Name: Zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną technikę wzbogacania do izolacji bakteriofagów Arthrobacter z próbek gleby. Ta metoda umożliwia szybkie i powtarzalne uzyskiwanie czystych izolatów fagów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze na rozwój tego protokołu zostały zapewnione przez Konsorcjum Południowo-Wschodniej Pensylwanii dla Szkolnictwa Wyższego oraz Departament Nauki Cabrini College. Dodatkowe fundusze i wsparcie pochodziły z Uniwersytetu Arcadia i Uniwersytetu Immaculata. Szczególnie dziękujemy dr Karen Snetselaar z Uniwersytetu św. Józefa za uprzejme wykonanie zdjęć mikroskopowych naszych izolowanych fagów. Dodatkowego wsparcia udzielił program Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science (SEA-PHAGES).

1. Przygotowanie komórek Arthobacter do izolacji fagów
<ul>
	<li>Kultura Arthrobactersp. Kolonie KY3901 prążkowane na płytce agarowej Luria Bertaini (LB) inkubowane w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni. Wybrać kolonię i za pomocą sterylnej pętli dodać ją do 250 ml bulionu LB w przegrodzie kolby hodowlanej i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem przy 225 obr./min w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Odczekaj około 24 godzin wzrostu, aby uzyskać późne komórki fazy wykładniczej/wczesnej stacjonarnej do eksperymentów z infekcją fagową. Uważnie monitoruj stan wzrostu bakterii, aby zapobiec przechodzeniu komórek w środkowy lub późny stacjonarny stan wzrostu. 
	UWAGA: Wzrost komórek powinien składać się z gęstości optycznej OD600 między 0,5-0,7 dla procedur/etapów izolacji i oczyszczania fagów opisanych poniżej.</li>
</ul>
2. Pobieranie fagów z próbek gleby
<ol>
	<li>Zbierz 200-400 g gleby z wybranego miejsca. Uwaga: Ponieważ bakterie z rodzaju Arthrobacter są powszechnymi bakteriami glebowymi, one i fagi, które je infekują, można znaleźć i są wszechobecne w większości rodzajów gleby.</li>
	<li>Dodać co najmniej 400 ml buforu fagowego (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO,4,10 mM Tris-CL (pH 7,5)] do gleby i wymieszać w wystarczająco dużej kolbie, aby co najmniej 200 ml PB znajdowało się w supernatancie i było możliwe do ekstrakcji.</li>
	<li>Mieszaj, delikatnie mieszając lub mieszając, aż gleba zostanie zawieszona i pozwól osadowi glebowemu osiąść, zwykle 30 minut.</li>
	<li>Przepuść "ekstrakt glebowy" przez bibułę filtracyjną przez filtrację grawitacyjną w celu usunięcia resztek osadu glebowego.</li>
	<li>Dodaj proszek LB i wymieszaj, aby uzyskać 2% roztwór (4 g proszku LB w 200 ml ekstraktu glebowego).</li>
	<li>Przepuścić roztwór przez filtr 0,22 μm przez filtrację próżniową w celu uzyskania sterylnego filtratu. Jeśli to możliwe, natychmiast przejdź do kroku 2.7. W razie potrzeby przefiltrowane próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia przed kontynuacją, jednak liczba żywotnych cząstek fagów zostanie zmniejszona.</li>
	<li>Porcję wielokrotnych 50 ml wysterylizowanej przez filtr mieszaniny LB/ekstraktu glebowego rozmieścić w osobnych 250 ml wysterylizowanych, wytrząsanych, przegrodowanych kolbach hodowlanych z zachowaniem technik aseptycznych. Dodać sterylny roztwór 2,0 M CaCl2 do końcowych pożądanych stężeń (0-50 mM), ponieważ różne fagi Arthrobacter rosną optymalnie w różnych warunkach CaCl2. 
	UWAGA: Stwierdzamy, że większość zidentyfikowanych przez nas fagów Arthrobacter mieści się w zakresie 1 mM-2,5 mM CaCl2. Jednak kilka z wyizolowanych fagów wyhodowano przez nas wyłącznie przy 0 mM CaCl2 lub przy bardzo wysokich stężeniach CaCl2. Przejdź natychmiast do kroku 3.1.</li>
</ol>
3. Izolacja fagów
<ol>
