Name: Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metody obrazowania całych zwierząt i cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8+ po szczepieniu nanocząstkami lipidowymi u myszy. Techniki te umożliwiają nieinwazyjne monitorowanie ekspansji komórek T in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Narodowego Instytutu Zdrowia 1K22AI097291-01 oraz przez National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health w ramach Nagrody Numer UL1TR000433. Wyrażamy również uznanie dla prof. Darrella Irvine'a z MIT i prof. Matthiasa Stephana z Fred Hutchinson Cancer Center za ich wkład we wstępne prace nad nanocząstkami szczepionki i transgenicznymi myszami OT-I/Luc.

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (UCUCA) na Uniwersytecie Michigan i przeprowadzone zgodnie z ustalonymi zasadami i wytycznymi.
1. Synteza i charakterystyka ICMV współładowanych antygenami białkowymi i cząsteczkami adiuwantowymi
<ol>
	<li>Zmieszać stosunek molowy 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[4-(p-maleimidofenylo)butyramidu] (MPB) w chloroformie, utrzymując całkowitą ilość lipidów na poziomie 1,26 μmol na partię (tj. 500 μg DOPC i 630 μg MPB) w szklanej fiolce o pojemności 20 ml (średnica = 28 mm i wysokość = 61 mm).</li>
	<li>Dodaj leki lipofilowe, takie jak monofosforylowy lipid A (MPLA) lub barwniki lipofilowe (np. DiD), do roztworu lipidów w żądanym stężeniu. Dokładnie usunąć rozpuszczalnik organiczny, przepłukując je dodatkowym suchym azotem i umieszczając próbki w próżni O/N.</li>
	<li>Uwodnić płaszcz lipidowy, dodając 200 μl 10 mM bis-tris propanu (BTP, pH 7,0) zawierającego leki rozpuszczalne w wodzie (np. antygeny białkowe). Wiruj przez 10 sekund co 10 minut przez 1 godzinę przy temperaturze regulowanej.</li>
	<li>Przenieś zawartość szklanej fiolki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, umieść próbki w łaźni lodowo-wodnej i poddaj soniku w sposób ciągły przez 5 minut, używając ustawienia intensywności 40% na sonikatorze 125 W/20 kHz z końcówką sondy.</li>
	<li>Dodać 4 μl 150 mM ditiotreitolu (DTT) do każdej partii (stężenie robocze 2,4 mM), odwirować i krótko odwirować za pomocą mikrowirówki stołowej.</li>
	<li>Dodać 40 μl z 200 mM CaCl2 i wymieszać z pipetą (stężenie robocze 33 mM). Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić sieciowanie warstw lipidowych zawierających MPB za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 15 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl ddiH2O.</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.7 i ponownie odwirować po drugim płukaniu ddiH2O w celu usunięcia CaCl2, nieprzereagowanej DTT i niekapsułkowanych materiałów wsadowych z supernatantu.</li>
	<li>Przygotować 10 mg/ml tiolu glikolu polietylenowego o stężeniu 2 kDa (PEG-SH) w ddiH2O. Zawiesić każdą próbkę ICMV w 100 μl roztworu PEG-SH i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Wykonać dwa płukania ddiH2O (krok 1.7) i ponownie zawiesić końcowe granulki ICMV w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem wymieszać zawiesinę ICMV, ponieważ cząstki mogą osiąść na dnie po dłuższym przechowywaniu.</li>
	<li>W celu scharakteryzowania cząstek, należy usunąć niewielką porcję (~10%) ICMV z każdej partii i rozcieńczyć indywidualnie w całkowitej objętości 1 ml ddiH2O. Umieścić pojedynczą próbkę w komórce Zetasizer i zmierzyć wielkość cząstek, wskaźnik polidyspersyjności i potencjał zeta próbek za pomocą systemu pomiaru potencjału DLS i zeta (zgodnie z protokołem producenta).</li>
</ol>
2. Badanie drenażu węzłów chłonnych ICMV znakowanych fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Przygotowanie ICMV obciążonych antygenem znakowanym fluoroforem i lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym
	<ol>
		<li>Przygotuj białko znakowane fluoroforem, takie jak albumina jaja kurzego reagująca z estrem sukcynimidylu Alexa Fluor 555, zgodnie z instrukcją producenta.</li>
		<li>Aby przygotować ICMV znakowane fluoroforem w otoczce lipidowej, dodaj lipofilowy barwnik fluorescencyjny (np. 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindodicarbocyanine, (DiD)) podczas przygotowywania filmu lipidowego (Krok 1.2) w 0,05% molowej ilości lipidów. Do uwodnienia filmu lipidowego (krok 1.3) użyj buforu zawierającego antygen znakowany fluoroforem i zakończ syntezę ICMV, jak opisano w krokach 1.4-1.11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podskórne podawanie nanocząstek u podstawy ogona
