Name: Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę ablacji hepatocytów u Danio rerio w celu badania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe. Technika wykorzystuje metronidazol i mikroskopię fluorescencyjną do analizy procesów regeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują doktorom Hukriede i Tsangowi za dyskusje. M.K. otrzymał wsparcie w ramach grantu szkoleniowego NIH (T32EB001026). Praca ta była częściowo wspierana przez granty z American Liver Foundation, March of Dimes Foundation (5-FY12-39) i NIH (DK101426) dla D.S.

Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardową procedurą; eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu.
1. Przygotowanie zarodków/larw
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić krycie na czas, ustaw dorosłe samce i samice Tg(fabp10a:CFP-NTR)s931 hemizygotyczne lub homozygotyczne ryby O/N i umieść między nimi przegrodę. Usuń tę przegrodę następnego ranka, gdy pożądane jest krycie. Zbieraj zarodki, odcedzając wodę za pomocą sitka z drobną siatką z tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Odwróć sitko do góry nogami i spłucz powierzchnię siatki drobnym strumieniem wody jajecznej nalewanej z wyciskanej butelki. Przenieś 100 zarodków na szalkę Petriego o średnicy 100 mm z 25 ml wody jajecznej. Przechowywać nie więcej niż 100 zarodków na szalce Petriego i hodować je w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Aby zahamować pigmentację, dodaj fenylotiomocznik (PTU) do szalek Petriego przed 10 godzinami po zapłodnieniu (hpf) i hoduj zarodki/larwy do 80 hpf. Końcowe stężenie PTU wynosi 0,2 mM. UWAGA: PTU jest toksyczny. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Znieczulić larwy poprzez dodanie estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina) o końcowym stężeniu 0,016% do szalek Petriego. Następnie, za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, posortuj larwy CFP-dodatnie. Używaj larw o podobnej wielkości wątroby i odrzucaj te z mniejszą lub większą wątrobą. 
	UWAGA: można użyć dowolnych larw CFP-dodatnich, niezależnie od intensywności, ponieważ nie ma różnicy w zakresie ablacji hepatocytów między larwami hemizygotycznymi i homozygotycznymi. UWAGA: trikaina jest toksyczna. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Usuń wodę jajeczną zawierającą trikainę i dodaj wodę jajeczną uzupełnioną 0,2 mM PTU. Przechowywać zarodki/larwy w temperaturze 28 °C.</li>
</ol>
2. Leczenie Mtz
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór 10 mM Mtz, rozpuszczając 0,171 g proszku Mtz w 100 ml wody jajecznej uzupełnionej 0,2% DMSO i 0,2 mM PTU. Aby całkowicie rozpuścić Mtz, wymieszaj roztwór w temperaturze pokojowej, szybko mieszając przez 20-30 minut. Aby pomóc w rozpuszczaniu Mtz i zwiększyć przenikanie Mtz do larw, dodaj DMSO podczas przygotowywania Mtz. UWAGA: długotrwałe narażenie lub zwiększone stężenie Mtz jest toksyczne. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Podzielić larwy na grupy kontrolne i eksperymentalne, przenosząc żądaną liczbę larw na dwie różne 100-milimetrowe szalki Petriego lub płytkę wielodołkową. W przypadku grupy doświadczalnej larwy należy przechowywać w roztworze o stężeniu 10 mM Mtz; w przypadku grupy kontrolnej trzymaj je w wodzie jajecznej zawierającej 0,2% DMSO.</li>
	<li>Przykryć płytki lub szalki Petriego zawierające roztwór Mtz folią aluminiową, aby zapobiec fotoinaktywacji Mtz, i inkubować w temperaturze 28 °C. Czas trwania leczenia Mtz zależy od stadium larwalnego i linii transgenicznej.</li>
	<li>Aby zaobserwować podobną ciężką ablację hepatocytów w linii Tg(fabp10a:CFP-NTR), należy potraktować larwy roztworem Mtz od 3,5 dnia po zapłodnieniu (dpf) (przez 36 godzin) lub od 5 dpf (przez 24 godziny).</li>
</ol>
3. Analiza regeneracji wątroby pod wpływem dróg żółciowych
<ol>
	<li>Pod koniec okresu ablacji należy usunąć roztwór Mtz z płytek. Umyj larwy poddane działaniu Mtz, dodając 25 ml wody jajecznej. Zakręć płytką 2-3 razy, aby umyć larwy przed wylaniem wody z jaja. Powtórz trzy razy, a następnie ponownie zanurz larwy w wodzie z jaj. Aby uniknąć obrzęku serca i śmierci larw u larw leczonych Mtz, należy dodać niższe stężenie trikainy, o końcowym stężeniu 0,008%, w celu unieruchomienia larw.</li>
	<li>W celu analizy wątroby należy zbadać wielkość wątroby larw leczonych Mtz pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem CFP. Oceń poziom ablacji hepatocytów na podstawie względnej wielkości wątroby: duża (bez ablacji; 0-10% larw), średnia (częściowo poddana ablacji; 10-20%) i bardzo mała (całkowicie poddana ablacji; 80-90%).</li>
	<li>Usunąć larwy z wątrobami niepoddanymi ablacji lub częściowo poddanymi ablacji. Trzymaj larwy tylko z maleńką wątrobą, co wskazuje na ciężką ablację hepatocytów. W celu analizy wątroby w punkcie czasowym regeneracji 0 godz. (R0h) należy pobrać larwy po wypłukaniu Mtz i sortowaniu CFP. W przeciwnym razie posortowane larwy należy przechowywać w wodzie jajowej uzupełnionej 0,2 mM PTU, aż będą gotowe do zbioru.</li>
	<li>Zebrane larwy przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i zastąpić wodę z jaj roztworem utrwalającym 3% formaldehydu w buforze PEM. Inkubować probówkę na rotatorze O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zastąp roztwór utrwalający 1 ml PBSDT i obracaj probówkę zawierającą larwy na rotatorze przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść utrwalone larwy na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą PBSDT i za pomocą kleszczy ręcznie usunąć żółtko i płetwy piersiowe pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieść do 20 wypreparowanych larw do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zastąp roztwór PBSDT 1 ml roztworu blokującego i kołysz probówką na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Zastąp roztwór blokujący 100 μl roztworu blokującego zawierającego przeciwciała pierwszorzędowe. Powoli kołysz rurką na rotatorze O/N w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć PBSDT 5 razy przez 10 minut za każdym razem. Następnie dodaj 100 ul roztworu blokującego zawierającego przeciwciała drugorzędowe i kołysz nim na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Myć 5 razy PBSDT przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej, kołysząc się na rotatorze.</li>
	<li>Ustaw larwy bocznie na szkiełku mikroskopowym i dodaj kroplę podłoża mocującego. Ostrożnie przykryj je szkłem nakrywkowym i uszczelnij szkło nakrywkowe polerką do paznokci. Teraz jest gotowy do mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>