	<li>Dodać od 1 do 2,5 ml kultury bakterii w późnej fazie wykładniczej/wczesnej fazy stacjonarnej do każdej z kolb. W przypadku OD600 od 0,5-0,7 użyj 1 ml komórek. W przypadku OD600 wyższego niż OD 0,7 użyj 2,5 ml komórek. 
	UWAGA: Komórki we wzroście fazy wykładniczej zazwyczaj dają więcej fagów i wyższe miana niż komórki we wzroście w fazie stacjonarnej.</li>
	<li>Wytrząsać kolby z prędkością 250 obr./min w temperaturze 30 °C przez około 24 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
	<li>Po 24-godzinnym okresie inkubacji wyjąć kolby wzbogacające z inkubatora do wytrząsania i rozcieńczyć próbki wzbogacające dziesięciokrotnie w buforze fagowym.</li>
	<li>Ustawić probówki hodowlane z 0,5 ml kultury bakterii w późnej/wczesnej fazie stacjonarnej i dodać różne ilości kultury wzbogacającej (5 μl do 500 μl rozcieńczenia 10-1 w PB) do probówek. 
	UWAGA: Zaleca się badanie szerokiego zakresu stężeń, ponieważ każda próbka gleby generuje różne miana fagów po wzbogaceniu.</li>
	<li>Dodać CaCl2 do probówek hodowlanych, aby uzyskać końcowe stężenie równe stężeniu obecnemu w oryginalnej kolbie wzbogacającej. Użyj zakresu różnych stężeń CaCl2, aby wybrać wiele fagów o różnych zależnościach CaCl2. 
	UWAGA: Większość fagów zostanie wyizolowana w zakresie CaCl2 1-2,5 mM, ale istnieją fagi izolowane najbardziej optymalnie w dowolnym miejscu od stężeń 0-50 mM CaCl2. Z tego powodu najlepiej jest sprawdzić zakres stężeń CaCl2, aby zmaksymalizować liczbę unikalnych izolowanych fagów Arthrobacter.</li>
	<li>Wymieszaj 4,5 ml górnego agaru LB w probówce hodowlanej i wylej mieszaninę na płytkę agarową LB. Delikatnie zamieszać, aby równomiernie rozprowadzić na płytce i pozostawić górny agar do zestalenia się przez około 15 minut. 
	UWAGA: Agar górny można przygotować w większych partiach (250 ml), a dodatkowy agar górny może być przechowywany w temperaturze pokojowej i ponownie wykorzystany do kolejnych eksperymentów przez co najmniej dwa tygodnie. Chociaż istnieją różne formuły stosowane do produkcji agaru górnego, agar górny wytwarzamy przy użyciu 7 g / l agaru zmieszanego z LB. Umieść górny agar w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C, aby zachować stan ciekły w trakcie eksperymentu.</li>
	<li>Odwrócić płytkę i inkubować w żądanej temperaturze (temperatura do 30 °C) O/N do 48 godzin. Zmieniaj te warunki, aby zoptymalizować pod kątem obecnych fagów. Większość izolowanych fagów pochodzi z płytek inkubowanych w temperaturze 30 °C przy stężeniu 1-2,5 mM CaCl2 po 24-godzinnym okresie inkubacji.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie fagów
<ol>
	<li>Po 24 godzinnej inkubacji sprawdź, czy na płytkach nie tworzy się płytka nazębna. Kontynuuj inkubację do 72 godzin, jeśli nie są widoczne żadne blaszki lub w celu ustalenia, czy pojawią się dodatkowe blaszki. W razie potrzeby należy przechowywać płytki z domniemanymi blaszkami przez okres do tygodnia w temperaturze 4 °C przed kontynuacją. 
	UWAGA: Nierzadko zdarza się, że na jednej płytce znajduje się wiele różnych morfologii płytki. Znalezienie blaszek miażdżycowych po 3 dniach inkubacji jest możliwe, ale rzadkie.</li>
	<li>Oczyść pożądane fagi z wyraźnie izolowanych blaszek za pomocą metody płytki smugowej. Dotknij płytki sterylnym drewnianym patyczkiem. Smugi na blaszce nazębnej, przesuwając drewniany patyczek przez płomień, pozwalając patyczkowi na chwilę ostygnąć, a następnie pocierając patyczek o płytkę agarową delikatnym ruchem, jak pokazano na rysunku 1. Powtórz to za pomocą czystego patyczka przy każdym przejściu.</li>
