Name: Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj technikę jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych do pomiaru zewnątrzkomórkowych strumieni jonów in vivo. Ta metoda umożliwia dokładne, nieinwazyjne badanie dynamiki jonów w żywych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Science Foundation MCB-0951199, a częściowo przez grant NIH EY01910, Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej granty RB1-01417 oraz przez Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. Przygotowanie mikroelektrod z samoodniesieniem jonoselektywnym
<ol>
	<li>Przygotowanie mikroelektrody jonoselektywnej
	<ol>
		<li>Cienkościenne kapilary borokrzemianowe bez filamentu (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 1,12 mm) za pomocą ściągacza do mikroelektrod. 
		Uwaga: Daje to końcówki o średnicy 3-4 μm. Mniejsze końcówki mają wyższą rezystancję, co sprawia, że mikroelektrody są bardziej podatne na szum elektronowy, a także wiąże się z wolniejszą reakcją na zmianę stężenia jonów. Przydatne informacje można znaleźć w artykule opublikowanym przez Smith i wsp. Lokal mieszkalny 26.</li>
		<li>Silanizuj elektrody, aby wewnętrzna powierzchnia była hydrofobowa, aby pomóc w utrzymaniu lipofilowego koktajlu jonoforowego. Umieść mikroelektrody na metalowym ruszcie i podgrzej O/N w piekarniku w temperaturze >100 °C, aby je wysuszyć. Stojak to metalowa płyta z otworami o średnicy 2 mm, wywierconymi częściowo na wylot. Umieść elektrody w otworach czubkiem do góry, umieszczając nad nimi szklaną zlewkę o pojemności 250 ml.</li>
		<li>Rano wyłącz piekarnik i w ocieplanych rękawicach ostrożnie wyjmij metalowy ruszt z elektrodami i zlewką na miejscu. Zamknij drzwiczki piekarnika, aby zatrzymać ciepło.</li>
		<li>Nosić rękawice lateksowe lub nitrylowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura umieść kroplę roztworu silanizacyjnego I u podstawy każdej elektrody (trzymaj zlewkę na miejscu; użyj wargi do nalewania, aby uzyskać dostęp do pipety). Roztwór silanizacyjny jest odparowywany przez płytę grzejną i silanizuje wnętrze elektrod. Na tym etapie należy użyć wyciągu wyciągowego z chemikaliami. Umieść ruszt/zlewkę/elektrody z powrotem w gorącym piekarniku na kilka godzin, aby pozostały roztwór silanizacyjny odparował. 
		Uwaga: Ze względów bezpieczeństwa nie włączaj ponownie piekarnika. Umieść na kuchence etykietę wskazującą, że nie wolno jej włączać, ponieważ może zawierać szkodliwe i łatwopalne opary.</li>
		<li>Po schłodzeniu przechowywać mikroelektrody w słoiku do przechowywania mikroelektrod w szklanym eksykatorze z 400 g środka osuszającego. W ten sposób mikroelektrody mogą być przechowywane przez wiele tygodni. 
		Uwaga: Alternatywna metoda silanizacji została opisana w Smith i wsp.26</li>
		<li>Wypełnić mikroelektrodę 50 do 100 μl (o długości około 1 cm) roztworu zawierającego 100 mM mierzonego jonu (patrz Tabela 1 i Rysunek 1B). Użyj jednorazowej plastikowej pipety Pasteura, którą podciągnij w palniku Bunsena do drobnego filamentu. Następnie przepłukać pipetę w dH2O, aby zapobiec zablokowaniu. 
		Uwaga: Alternatywnie, dostosować stężenie jonów w roztworze do wypełniania, aby dopasować je do stężenia jonów w roztworze zewnętrznym27.</li>
		<li>Obserwuj mikroelektrodę pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
		<ol>
			<li>Jeśli obecne są pęcherzyki, delikatnie postukaj w mikroelektrodę paznokciem, trzymając elektrodę pionowo (końcówką w dół) i/lub wypchnij pęcherzyki z końcówki, wywierając przeciwciśnienie za pomocą strzykawki zmodyfikowanej silikonową rurką zastępującą igłę.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Napełnij końcówkę mikroelektrody 15 do 20 nl (długość 30-50 μm) specyficznego dla jonów koktajlu jonoforowego (patrz tabela 1). Umieść małą kropelkę koktajlu jonoforowego na krótkiej krawędzi szkiełka mikroskopowego. Obserwuj końcówkę mikroelektrody pod mikroskopem preparacyjnym i przesuwaj ją w kierunku szkiełka mikroskopowego, aż końcówka mikroelektrody dotknie koktajlu jonoforowego tylko przez około pół sekundy. Wciągnij koktajl jonoforowy do mikroelektrody za pomocą ciśnienia kapilarnego. 
		Uwaga: Unikaj długiej kolumny koktajlu jonoforowego, ponieważ zwiększa to opór elektryczny sondy, co może sprawić, że będzie ona podatna na zakłócenia elektroniczne (szumy), a także spowolni czas reakcji.</li>
		<li>Zamontuj mikroelektrodę w prostym uchwycie mikroelektrody ze złotym złączem męskim 1 mm i przewodem AgCl(Ag+) (Rysunek 1B).</li>
		<li>Przymocuj uchwyt mikroelektrody do stopnia głowicy zamontowanego na trójwymiarowym, sterowanym komputerowo elektronicznym mikropozycjonerze (Rysunek 1A).</li>
		<li>Umieść końcówkę mikroelektrody w roztworze pomiarowym odpowiednim dla mierzonej próbki (sól fizjologiczna, pożywka hodowlana itp.), aby umożliwić stabilizację mikroelektrody przez godzinę lub dwie, a nawet przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie elektrody referencyjnej
	<ol>
		<li>Elektrody referencyjne (rysunek 1C) to te same kapilary co powyżej. Przetnij kapilarnę ołówkiem diamentowym na odcinki o długości 5 cm i wypoleruj ogniowo na każdym końcu przez 1-2 sekundy w płomieniu Bunsena.</li>
		<li>Napełnij te elektrody ~200 μl 3 M roztworu NaCl, CH,3CO2K (octan potasu) lub KCl z 2% agarozą. Wybierz roztwór w zależności od mierzonego jonu (elektroda referencyjna nie powinna zawierać mierzonego jonu; patrz Tabela 1). Wymieszaj agarozę z roztworem i podgrzej do prawie wrzenia w kuchence mikrofalowej. Mieszaj, aby rozpuścić agarozę (roztwór staje się klarowny).</li>
