Name: Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Naucz się przygotowywać kriosekcje z biopsji mięśniowych bez artefaktów zamrażania. Metoda obejmuje szybkie zamrażanie w izopentanie, wbudowanie w OCT i barwienie do analizy histologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Alexowi Millerowi za poprawki w rękopisie. Praca ta została wsparta grantami badawczymi przyznanymi M.G. przez Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) i Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Pobieranie tkanek i zamrażanie tkanek mięśniowych
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu (2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan). Wykonaj ten krok w dygestoriach i użyj wtórnej metody zabezpieczania, takiej jak eksykator lub słoik dzwonowy zawierający bawełniany wacik nasączony izofluranem.</li>
	<li>Potwierdź śmierć, mocno ściskając podnóżek. Zastosuj wtórną metodę eutanazji, taką jak zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Zwilż sierść 70% alkoholem, aby zmniejszyć sklejanie się luźnych pasm włosów na mięśniach. Zdejmij skórę z kończyny za pomocą cienkich kleszczy, takich jak #5.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel mięsień będący przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku piszczel przedni (TA)) od kości pod spodem, zaczynając od ścięgna i usuń.</li>
	<li>Wytnij mięsień, przykryj go związkiem OCT (Optimum Cutting Temperature) i połóż płasko na oznakowanej jednorazowej formie do zamrażania. Upewnij się, że mięsień jest w normalnej orientacji fizjologicznej (od głowy do ogona) bez rozciągania. Alternatywnie, zamroź mięsień na małych styropianowych kwadratach i przypnij go za pomocą szpilek przeciw owadom, aby zapewnić odpowiednią długość mięśni.</li>
	<li>Schłodzić 2-metylobutan (izopentan) w stalowej zlewce przy użyciu ciekłego azotu. Trwa to średnio 3 - 5 min. Mieszaj z przerwami, aż na dnie i ściankach zlewki zaczną tworzyć się białe osady. 
	UWAGA: W takim przypadku izopentan osiągnął optymalną temperaturę zamarzania (-150 °C)</li>
	<li>Zanurz formy zawierające mięśnie w schłodzonym 2-metylobutanie. Zamroź małe mięśnie, takie jak przepona i prostownik palca długiego (EDL) na 6 - 12 sekund, a większe mięśnie, takie jak mięśnie brzuchaty łydki (GS) i triceps na 15 - 20 sekund. Nie zamrażaj mięśni zbyt długo, ponieważ może to prowadzić do pękania.</li>
	<li>Przenieś zamrożone tkanki na suchy lód i pozwól izopentanowi odparować (należy pamiętać, że proces ten trwa średnio około 15 - 20 minut). Zawiń chusteczki w folię aluminiową i przechowuj je w bardzo niskiej temperaturze (od -70 °C do -80 °C) do momentu pokrojenia.</li>
</ol>
2. Osadzanie tkanek w OCT w celu przygotowania bloku tkanek
<ol>
	<li>Transportuj tkanki na suchym lodzie do cyrostatu, aby zapobiec rozmrożeniu. Przenieść tkankę do komory kriostatu (ustawionej na temperaturę od -20 do -24 °C, aby uniknąć całkowitego rozmrożenia tkanek) i pozostawić je do równowagi przez 30 minut.</li>
	<li>Włącz chłodzenie wnęki Peltiera. Jeśli kriostat nie ma tego chłodzenia, użyj sprayu chłodzącego w aerozolu, aby szybko zamrozić OCT. Nie pozwól, aby mięsień rozmroził się w żadnym momencie podczas osadzania, ponieważ może to spowodować uszkodzenia spowodowane zamarzaniem.</li>
	<li>Nałóż jednolitą cienką warstwę OCT na krążek próbki i pozwól jej ostygnąć. Gdy większość OCT zostanie zamrożona na dnie, podczas gdy płyn jest nadal płynny na górze, wprowadź tkankę we właściwej orientacji (prostopadle do OCT dla odcinków poprzecznych i równolegle do OCT dla odcinków podłużnych). Użyj sprayu chłodzącego w aerozolu, aby szybko zamrozić OCT. Dotknij nieosadzonej części tkanki ekstraktorem ciepła i odczekaj 45 sekund.</li>
	<li>Dodaj kolejną cienką warstwę OCT wokół mięśnia, spryskaj sprayem chłodzącym w aerozolu i odprowadź ciepło, tak jak w poprzednim kroku.</li>