	<li>Alternatywnie można użyć tradycyjnego testu miana płytki do wyizolowania pojedynczych blaszek fagowych. Test miana płytki miażdżycowej wymaga użycia większej liczby odczynników, takich jak agar LB i agar górny LB oraz materiałów, takich jak płytki Petriego do izolacji płytki fagowej. Odnieśliśmy duży sukces stosując metodę płytki smugowej, ale technicznie łatwiej jest wyizolować pojedyncze blaszki za pomocą testu miana płytki.</li>
	<li>Gdy płytka agarowa LB zostanie pokryta co najmniej trzykrotnymi smugami, zaznacz obszar o najniższym stężeniu przypuszczalnych cząstek fagów i DELIKATNIE nałóż 0,5 ml Arthrobacter i 4,5 ml stopionego górnego agaru LB (zawierającego takie samo stężenie chlorku wapnia jak płytka macierzysta) i pozwól mu równomiernie rozprowadzić się po płytce.</li>
	<li>Odwrócić i inkubować płytkę O/N. Powtórzyć technikę płytki smugowej przez co najmniej trzy iteracje, aby upewnić się, że wyizolowany jest czysty gatunek faga. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, w razie potrzeby między smugami, bez znaczącej utraty żywotności fagów.</li>
	<li>Po wyhodowaniu i wyizolowaniu pożądanych blaszek na ostatniej płytce smugowej, dotknij jednej dobrze odizolowanej płytki nazębnej końcówką do mikropipet i ponownie zawieś w 100 μl PB. Roztwór 10:0 rozcieńczyć seryjnie do rozcieńczenia 10-8, przepuszczając 20 μl próbki do 180 μl świeżego PB.</li>
	<li>Dodać 10 μl każdego rozcieńczenia do 0,5 ml wyhodowanego Arthrobacter w probówce hodowlanej przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej i płytkę, mieszając zakażone bakterie z 4,5 ml stopionego górnego agaru LB zawierającego takie samo stężenie CaCl2, jak użyto do wyizolowania faga z pierwotnej próbki gleby. Wszystkie rozcieńczenia sporządzone w temperaturze 4 °C należy zachować do następnego dnia.</li>
	<li>Określ seryjne rozcieńczenie faga potrzebne do wytworzenia wzoru wstęgi za pomocą tradycyjnego testu miana płytki. Celem testu miana płytki miażdżycowej jest określenie miana faga potrzebnego do uzyskania płytki z wzorem wstęgi. Zidentyfikuj płytkę z wzorem wstęgi jako w większości pozbawioną bakterii, ale zawierającą pozostałości bakterii, które nie zostały jeszcze zlizowane przez fagi. Dodać 5 ml późno wykładniczej/wczesnej stacjonarnej kultury Arthrobacter do sterylnej kolby hodowlanej o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl rozcieńczenia (które nadało wzór wstęgi kulturze Arthrobacter) do kolby hodowlanej i pozwolić fagom zainfekować komórki bakteryjne przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać ze stopionym agarem górnym LB zawierającym takie samo stężenie CaCl2, jak użyte do wstępnej identyfikacji faga, i rozlać 5 ml tej mieszaniny na 10 świeżych płytek LB. Pozostawić do zestalenia i inkubacji odwróconych płytek w temperaturze 30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia należy zalać płytki wzoru wstęgi 5 ml PB i przechowywać O/N w temperaturze 4 °C lub 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przefiltrować lizat fagowy przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten końcowy zapas fagów należy wykorzystać do dodatkowych eksperymentów, takich jak obrazy cząstek fagów za pomocą mikroskopii elektronowej, izolacja genomowego DNA fagowego do analizy enzymów restrykcyjnych DNA oraz sekwencjonowanie genomu przy użyciu standardowych procedur. W celu długotrwałego przechowywania materiału fagowego należy dodać równą ilość lizatu fagowego do sterylnego glicerolu w małych fiolkach w celu archiwizacji zapasów w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Dla tych, którzy nie mają doświadczenia z tymi technikami fagowymi, doskonałym źródłem informacji jest dostępna online strona internetowa www.phagesdb.org.</li>
</ol>

