Zoptymalizowana technika wzbogacania do izolacji gatunków bakteriofagów Arthrobacter z izolatów próbek gleby

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie faz bakterii Arthrobacter z próbek gleby przy użyciu protokołu wzbogacania. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie próbek gleby i wyizolowanie żywotnych cząstek fagów od zanieczyszczających mikroorganizmów glebowych. Drugim krokiem jest zakażenie komórek bakteryjnych arthrobacter gospodarza izolowanymi cząstkami faga.

Następnie zakażone komórki bakteryjne są umieszczane na płytkach ślimakowych w celu zidentyfikowania faga, o czym świadczy tworzenie się płytki nazębnej. Ostatnim krokiem jest oczyszczenie pożądanych fagów z wyraźnie wyizolowanych blaszek za pomocą metody płytki smugowej. Ostatecznie ta technika wzbogacania jest zoptymalizowana pod kątem stosunkowo łatwej izolacji fagów Arthrobacter od gatunków Arthrobacter KY 3 9 0 1.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami wzbogacania jest dodanie drobno przefiltrowanej próbki gleby do czystej kultury bakterii gospodarza, aby uniknąć rozwoju konkurencyjnych bakterii. Chociaż udowodniono, że metoda ta jest skuteczna w izolacji fagów Arthrobacter, powinna mieć zastosowanie do izolacji fagów od innych gospodarzy bakterii. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy dowiedzieliśmy się, że inni badacze mają trudności ze znalezieniem fagów Arthrobacter.

Z tradycyjnymi technikami wzbogacania. Moi studenci będą demonstrować techniki stosowane do skutecznego izolowania fagów Arthrobacter. Komórki Arthrobacter są hodowane z kolonii ułożonych na płytce ślimakowej LB, inkubowane w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.

Użyj sterylnej pętli, aby wybrać kolonię i dodać ją do 50 mililitrów bulionu funtowego. W kulturze z przegrodą kolbę inkubować kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 24 godziny. Aby uzyskać komórki fazy wykładniczej lub wczesnej stacjonarnej do eksperymentów z infekcją fagową.

Uważnie monitoruj stan wzrostu bakterii, aby zapobiec przechodzeniu komórek w środkowy i późny wzrost stacjonarny. Stan. Idealny OD 600 do izolacji fagów wynosi od 0,5 do 0,7. Ponieważ bakterie z rodzaju Arthrobacter są powszechnymi bakteriami glebowymi, one i fagi, które je infekują, można znaleźć w większości rodzajów gleby.

Zbierz od 200 do 400 gramów gleby z wybranego miejsca. Dodaj co najmniej 400 mililitrów buforu fagowego do gleby w wystarczająco dużych zlewkach, tak aby co najmniej 200 mililitrów buforu fagowego znajdowało się w supernatancie i można je było wyekstrahować zmieszane przez delikatne mieszanie lub wirowanie, aż gleba zostanie zawieszona i pozwól osadowi glebowemu osiąść, zwykle przez 30 minut. Następnie usuń resztki osadu glebowego, przepuszczając ekstrakt glebowy przez bibułę filtracyjną za pomocą filtracji próżniowej.

Dodaj cztery gramy proszku LB do 200 mililitrów przefiltrowanego ekstraktu glebowego i wymieszaj, aby uzyskać 2% roztwór. Przepuścić roztwór przez filtr 0,22 mikrona przez filtrację próżniową, aby uzyskać sterylny filtrat. Jeśli to możliwe, natychmiast przejdź do następnego kroku.

Niemniej jednak, jeśli zajdzie taka potrzeba, przefiltrowane próbki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia przed kontynuowaniem. Jednak liczba żywotnych cząstek fagów zostanie zmniejszona przy użyciu technik septycznych, które dzielą wielokrotność 50-mililitrowych porcji wysterylizowanej mieszaniny ekstraktu glebowego LB na pojedyncze 250 mililitrów. Wysterylizowane, wstrząsane, przegrodowane kolby hodowlane dodać sterylny 2,0-molowy roztwór chlorku wapnia do końcowych pożądanych stężeń.