	<li>Dodawaj OCT małymi krokami i szybko zamroź OCT za pomocą kombinacji aerozolu chłodzącego w sprayu i ekstraktora ciepła, aż cały mięsień zostanie pokryty.</li>
	<li>Umieść ekstraktor ciepła na górze bloku tkanek i odczekaj 5 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie sekcji i identyfikacja sekcji od środkowej części brzucha mięśni
<ol>
	<li>Zamontuj próbkę na głowicy próbki. Dokręć pokrętło, aby zabezpieczyć dysk. Upewnij się, że krążek próbki ma dobry kontakt z głowicą próbki.</li>
	<li>Ustaw temperaturę komory w zakresie od -21 do -24 °C i poczekaj, aż zostanie osiągnięta ustawiona temperatura.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia grubości (7 μm); przytnij blok, przesuwając lub cofając blok za pomocą ustawień zgrubnych i precyzyjnych.</li>
	<li>Zbierz skrawki na wstępnie podgrzanych dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych, dociskając górną część szkiełka do sekcji, wykorzystując przyciąganie między przeciwnymi ładunkami, aby ułatwić przyleganie wyciętych odcinków do szkiełka.</li>
	<li>Zidentyfikuj sekcje środkowego brzucha, mierząc pole przekroju poprzecznego (CSA) sekcji. Zrób to za pomocą oprogramowania do obrazowania na komputerze podłączonym do mikroskopu. 
	UWAGA: Wykonywane są obrazy kontrastu fazowego, a obwód całego mięśnia jest mierzony za pomocą funkcji śledzenia w oprogramowaniu. Da to zarówno pomiary CSA, jak i minimalną średnicę fretki (miara wielkości przekroju poprzecznego włókna, która jest wyrażona jako najmniejsza odległość między dwiema równoległymi stycznymi po przeciwnych stronach cząstki). Uwaga: Kiedy pomiary CSA i minimalnej średnicy fretki zaczynają się stabilizować, osiągnięto środek brzucha.</li>
	<li>Zinwentaryzuj i zarchiwizuj szkiełka w temperaturze -80 °C do przyszłego barwienia. 
	UWAGA: OCT nie musi być usuwany przed procedurami barwienia. Po nałożeniu szkiełek nakrywkowych są one natychmiast gotowe do barwienia.</li>
</ol>
4. Barwienie
UWAGA: Chociaż szczegółowe procedury krok po kroku można znaleźć w karcie produktu i należy ich przestrzegać w przypadku procedur barwienia, może być wymagana osobista optymalizacja, aby uzyskać optymalne barwienie.
<ol>
	<li>Ponieważ media montażowe (patrz tabela) nie mieszają się z wodą, szkiełka odwadniane przepuszczają przez coraz większe ilości alkoholu (po 2 minuty w 70%, 95% i 100% etanolu) i oczyszczają je ksylenem (100% przez 5 minut), aby zapewnić, że szkiełka nie staną się z czasem nieprzezroczyste.</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe i pozostaw do wyschnięcia. Obraz za pomocą mikroskopu wyposażonego w oprogramowanie do obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
<li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li>
<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Histologia i immunohistochemia zostały wykorzystane jako kluczowe narzędzia w zrozumieniu manifestacji i progresji patologii w różnych zaburzeniach nerwowo-mięśniowych. Klasycznie biopsje mięśni były najpierw utrwalane w formaldehydzie, a następnie zatapiane woskiem parafinowym. Podczas gdy wiązanie formaldehydu zachowuje architekturę tkankową i umożliwia przechowywanie i transport tkanek w temperaturze pokojowej, dezaktywuje również enzymy i białka sieciujące, co wymaga dalszych kroków w celu uzyskania dokładnego barwie...

Badanie histologii mięśni odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu różnych typów zaburzeń nerwowo-mięśniowych1-4. W połączeniu z innymi technikami pozwala badaczom lepiej zrozumieć manifestację i postęp patologii, a także może być niezbędna do oceny skuteczności interwencji terapeutycznej5-10. Jednak, aby być dokładnym, tkanki muszą być zachowane w odpowiedni sposób, aby zachować stan fizjologiczny bezpośrednio przed wycięciem. Wymaga to dużej ostrożności podczas usuwania, konserwowania, krojenia i barwienia.
