Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie ablacji hepatocytów u danio pręgowanego w celu analizy regeneracji wątroby napędzanej przez żółć. Osiąga się to poprzez najpierw wystawienie transgenicznych larw, które wyrażają nitroreduktazę w swoich hepatocytach, na metronę lub MTZ. W drugim etapie poziom ablacji hepatocytów ocenia się na podstawie względnej wielkości wątroby.

Po leczeniu MTZ w ostatnim etapie, larwy z drobną wątrobą są zbierane ostatecznie do wielkości wątroby i ekspresji markerów wątrobowych w regenerującej się wątrobie za pomocą odpowiednio epifluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak modele aktywacji owalnych komórek gryzoni, jest to, że dzięki tej technice regeneracyjne hepatocyty pochodzą głównie z komórek nabłonka dróg żółciowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji wątroby, takie jak to, w jaki sposób komórki progowe dróg żółciowych lub wątroby przyczyniają się do regeneracji wątroby Ogólnie rzecz biorąc, indywidualne lub nowe w tej metodzie będą walczyć, ponieważ rozmiar wątroby w laboratorium ołowiu i degeneracji jest zmienny.

Aby przeprowadzić krycie na czas, ustaw dorosłego samca i samicę ryb hemizygotycznych lub homozygotycznych na noc z przegrodą między nimi. Wyjmij przegrodę następnego ranka, gdy pożądane jest krycie, używając sitka z drobną siatką z tworzywa sztucznego do zebrania zarodków, odwróć sitko do góry nogami i użyj butelki do wyciskania, aby spłukać powierzchnię siatki drobnym strumieniem wody z jaj. Następnie przenieś do 100 zarodków na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 25 mililitrów wody jajecznej i umieść szalkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza, aby zahamować pigmentację.

Dodaj PTU do kultury do 10 godzin. Po zapłodnieniu po 80 godzinach. Po personalizacji znieczulij larwy tricą i użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby zebrać larwy CFP dodatnie, zachowując tylko zwierzęta o podobnej wielkości wątrobach.

Następnie zastąp wodę z jaj trica świeżą wodą jajeczną uzupełnioną PTU i włóż larwy danio pręgowanego z dodatnim CFP do inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Aby potraktować larwy danio pręgowanego MTZ, najpierw podziel odpowiednią liczbę larw na dwa różne naczynia hodowlane. Badaną grupę larw należy przechowywać w roztworze świeżo przygotowanego MTZ, a grupę kontrolną w wodzie z jaj.

Uzupełniony o DMSO. Przykryj grupę doświadczalną folią aluminiową, aby zapobiec dezaktywacji fotoaktywnej MTZ i inkubuj obie grupy larw danio pręgowanego w temperaturze 28 stopni Celsjusza pod koniec okresu ablacji. Usuń roztwór MTZ z płytek i umyj larwy poddane działaniu MTZ dwa do trzech razy 25 mililitrami wody jajecznej i mieszając, wylewając wodę jajeczną Po każdym myciu.

Po ostatnim przepłukaniu unieruchomić larwy połową stężenia trica stosowanego wcześniej, aby uniknąć obrzęku serca i śmierci larw leczonych MTZ. Następnie użyj filtra CFP w mikroskopie fluorescencyjnym epi, aby ocenić poziomy ablacji hepatocytów na podstawie względnej wielkości wątroby larw leczonych MTZ. Rozważ, że danio pręgowany z dużymi wątrobami stanowiącymi od 0 do 5% larw nie uległ ablacji.

Osoby ze średniej wielkości wątrobami stanowiącymi od 10 do 20% larw do częściowej ablacji i osoby z bardzo małymi wątrobami stanowiącymi od 80 do 90% larw do całkowitej ablacji. Po sklasyfikowaniu wszystkich zwierząt odkryj larwy z wątrobą bez ablacji lub częściowo poddaną ablacji, zatrzymując tylko rybę danio pręgowanego z maleńkimi wątrobami wskazującymi na ciężką ablację hepatocytów do analizy wątroby. W punkcie czasu regeneracji godziny zero przenieś larwy do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Natychmiast po wypłukaniu MTZ i pozyskaniu CFP, zastąp wodę jajeczną 3% buforem MPEM z formaldehydu w celu utrwalenia przez noc na wirniku o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka zastąp roztwór utrwalający jednym mililitrem P-B-S-D-T i obracaj larwy przez dodatkowe pięć minut. Następnie wszystkie larwy utrwalić na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej świeże P-B-S-D-T pod mikroskopem preparacyjnym i użyć kleszczy do ręcznego usunięcia żółtka i płetw piersiowych, gdy wszystkie larwy zostaną przycięte.

Przenieś do 20 zwierząt do probówki o pojemności 1,5 mililitra i zastąp P-B-S-D-T jednym mililitrem roztworu blokującego. Po dwóch godzinach na rotatorze w temperaturze pokojowej zastąp roztwór blokujący 100 mikrolitrami pierwotnego koktajlu przeciwciał do całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia z kołysaniem usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i umyj danio pręgowanego P-B-S-D-T przez pięć 10-minutowych płukań.

Po ostatnim płukaniu dodać 100 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Na koniec umyj larwy pięć razy w P-B-S-D-T, jak właśnie pokazano. Ustaw larwy bocznie na szkiełku mikroskopowym i dodaj kroplę podłoża mocującego.

Następnie ostrożnie przykryj każdą rybę zebry szkłem nakrywkowym i uszczelnij szkło nakrywkowe lakierem do paznokci. Leczenie MTZ przez 36 godzin od 3,5 do pięciu dni po zapłodnieniu radykalnie zmniejsza rozmiar wątroby. Po wypłukaniu MTZ silna ekspresja CFP i czerwieni pojawia się ponownie w ciągu 30 godzin, co oceniano na podstawie ekspresji LCAM w błonie komórek nabłonka dróg żółciowych.

Wewnątrzwątrobowa sieć żółciowa początkowo zapada się, ale następnie zostaje przywrócona 54 godziny po wypłukaniu, co wskazuje na szybką regenerację i regenerację wątroby. Na tych obrazach regenerujące się hepatocyty transgeniczne dla jądrowego białka czerwonej fluorescencji ulegające ekspresji wyłącznie w komórkach nabłonka żółciowego wątroby pokazano, że większość z tych H, dwóch komórek wiśni BM dodatnich w regenerującej wątrobie wyraża HNF cztery alfa w godzinie regeneracji zero w czwartej godzinie regeneracji C, osiem. Hepatocyty CFP zakażone MTZ nadal zachowują ekspresję wiśni H 2 BM, co wskazuje na konwersję komórek nabłonka dróg żółciowych do hepatocytów po ciężkiej utracie hepatocytów.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby wybrać pełną ablację po leczeniu MTT do późniejszej regeneracji wątroby po lizie Działanie po jego rozwinieniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regeneracją wątroby do zbadania mechanizmów leżących u podstaw genezy wątroby, czyli regeneracji wątroby sterowanej komórkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tego specyficznego dla geografii modelu operacyjnego cytów w badaniach nad zwyrodnieniem wątroby napędzanym bilio.