		<li>Podłącz elektrodę referencyjną do plastikowej pipety Pasteura i wciągnij gorący roztwór do kapilary.</li>
		<li>Wrzuć elektrodę do zimnego roztworu 3 M NaCl, CH,3CO, 2K lub KCl i przechowuj w tym roztworze 3 M w szczelnie zamkniętych probówkach przed użyciem. Wyrzucić wszystkie elektrody referencyjne z pęcherzykami powietrza.</li>
		<li>Zamontuj elektrodę odniesienia w prostym uchwycie mikroelektrody (wstępnie wypełnionym roztworem 3 M) z osadem AgCl(Ag+) w środku i złotym złączem męskim 2 mm (Rysunek 1C), a następnie przymocuj elektrodę i uchwyt do ręcznego mikropozycjonera zamontowanego na stojaku magnetycznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Samoreferencyjny rezonans jonowy Kalibracja mikroelektrod
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów kalibracyjnych zawierających jon będący przedmiotem zainteresowania, jak w roztworze odniesienia; patrz tabela 1. Umieścić w nawiasie stężenie zawarte w roztworze, w którym będzie znajdować się próbka (np. pożywka hodowlana, sól fizjologiczna). Oznacza to, że jeden roztwór kalibracyjny musi zawierać niższe stężenie jonów niż w roztworze pomiarowym, a jedno wyższe.
	<ol>
		<li>Na przykład użyj soli fizjologicznej, która zawiera 1 mM K+. Aby określić to stężenie, rozpuść proszek KCl w wodzie dejonizowanej do stężenia 10, 1 i 0,1 mM w seryjnych rozcieńczeniach. Użyj tych roztworów kalibracyjnych. Alternatywnie możesz skorzystać z co najmniej dwóch z tych rozwiązań.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz mikroelektrodę jonoselektywną i elektrodę odniesienia w każdym roztworze kalibracyjnym i pozwól, aby wartość napięcia ustabilizowała się przez 1 do 3 minut przed zarejestrowaniem odpowiedniego napięcia za pomocą dedykowanego oprogramowania (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Ponieważ oprogramowanie zapisuje dane (wyjście wzmacniacza) jako plik txt, skopiuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego. Wykreślić wartość wyjściową mikroelektrody (mV) w stosunku do logarytmu stężenia jonów molowych (rysunek 2A).</li>
	<li>Zastosuj regresję liniową i oblicz nachylenie Nernst, punkt przecięcia i wartość R2. Zaakceptuj mikroelektrodę, jeśli nachylenie Nernsta wynosi 58 ± 11 mV/dekadę dla jonów jednowartościowych i 29 ± 11 mV/dekadę dla jonów dwuwartościowych (dla kationów nachylenie Nernsta jest dodatnie, dla anionów jest ujemne). Dodatkowo dobre mikroelektrody powinny charakteryzować się silną korelacją liniową (R2 >0,9; Rysunek 2B). 
	Uwaga: Zastosowane tutaj wyjście mV wzmacniacza daje odczyt mV z dziesięciokrotnym wzmocnieniem. Wartości muszą być podzielone przez współczynnik dziesięciokrotny.</li>
	<li>Użyj wzoru na regresję liniową, aby przeliczyć surową moc wyjściową mV mikroelektrody na rzeczywiste stężenie jonów (rysunek 2B).</li>
</ol>
3. Walidacja techniki mikroelektrod selektywnych jonowo
<ol>
	<li>Przygotowanie sztucznego źródła
	<ol>
		<li>Kapilary ze sztucznym źródłem to te same naczynia włosowate co powyżej. Podgrzej kapilarę za pomocą ściągacza do mikroelektrod, jak w kroku 1.1.1.</li>
		<li>Wypełnić te kapilary 200 μl 1 M roztworu NaCl, KCl, CaCl22 H2O lub buforu o pH 4. Wybrać roztwór sztucznego źródła w zależności od mierzonego jonu (patrz Tabela 1). 
		Uwaga: Alternatywnie, wyciągnij elektrody o większej średnicy końcówki (~20 μm) i wypełnij końcówkę tymi samymi roztworami, ale zawierającymi 0,5-1% agarozy (agaroza zapobiegnie jakiemukolwiek przepływowi roztworu).</li>
		<li>Zamontuj kapilarnę sztucznego źródła na mikromanipulatorze i zanurz ją w roztworze używanym do pomiaru strumienia jonów w próbkach. Pozostaw sztuczne źródło w roztworze na 30 minut do 1 godziny, aby umożliwić stabilizację gradientu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja mikroelektrody jonoselektywnej
	<ol>
		<li>Zanurz mikroelektrodę jonoselektywną w odległości około jednego centymetra od kapilary sztucznego źródła w roztworze używanym do pomiaru strumienia jonów na próbkach i zamknij obwód elektrodą referencyjną, jak poprzednio. Poczekaj, aż wartość napięcia ustabilizuje się przez 1 do 3 minut, a następnie zarejestrujesz odpowiednie napięcie za pomocą dedykowanego oprogramowania na 1 do 2 minut. Wartość ta odpowiada wartości buforowej (w literaturze nazywanej również wartością referencyjną, tła lub pustą).</li>
		<li>Przesuń mikroelektrodę jonoselektywną na około 5 μm od sztucznego źródła i pozwól, aby wartość napięcia ustabilizowała się przez 1 do 3 minut, zanim zarejestrujesz odpowiednie napięcie za pomocą oprogramowania na 1 do 2 minut.</li>
		<li>Powtórz powyższą procedurę, umieszczając mikroelektrodę jonoselektywną w odległości 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 i 1280 μm od kapilary sztucznego źródła.</li>
		<li>Wyodrębnij dane jako plik txt i skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć stężenie jonów odpowiadające wartościom mV w taki sam sposób, jak w przypadku wartości kalibracyjnych. Wykreśl wartość. 
	Uwaga: Jeśli obecny jest strumień jonów, mikroelektroda wykrywa różnicę w stężeniu jonów między dwoma położeniami (rysunek 3B). Jeżeli sztuczne źródło zawiera więcej mierzonych jonów niż roztwór, stężenie powinno być wyższe blisko źródła niż daleko, potwierdzając zdolność mikroelektrody jonoselektywnej do prawidłowego wykrywania kierunku strumienia jonów (w tym przypadku wypływu; dla sztucznego pochłaniacza, o niższym stężeniu jonów właściwych niż ośrodek pomiarowy, powinien to być napływ).
	<ol>
		<li>Oblicz strumień jonów za pomocą prawa dyfuzji Ficka: J = c μ (dc/dx), gdzie c to stężenie jonów w roztworze (mol cm-3), μ to ruchliwość jonów (mol cm N-1 sec-1), a dc to różnica stężeń w zależności od odległości dx (cm) (rysunek 2C). Dane dotyczące strumienia jonów są zwykle prezentowane w pmol cm-2 s-1lub nmol cm-2 sec-1. 