<ol><li>Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroen+Hepatol%22%5BJournal%5D)">New concepts in liver regeneration.</a> J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hepatocytes+and+oval+cells+in+liver+regeneration+and+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation.</a> Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+and+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells and Liver Regeneration.</a> Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+Alternative+epithelial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+B%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: Alternative epithelial pathways.</a> Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).</li>
<li>Falkowski, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+hepatocyte+%27buds%27+in+cirrhosis+from+intrabiliary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+hepatology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells.</a> Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).</li>
<li>Yoon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Cell+Adhesion+Molecule+%28EpCAM%29+Marks+Hepatocytes+Newly+Derived+from+Stem%2FProgenitor+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.</a> Hepatology. 53, 964-973 (2011).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+after+Partial+Hepatectomy+Critical+Analysis+of+Mechanistic+Dilemmas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas.</a> Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).</li>
<li>Yanger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hepatocytes+are+generated+by+self-duplication+rather+than+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).</li>
<li>Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+against+a+Stem+Cell+Origin+of+New+Hepatocytes+in+a+Common+Mouse+Model+of+Chronic+Liver+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury.</a> Cell reports. 8, 933-939 (2014).</li>
<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+alpha+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator%2C+uhrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosothiol+signaling+regulates+liver+development+and+improves+outcome+following+toxic+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury.</a> Cell reports. 6, 56-69 (2014).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2-regulated+wnt+signaling+and+N-acetylcysteine+are+synergistically+hepatoprotective+in+zebrafish+acetaminophen+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+A+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. , (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).</li>
<li>Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+signals+modulate+hepatocyte+apicobasal+polarization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish.</a> Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).</li>
<li>Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+Notch+signaling+regulate+quiescence%2C+renewal+and+differentiation+in+pancreatic+endocrine+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors.</a> Development. 139, 1557-1567 (2012).</li>
<li>Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+notch+signal+during+zebrafish+intrahepatic+biliary+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+by+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li>
<li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li>
<li>Stueck, A. E., Wanless, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+cirrhosis%3A+The+maturation+sequence+of+buds+arising+from+hepatocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells.</a> Hepatology. 58, 235A(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Poważna, ale nie łagodna ablacja hepatocytów wywołuje regenerację wątroby napędzaną przez żółć. Dlatego po leczeniu Mtz i wypłukaniu ważne jest zbadanie wielkości wątroby larw leczonych Mtz, którą można ocenić za pomocą wewnętrznej fluorescencji CFP z transgenu fabp10a:CFP-NTR . Ponieważ niewielki odsetek larw leczonych Mtz będzie wykazywał nieablowaną (0-5%) lub częściowo ablowaną (10-20%) wątrobę, konieczne jest uporządkowanie i przeanalizowanie tylko larw z bardzo małą wątrobą, co wskazuje na ciężką ablację h...