Ponieważ różne fagi Arthrobacter rosną optymalnie w różnych warunkach chlorku wapnia, rozpocznij tę procedurę od dodania od jednego do 2,5 mililitra kultury bakterii w późnej wykładniczej lub wczesnej fazie stacjonarnej do każdej z kolb zawierających wysterylizowaną z filtrem mieszaninę ekstraktu glebowego LB. Jeśli OD 600 kultury wynosi od 0,5 do 0,7, użyj jednego mililitra. Jeśli OD 600 jest wyższy niż 0.7, użyj 2.5 mililitra.

Wytrząsać kolby z prędkością 250 obr./min w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez około 24 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem. Po 24-godzinnym okresie inkubacji wyjąć kolby wzbogacające z inkubatora do wytrząsania. Rozcieńczyć próbki wzbogacające dziesięciokrotnie w buforze fagowym.

Ustaw probówki hodowlane z 0,5 mililitra późnego wykładniczego lub wczesnego stacjonarnego. Faza hodowli bakterii. Dodaj różne ilości od pięciu mikrolitrów do 500 mikrolitrów rozcieńczonej kultury wzbogacającej do probówek hodowlanych.

Dodać chlorek wapnia do probówek hodowlanych, aby uzyskać końcowe stężenie w pięciu mililitrach równe stężeniu obecnemu w oryginalnej kolbie wzbogacającej. Użyj szeregu różnych stężeń chlorku wapnia, aby wybrać wiele fagów o różnych zależnościach chlorku wapnia. Dodaj 4,5 mililitra górnego ślimaka LB do każdej rurki hodowlanej i wlej mieszaninę na płytkę ślimaka LB.

Delikatnie obracaj, aby równomiernie rozprowadzić na płycie i pozwól górnemu ślimakowi zestalić się przez około 15 minut. Odwróć płytki i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc do 48 godzin. Zmieniaj czas inkubacji, aby zoptymalizować pod kątem fagów obecnych po 24-godzinnej inkubacji, sprawdź, czy na płytkach nie tworzy się płytka nazębna.

Większość izolowanych fagów pochodzi z płytek inkubowanych w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy stężeniu chlorku wapnia od jednego do 2,5 milimola po 24-godzinnym okresie inkubacji, przy czym najtrudniejszą częścią tej procedury jest oczyszczanie pożądanych fagów z wyraźnie izolowanych blaszek za pomocą drewnianego patyczka. Wymagana jest wiedza techniczna, aby delikatnie rozprowadzić blaszki na płycie ślimaka, aby uzyskać jednolitą płytkę smugową. Wysterylizuj drewniany patyczek, przepuszczając go przez płomień i pozwalając mu ostygnąć.

Krótko dotknij płytki sterylnym drewnianym patyczkiem i pocieraj patyczek o płytkę ślimaka delikatnym ruchem, jak pokazano. Powtórz to za pomocą czystego patyczka przy każdym przejściu. Gdy płyta ślimaka LB zostanie pokryta smugami co najmniej trzy razy, zaznacz obszar o najniższym stężeniu przypuszczalnych cząstek fagowych.

Delikatnie nałóż 0,5 mililitra arthrobacter i 4,5 mililitra stopionego górnego ślimaka LB na zaznaczony obszar i pozwól mu równomiernie rozprowadzić się po płytce. Pozwól górnemu ślimakowi zestalać się przez co najmniej godzinę, gdy płytka zastygnie, odwróć i inkubuj ją przez noc. Powtórz technikę płytki smugowej przez co najmniej trzy iteracje, aby upewnić się, że wyizolowany jest czysty gatunek faga.

