Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar pozakomórkowych strumieni jonowych in vivo z wykorzystaniem techniki samoreferencyjnych mikroelektrod selektywnych jonowo. Jest to realizowane poprzez montaż mikroelektrod selektywnych jonowo oraz mikroelektrod referencyjnych, a następnie kalibrację i walidację samoreferencyjnych mikroelektrod selektywnych jonowo.

Następnie przeprowadza się pomiary specyficznego strumienia jonów w próbce biologicznej w formie rejestracji napięcia. W końcowej fazie zapis napięcia jest przeliczany na strumień jonów. Ostatecznie technika ta pozwala na dokładny, nieinwazyjny pomiar specyficznych pozakomórkowych strumieni jonów w żywych komórkach lub tkankach.

Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii lub starzenia się, a także regeneracji lub patologii. Na przykład metoda ta umożliwia identyfikację specyficznych strumieni jonowych, które kontrolują procesy biologiczne, takie jak wzrost morfogenezy tkanek lub różnicowanie. Procedurę tę zademonstrują dr Gim Ardi, pracownik postdoc, oraz laboratorium dr. Benjasa. Przed kalibracją elektrody należy zamontować uprzednio napełnioną elektrodę jonoselektywną w uchwycie mikroelektrody wyposażonym w jeden milimetrowy złoty konektor męski i srebrny drut powlekany chlorkiem srebra.

Następnie przymocuj uchwyt mikroelektrody do trójosiowego, komputerowo sterowanego elektronicznego mikropozycjonera. Sama elektroda selektywna jonowo powinna zawierać już elektrolit oraz roztwór koktajlu jonoforowego odpowiedni dla badanych jonów. Po zamontowaniu elektrodę należy zanurzyć w roztworze zawierającym 1 mM chlorku potasu.

Dodatkowo zamontuj elektrodę odniesienia w prostym uchwycie do mikroelektrod zawierającym trzymolowy roztwór soli w agarze, pelet srebrny powlekany chlorkiem srebra oraz dwumilimetrowy złoty konektor męski dla elektrody odniesienia. Wybór roztworu soli zależy od rodzaju jonów poddawanych pomiarowi. Po przygotowaniu elektrody odniesienia przymocuj uchwyt elektrody do manualnego mikropozycjonera, który jest wcześniej zamontowany na statywie magnetycznym.

Po zamontowaniu elektrodę należy zanurzyć w roztworze zawierającym 1 mM chlorku potasu. Przed rozpoczęciem pracy, w układzie elektrody selektywnej jonowo należy przygotować szereg rozcieńczeń standardów kalibracyjnych elektrolitu zawierających badane jony. Na przykład, jeśli kationy potasu mają być wykrywane w stężeniu fizjologicznym wynoszącym około 1 mM, należy przygotować trzystopniowy szereg logarytmiczny roztworów chlorku potasu o stężeniach 10, 1 oraz 0.1 mM.

Maksymalizuje to zakres dynamiczny detekcji wymaganego w tym teście. Aby skalibrować elektrodę jonoselektywną, należy zacząć od zanurzenia obu elektrod – jonoselektywnej oraz odniesienia – w roztworze kalibracyjnym o najniższym stężeniu, w tym przypadku 0.1 millimolar. Po krótkim okresie stabilizacji od jednej do trzech minut w temperaturze pokojowej, należy zmierzyć i zapisać napięcie stanu ustalonego.

Powtórz pomiary napięcia dla pozostałych wzorców kalibracyjnych, a następnie nanieś zmierzone napięcia na wykres w funkcji logarytmu molarnych stężeń jonów. Dla każdego roztworu wzorcowego zastosuj regresję liniową, aby wyznaczyć nachylenie, punkt przecięcia oraz wartości R² krzywej kalibracyjnej. Aby obliczyć rzeczywiste nachylenie, pamiętaj o podzieleniu zmierzonych napięć przez całkowite wzmocnienie wzmacniacza napięcia.