Wątroba jest organem wysoce regenerującym. Podczas regeneracji wątroby regenerujące się hepatocyty, komórki miąższowe wątroby, pochodzą z wcześniej istniejących hepatocytów (regeneracja wątroby sterowana przez hepatocyty) lub BEC (regeneracja wątroby sterowana przez żółć)1,2. Uszkodzenie wątroby zwykle wywołuje proliferację wcześniej istniejących hepatocytów; jednakże, gdy proliferacja hepatocytów jest zagrożona, BEC mogą przyczyniać się do hepatocytów2-4. Te dwa tryby regeneracji wątroby mają znaczenie kliniczne. Po chirurgicznym usunięciu części ludzkiej wątroby (np. z powodu guzów wątroby lub żywych dawców wątroby), hepatocyty w pozostałej wątrobie namnażają się, aby odzyskać utraconą masę wątroby. Natomiast u pacjentów z ciężkimi chorobami wątroby proliferacja hepatocytów jest znacznie upośledzona, tak że BEC lub komórki progenitorowe wątroby (LPC) wydają się przyczyniać do regeneracji hepatocytów5,6. Model częściowej hepatektomii 2/3 gryzoni, w którym hepatocyty namnażają się w celu odzyskania utraconej masy wątroby, znacząco przyczynił się do obecnego zrozumienia regeneracji wątroby sterowanej przez hepatocyty7,8. Nie ma jednak prawidłowego modelu gryzoni, w którym regenerujące się hepatocyty pochodzą głównie z BEC. Chociaż kilka modeli toksyn wątrobowych gryzoni doprowadziło do identyfikacji regeneracji wątroby sterowanej przez drogi żółciowe2-4, ostatnie badania śledzenia linii u myszy wskazują na minimalny wkład BEC w regenerację hepatocytów w tych modelach9,10. Niektóre z modeli uszkodzeń wątroby gryzoni, w tym częściowa hepatektomia11-13 i uszkodzenie wątroby wywołane paracetamolem14,15, zostały zastosowane u danio pręgowanego i doprowadziły do identyfikacji nowych genów lub szlaków zaangażowanych w regenerację wątroby. Jednak regeneracja wątroby sterowana przez hepatocyty, ale nie przez BEC, występuje w tych modelach uszkodzenia wątroby danio pręgowanego. W związku z tym potrzebny jest nowy model uszkodzenia wątroby, w którym BEC w znacznym stopniu przyczyniają się do regeneracji hepatocytów, aby lepiej zrozumieć regenerację wątroby sterowaną przez BEC.
Ogólne cele opisanego tutaj modelu ablacji hepatocytów to (1) wygenerowanie modelu uszkodzenia wątroby, w którym BEC w znacznym stopniu przyczyniają się do regeneracji hepatocytów, oraz (2) wyjaśnienie molekularnych i komórkowych mechanizmów leżących u podstaw regeneracji wątroby sterowanej przez BEC. Postawiliśmy hipotezę, że ciężkość urazu determinuje sposób regeneracji wątroby; W związku z tym przewidywaliśmy, że regeneracja wątroby napędzana przez drogi żółciowe rozpocznie się po ciężkim uszkodzeniu hepatocytów. Aby przetestować tę hipotezę, opracowaliśmy model uszkodzenia wątroby danio pręgowanego, generując linię transgeniczną, Tg(fabp10a:CFP-NTR)s931, która wykazuje wysoką ekspresję bakteryjnej nitroreduktazy (NTR) połączonej z cyjanowym białkiem fluorescencyjnym (CFP) pod specyficznym dla hepatocytów promotorem fabp10a. Ponieważ NTR przekształca nietoksyczny prolek, metronidazol (Mtz), w lek cytotoksyczny, dokonuje ablacji tylko zamierzonych komórek wykazujących ekspresję NTR16-18, w tym przypadku hepatocytów. Manipulując czasem trwania leczenia Mtz, można kontrolować zakres ablacji hepatocytów. Korzystając z tego modelu, niedawno informowaliśmy, że po poważnej utracie hepatocytów, BEC w znacznym stopniu powodują regenerację hepatocytów19, co zostało dodatkowo potwierdzone w dwóch innych niezależnych badaniach20,21. Dlatego też, w porównaniu z wyżej wymienionymi modelami uszkodzeń wątroby gryzoni i danio pręgowanego, nasz model ablacji hepatocytów jest bardziej korzystny do badania regeneracji wątroby sterowanej przez BEC.
Ten protokół opisuje procedurę przeprowadzania eksperymentów z regeneracją wątroby przy użyciu modelu ablacji hepatocytów danio pręgowanego. Model ten będzie odpowiedni do określenia mechanizmów leżących u podstaw regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe oraz do badań chemicznych w celu identyfikacji małych cząsteczek, które mogą hamować lub zwiększać regenerację wątroby.