		Uwaga: Alternatywna metoda obliczania strumienia jonów opisana przez Smitha i wsp.26. Może być używany. Główne różnice obejmują zastosowanie współczynnika dyfuzji zamiast ruchliwości jonów oraz odjęcie strumienia jonów tła (również dryft napięcia lub współczynnik korekcyjny) obliczonego na podstawie pomiaru strumienia jonów w roztworze soli fizjologicznej bez próbki.</li>
		<li>Wykreślić średnią strumieni jonów każdego kroku w stosunku do odległości od źródła (rysunek 2D). Oddalając się od źródła, obserwuj wykładniczy spadek wartości strumienia, potwierdzający zdolność mikroelektrody jonoselektywnej do wykrywania różnych wielkości strumieni jonów.</li>
		<li>Przeprowadzić walidację sztucznego źródła raz dla każdego konkretnego jonu, który ma być zarejestrowany, w celu walidacji jego prawidłowych pomiarów kierunku i wielkości przy dużym stosunku sygnału do szumu. 
		Uwaga: Pomiar strumienia jonów w buforze bez próbek wskazuje poziom tła lub szum. Zazwyczaj pomiar buforu nie wykazuje wyraźnych wahań stężenia jonów, co prowadzi do bardzo małego strumienia, który wykazuje zmienne kierunki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie komory pomiarowej
Uwaga: Przed eksperymentami rozważ próbkę, która ma być mierzona, oraz sposób, w jaki próbka ma być zamontowana i unieruchomiona do pomiarów mikroelektrod.
<ol>
	<li>W celu pomiaru oocytów Xenopus laevis należy wyciąć 1 cm kwadrat nylonowej siatki o grubości 800 μm (siatka niteksowa) i przykleić ją do plastikowej szalki Petriego (ryc. 1E).</li>
</ol>
5. Pomiar strumienia jonów
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenie jonów obecnych w buforze używanym do wykonywania pomiarów na próbce w taki sam sposób, jak w przypadku roztworu kalibracyjnego. Oocyty X. laevis wymagają zmodyfikowanego dzwonka Marka (MMR). Rozpuścić NaCl, KCl, CaCl, MgCl i HEPES w wodzie dejonizowanej, aby osiągnąć końcowe stężenie (mM): 100 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl i 5 HEPES. Dostosować pH buforu do 7,5 za pomocą NaOH.</li>
	<li>Umieścić próbkę w komorze pomiarowej i zbliżyć mikroelektrodę jonoselektywną do próbki (w odległości około 10 μm) za pomocą mikropozycjonera w celu określenia bliskiego położenia mikroelektrody (rysunek 3A).</li>
	<li>Rozpocznij odchylenie mikroelektrody o niskiej częstotliwości (0,3 Hz) (100 μm) między pozycją bliską a pozycją oddaloną od próbki (odległą) za pomocą dedykowanego oprogramowania. Upewnij się, że ruch mikroelektrody jest prostopadły do powierzchni próbki. 
	Uwaga: Wychylenie mikroelektrody można ustawić w oprogramowaniu. Duży skok zwiększa odczyt gradientu, umożliwiając łatwiejsze wykrycie małych strumieni podczas pomiaru, jednocześnie wydłużając interwał próbkowania i zmniejszając rozdzielczość czasową. Zobacz rysunek 3A, aby zapoznać się z przykładem.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania. Mikroelektroda zatrzymuje się w każdej pozycji, a potencjał elektryczny w mV jest rejestrowany w komputerze. Pomiary należy wykonywać przez co najmniej 2 minuty, co pozwala na stabilizację sygnału. W przypadku krótkich eksperymentów poklatkowych rejestruj potencjalne zmiany w pozycji zainteresowania przez cały przebieg czasu.</li>
	<li>Wyodrębnij dane jako plik txt i skopiuj wartości do pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Obliczyć stężenie jonów odpowiadające wartościom mV w taki sam sposób, jak w przypadku wartości kalibracyjnych. Wykreśl wartość. 
	Uwaga: Jeśli obecny jest strumień jonów, mikroelektroda wykrywa różnicę w stężeniu jonów między dwoma położeniami (rysunek 3B).</li>
	<li>Oblicz strumień jonów, korzystając z prawa dyfuzji Ficka, jak poprzednio (krok 3.3.1).</li>
	<li>Powtórzyć pomiar bufora przed pomiarem nowej próbki i powtórzyć procedurę pomiaru strumienia i obliczenia dla każdej nowej próbki.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna i prezentacja danych
<ol>
	<li>Zbadanie niezależnego wpływu położenia i/lub czasu na strumienie jonów w warunkach kontrolnych przy użyciu modelu ANCOVA z efektami mieszanymi28, 
	Uwaga: Analiza kowariancji (ANCOVA) jest ogólnym modelem liniowym, który łączy regularną ANOVA i regresję, umożliwiając stosowanie zarówno miar kategorycznych, jak i ciągłych jako zmiennych niezależnych. Ponadto, w przypadku skorelowanych błędów wywołanych powtarzanymi pomiarami dla poszczególnych osób i ostatecznych efektów zagnieżdżonych, modele efektów mieszanych są wykorzystywane do modelowania dokładnych oszacowań zarówno efektów stałych, jak i losowych.</li>
	<li>Oblicz porównania parami za pomocą testu t-Studenta między poziomami grup z poprawką Bonferroniego dla testów wielokrotnych28.</li>
	<li>Generuj wykresy skrzynkowe, aby podsumować pomiary strumienia jonów według pozycji i czasu. Uwzględnij wartości p z opisanego powyżej wskaźnika Student t (rysunek 3D) i wskaż poziomy istotności wartości p w następujący sposób: *: p <0,05; **: p <0,01; : p <0,00129</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najważniejszymi etapami skutecznego pomiaru zewnątrzkomórkowych strumieni jonów in vivo są: redukcja szumu, prawidłowe wykonanie mikroelektrod jonoselektywnych i elektrody referencyjnej oraz ustawienie próbki i obu elektrod.
W celu zminimalizowania hałasu, system nagrywania powinien znajdować się w uziemionej (uziemionej) klatce Faradaya, najlepiej ze stołem z metalowym blatem (izolacja drgań), który jest również uziemiony. Ponadto obudowa mikroskopu powinna być również uziemiona. Do ...