Aby zademonstrować protokół pomiarowy, przeprowadzona zostanie charakterystyka strumienia jonów potasu z perforowanego oocytu żaby przy użyciu mikroelektrody selektywnej względem potasu. Przed rozpoczęciem konfiguracji elektrody selektywnej jonów, wytnij fragment nylonowej siatki o oczkach 800 µm o wymiarach jednego centymetra i przyklej go do plastikowej szalki Petriego. Należy również wcześniej przygotować zmodyfikowany roztwór Ringera według następującego składu: 100 mM chlorku sodu, 2 mM chlorku potasu, 2 mM chlorku wapnia, 1 mM chlorku magnezu oraz 5 mM HEPES. Dostosuj pH buforu do wartości 7,5 za pomocą wodorotlenku sodu, a następnie wlej porcję gotowego buforu do szalki Petriego.

Ostrożnie umieść cyta żaby, elektrodę selektywną jonowo oraz elektrodę odniesienia w szalce Petriego. Następnie perforuj cyta i uruchom mikro pozycjoner tak, aby elektroda selektywna jonowo znajdowała się w odległości około 10 mikronów od próbki. Zgodnie z nomenklaturą, aktualny dystans między próbką a elektrodą zostanie określony jako pozycja bliska.

Następnie uruchom mikropozycjoner w taki sposób, aby elektroda selektywna jonowo okresowo przemieszczała się z pozycji bliskiej (10 µm) do pozycji dalszej (100 µm), a następnie powracała do pozycji bliskiej z częstotliwością 0,3 Hz, co oznacza trzy pełne cykle w ciągu każdych 10 sekund. Podczas pracy mikropozycjonera należy zweryfikować, czy ruch elektrody jest rzeczywiście prostopadły do uszkodzonej powierzchni stycznej cytu, a następnie uruchomić oprogramowanie do pomiaru i rejestracji napięcia. Mikropozycjoner jest zaprogramowany tak, aby zatrzymywał się na krótko w pozycjach bliskiej i dalszej podczas gromadzenia danych o napięciu.

Dane są rejestrowane w sposób ciągły podczas gojenia rany w oocycie, co w przypadku dłuższych eksperymentów trwa około 15 minut; natomiast przy obserwacji wielodniowych procesów, takich jak regeneracja ogona kijanki opus, pomiary są rejestrowane przez dwie minuty w różnych punktach czasowych, na przykład po 1, 3, 6, 12 i 24 godzinach. Po zakończeniu eksperymentu wyeksportuj dane dotyczące napięcia do pliku tekstowego, a następnie skopiuj wartości do arkusza kalkulacyjnego.

Użyj wcześniej wyznaczonej krzywej kalibracyjnej, aby przeliczyć zmierzone wartości napięcia na odpowiadające im stężenia jonów. Przedstaw wyekstrapolowane stężenia jonów jako funkcję odległości od próbki biologicznej. Na koniec oblicz strumień jonów, korzystając z prawa dyfuzji Ficka.

Gdzie C to stężenie jonów w roztworze, MU to ruchliwość jonowa, a DC DX to różnica stężeń na dystansie dx. Przed rozpoczęciem eksperymentów biologicznych wartość punktu przecięcia nachylenia NER oraz cała krzywa kalibracyjna dla elektrody selektywnej jonowo mogą zostać zwalidowane względem sztucznego gradientu jonowego wytworzonego z jednomolarnego źródła jonów umieszczonego w szalce Petriego. Gdy zmiany stężeń jonów potasu są nanoszone na wykres w odległości bliskiej lub oddalonej od miejsca zranienia pierścienia.

Dane sugerują, że w momencie powstania uszkodzenia komórki następuje masowy przepływ jonów potasu; w miarę postępu gojenia rany przepływ ten stopniowo słabnie, powracając do poziomów spoczynkowych po 15 minutach, gdy rana jest całkowicie zagojona. Ponadto, po przeliczeniu zmierzonych stężeń jonów potasu na strumień jonowy, nagły wzrost i stopniowy spadek przepływu potasu po zranieniu wydaje się być efektem statystycznie istotnym w porównaniu z nienaruszoną oocytem kontrolnym. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak fluorescencyjne znakowanie bioelektryczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki międzykomórkowych i wewnątrzkomórkowych przepływów jonowych.