<ol><li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Catabolic+Pathways%3A+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li>
<li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li>
<li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Hlth%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li>
<li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li>
<li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li>
<li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+%E2%80%9CArthrobacter+aureus%E2%80%9D+C70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li>
<li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li>
<li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li>
<li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li>
<li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li>
<li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li>
<li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li>
<li>MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Pomimo wielu wcześniejszych prób wyizolowania fagów zdolnych do infekowania gospodarzy Arthrobacter , odnieśliśmy niewielki sukces przy użyciu standardowych procedur wzbogacania. Uogólniona metoda wzbogacania bakterii opracowana i zaadaptowana przez van Twesta iKropińskiego10 w celu wzbogacenia fagów z próbek środowiskowych pozostaje podstawą większości procedur wzbogacania. Dowody z poprzednich badań sugerują, że metody bezpośredniego posiewu doprowadziły do powstania wykrywalnych blaszek na szczepac...

Wszechobecność gatunków Arthrobacter w środowisku glebowym oferuje ogromną liczbę i różnorodność fagów, które mogą być izolowane z tego gatunku bakterii gospodarza. Bakterie z rodziny Acintobacteriaceae są najbardziej znane ze swoich katabolicznych szlaków rozkładu opornych związków, takich jak atrazyna i różne inne pestycydy i herbicydy1,2,3. Chociaż większość badań przeprowadzono przy użyciu środowiskowych szczepów Arthrobacter, kliniczne izolaty tego rodzaju znajdują się we krwi, moczu, oczach i wielu innych źródłach ludzkich, z których wszystkie wykazują filogenetyczną heterogeniczność4.
Chociaż istnieje dość obszerny zbiór badań nad bakteriami Arthrobacter, tylko kilka badań donosi o fagach zdolnych do infekowania członków tego różnorodnego rodzaju. Co ciekawe, wcześniejsze prace nad fagami Arthrobacter dotykają kilku kluczowych, odrębnych tematów, takich jak typowanie gatunków Arthrobacter w glebie5, zastosowania przemysłowe mające na celu zmniejszenie szkodliwej piany w oczyszczalniach osadu czynnego 6 oraz prace skupiające się na genach rekombinacji i integracjispecyficznych dla danego miejsca 7.
Różne protokoły techniki wzbogacania zostały wykorzystane do generowania czystych izolatów fagów u gatunków Arthrobacter. Wczesne procedury obejmują inkubację gleby z dodatkiem czynników toksycznych, takich jak sole nikotyny, przez okres ponad jednego roku8 powodując powstawanie fagów zdolnych do infekowania tylko A. globiformis. Badania przeprowadzone przy użyciu gleby przesiąkniętej labilnymi substancjami organicznymi wydawały się wytwarzać wykrywalne fagi za pomocą technik oznaczania płytki nazębnej, z pominięciem długich okresów inkubacji8. Co ciekawe, w przeszłości stosowano technikę przypominającą bezpośrednie posiew, która doprowadziła do powstania kilku fagów, a jednocześnie miała wyjątkowo niski wskaźnik sukcesu przez badaczy5, powołując się na wcześniejsze badania o niskich wskaźnikach sukcesu8.
Ogólnie rzecz biorąc, techniki izolacji stosowane w przeszłości były godne uwagi ze względu na niewielką skuteczność w praktyce, mimo że rodzaj Arthrobacter reprezentuje najpowszechniejszy tlenowy izolat gleby w przyrodzie4,9,,Van Twest i Kropinski10 prezentują metody wzbogacania do izolowania fagów z wody i gleby dostosowane do wcześniejszych technik stosowanych do wzbogacania środowiskowych izolatów bakteryjnych, ale te techniki wzbogacania okazały się nieskuteczne w izolowaniu Fagi Arthrobacter. Celem opisanej tutaj metody jest pokazanie "dowodu słuszności koncepcji", że metody wczesnego wzbogacania mogą być dostosowane do konsekwentnego i skutecznego izolowania fagów Arthrobacter, pokonując wcześniejsze wyzwania techniczne związane z izolacją fagów z tego rodzaju bakterii.