<table><tbody><tr><td>Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina) w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Zrób 0,4% (15 mM) wywar trykainowy: Przynieś 0,4 g trikainy do 100 ml z wodą jajeczną. Dostosuj do pH 7.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny siarczan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Materiały montażowe (Vectashield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 x 15 mm&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td>Bezbarwny lakier do paznokci <td>M5300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>drobne kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp;</td></tr><tr><td>szkiełko szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A i 12-542-A 18</td><td>x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (mysz anty-Alcam)</td><td>ZIRC</td><td>zn-5</td> 1<td>:10 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>koza anty-Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>szczura anty-RFP</td><td>Allel Biotechnologia</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anty-kozie IgG (H+L)</td><td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Cy3 osioł anty-szczurzy IgG</td><td>Jackson laboratories</td><td>712-165-150</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>mikroskop preparacyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop epifluorescencyjny</td> Mikroskop konfokalny <td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>woda</td><td></td><td></td> jajeczna <td>0,3 g/L soli morskich ' Natychmiastowy ocean" i 0,5 mM CaSO4 w wodzie destylowanej. 
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25,6 g Na2HPO4&middot; 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&nbsp; Doprowadzić do 1 l wodą destylowaną. Dostosuj pH 7.&nbsp; Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121&C.</td></tr><tr><td>1X PBSDT</td><td></td><td></td><td>0,2% Triton X-100 i 0,2% DMSO w 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> PEM <td>30,2 g RURKI, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&nbsp; Doprowadzić do 1 l wodą destylowaną. Dostosuj pH 7.</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> blokujący<td>: Wymieszaj 1 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej z 9 ml 1X PBSDT.</td></tr></tbody></table>

ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Wątroba ma dużą zdolność do regeneracji. Hepatocyty, komórki miąższowe wątroby, mogą regenerować się na jeden z dwóch sposobów: regenerację wątroby za pomocą hepatocytów lub dróg żółciowych. W regeneracji wątroby sterowanej hepatocytami, regenerujące się hepatocyty pochodzą z wcześniej istniejących hepatocytów, podczas gdy w regeneracji napędzanej żółcią regenerujące się hepatocyty pochodzą z komórek nabłonka dróg żółciowych (BEC). W przypadku regeneracji wątroby opartej na hepatocytach istnieją doskonałe modele gryzoni, które znacząco przyczyniły się do obecnego zrozumienia regeneracji wątroby. Nie istnieje jednak taki model gryzoni do regeneracji wątroby sterowanej przez żółć. Niedawno informowaliśmy o modelu uszkodzenia wątroby danio pręgowanego, w którym BEC w znacznym stopniu powodują powstawanie hepatocytów po poważnej utracie hepatocytów. W tym modelu hepatocyty są specyficznie ablowane za pomocą środków farmakogenetycznych. Tutaj szczegółowo przedstawiamy metody ablacji hepatocytów i analizy procesu regeneracji wątroby sterowanego przez BEC. Ten specyficzny dla hepatocytów model ablacji może być dalej wykorzystywany do odkrywania molekularnych i komórkowych mechanizmów regeneracji wątroby napędzanej przez żółć. Co więcej, metody te mogą być stosowane do chemicznych badań przesiewowych w celu identyfikacji małych cząsteczek, które zwiększają lub hamują regenerację wątroby.

Podawanie Mtz przez 36 h (A36h, gdzie A oznacza ablację) od 3,5 do 5 dpf drastycznie zmniejszyło rozmiar wątroby (Rycina 1B). Po wypłukaniu Mtz, uznanym za początek regeneracji wątroby (R), silna ekspresja fabp10a:CFP-NTR oraz fabp10a:dsRed pojawiła się ponownie w ciągu 30 h (Rycina 1B). Wewnątrzpośrednia sieć żółciowa, oceniana na podstawie ekspresji Alcam obecnego w błonie BECs22, początkowo uległa zapadnięciu, ale została odtworzona w 54 h po wypłukaniu (R...