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy za pomocą parownika o kontrolowanym przepływie wyposażonego w komorę indukcyjną wykorzystującą 3% izofluranu i przepływ tlenu 1,5 l/min zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez IACUC. Gdy mysz straci przytomność, należy szybko wykonać następujące czynności przed ustąpieniem znieczulenia, aby umożliwić optymalny dostęp do miejsca wstrzyknięcia i zminimalizować dyskomfort zwierzęcia. Alternatywnie, użyj odpowiednio dopasowanego stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie. Jeśli myszy są znieczulone dłużej niż 5 minut, należy nałożyć lubrykant do oczu niezbędny do zminimalizowania podrażnień po zabiegu.</li>
		<li>Spryskaj podstawę ogona 70% etanolem, aby zdezynfekować i zwilżyć sierść Rozchyl mokre włosy, aby odsłonić mały fragment widocznej skóry, który można wykorzystać do wizualizacji igły pod skórą.</li>
		<li>Przygotować zawiesinę do wstrzykiwań zawierających pożądaną ilość antygenu i adiuwanta na 100 μl dawki szczepionki w PBS (np. 10 μg OVA i 0,3 μg MPLA na 100 μl dawki iniekcyjnej stosowano w przeszłości6,9).</li>
		<li>Narysować zawiesinę cząstek do strzykawki z igłą o sile 27-29 G i wprowadzić igłę u podstawy ogona (~5 mm od linii włosów) skosem skierowanym do góry i wstrzyknąć 50 μl zawiesiny cząstek22.</li>
		<li>Odczekaj kilka sekund, aż ciśnienie się wyrówna, aby zapobiec nadmiernemu przepływowi wstecznemu i wyciągnij igłę. Powtórzyć wstrzyknięcie po drugiej stronie podstawy ogona, aby dotrzeć do obu drenujących pachwinowych LN.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kriosekcji węzłów chłonnych i badanie za pomocą mikroskopii konfokalnej.
	<ol>
		<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie indukowaną odmę opłucnową zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem na zwierzętach. Ekstrahować pachwinowe LN zgodnie z protokołem przedstawionym w Bedoya23 i wypłukać krew, umieszczając tkanki w 1 ml PBS o temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wchłonąć PBS z tkanek z tkankami i umieścić tkankę w krioformach tkankowych (10 x 10 x 5 mm3) wstępnie wypełnionych do góry pożywką do zamrażania OCT24. Zamroź blok tkanki w ciekłym azocie na 30 sekund. Alternatywnie umieść blok tkanki na suchym lodzie na 30 minut. Zamrożoną tkankę przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Wyciąć skrawki tkanek o grubości 5-10 μm w kriosacie ustawionym w temperaturze -20 °C24.</li>
		<li>W razie potrzeby wykonaj znakowanie immunofluorescencyjne i zbadaj tkankę za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak wykazano wcześniej24.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Monitorowanie ekspansji limfocytów T CD8+ swoistych dla antygenu i ekspresji lucyferazy po szczepieniu nanocząsteczkami za pomocą obrazowania całego zwierzęcia
<ol>
	<li>Izolacja specyficznych dla OVA257-264, eksprymujących lucyferazy limfocytów T CD8 + od transgenicznych myszy OT-I / Luc
	<ol>
		<li>Poddać eutanazji transgeniczną mysz OT-I/Luc z uduszeniem CO2 i wywołać odmę opłucnową zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez IACUC. Pobrać śledzionę w sterylny sposób, uzyskując dostęp do jamy otrzewnej i ostrożnie odłączając tkankę od trzustki23 i umieścić w 5 ml 4 °C PBS + 2% FBS w celu przeniesienia do kaptura do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Umieść śledzionę na nylonowym sitku o średnicy 70 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (do 3 śledziony na raz). Za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 3 ml zmielić komórki przez sitko.</li>