Wszystkie komórki zwierzęce są otoczone dwuwarstwową błoną lipidową, która oddziela cytoplazmę od środowiska zewnętrznego. Komórka utrzymuje elektryczny potencjał błonowy, ujemny wewnątrz, poprzez aktywny transport jonów1. Potencjał błonowy jest zmagazynowanym źródłem energii, które komórka może wykorzystać do obsługi różnych urządzeń molekularnych w błonie2. Neurony i inne pobudliwe komórki mają duże potencjały błonowe. Szybkie otwarcie kanałów sodowych powoduje załamanie potencjału błonowego (depolaryzacja) i wytwarza potencjał czynnościowy, który jest transportowany wzdłuż neuronu2. Oprócz tych gwałtownych zmian elektrycznych, wiele tkanek i narządów generuje i utrzymuje znaczne długoterminowe potencjały elektryczne. Na przykład nabłonek skóry i rogówki generuje i utrzymuje potencjały transnabłonkowe i zewnątrzkomórkowe prądy elektryczne poprzez kierunkowe pompowanie jonów (głównie sodu i chlorków)3.
Podczas gdy pomiary endogennego zewnątrzkomórkowego prądu elektrycznego za pomocą sondy wibracyjnej4-6 oraz pomiary potencjałów błonowych lub trans-nabłonkowych za pomocą systemu mikroelektrod7-10 pozwalają na pomiar parametrów elektrycznych błon komórkowych i warstw komórek nabłonkowych, nie dają one żadnych wskazówek co do zaangażowanych form jonów.
Mikroelektrody z selektywnym jonoforem mogą mierzyć określone stężenie jonów w roztworze. Gradienty jonów lub strumień można mierzyć za pomocą dwóch lub więcej elektrod w różnych pozycjach. Jednak wewnętrzny dryft napięcia każdej sondy byłby inny, powodując niedokładne pomiary, a nawet wykrycie gradientu, którego nie było. Pojedyncza elektroda używana w trybie "samoreferencyjnym", w którym porusza się z niską częstotliwością między dwoma punktami, rozwiązuje ten problem. Teraz strumień jonów można zobaczyć na tle stosunkowo powolnego i stabilnego dryfu sygnału (patrz rysunek 3B).
Wrażliwy na jony system pomiarowy wykorzystuje jonoselektywne, samoreferencyjne mikroelektrody do wykrywania małych zewnątrzkomórkowych strumieni jonów w pobliżu tkanek lub pojedynczych komórek. Układ składa się ze wzmacniacza, który przetwarza sygnał z mikroelektrody oraz mikrosilnika krokowego i sterownika do sterowania ruchem mikroelektrody. Mikroelektroda jonoselektywna i elektroda odniesienia, które zamykają obwód, są połączone ze wzmacniaczem za pośrednictwem przedwzmacniacza stopnia czołowego (ilustracja 1A). Oprogramowanie komputerowe określa parametry ruchu mikroelektrody (częstotliwość, odległość), a także rejestruje wyjście wzmacniacza. Silnik krokowy steruje ruchem mikroelektrod za pomocą trójwymiarowego mikropozycjonera. Wibrująca mikroelektroda jonoselektywna o niskiej częstotliwości została po raz pierwszy opracowana w 1990 roku do pomiaru właściwego strumienia wapnia11. Oprócz wapnia dostępne są obecnie dostępne na rynku koktajle jonoforowe, które sprawiają, że mikroelektrody są wrażliwe na sód, chlorek, potas, wodór, magnez, azotany, amon, fluor, lit lub rtęć.
Zasadniczo, technika samoreferencyjnej jonoselektywnej mikroelektrody przekształca aktywność określonego jonu rozpuszczonego w roztworze na potencjał elektryczny, który może być mierzony przez woltomierz. Koktajl jonoforowy jest niemieszającą się fazą cieczową (organiczną, lipofilową) o właściwościach jonowymiennych. Jonofor selektywnie kompleksuje (wiąże) określone jony odwracalnie i przenosi je między roztworem wodnym zawartym w mikroelektrodzie (elektrolitem) a roztworem wodnym, w którym zanurzona jest mikroelektroda (ryc. 1D). Ten transfer jonów prowadzi do równowagi elektrochemicznej, a zmiana potencjału elektrycznego między mikroelektrodą a elektrodą odniesienia jest mierzona przez woltomierz. Napięcie jest proporcjonalne do logarytmu właściwej aktywności jonów zgodnie z równaniem Nernsta pozwalającym na obliczenie stężenia jonów (rys. 2A i B).
Obecnie kilka systemów pozwala na pomiar strumienia jonów przy użyciu podobnej koncepcji lub zasady. Na przykład technika skanowania elektrody jonoselektywnej (SIET)12,13 lub technika szacowania strumienia jonów mikroelektrod (MIFE) opracowana przez Newmana i Shabalę14-16 są komercyjnie dostępne i szeroko stosowane przez społeczność naukową w celu określenia określonych strumieni jonów występujących na błonie komórkowej i tkance w różnych modelach zwierzęcych, roślinnych i pojedynczych żywych komórek. Mikroelektrody jonoselektywne zostały użyte do pomiaru przepływu wodoru, potasu i wapnia przez korzenie roślin17, strumienia chlorków w tętnicach mózgowych szczurów18 i w łagiewkach pyłkowych19, strumienia wodoru w komórkach siatkówki łyżwy20, strumienia wapnia w kości myszy21, różnych strumieni jonów w strzępkach grzybów22 i w rogówce szczura23, a na koniec strumienia wapnia podczas gojenia się ran jednokomórkowych12,24. Patrz również poniższy przegląd, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych25.
Poniższy artykuł opisuje szczegółowo, jak przygotować i przeprowadzić pomiar endogennych strumieni jonów zewnątrzkomórkowych za pomocą techniki jonoselektywnej samoreferencyjnej mikroelektrody na poziomie pojedynczej komórki.