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem. W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest indukcja ablacji hepatocytów u danio pręgowanego w celu analizy regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe. Jest to realizowane poprzez wstępną ekspozycję transgenicznych larw wykazujących ekspresję nitroreduktazy w hepatocytach na metronidazol lub MTZ. W drugim kroku stopień ablacji hepatocytów jest oceniany na podstawie względnej wielkości wątroby.Po podaniu MTZ w ostatnim etapie, zbiera się larwy z ablacją, posiadające niewielką wątrobę; ostatecznie mierzy się wielkość wątroby oraz ekspresję markerów wątrobowych w regenerującej się wątrobie, odpowiednio za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak modele aktywacji komórek owalnych u gryzoni, jest fakt, że w tej technice regenerujące się hepatocyty pochodzą głównie z nabłonkowych komórek dróg żółciowych. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji wątroby, takie jak sposób, w jaki komórki progenitorowe dróg żółciowych lub wątroby przyczyniają się do regeneracji wątroby. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wielkość wątroby w larwach poddanych ablacji i regeneracji jest zmienna.Aby przeprowadzić zapłodnienia synchroniczne, umieść dorosłe samce i samice hemizygoticzne lub homozygotyczne w jednym zbiorniku na noc, oddzielając je przegrodą. Usuń przegrodę następnego ranka w momencie pożądanego zapłodnienia. Do zebrania embrionów użyj gęstego plastikowego sitka; odwróć sitko do góry dnem i za pomocą butelki z dozownikiem wypłucz powierzchnię siatki cienkim strumieniem wody do jaj. Następnie przenieś do 100 embrionów do szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 25 ml wody do jaj i umieść szalkę w temperaturze 28 °C, aby zahamować pigmentację.Dodaj PTU do hodowli na okres do 10 godzin. Po zapłodnieniu odczekaj 80 godzin. Po tym czasie znieczul larwy przy użyciu trica i wykorzystaj mikroskop fluorescencyjny do wybrania larw wykazujących ekspresję CFP, zachowując jedynie osobniki o podobnej wielkości wątroby.Następnie należy zastąpić wodę z inkubatora dla ikry świeżą wodą do ikry z dodatkiem PTU i przenieść larwy zebrafish wykazujące ekspresję CFP z powrotem do inkubatora ustawionego na 28 °C. Aby poddać larwy zebrafish działaniu MTZ, należy najpierw podzielić odpowiednią liczbę larw do dwóch różnych naczyń hodowlanych. Grupę eksperymentalną larw należy utrzymać w roztworze świeżo przygotowanego MTZ, a grupę kontrolną w wodzie do ikry.Uzupełnić DMSO. Grupę eksperymentalną przykryć folią aluminiową, aby zapobiec fotoinaktywacji MTZ, a następnie inkubować obie grupy larw zebrafish w temperaturze 28 °C do końca okresu ablacji. Usunąć roztwór MTZ z płytek, a larwy traktowane MTZ przemyć dwa do trzech razy 25 ml wody do jaj (egg water), delikatnie mieszając i wylewając wodę po każdym przemyciu.Po ostatnim płukaniu unieruchom początkowo używanym stężeniem trica zmniejszonym o połowę, aby uniknąć obrzęku serca i śmierci larw traktowanych MTZ. Następnie użyj filtra CFP w mikroskopie fluorescencyjnym epifluorescencyjnym, aby ocenić stopień ablacji hepatocytów na podstawie względnej wielkości wątroby u larw traktowanych MTZ. Rybki danio pręgowane z dużymi wątrobami, stanowiące od 0 do 5% larw, należy uznać za nieablacyjne.Larwy z wątrobą średniej wielkości, stanowiące 10 do 20% populacji, zostaną poddane ablacji częściowej, natomiast larwy z bardzo małą wątrobą, stanowiące 80 do 90% populacji, zostaną poddane ablacji całkowitej. Po sklasyfikowaniu wszystkich zwierząt, należy wyeliminować larwy z wątrobami nieablacyjnymi lub częściowo ablacyjnymi, pozostawiając jedynie danio pręgowane z miniaturowymi wątrobami, co wskazuje na silną ablację hepatocytów niezbędną do analizy wątroby. W punkcie czasowym zero godziny regeneracji, należy przenieść larwy do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml.Bezpośrednio po wypłukaniu MTZ i sourcingu CFP, należy zastąpić wodę z jajami buforem MPEM z 3% formaldehydem i pozostawić do utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze. Następnego dnia roztwór utrwalający należy zastąpić 1 mL PBS-T i rotować larwy przez dodatkowe pięć minut. Następnie wszystkie utrwalone larwy należy przenieść pod mikroskop stereoskopowym do szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej świeży PBS-T i za pomocą pęsety ręcznie usunąć żółtko oraz płetwy piersiowe, aż wszystkie larwy zostaną odpowiednio przycięte.Przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml maksymalnie 20 zwierząt i zastąp P-B-S-D-T jednym mililitrem roztworu blokującego. Po dwóch godzinach na rotatorze w temperaturze pokojowej zastąp roztwór blokujący 100 µl koktajlu przeciwciał pierwszorzędowych i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia, podczas kołysania, usuń roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i przemyj danio pręgowane w P-B-S-D-T, wykonując pięć 10-minutowych przemyć.Po ostatnim przemyciu dodaj 100 µL przeciwciała wtórnego i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy stałym kołysaniu. Na koniec przemyj larwy pięć razy w P-B-S-D-T, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Ułóż larwy bocznie na szkiełku przedmiotowym i dodaj kroplę medium montażowego.Następnie ostrożnie przykryj każdą rybkę danio pręgowaną szkiełkiem nakrywką i uszczelnij je lakierem do paznokci. Leczenie MTZ przez 36 godzin, od 3,5 do pięciu dni po zapłodnieniu, drastycznie zmniejsza rozmiar wątroby. Po wypłukaniu MTZ silna ekspresja CFP i czerwona ponownie pojawiają się w ciągu 30 godzin, co potwierdzono poprzez ocenę ekspresji LCAM w błonie komórek nabłonka dróg żółciowych.Wewnątrzwątrobna sieć żółciowa początkowo ulega zapadnięciu, lecz zostaje odtworzona w 54 godzinie po wypłukaniu, co wskazuje na szybką regenerację i powrót funkcji wątroby. Na tych obrazach przedstawiono regenerujące się hepatocyty transgeniczne pod kątem jądrowego czerwonego białka fluorescencyjnego, wyrażanego wyłącznie w komórkach nabłonka żółciowego wątroby; większość tych komórek H2B-mCherry-dodatnich w regenerującej się wątrobie wykazuje ekspresję HNF4α w 0. godzinie regeneracji oraz w 4. i 8. godzinie regeneracji. Hepatocyty CFP-dodatnie traktowane MTZ nadal utrzymują ekspresję H2B-mCherry, co wskazuje na konwersję komórek nabłonka żółciowego w hepatocyty w przypadku znacznej utraty hepatocytów.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wybraniu pełnej ablacji po traktowaniu MTT, aby umożliwić późniejszą regenerację wątroby w wyniku działania lizy po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie regeneracji wątroby do zgłębienia mechanizmów leżących u podstaw regeneracji wątroby napędzanej przez komórki progenitorowe wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wykorzystać ten specyficzny model operacyjny hepatocytów w badaniach nad degeneracją wątroby napędzaną przez drogi żółciowe.