		<li>Umyć tłok i sitko środkiem PBS + 2% FBS i wyrzucić. Doprowadzić całkowitą objętość do 10 ml/śledzionę w probówce o pojemności 50 ml, pobrać małą próbkę zawiesiny komórek do policzenia za pomocą hemocytometru i odwirować przez 10 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Korzystając z dostępnego w handlu zestawu do selekcji magnetycznego negatywu, wyizoluj populację limfocytów T CD8 +, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Po umyciu komórek PBS policz liczbę wyizolowanych limfocytów T CD8 +. Aby ocenić czystość wyizolowanych limfocytów T CD8 +, inkubować ~ 20 000-30 000 komórek w 20 μl mysiego przeciwciała CD16/32 (0,025 mg / ml) przez 10 minut, a następnie dodać 20 μl przeciwciała αCD8-APC (0,005 mg / ml) i inkubować przez 30 minut. Wszystkie inkubacje należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C w PBS + 1% w/v BSA. Wykonać analizę cytometrii przepływowej25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adoptywny transfer izolowanych limfocytów T CD8+ i wizualizacja ich ekspansji po szczepieniu
	<ol>
		<li>Wykonaj adoptywny transfer izolowanych limfocytów T OT-I / Luc CD8 + do naiwnych myszy C57BL / 6, podając 1-10 × 105 komórek w objętości 200 μl PBS poprzez dożylne wstrzyknięcie żyły ogonowej22 (dzień -1). Biorąc pod uwagę, że futro i czarne plamy skóry u myszy C57BL / 6 mogą zakłócać sygnał bioluminescencyjny, ogolone myszy albinosy C57BL / 6 są idealne do tych badań.</li>
		<li>Po upływie jednego dnia (dzień 0) należy podać szczepionkę w sposób opisany wcześniej (punkt 2.2).</li>
		<li>Podawać 150 mg lucyferyny na kg masy ciała myszy dootrzewnowo w objętości 300 μl PBS. Po 10 minutach znieczulij myszy izofluranem (jak w kroku 2.2.1) i uwidocznij limfocyty T OT-I/Luc CD8 +, uzyskując sygnał bioluminescencji przez 5-10 minut za pomocą systemu obrazowania całego zwierzęcia (IVIS; szczegółowe instrukcje można znaleźć w Wilson26). Powtórz w razie potrzeby w przypadku badań podłużnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie tetramerów peptydowo-MHC PBMC do analizy specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+
Uwaga: Poniższa procedura protokołu może być wykonana przy użyciu myszy C57BL/6 adoptycyjnie przeniesionych z limfocytami T OT-I/Luc CD8+ lub myszy C57BL/6 bez transferu adoptywnego.
<ol>
	<li>W pożądanym momencie po szczepieniu należy pobrać około 100 μl krwi (4-6 kropli) od myszy za pomocą techniki krwawienia podżuchwowego27 do probówki pokrytejK2EDTA i kilkakrotnie odwrócić, aby zapobiec zakrzepom.</li>
	<li>Przenieść 100 μl krwi do probówki mikrowirówkowej, dodać 1 ml buforu do lizy i inkubować przez 2 do 3 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek (RBC). Odwirować próbki przez 5 minut przy 1 500 x g i usunąć supernatant. Jeśli osad nadal wydaje się czerwony (co wskazuje na niepełne usunięcie erytrocytów), powtórz etap lizy z krótką inkubacją (< 1 min) buforu do lizy.</li>
	<li>Przemyć pozostałe PBMC 1 ml buforu FACS (PBS + 1% w/v BSA) i odwirować przy 1 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić próbkę w 20 μl mysiego przeciwciała CD16/32 (0,025 mg/ml) w celu zablokowania wiązania przeciwciał niespecyficznych i za pośrednictwem FcR. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść komórki z probówek do mikrowirówek do 4 ml okrągłodennych probówek FACS. Do każdej próbki dodać 20 μl roztworu H-2Kb OVA Tetramer-SIINFEKL-PE zgodnie ze specyfikacją producenta i inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj koktajl przeciwciał (np. przeciwciała αCD8-APC, αCD44-FITC i αCD62L-PECy7 (stężenie odpowiednio 0,005, 0,005 i 0,002 mg/ml)). Dodać 20 μl do każdej próbki doświadczalnej i inkubować przez 20 minut na lodzie. Przygotować pojedyncze kontrole fluoroforowe, znakując komórki każdym tetramerem lub przeciwciałem znakowanym fluoroforem w stężeniu wskazanym powyżej.</li>
	<li>Przemyć 2 razy buforem FACS i ponownie zawiesić końcowe osady w buforze FACS zawierającym 2 μg/ml DAPI. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej (szczegóły i przykłady można znaleźć w Scheffold25).</li>
</ol>

Perkin Elmer podał koszty produkcji poniesione podczas publikacji tego artykułu.

Protokół przedstawiony w tym artykule opisuje syntezę i charakterystykę nowego systemu nanocząstek na bazie lipidów, określanego jako ICMV, i zapewnia proces walidacji skuteczności preparatów szczepionek opartych na nanocząstkach w indukowaniu odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu. Synteza ICMV jest zakończona we wszystkich warunkach wodnych, co jest dużą zaletą w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi układami nanocząstek polimerowych (np. cząstkami kwasu poli(laktydowo-ko-glikolidowego)...