<table><tbody><tr><td>Wzmacniacz jonowy&nbsp;</td><td>&nbsp; Centrum Badawcze BioCurrents, Woods Hole, MA, USA</td><td>brak</td><td>wzmacniacza stworzonego przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z odpowiedniej elektroniki(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>IonAmp32&nbsp;</td><td>&nbsp; BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>brak</td><td>oprogramowania stworzonego przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz czołowy</td><td>&nbsp; Centrum Badawcze BioCurrents, Woods Hole, MA, USA</td><td>INA116</td><td>BSR Voltage Follower INA116, zaprojektowany przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z odpowiedniej elektroniki(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Sterownik MicroStep</td><td>&nbsp; Centrum Badawcze BioCurrents, Woods Hole, MA, USA</td><td>do</td><td>pozycjonowania X, Y i Z nie są wymagane żadne trzy sterowniki MicroStep; stworzone przez BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Podobny system można nabyć w " Funkcja XBL ma znaczenie" (http://www.xuyue.org/) lub z " Młodsze Stany Zjednoczone" (http://www.youngerusa.com/) lub z Odpowiedniej elektroniki(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Mikropozycjoner ręczny&nbsp; &nbsp;</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne&nbsp;</td><td>Model KITE-R</td><td>Podobny system można kupić w Odpowiedniej elektronice(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Podstawka magnetyczna&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model M10</td><td>Podobny system można kupić w odpowiedniej elektronice(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Tabela izolacji drgań&nbsp; &nbsp;</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Model VW-3036-OPT-023040</td><td>Podobny system można kupić w Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Część trójwymiarowego mikropozycjonera: kątownik, 90&deg;, powierzchnie szczelinowe</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Model 360-90</td><td>Montaż mikropozycjonera o trzech wymiarach wymaga również trzech elektrycznych silników obrotowych do sterowania X, Y, Z, ramienia montażowego MPH-1 ze słupkiem o regulowanym kącie MCA-2 oraz różnych złączy i Newport do przykręcenia do stołu wibracyjnego</td></tr><tr><td>Część mikropozycjonera trójwymiarowego: Etap na jaskółczy ogon do łączenia kołków 0,5 cala X Travel</td><td>Newport Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>brak</td></tr><tr><td>Część trójwymiarowego mikropozycjonera: Szybkomontowany stolik liniowy, 0,5 cala XY Travel</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>brak</td></tr><tr><td>Kwik-Fil cienkościenne kapilary ze szkła borokrzemianowego bez żarnika&nbsp;</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne&nbsp;</td><td>TW150-4</td><td>brak</td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; PC-10</td><td>brak</td></tr><tr><td>Stojak metalowy</td><td>Wykonany we własnym zakresie</td><td>brak</td><td>Metalowy uchwyt elektrody wykonany we własnym zakresie poprzez wiercenie otworów o szerokości 2 mm półcentymetrowych rozmieszczonych w prostokątnej podstawie ze stali o wymiarach 10 cm na 15 cm</td></tr><tr><td>Piekarnik</td> laboratoryjny <td>QL</td><td>Model 10 brak</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do silanizacji I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>Niebezpieczne, uchwyt zgodnie z zaleceniami dostawcy&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego; Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>316060</td><td>brak</td></tr><tr><td>Słoik do przechowywania elektrod/mikropipet</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>E215</td><td>brak</td></tr><tr><td>Szklany eksykator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-595E</td><td>Zawiera środek osuszający Drierite (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Umieść wazelinę na uszczelce, aby była szczelna.</td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597722</td><td>brak</td></tr><tr><td>Palnik Bunsena</td><td>Fisher Scientific</td><td>S97329</td><td>brak</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>brak</td></tr><tr><td>Prosty uchwyt na mikroelektrody</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-A15P</td><td>ze złotym złączem męskim 1 mm i drutem Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Prosty uchwyt mikroelektrody&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>z granulką AgCl(Ag+) wewnątrz i złotym złączem męskim 2 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>6 cm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>brak</td></tr><tr><td>Siatka Nitex</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX750</td><td>brak</td></tr><tr><td>Klej; Żywica epoksydowa Loctite</td><td>VWR</td><td>500043-451</td><td>Wymieszaj klej i utwardzacz w równych częściach w plastikowej łódce wagowej i dokładnie wymieszaj. Twardnieje szybko, ale pozostawia w RT na 24 godziny w celu pełnego utwardzenia</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>brak</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>brak</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>brak</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>brak</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>brak</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>brak</td></tr><tr><td>Hydroksyd sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>brak</td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>brak</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>brak</td></tr></tbody></table>

pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Komórki zwierząt, roślin i pojedynczych komórek są otoczone barierą zwaną błoną komórkową, która oddziela cytoplazmę od zewnątrz. Warstwy komórkowe, takie jak nabłonek, również tworzą barierę, która oddziela wnętrze od zewnątrz lub różne przedziały organizmów wielokomórkowych. Kluczową cechą tych barier jest zróżnicowany rozkład jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe. Dwie właściwości umożliwiają taki rozkład: 1) błony i nabłonek wykazują selektywną przepuszczalność dla określonych jonów; 2) Jony są transportowane przez pompy przez błony komórkowe i warstwy komórkowe. Właściwości te odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu fizjologii tkanek i działają jako sygnały sygnalizacyjne po uszkodzeniu, podczas naprawy lub w stanie patologicznym. Mikroelektroda samoreferencyjna jonoselektywna umożliwia pomiary określonych strumieni jonów, takich jak wapń, potas lub sód, na poziomie pojedynczych komórek i tkanek. Mikroelektroda zawiera koktajl jonoforowy, który jest selektywnie przepuszczalny dla określonego jonu. Wewnętrzny roztwór wypełniający zawiera ustalone stężenie jonu będącego przedmiotem zainteresowania. Potencjał elektryczny mikroelektrody zależy od zewnętrznego stężenia jonu. Wraz ze zmianą stężenia jonów potencjał mikroelektrody zmienia się w funkcji logarytmu aktywności jonów. Podczas przemieszczania się tam i z powrotem w pobliżu źródła lub ujścia jonu (tj. w gradiencie stężeń spowodowanym strumieniem jonów) potencjał mikroelektrody zmienia się z amplitudą proporcjonalną do strumienia/gradientu jonów. Wzmacniacz wzmacnia sygnał mikroelektrody, a wyjście jest rejestrowane w komputerze. Strumień jonów można następnie obliczyć za pomocą prawa dyfuzji Ficka przy użyciu fluktuacji potencjału elektrody, wychylenia mikroelektrody i innych parametrów, takich jak właściwa ruchliwość jonów. W artykule szczegółowo opisano metodologię pomiaru zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą jonoselektywnej mikroelektrody samoreferencyjnej i przedstawiono reprezentatywne wyniki.

