciała z tagiem fluoro-four. Na koniec, po kolejnej 20-minutowej inkubacji, przemyć wszystkie próbki w buforze fax, zawiesić osady w buforze fax uzupełnionym o DPI i przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej. CMV współładowane z białkowymi antygenami tagowanymi fluoro-four oraz fluorescencyjnymi barwnikami lipofilowymi umożliwiają wizualizację dostarczania antygenu i nanocząstek in vivo. Na przykład obrazy z mikroskopii konfokalnej wskazują, że rozpuszczalny antygen podany podskórnie u podstawy ogona dociera do drenujących węzłów chłonnych w ciągu czterech godzin od podania i zostaje usunięty w ciągu 24 godzin.

W przeciwieństwie do nich, przeładowane I CMV są po raz pierwszy wykrywane na obwodzie drenujących węzłów chłonnych w ciągu 24 godzin po podaniu, przy czym ich ciągłe gromadzenie prowadzi do powstania dużego depozytu ova I CMV w obrębie tkanki chłonnej drenującej. W czwartym dniu obrazowanie bioluminescencyjne myszy C 57 BL six, którym w dniu szczepienia adoptywnie przeniesiono limfocyty T CD8+ OT one Luciferase, wykazuje minimalny poziom tła dla OT one luciferase tcell w czwartym dniu po szczepieniu. Jednakże myszy uodpornione za pomocą ova MPI CMV wykazują silny sygnał bioluminescencyjny w obrębie drenujących pachwinowych węzłów chłonnych.

Myszy szczepione rozpuszczalnym OVA wykazują natomiast znacznie mniejszą ekspansję komórek T CD8+ specyficznych dla OT-I w węzłach chłonnych drenujących. Ponadto myszy immunizowane rozpuszczalnym OVA i MPLA, bez adoptywnego transferu antygenowo specyficznych komórek T, nie wykazują znaczącej ekspansji specyficznych dla OVA komórek T CD8+, co potwierdzono w drodze cotygodniowego monitorowania PBMC. Szczepionka ICMV wywołuje jednak znacznie silniejszą i endogenną odpowiedź komórek T CD8+, osiągając szczyt 28% tetramer-dodatnich komórek T w populacji komórek T CD8+ wśród PBMC do 41. dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak syntetyzować nanocząsteczki lipidowe, przeprowadzać immunizacje oraz wizualizować i kwantyfikować ekspansję CTL in vivo.

Metody te można dodatkowo modyfikować, aby uzyskać więcej informacji na temat odpowiedzi CTL. Na przykład test barwienia teer można uzupełnić o dodatkowe markery, takie jak CD 1 27, BCL two oraz K lrg one, w celu oceny fenotypu pamięci komórek.