Tradycyjne opracowanie szczepionki opierało się głównie na empirycznym podejściu prób i błędów. Jednak dzięki niedawnemu rozwojowi szerokiej gamy biomateriałów i odkryciu molekularnych determinantów aktywacji immunologicznej, możliwe jest obecnie racjonalne projektowanie preparatów szczepionek z biofizycznymi i biochemicznymi wskazówkami pochodzącymi z patogenów1,2. W szczególności zbadano różne platformy dostarczania leków w postaci cząstek stałych jako nośniki szczepionek, ponieważ mogą być one współładowane z antygenami podjednostkowymi i środkami immunostymulującymi, chronić składniki szczepionki przed degradacją i zwiększać ich jednoczesne dostarczanie do komórek prezentujących antygen (APC) znajdujących się w węzłach chłonnych (LN), maksymalizując w ten sposób stymulację immunologiczną i aktywację3-5. W tym raporcie opisujemy syntezę systemu nanocząstek "naśladującego patogeny", określanego jako usieciowane pęcherzyki wielopłytkowe (ICMV) usieciowane międzywarstwowo, które wcześniej wykazano jako potężna platforma szczepionkowa do wywoływania silnych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) i humoralnej odpowiedzi immunologicznej zarówno w przedziałach tkanki układowej, jak i błony śluzowej6-9. W szczególności szczepienie ICMV spowodowało znaczne zwiększenie poziomu IgG w surowicy przeciwko antygenowi malarii w porównaniu ze szczepieniem konwencjonalnymi adiuwantami (np. ałunem i montanidem)7, a także wywołało silną odpowiedź CTL przeciwko komórkom nowotworowym i modelom prowokacji wirusowej u myszy9. Tutaj, wykorzystując ICMV jako modelowy system nanocząstek szczepionkowych, opisujemy metody charakterystyki nanopreparatów szczepionkowych, w tym pomiary wielkości cząstek i potencjału zeta oraz śledzenie transportu cząstek do drenujących LN (dLN) z wykorzystaniem obrazowania konfokalnego tkanek poddanych kriosekcji7. Ponadto przedstawiamy opartą na obrazowaniu całego zwierzęcia metodę analizy ekspansji odpowiedzi CTL u myszy po adoptywnym transferze limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu z ekspresją lucyferazy9,10. Na koniec opisujemy barwienie tetramerowe komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w celu podłużnego oznaczania ilościowego endogennych odpowiedzi limfocytów T u myszy zaszczepionych nanocząstkami6,9.
ICMV to preparat nanocząsteczkowy na bazie lipidów, syntetyzowany przez kontrolowane połączenie prostych liposomów w struktury wielopłytkowe, które są następnie chemicznie stabilizowane przez sieciowanie funkcjonalizowanych maleimidem fosfolipidowych grup głównych w warstwach lipidowych za pomocą środków sieciujących ditiool6. Po zsyntetyzowaniu ICMV, niewielka frakcja nanocząstek może być wykorzystana do określenia wielkości cząstek i potencjału zeta (tj. ładunku powierzchniowego cząstek) za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i analizatora potencjału zeta. DLS mierzy zmiany rozpraszania światła w zawiesinach cząstek, co pozwala na wyznaczenie współczynnika dyfuzji i wielkości hydrodynamicznej cząstek11. Osiągnięcie stałej wielkości cząstek z syntezy między partiami ma kluczowe znaczenie, ponieważ wielkość cząstek jest jednym z głównych czynników wpływających na drenaż limfatyczny cząstek szczepionki do dLN i późniejszy wychwyt komórkowy przez APC12,13. Ponadto potencjał zeta można uzyskać poprzez pomiar prędkości cząstek po przyłożeniu prądu elektrycznego, co pozwala na określenie ruchliwości elektroforetycznej cząstek i ładunku powierzchniowego cząstek11. Zapewnienie stałych wartości potencjału zeta cząstek jest ważne, ponieważ ładunek powierzchniowy cząstek decyduje o stabilności koloidalnej, co ma bezpośredni wpływ na dyspersję cząstek podczas przechowywania i po podaniu in vivo 14,15. W celu śledzenia lokalizacji cząstek w dLN, ICMV mogą być znakowane pożądanymi fluoroforami, w tym barwnikami lipofilowymi i kowalencyjnie znakowanymi antygenami. Po szczepieniu myszy mogą zostać poddane eutanazji w różnych punktach czasowych, wycięte dLN, poddane kriosekcji i przeanalizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia wizualizację drenażu limfatycznego zarówno nośników szczepionki nanocząsteczkowej, jak i antygenu do dLN. Skrawki tkanek można dodatkowo wybarwić fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami i wykorzystać do uzyskania większej ilości informacji, takich jak typy komórek związanych z antygenem i tworzenie centrów rozrodczych, jak pokazaliśmy wcześniej7.