Wcześniej wykazaliśmy, że po uszkodzeniu pojedynczej komórki następuje napływ wapnia24. W związku z tym postanowiliśmy sprawdzić, czy po uszkodzeniu pojedynczej komórki występują inne przepływy jonowe. Wykorzystaliśmy oocyty X. laevis, które stanowią uznany model w badaniach nad gojeniem ran pojedynczych komórek30-34 oraz w rejestracjach elektrofizjologicznych24,35-39. Co ciekawe, jony potasu są bardziej skoncentrowane wewnątrz oocytów X. laevis (około 110 mM)40</su...

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar pozakomórkowych strumieni jonowych in vivo z wykorzystaniem techniki samoreferencyjnych mikroelektrod selektywnych jonowo. Jest to realizowane poprzez montaż mikroelektrod selektywnych jonowo oraz mikroelektrod referencyjnych, a następnie kalibrację i walidację samoreferencyjnych mikroelektrod selektywnych jonowo.Następnie przeprowadza się pomiary specyficznego strumienia jonów w próbce biologicznej w formie rejestracji napięcia. W końcowej fazie zapis napięcia jest przeliczany na strumień jonów. Ostatecznie technika ta pozwala na dokładny, nieinwazyjny pomiar specyficznych pozakomórkowych strumieni jonów w żywych komórkach lub tkankach.Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii lub starzenia się, a także regeneracji lub patologii. Na przykład metoda ta umożliwia identyfikację specyficznych strumieni jonowych, które kontrolują procesy biologiczne, takie jak wzrost morfogenezy tkanek lub różnicowanie. Procedurę tę zademonstrują dr Gim Ardi, pracownik postdoc, oraz laboratorium dr. Benjasa. Przed kalibracją elektrody należy zamontować uprzednio napełnioną elektrodę jonoselektywną w uchwycie mikr