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Specyficzna dla hepatocytów ablacja u danio prążkowanego w celu badania regeneracji wątroby zależnej od dróg żółciowych

Artykuł opisuje celowaną ablację wątroby, metodę wywoływania śmierci hepatocytów za pomocą metronidazolu u transgenicznych larw danio pręgowanego. Przykładowy protokół opisuje proces generowania, manipulowania i oceny celowanej ablacji wątroby u danio pręgowanego.

Celowana ablacja wątroby: indukowanie śmierci hepatocytów za pomocą metronidazolu u transgenicznych larw danio pręgowanego

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje analizy histologiczne wątroby larw danio pręgowanego, które były leczone 2% etanolem przez 24 godziny. Takie ostre leczenie etanolem powoduje stłuszczenie wątroby i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Ten protokół pokazuje, jak konsekwentnie wycinać wypławki oczu (panewki wzrokowe) bez naruszania otaczających tkanek. Za pomocą igły insulinowej i strzykawki można dokonać ablacji jednego lub obu oczu, aby ułatwić badania nad mechanizmami regulującymi regenerację oczu, ewolucją regeneracji wzroku i neuronalnymi podstawami zachowań wywołanych światłem.

Test ablacji chirurgicznej do badania regeneracji oka u wypławków

Poznaj metodę ablacji hepatocytów u Danio rerio w celu badania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe. Technika wykorzystuje metronidazol i mikroskopię fluorescencyjną do analizy procesów regeneracyjnych.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Przeglądaj więcej filmów