Płytki można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia, w zależności od potrzeb, między smugami bez znaczącej utraty żywotności fagów. Po wyhodowaniu i wyizolowaniu pożądanych blaszek na ostatniej płytce z smugami, dotknąć jednej dobrze odizolowanej płytki nazębnej końcówką mikropipety i ponownie zawiesić w 100 mikrolitrach buforu fagowego szeregowo Rozcieńczyć ten roztwór do rozcieńczenia od 10 do minus ósmego, przepuszczając 20 mikrolitrów próbki do 180 mikrolitrów świeżego buforu fagowego. Dodaj 10 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do 0,5 mililitra wyhodowanego Arthrobacter w probówce hodowlanej przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie płytkę przez zmieszanie zakażonych bakterii z 4,5 mililitrami stopionego górnego ślimaka LB zawierającego to samo stężenie chlorku wapnia, które jest używane do izolowania faga od oryginalnej próbki gleby. Inkubuj płytki przez noc. Zachowaj całe rozcieńczenie wykonane w temperaturze czterech stopni Celsjusza do następnego dnia.

Określ rozcieńczenie zboża fagowego potrzebne do wytworzenia wzoru wstęgi za pomocą tradycyjnego testu miana płytki. Zidentyfikuj płytkę wzoru wstęgi jako w większości pozbawioną bakterii, ale zawierającą pozostałości bakterii, które nie zostały jeszcze splecione z fagami. Dodać pięć mililitrów późnej wykładniczej lub wczesnej stacjonarnej kultury Arthrobacter do sterylnej kolby hodowlanej o pojemności 50 mililitrów.

Dodać 100 mikrolitrów rozcieńczenia, które nadało wzór wstęgi kulturze Arthrobacter i pozwolić fagom zainfekować komórki bakteryjne przez pięć do 10 minut. W temperaturze pokojowej dodać do kolby stopiony górny ślimak o takim samym stężeniu chlorku wapnia, jaki został użyty do wstępnej identyfikacji płytki fagowej. Pięć mililitrów tej mieszanki na każdą z 10 świeżych płytek LB.

Po pozostawieniu górnego ślimaka do zestalenia się, odwrócenia i inkubacji płytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc następnego dnia, zalej płytki wzoru wstęgi pięcioma mililitrami buforu fagowego na płytkę i przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltruj lizat fagowy przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona. Przechowuj ten końcowy zapas fagów w temperaturze czterech stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.

Dodać równą ilość lizatu fagowego do sterylnego glicerolu w małych fiolkach w celu archiwizacji zapasów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w procedurze wzbogacania pokazanej na tym filmie, metoda smug płytki nazębnej do izolacji czystych populacji fagów po wstępnym wzbogaceniu i posiewie na ślimaku LB pokazana jest reprezentatywne wyniki izolacji płytek dla faga DI w temperaturze pokojowej, 30 stopni Celsjusza i 37 stopni Celsjusza. Czerwone kółka na dwóch tabliczkach otaczają wyraźnie izolowane tablice. Phage Dylan wytwarza podobne blaszki w trzech różnych temperaturach.

Alternatywnie, do wyizolowania czystego izolatu fagowego można zastosować tradycyjny standardowy test miana płytki. Test ten został tutaj wykorzystany do empirycznego określenia liczby miana fagów i liczby jednostek tworzących blaszki w celu utworzenia wzoru taśmy na płytce. Zestaw seryjnych rozcieńczeń dla faga bananowego jest pokazany z przykładem, jak powinien wyglądać dobry wzór wstęgi.

Są to mikrograficzne obrazy elektronowe 20 fagów Arthrobacter wyizolowanych przy użyciu techniki wzbogacania. Spośród 25 obecnie izolowanych fagów, 23 z nich to wirusy cifo o dość długich ogonach. Dwa z wyizolowanych fagów to wirusy myo, których średnica głowy jest podobna do długości ogona.

Po opanowaniu, posiewanie wzbogacające powinno pozwolić na pomyślne wyizolowanie fagów Arthrobacter z różnych próbek gleby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić jest używany w metodzie malowania smugami z próbki gleby środowiskowej.