<table><tbody><tr><td>Bulion LB w proszku</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>Najlepiej zamawiać je hurtowo.</td></tr><tr><td>Agar granulowany</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Najlepiej zamawiać je hurtowo.</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe 0,22 um</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0,22 um filtry buchnera</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>Ponad 50 ml płynu można uzyskać, ostrożnie wymieniając rurkę odbiorczą.</td></tr><tr><td>Eppendorf Probówki</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 5 ml indywidualne</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml rurki stożkowe</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipety indywidualne</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>Pifle 25 ml indywidualne</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna jakościowa Whatman</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów arthrobacter z izolatów próbek gleby

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Izolacja bakteriofagów z próbek środowiskowych jest przeprowadzana od dziesięcioleci przy użyciu zasad określonych przez pionierów mikrobiologii. Izolacja fagów infekujących gospodarzy Arthrobacter była ograniczona, być może ze względu na niski wskaźnik sukcesu wielu wcześniejszych technik izolacji, co spowodowało, że grupa fagów Arthrobacter jest niedostatecznie reprezentowana do badań. Opisana tutaj technika wzbogacania, w przeciwieństwie do wielu innych, wykorzystuje przefiltrowany ekstrakt wolny od bakterii zanieczyszczających jako bazę do wzrostu bakterii wskaźnikowych, Arthrobactersp. W szczególności KY3901. Usuwając najpierw bakterie glebowe, docelowe fagi nie są hamowane przez konkurencję z rodzimymi bakteriami glebowymi obecnymi w początkowych próbkach gleby. Ta metoda wzbogacania zaowocowała dziesiątkami unikalnych fagów z kilku różnych typów gleby, a nawet wyprodukowano różne typy fagów z tego samego wzbogaconego izolatu próbki gleby. Zastosowanie tej procedury można rozszerzyć na większość bogatych w składniki odżywcze pożywek tlenowych w celu izolacji fagów w ogromnej różnorodności interesujących bakterii gospodarza.

Aby wykazać powtarzalność ulepszonej techniki namnażania fagów Arthrobacter, wykorzystano 30 różnych próbek gleby pobranych w różnym czasie i miejscach podczas wiosny i lata 2014 roku. Z tych 30 próbek gleby, stosując tę procedurę namnażania, uzyskano unikalne fagi Arthrobacter z 22 zebranych próbek. Standardowa procedura namnażania pozwoliła na uzyskanie unikalnych fagów z 3 z tych samych próbek gleby. Próbki po namnażaniu mogą charakteryzować się bardzo wysokim mianem fagów, co wymaga wstępnego rozcie...

Przedstawiamy protokół wzbogacania do izolacji bakteriofagów infekujących bakterie z rodzaju Arthrobacter. Ten protokół wzbogacania daje szybkie i powtarzalne wyniki izolacji i amplifikacji fagów Arthrobacter z izolatów glebowych.

Zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie fagów bakterii z rodzaju arthrobacter z próbek gleby przy użyciu protokołu wzbogacania. Jest to realizowane poprzez najpierw pobranie próbek gleby i wyizolowanie żywotnych cząstek fagowych od zanieczyszczających glebę mikroorganizmów. Drugim krokiem jest zakażenie komórek bakteryjnych gospodarza arthrobacter wyizolowanymi cząstkami fagowymi.Następnie zainfekowane komórki bakteryjne wysiewa się na płytki agarowe w celu identyfikacji fagów na podstawie tworzenia się placków lizowych. Ostatnim etapem jest oczyszczenie pożądanych fagów z wyraźnie wyizolowanych placków przy użyciu metody wysiewu kreskowego. Ostatecznie ta technika wzbogacania została zoptymalizowana pod kątem stosunkowo łatwej izolacji fagów arthrobacter z gatunku arthrobacter KY 3 9 0 1.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami wzbogacania jest dodanie drobno przefiltrowanej próbki gleby do czystej kultury bakterii gospodarza w celu uniknięcia wzrostu bakterii konkurujących. Chociaż metoda ta okazała się skuteczna w izolacji fagów arthrobacter, powinna ona znaleźć zastosowanie również w izolacji fagów z innych bakterii gospodarzy. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy dowiedzieliśmy się, że inni badacze mają trudności ze znalezieniem fagów arthrobacter.Z wykorzystaniem tradycyjnych technik wzbogacania. Moi studenci zademonstrują techniki stosowane do skutecznej izolacji fagów arthrobacter. Komórki Arthrobacter są hodowane z kolonii wysianych na płytkę z agarem LB i inkubowane w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni.Za pomocą sterylnej pętli nabiór kolonię i przenieś ją do 50 mililitrów bulionu LB. Inkubuj kolbę z przegrodami w inkubatorze wytrząsowym przy 225 RPM w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 24 godziny, aby uzyskać komórki w fazie wykładniczej lub wczesnej fazie stacjonarnej do eksperymentów z infekcją fagową.Należy uważnie monitorować stan wzrostu bakterii, aby zapobiec przejściu komórek w środkową lub późną fazę stacjonarną. Optymalna wartość OD 600 dla izolacji fagów mieści się w przedziale od 0,5 do 0,7. Ponieważ bakterie z rodzaju Arthrobacter są powszechnymi bakteriami glebowymi, one oraz infekujące je fagi mogą być znalezione w większości rodzajów gleby.Pobrać od 200 do 400 gramów gleby z wybranej lokalizacji. Do gleby w zlewce o odpowiedniej pojemności dodać co najmniej 400 mililitrów buforu fagowego, tak aby w nadsączu znajdowało się co najmniej 200 mililitrów buforu fagowego i można go było wyekstrahować. Mieszać poprzez delikatne mieszanie lub wirowanie, aż gleba zostanie zawieszona, a następnie pozostawić osad glebowy do opadnięcia, zazwyczaj na 30 minut. Następnie usunąć zanieczyszczenia z osadu glebowego, przepuszczając ekstrakt glebowy przez papier filtracyjny za pomocą filtracji próżniowej.Do 200 mililitrów przefiltrowanego ekstraktu z gleby dodać cztery gramy proszku LB i wymieszać, aby przygotować 2% roztwór. Przepuścić roztwór przez filtr 0,22 mikrona za pomocą filtracji próżniowej w celu otrzymania sterylnego filtratu. Jeśli to możliwe, niezwłocznie przejść do następnego kroku.Niemniej jednak, w razie potrzeby, przefiltrowane próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia przed kontynuacją procedury. Należy jednak pamiętać, że liczba żywotnych cząsteczek fagów ulegnie zmniejszeniu. Stosując techniki aseptyczne, odnieś wielokrotne porcje po 50 ml sterylizowanego filtrem ekstraktu z gleby w pożywce LB do poszczególnych sterylnych kolb z zapadkami o pojemności 250 ml. Dodaj sterylny 2,0 M roztwór chlorku wapnia do uzyskania końcowych pożądanych stężeń.Ponieważ różne fagi arthrobacter rosną optymalnie w różnych warunkach stężenia chlorku wapnia, należy rozpocząć tę procedurę od dodania od 1 do 2,5 ml kultury bakterii w późnej fazie wykładniczej lub wczesnej fazie stacjonarnej do każdej z kolb zawierających sterylizowaną filtracyjnie mieszaninę ekstraktu glebowego LB. Jeśli OD 600 kultury wynosi od 0,5 do 0,7, należy użyć 1 ml. Jeśli OD 600 jest wyższa niż 0,7, należy użyć 2,5 ml.Inkubować kolby w inkubatorze wytrząsowym przy 250 RPM w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 24 godziny. Po upływie 24-godzinnego okresu inkubacji wyjąć kolby z wzbogaceniem z inkubatora wytrząsowego. Próbki z wzbogaceniem rozcieńczyć dziesięciokrotnie w buforze fagowym.Przygotować probówki z 0,5 milliliters kultury bakterii w późnej fazie wykładniczej lub wczesnej fazie stacjonarnej. Do probówek dodać różne objętości rozcieńczonej kultury wzbogaconej, od 5 microliters do 500 microliters.Do probówek z kulturą należy dodać chlorek wapnia, aby uzyskać w pięciu mililitrach stężenie końcowe równe stężeniu w pierwotnej kolbie do namnażania. Należy zastosować zakres różnych stężeń chlorku wapnia, aby wyselekcjonować wiele fagów o zróżnicowanej zależności od chlorku wapnia. Do każdej probówki z kulturą dodaje się 4,5 mililitra górnej agaru LB, a następnie mieszaninę wylewa się na płytkę z agarem LB.Delikatnie zakręć płytką, aby równomiernie rozprowadzić agar, i pozostaw górną warstwę agaru do zastygnięcia przez około 15 minut. Odwróć płytki i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza od nocy do 48 godzin. Zróżnicuj czasy inkubacji w celu optymalizacji dla obecnych fagów; po 24 godzinach inkubacji sprawdź płytki pod kątem tworzenia się placków.Większość wyizolowanych fagów pochodzi z płytek inkubowanych w temperaturze 30 °C przy stężeniu chlorku wapnia od 1 do 2,5 mM po 24-godzinnym okresie inkubacji, przy czym najtrudniejszym etapem tej procedury jest oczyszczanie pożądanych fagów z wyraźnie odizolowanych przejaśnień za pomocą drewnianego patyczka. Wymagana jest wiedza techniczna, aby delikatnie rozprowadzić przejaśnienia na płytce, tworząc jednolity posiew kreskowy. Sterylizujemy drewniany patyczek, przepuszczając go przez płomień i pozostawiając do ostygnięcia.Krótko dotknij szalki sterylnym drewnianym patyczkiem, a następnie pocieraj patyczkiem po płytce z agarem LB delikatnymi ruchami, tak jak pokazano. Powtórz tę czynność, używając czystego patyczka do każdego przejścia. Po wykonaniu co najmniej trzech smug na płytce z agarem LB zaznacz obszar o najniższym stężeniu domniemanych cząsteczek fagów.Ostrożnie nanieś 0,5 milliliters arthrobacter i 4,5 milliliters roztopionej agary wierzchniej LB na zaznaczony obszar, pozwalając jej równomiernie rozprowadzić się po płytce. Pozostaw agar wierzchnią do zastygnięcia na co najmniej godzinę; gdy płytka stężeje, odwróć ją i inkubuj przez noc. Powtórz technikę pasowania w celu wyizolowania placków co najmniej trzykrotnie, aby zapewnić izolację czystego gatunku faga.W razie potrzeby, pomiędzy kolejnymi pasażami, płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia bez znaczącej utraty żywotności fagów. Po wyhodowaniu i wyizolowaniu pożądanych placków na końcowej płytce z pasażem, należy dotknąć jednego, dobrze odizolowanego placka końcówką mikropipety i zawiesić go w 100 µL buforu do fagów. Roztwór ten należy rozcieńczać seryjnie do stężenia 10⁻⁸, przenosząc 20 µL próbki do 180 µL świeżego buforu do fagów. Następnie należy dodać 10 µL każdego rozcieńczenia do 0,5 mL wyhodowanej kultury arthrobacter w probówce i inkubować przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie wykonaj wysiew, mieszając zainfekowane bakterie z 4,5 mililitrów płynnej agary wierzchniej LB zawierającej takie samo stężenie chlorku wapnia, jakie zastosowano do izolacji faga z pierwotnej próbki gleby. Inkubuj płytki przez noc. Wszystkie rozcieńczenia przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do następnego dnia.Wyznacz rozcieńczenie fagów zbóż niezbędne do uzyskania wzoru sieciowego w tradycyjnym teście miana płytek. Płytkę o wzorze sieciowym zdefiniuj jako taką, która jest w przeważającej mierze pozbawiona bakterii, lecz zawiera pozostałości bakterii, które nie zostały jeszcze zainfekowane przez fagi. Dodaj 5 ml kultury arthrobacter w późnej fazie wykładniczej lub wczesnej fazie stacjonarnej do sterylnej kolby hodowlanej o pojemności 50 ml.Do kultury arthrobacter dodać 100 µL rozcieńczenia, które utworzyło wzór sieciowy, i pozostawić fagi na 5 do 10 minut w celu zainfekowania komórek bakteryjnych. W temperaturze pokojowej do kolby dodać płynne podłoże LB top agar o tym samym stężeniu chlorku wapnia, którego użyto do wstępnej identyfikacji płytki z fagiem. Po 5 mL tej mieszaniny wylać na każdą z 10 świeżych płytek LB.Po zastygnięciu górnej warstwy agaru, odwróć płytki i inkubuj je w temperaturze 30 °C przez noc. Następnego dnia zalej płytki z wzorem sieci pięcioma mililitrami buforu fagowego na każdą płytkę i przechowuj przez noc w temperaturze 4 °C. Przefiltruj lizat fagowy przez filtr strzykawkowy o porach 0,22 µm. Przechowuj tak przygotowany końcowy zapas fagów w temperaturze 4 °C do długoterminowego przechowywania.Do małych probówek z jałowym glicerolem należy dodać równą ilość lizatu fagowego w celu archiwizacji zapasów w temperaturze -80°C. W procedurze wzbogacania zaprezentowanej w tym filmie, zastosowano metodę smugową do izolacji czystych populacji fagów po wstępnym wzbogaceniu i wysianiu na agar LB. Przedstawione wyniki są reprezentatywne dla izolacji plam fagowych dla faga DI w temperaturze pokojowej, 30°C oraz 37°C. Czerwone okręgi na dwóch płytkach otaczają wyraźnie odizolowane plamki. Fag Dylan tworzy podobne plamki w trzech różnych temperaturach.Alternatywnie, w celu wyizolowania czystego izolatu faga można zastosować tradycyjny standardowy test miana płytek. Test ten został tutaj wykorzystany do empirycznego określenia miana fagów oraz liczby jednostek tworzących plaque, które tworzą wzór sieciowy na płytce. Przedstawiono zestaw rozcieńczeń seryjnych dla faga banana wraz z przykładem tego, jak powinien wyglądać prawidłowy wzór sieciowy.Są to mikrografie elektronowe 20 fagów arthrobacter wyizolowanych za pomocą techniki wzbogacania. Z 25 obecnie wyizolowanych fagów 23 to wirusy typu sifo o dość długich ogonkach. Dwa z wyizolowanych fagów to wirusy typu myo, u których średnice główek są zbliżone do długości ich ogonków.Po opanowaniu techniki, posiewy wzbogacone powinny umożliwić pomyślną izolację fagów arthrobacter z różnych próbek gleby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, w jaki sposób oczyszczany jest fag przy użyciu metody posiewu kreskowego z próbki gleby środowiskowej.