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar przepływów jonów pozakomórkowych z wykorzystaniem techniki mikroelektrod jonoselektywnych z autoreferencją

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

W tym filmie, embrionalne hodowle komórek nerkowych wyrażające zależne od światła białka kanału jonowego połączone fluorescencyjnym reporterem demonstrują wpływ światła na ruch jonów. Zacisk krosowy na całe komórki służy do monitorowania ruchu jonów.

Zapis elektrofizjologii optogenetycznej komórek z kanałami jonowymi zależnymi od światła

Ten film pokazuje, jak scharakteryzować przestrzeń zewnątrzkomórkową w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych do pomiaru i porównywania sygnałów elektrycznych. Proces ten pomaga określić objętość, frakcję przestrzeni i stopień skręcenia.

Charakterystyka przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Ten protokół opisuje użycie testu Ramsaya do pomiaru szybkości wydzielania płynów z izolowanych kanalików Malpighiego (nerkowych) z Drosophila melanogaster. Ponadto opisano zastosowanie elektrod jonospecyficznych do pomiaru stężeń sodu i potasu w wydzielanym płynie, co pozwala na obliczenie transnabłonkowego strumienia jonów.

Zastosowanie testu Ramsaya do pomiaru wydzielania płynów i szybkości przepływu jonów w kanaliku Malpighian Drosophila melanogaster

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Jony potasu przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, a zewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Opisujemy, jak wykonać, skalibrować i stosować monopolarne mikroelektrody selektywne K+. Zastosowanie takich elektrod umożliwia pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki stężenia K+ w dorosłych wycinkach hipokampa.

Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Ten protokół przedstawia metodologie testu Ramsaya, mikroelektrody selektywne jonowo, technikę skanowania elektrod jonoselektywnych (SIET) oraz testy skurczowe in vitro, stosowane do badania układu wydalniczego dorosłych komarów, składającego się z kanalików Malpighiego i jelita tylnego, do wspólnego pomiaru szybkości wydzielania jonów i płynów, aktywności skurczowej i transepitelowego transportu jonów.

Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara

Poznaj technikę jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych do pomiaru zewnątrzkomórkowych strumieni jonów in vivo. Ta metoda umożliwia dokładne, nieinwazyjne badanie dynamiki jonów w żywych tkankach.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Przeglądaj więcej filmów