Gdy synteza cząsteczek zostanie zoptymalizowana i transport do dLN zostanie potwierdzony, ważne jest, aby potwierdzić możliwość uzyskania ekspansji CTL in vivo. W celu analizy wywołania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + w odpowiedzi na szczepienie nanocząsteczkami, wykorzystaliśmy modelowy antygen, albuminę jaja kurzego (OVA), z immunodominującym epitopem limfocytów T CD8 + peptydu OVA257-264 (SIINFEKL), co umożliwia szczegółowe analizy immunologiczne odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w celu wstępnego opracowania szczepionki16,17. W szczególności, aby zbadać dynamikę ekspansji i migracji limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu, wygenerowaliśmy podwójnie transgeniczny model myszy, krzyżując transgeniczne myszy eksprymujące lucyferazę świetlika (Luc) z transgenicznymi myszami OT-I, które posiadają limfocyty T CD8 + z receptorem komórek T (TCR) specyficznym dla SIINFEKL (w połączeniu z H-2Kb). Z tych myszy OT-I / Luc limfocyty T OT-I CD8 + z ekspresją lucyferazy można wyizolować i przygotować do adoptywnego transferu do naiwnych myszy C57BL / 6. Po wysianiu, udana immunizacja nanocząstkami zawierającymi OVA spowoduje ekspansję przeniesionych limfocytów T, które można śledzić, monitorując sygnał bioluminescencji za pomocą systemu obrazowania całego zwierzęcia9,10. Ta nieinwazyjna technika obrazowania całego ciała była stosowana z innymi antygenami wirusowymi lub nowotworowymi w ciągu ostatnich18-20 lat, ujawniając procesy związane z ekspansją limfocytów T w tkankach limfatycznych i rozprzestrzenianiem się do tkanek obwodowych w sposób podłużny.
Uzupełnienie do analizy adoptywnie przenoszonych komórek T CD8+ specyficznych dla antygenu, endogenne odpowiedzi limfocytów T po szczepieniu mogą być badane za pomocą testu tetramerowego peptyd-major histocompatibility complex (MHC)21, w którym kompleks tetramerowy peptyd-MHC, składający się z czterech znakowanych fluoroforem cząsteczek MHC klasy I załadowanych epitopami peptydowymi, jest używany do wiązania TCR i znakowania limfocytów T CD8+ w sposób specyficzny dla antygenu. Test tetrameru peptyd-MHC można przeprowadzić albo w końcowych badaniach sekcji zwłok w celu identyfikacji limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu w tkankach limfoidalnych i obwodowych, albo w badaniach podłużnych z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) uzyskanymi z seryjnych pobrań krwi. Po barwieniu limfocytów tetramerem peptyd-MHC przeprowadza się analizę cytometrii przepływowej w celu szczegółowych analiz fenotypu CTL lub ilościowego określenia ich częstości wśród limfocytów T CD8+.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>1. Synteza i charakterystyka ICMV współobciążonych antygenem białkowym i cząsteczkami adiuwantowymi</td></tr><tr><td>1,2-dioleoiloilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidofenylo)butyramid] (sól sodowa) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Monofosforylowy lipid A (syntetyczny) (PHAD&trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>20 ml szklane fiolki</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny Piekarnik próżniowy</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Albumina jaja kurzego (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris Propan (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonikator (125&nbsp; W/20&nbsp; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Tiolowany glikol polietylenowy (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Kuwety</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Badanie drenażu węzłów chłonnych znakowanych fluorescencyjnie ICMV za pomocą mikroskopii konfokalnej</td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonian Salt (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidylowy ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do zamrażania Tissue-Tek OCT&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Krioformy tkankowe</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Monitorowanie ekspansji specyficznych dla antygenu, eksprymujących lucyferazy limfocytów T CD8 + po szczepieniu nanocząsteczkami za pomocą obrazowania całego zwierzęcia</td></tr><tr><td>C57BL / 6 myszy</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albinos C57BL / 6 myszy</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 myszy</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m nylonowe sitko</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Zestaw do izolacji limfocytów T myszy CD8 +</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; system obrazowania całych zwierząt</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Barwienie tetramerem peptydowo-MHC jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) do analizy cytometrycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu </td></tr><tr><td>K2EDTA Probówki</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>bufor do lizy ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blok anty-CD16/32 Fc</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetramer</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&,6- Dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy CyAn Oprogramowanie</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów t cd8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Tradycyjne adiuwanty szczepionkowe, takie jak ałun, wywołują nieoptymalne odpowiedzi limfocytów T CD8+. Aby sprostać temu głównemu wyzwaniu w opracowywaniu szczepionek, zaprojektowano różne systemy nanocząstek, które naśladują cechy patogenów w celu poprawy dostarczania antygenu do drenujących węzłów chłonnych i zwiększenia wychwytu antygenu przez komórki prezentujące antygen, co doprowadziło do powstania nowych preparatów szczepionek zoptymalizowanych pod kątem indukcji odpowiedzi limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu. W tym artykule opisujemy syntezę systemu nanocząstek "naśladującego patogeny", określanego jako usieciowane pęcherzyki wielopłytkowe (ICMV) usieciowane międzywarstwowo, które mogą służyć jako skuteczny nośnik szczepionki do jednoczesnego dostarczania antygenów podjednostkowych i środków immunostymulujących oraz wywoływania silnych odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T CD8 + (CTL). Opisujemy metody charakteryzowania wielkości hydrodynamicznej i ładunku powierzchniowego nanocząstek szczepionki za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i analizatora potencjału zeta oraz przedstawiamy procedurę opartą na mikroskopii konfokalnej do analizy dostarczania antygenu za pośrednictwem nanocząstek do drenujących węzłów chłonnych. Ponadto pokazujemy nową technikę obrazowania bioluminescencji całych zwierząt, wykorzystującą adoptywny transfer limfocytów T CD8 + CD8 + z ekspresją lucyerazy, specyficznych dla antygenu do myszy biorców, a następnie szczepienie nanocząsteczkami, co pozwala na nieinwazyjne badanie wzorców ekspansji i transportu CTL w czasie rzeczywistym. Opisujemy również barwienie tetramerowe i analizę cytometryczną przepływową komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu podłużnego oznaczania ilościowego endogennych odpowiedzi limfocytów T u myszy zaszczepionych nanocząstkami.

Etapy syntezy ICMV przedstawiono na Rysunku 16. W skrócie, film lipidowy zawierający leki lipofilowe lub barwniki fluorescencyjne jest hydratowany w obecności leków hydrofilowych>. Kationy dwuwartościowe, takie jak Ca2+, są dodawane w celu zainicjowania fuzji liposomów anionowych w pęcherzyki wielowarstwowe. Ditiolowy czynnik sieciujący, taki jak DTT, jest dodawany w celu „zszycia” lipidów funkcjonalizowanych maleimidem na przeciwległych warstwach lipidowych, a na koniec pozostałe z...

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest synteza i charakterystyka nanopartykuł szczepionkowych opartych na lipidach oraz ocena ich zdolności do wywoływania ekspansji swoistych dla antygenu cytotoksycznych limfocytów T in vivo. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie imitujących patogeny, sieciowanych wielowarstwowych pęcherzyków z przeplatającymi się warstwami, czyli I CMVs, współładowanych antygenem i adiuwantem do szczepienia naiwnych myszy. Następnie przeprowadzono adoptywny transfer antygenowo swoistych limfocytów T CD8+ wykazujących ekspresję lucyferazy.W drugim kroku ekspansję swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ ocenia się za pomocą obrazowania in vivo całego organizmu zwierzęcia. Komórki mononuklearne krwi obwodowej pobrane od zwierząt uodpornionych na ICMV barwi się następnie tetramerami znakowanymi fluorescencyjnie i analizuje metodą cytometrii przepływowej, aby określić częstotliwość występowania endogennych swoistych dla antygenu limfocytów T CD8+ w układzie systemowym. Ostatecznie obrazowanie bioluminescencyjne może zostać wykorzystane do śledzenia ekspansji swoistych dla antygenu cytotoksycznych limfocytów T w odpowiedzi na szczepienie nanocząsteczkami.Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe wstępne pytania dotyczące projektowania szczepionek, takie jak: jaki jest zakres ekspansji cytotoksycznych limfocytów T i w jaki sposób komórki te migrują do różnych tkanek w odpowiedzi na szczepienie nanocząsteczkami? Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza komórek T in situ po nekropsji tkanek, jest fakt, że obrazowanie odpowiedzi komórek TT in vivo jest nieinwazyjne. Pozwala to na monitorowanie podłużne tego samego zwierzęcia. Rozpocznij od zmieszania DOPC i MPB w chloroformie w stosunku molowym jeden do jednego, zachowując całkowitą ilość lipidów wynoszącą 1,26 micromoles na partię w szklanej fiolce o pojemności 20 milliliter.Następnie do roztworu lipidów dodaje się ładunek lipofilowy w pożądanym stężeniu i przepłukuje roztwór nadmiarowo suchym azotem, aby całkowicie usunąć rozpuszczalnik organiczny. Próbkę pozostawia się w próżni na noc; następnego ranka dodaje się 200 µL 10 mM BTP zawierającego interesujący ładunek rozpuszczalny w wodzie w celu hydratacji filmu lipidowego, a otrzymany roztwór miesza się w wstrząsarku wierzchowej (vortex) przez 10 sekund co 10 minut przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zawartość przenosi się do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.Następnie umieść probówkę w kąpieli wodnej z lodem, poddając ją ciągłej sonikacji przy ustawieniu intensywności 40% za pomocą sondy ultradźwiękowej o mocy 125 watt i częstotliwości 20 kilohertz. Po pięciu minutach dodaj do probówki cztery µL 150 mM DTT, wymieszaj na wortexie i odwirowuj próbkę w mikro wirówce. Następnie dodaj do próbki 40 µL 200 mM chlorku wapnia, a następnie przeprowadź sieciowanie warstw lipidowych zawierających MPB z DTT w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Po zakończeniu inkubacji odwiruj roztwór trzy razy, dodając 200 µl wody podwójnie destylowanej podczas drugiej i trzeciej centrifugacji, aby usunąć z naddatku pozostały chlorek wapnia, niezareagowany DTT oraz nieenkapsulowane materiały ładunku. Po ostatnim wirowaniu zawieszamy I CMV w 100 µl świeżo przygotowanego pegolu przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie pęcherzyki przemywamy jeszcze dwa razy wodą podwójnie destylowaną.Resuspenduj końcowy osad w PBS i przechowuj ICM VS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby scharakteryzować cząsteczki, wymieszaj zimną zawiesinę ICMV przed rozcieńczeniem niewielkiej porcji próbki do całkowitej objętości jednego mililitra dwukrotnie destylowanej wody. Następnie umieść ICMV w komórce zeta sizer i użyj systemu pomiarowego dynamicznego rozpraszania światła oraz potencjału zeta, aby zmierzyć indeks polidyspersyjności wielkości cząstek i potencjał zeta próbek zgodnie z instrukcjami producenta.W celu izolacji komórek T CD8+ wykazujących ekspresję lucyferazy specyficznej dla OVA, najpierw pobierz śledziony od myszy transgenicznych OT-I lucyferazy. Umieść tkanki w 5 ml lodowatego PBS z 2% FBS, a następnie przenieś je do komory z laminarnym przepływem powietrza.Za pomocą tłoka z strzykawki 3 ml rozetrzyj do trzech śledzion jednocześnie przez sitko 70 µm do probówki stożkowej 15 ml. Przepłucz tłok oraz sitko roztworem PBS i 2% FBS. Następnie uzupełnij całkowitą objętość zawiesiny komórkowej do 10 ml na jedną śledzionę.Wyznaczyć całkowitą liczbę komórek, a następnie poddać je wirowaniu. Następnie, zgodnie z instrukcją producenta, użyć dostępnego komercyjnie zestawu do magnetycznej selekcji negatywnej w celu wyizolowania komórek śledziony CD8+. Następnie przemyć limfocyty T w PBS.Policz komórki i inkubuj od 2 do 3 × 10⁵ komórek w 20 µL blokującego przeciwciała przeciwko mysiemu CD 1632. Po 10 minutach dodaj do komórek 20 µL przeciwciała anty-CD8 APC na 30 minut, a następnie za pomocą cytometrii przepływowej oceń czystość populacji komórek T CD8+ wyizolowanych za pomocą kulek magnetycznych. Następnie przeprowadź transfer adopcyjny od 1 do 10 × 10⁵ komórek T CD8+ OT1 z lucyferazą do naiwnych, ogolonych myszy albinosów C57BL/6 w 200 µL PBS poprzez wstrzyknięcie dożylne do żyły ogonowej. 