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Zoptymalizowana Technika Obogacenia dla Izolacji Gatunków Bakteryofagu Arthrobacter z Izolatów Próbek Gleby

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Cross, T. i in., Zoptymalizowana technika wzbogacania dla izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby. J. Vis. Exp.(2015)Ten film pokazuje przygotowanie kultury bakteryjnej do produkcji bakteriofagów. Obejmuje etapy zaszczepienia bakterii glebowej w kolbie z przegrodami, promowanie równomiernego wzrostu poprzez napowietrzanie i potrząsanie oraz monitorowanie gęstości komórek za pomocą pomiarów gęstości optycznej. Gdy hodowla osiągnie optymalną fazę wzrostu, jest...

Przygotowanie kultury bakteryjnej glebowej pod kątem infekcji bakteriofagami

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample

Demonstrujemy metodę zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), które można zastosować do naturalnych wód.  MTB można wyizolować i wzbogacić z próbek osadu przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji, która wykorzystuje naturalny magnetyzm bakterii.  Wyizolowany MTB można następnie szczegółowo zbadać zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej.

Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Izolacja odpornych na metale ciężkie mikroorganizmów ze źródeł geotermalnych jest gorącym tematem dla rozwoju biosystemów bioremediacji i monitorowania środowiska. Badanie to zapewnia metodologiczne podejście do izolowania i identyfikacji bakterii tolerujących metale ciężkie z gorących źródeł.

Bioprospekcja mikroorganizmów ekstremofilnych w celu rozwiązania problemu zanieczyszczenia środowiska

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Poznaj zoptymalizowaną technikę wzbogacania do izolacji bakteriofagów Arthrobacter z próbek gleby. Ta metoda umożliwia szybkie i powtarzalne uzyskiwanie czystych izolatów fagów.

Zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby

Przeglądaj więcej filmów