24 godziny później, w odpowiednim dniu po szczepieniu, podaj szczepionkę.Po 10 minutach wstrzyknij zwierzętom Lucifer w dawce 150 mg/kg, a następnie przez okres od 5 do 10 minut rejestruj sygnał bioluminescencji za pomocą systemu obrazowania całego organizmu, aby zwizualizować komórki T CD8+ OT-1 Lucifer i określić liczbę antygenowo swoistych komórek T CD8+ w odpowiednim czasie. Po szczepieniu pobierz około 100 µl krwi od zaszczepionych myszy metodą pobierania podżuchwowego do probówki powlekanej EDTA potasem, a następnie kilkakrotnie odwróć probówkę, aby zapobiec krzepnięciu. Następnie przenieś 100 µl krwi do probówki do mikrowirówki i dodaj 1 ml buforu lizującego CK.Po dwóch do trzech minutach odwiruj komórki i usuń supernatant. Przemyj pozostałe pbmc w 1 ml buforu fax i zablokuj nieswoiste wiązanie za pomocą CD 1632, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Po 10 minutach podziel zawiesinę komórkową do probówek fax o okrągłym dnie o pojemności 4 ml i dodaj do każdej próbki 20 µL roztworu H two KB over tetramer syn fecal PE, zgodnie ze specyfikacją producenta.Po 30 minutach w lodzie dodać 20 µL odpowiedniego koktajlu przeciwciał do każdej próbki doświadczalnej oraz pojedyncze przeciwciała kontrolne fluoro-four do każdej próbki kontrolnej dla każdego tetrameru lub przeciwciała z tagiem fluoro-four. Na koniec, po kolejnej 20-minutowej inkubacji, przemyć wszystkie próbki w buforze fax, zawiesić osady w buforze fax uzupełnionym o DPI i przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej. CMV współładowane z białkowymi antygenami tagowanymi fluoro-four oraz fluorescencyjnymi barwnikami lipofilowymi umożliwiają wizualizację dostarczania antygenu i nanocząstek in vivo. Na przykład obrazy z mikroskopii konfokalnej wskazują, że rozpuszczalny antygen podany podskórnie u podstawy ogona dociera do drenujących węzłów chłonnych w ciągu czterech godzin od podania i zostaje usunięty w ciągu 24 godzin.W przeciwieństwie do nich, przeładowane I CMV są po raz pierwszy wykrywane na obwodzie drenujących węzłów chłonnych w ciągu 24 godzin po podaniu, przy czym ich ciągłe gromadzenie prowadzi do powstania dużego depozytu ova I CMV w obrębie tkanki chłonnej drenującej. W czwartym dniu obrazowanie bioluminescencyjne myszy C 57 BL six, którym w dniu szczepienia adoptywnie przeniesiono limfocyty T CD8+ OT one Luciferase, wykazuje minimalny poziom tła dla OT one luciferase tcell w czwartym dniu po szczepieniu. Jednakże myszy uodpornione za pomocą ova MPI CMV wykazują silny sygnał bioluminescencyjny w obrębie drenujących pachwinowych węzłów chłonnych.Myszy szczepione rozpuszczalnym OVA wykazują natomiast znacznie mniejszą ekspansję komórek T CD8+ specyficznych dla OT-I w węzłach chłonnych drenujących. Ponadto myszy immunizowane rozpuszczalnym OVA i MPLA, bez adoptywnego transferu antygenowo specyficznych komórek T, nie wykazują znaczącej ekspansji specyficznych dla OVA komórek T CD8+, co potwierdzono w drodze cotygodniowego monitorowania PBMC. Szczepionka ICMV wywołuje jednak znacznie silniejszą i endogenną odpowiedź komórek T CD8+, osiągając szczyt 28% tetramer-dodatnich komórek T w populacji komórek T CD8+ wśród PBMC do 41. dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak syntetyzować nanocząsteczki lipidowe, przeprowadzać immunizacje oraz wizualizować i kwantyfikować ekspansję CTL in vivo.Metody te można dodatkowo modyfikować, aby uzyskać więcej informacji na temat odpowiedzi CTL. Na przykład test barwienia teer można uzupełnić o dodatkowe markery, takie jak CD 1 27, BCL two oraz K lrg one, w celu oceny fenotypu pamięci komórek.

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie całego organizmu i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi komórek T CD8+ specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje test do analizy specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ na różnych etapach cyklu komórkowego. Znakowane fluorescencyjnie żywe komórki są wybierane za pomocą cytometrii przepływowej, a komórki na różnych etapach cyklu komórkowego są identyfikowane na podstawie zawartości DNA przy użyciu przeciwciał przeciwko białku jądrowemu związanemu z proliferacją komórek i barwienia kwasem nukleinowym.

Test do analizy cyklu komórkowego limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Ekspansja klonalna jest kluczową cechą odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu. Jednak cykl komórkowy limfocytów T reagujących na antygen został słabo zbadany, częściowo z powodu ograniczeń technicznych. Opisujemy metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy.

Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy

Protokół przedstawia szczegółowe metody oceny, czy adiuwant nanoemulsji ofiopogoniny D wspomaga skuteczne komórkowe odpowiedzi immunologiczne.

In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D

Poznaj metody obrazowania całych zwierząt i cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8+ po szczepieniu nanocząstkami lipidowymi u myszy. Techniki te umożliwiają nieinwazyjne monitorowanie ekspansji komórek T in vivo.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Przeglądaj więcej filmów