Tkanki mogą być przygotowane na dwa różne sposoby do mikroskopowego badania światłem. Pierwsza metoda, skrawki zatopione w parafinie (FFPE), wymaga utrwalenia tkanek w 10% naturalnym buforowanym formaldehydzie przed zatopieniem ich woskiem parafinowym11,12. Etap fiksacji pomaga lepiej zachować morfologię, ale także sieciuje białka endogenne, co wymaga skomplikowanych procedur pobierania antygenu w celu barwienia immunologicznego i eliminuje możliwość barwienia enzymatycznego na takich odcinkach12. Z drugiej strony zamrożone sekcje nie muszą być wstępnie mocowane ani przetwarzane; Dlatego białka są w stanie zachować natywne konformacje biologiczne13,14. Co więcej, zamrożone skrawki pozwalają również na szybki czas realizacji, co czasami jest konieczne, na przykład w śródoperacyjnej diagnostyce mięsaków i innych biopsjach chirurgicznych15. Jeśli jednak metoda ta nie zostanie wykonana prawidłowo, jest podatna na uszkodzenia spowodowane zamarzaniem, co wprowadza zmiany w architekturze mięśni, przez co skrawki nie nadają się do badania histologicznego. W tym artykule przedstawiono najskuteczniejszą metodę przygotowania biopsji mięśni w celu uzyskania optymalnego barwienia dla prawidłowego badania.

<table><tbody><tr><td>Kriostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 USA, telefon biurowy 1-800-248-0123 Alternatywa: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500 Alternatywa: Olympus</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Nikon Imaging Software Badania podstawowe</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500 Alternatywy: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 Stany Zjednoczone</td></tr> Ameryki<tr><td>PAŹ</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternatywne źródło: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Jednorazowa forma do tkanek</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: Prowadnice VWR</td></tr><tr><td>Scientific Colorfrost plus</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR</td></tr><tr><td>Scientific Alkohol etylowy</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR</td></tr><tr><td>Scientific Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatywne źródło: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Ocena histologiczna biopsji mięśni posłużyła jako niezbędne narzędzie w zrozumieniu rozwoju i postępu patologii zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Jednak w tym celu należy zachować odpowiednią ostrożność podczas wycinania i konserwowania tkanek, aby uzyskać optymalne barwienie. Jedna z metod konserwacji tkanek polega na utrwaleniu tkanek w formaldehydzie, a następnie zatopieniu ich w wosku parafinowym. Ta metoda dobrze zachowuje morfologię i pozwala na długotrwałe przechowywanie w temperaturze pokojowej, ale jest kłopotliwa i wymaga obchodzenia się z toksycznymi chemikaliami. Co więcej, wiązanie formaldehydu powoduje sieciowanie antygenu, co wymaga protokołów pobierania antygenu w celu skutecznego barwienia immunologicznego. Wręcz przeciwnie, zamrożone cięcie nie wymaga utrwalenia, a tym samym zachowuje biologiczną konformację antygenu. Metoda ta zapewnia również wyraźną przewagę w krótkim czasie realizacji, co czyni ją szczególnie przydatną w sytuacjach wymagających szybkiej oceny histologicznej, takich jak śródoperacyjne biopsje chirurgiczne. Tutaj opisujemy najskuteczniejszą metodę przygotowania biopsji mięśni do wizualizacji z różnymi barwnikami histologicznymi i immunologicznymi.

Układ do pobierania i mrożenia tkanek przedstawiono na Rysunku 1. Wycięte tkanki należy przechowywać na gazie nasączonej PBS, aby zapobiec ich wysychaniu (Rysunek 1A). Po wybraniu tkanek do analizy histologicznej, należy zanurzyć je w OCT i ułożyć w formie do mrożenia w odpowiedniej orientacji oraz w stopniu jak najbliższym długości fizjologicznej, aby zapewnić dokładną morfologię (Rysunek 1B). Zawiesinę izopentanu odpowiednią do mrożenia tkanek uzyskuje się poprzez schł...

Tutaj demonstrujemy najbardziej efektywne metody zamrażania, osadzania, kriosekcji i barwienia biopsji mięśni, aby uniknąć artefaktów zamrażania.

Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uniknięcie błędów podczas przygotowywania skrawków mrożonych z biopsji mięśni, takich jak powstawanie artefaktów mrożenia. Osiąga się to poprzez szybkie zamrożenie mięśnia w 2-metylobutanie schłodzonym w ciekłym azocie. Po wyrównaniu temperatury biopsji mięśni w kriotomie, są one zatapiane w medium OCT (optimal cutting temperature) w temperaturze pokojowej, małymi partiami, przy szybkim zamrażaniu z wykorzystaniem chłodzenia aerozolowego i odprowadzania ciepła.Następnie wykonuje się skrawki o grubości siedmiu mikronów i przenosi je na ciepłe, dodatnio naładowane szkiełka przedmiotowe. Ostatnim krokiem jest zabarwienie skrawków tkanek zgodnie z potrzebami, aby ocenić ich histologię. Ostatecznie prawidłowo przygotowane biopsje mięśniowe pozwalają uzyskać dobrze zachowaną strukturę histologiczną tkanki bez artefaktów mrożenia.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak sekcjonowanie tkanek zatopionych w parafinie, jest fakt, że jest ona bardzo szybka i nie zmienia struktury ani funkcji endogennych antygenów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące biologii mięśni w stanie zdrowia i choroby, takie jak wzrost, regeneracja, zapalenie, włóknienie i martwica. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię lub diagnostykę schorzeń mięśni, ponieważ pozwala ona na określenie stanu mięśni zdrowych i chorych.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat różnych postaci dystrofii mięśniowej, można ją również zastosować w innych układach, takich jak kacheksja związana z terminalnymi stadiami nowotworów i AIDS oraz utrata masy mięśniowej w populacjach osób starszych. Rozpocznij od eutanazji myszy poprzez podanie przedawkowania isofluranu pod dygestorium i w wtórnym stopniu zabezpieczenia, na przykład w kloszu.Następnie zwilżono futro 70% alkoholem. Zapobiega to przywieraniu luźnych kosmków włosa do mięśni. Następnie przystąpiono do oddzielania skóry od kończyny, używając precyzyjnej pęsety nr 5.Ostrożnie oddziel interesujący mięsień od kości, zaczynając od ścięgna. W tym przypadku izolowany jest mięsień piszczelowy przedni. Po wycięciu mięśnia pokryj go OCT i połóż płasko na opisanej jednorazowej formie do mrożenia.Więcej OCT zostanie dodane później, przed krojeniem. Upewnij się, że mięsień znajduje się w jego naturalnej orientacji fizjologicznej wzdłuż osi głowa-ogon i że nie jest on rozciągnięty. Teraz schłodzić.Nalej niewielką ilość izopentanu do stalowego zlewka, używając ciekłego azotu. Mieszaj go okresowo przez trzy do pięciu minut za pomocą plastikowej szpatułki. Gdy utworzy się biały osad, izopentan osiągnie optymalną temperaturę; w tym momencie zanurz napełnione formy w roztworze.Małe mięśnie, takie jak przepona i mięsień prostownik palców długi, wymagają od 6 do 12 sekund. Większe mięśnie wymagają od 15 do 20 sekund, gdyż nadmierne zamrażanie może prowadzić do pękania. Kolejnym krokiem jest umieszczenie zamrożonych tkanek na suchym lodzie, aby pozostały izopentan mógł odparować, co zajmuje około 15 do 20 minut.Gdy tkanka wyschnie, należy ją zawinąć w folię i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu wykonania skrawków. Przed sekcjonowaniem zamrożone tkanki należy przetransportować w suchym lodzie do kriotomu.Przenieś tkankę do komory kriostatu ustawionej w temperaturze od -24 do -20 °C i pozostaw ją na 30 minut w celu wyrównania temperatury. W tej temperaturze tkanki nie rozmrożą się całkowicie. Następnie wykonaj osadzanie tkanki.Jeśli jest dostępna, włącz chłodzenie w komorze Peltiera. Następnie nałóż równomierną cienką warstwę OCT na dysk do próbek i pozostaw do schłodzenia. Po zamrożeniu OCT na spodzie, gdy warstwa na górze pozostaje wciąż w stanie ciekłym, włóż tkankę, orientując ją prostopadle do OCT w przypadku przekrojów poprzecznych lub równolegle do OCT w przypadku przekrojów podłużnych.Następnie należy użyć aerozolu chłodzącego, aby szybko zamrozić OCT. Po tym dotknij niezanurowanej części tkanki ekstraktorem ciepła i przytrzymaj go przy tkance przez 45 sekund. Na żadnym etapie tego procesu nie wolno dopuścić do rozmrożenia mięśnia.Jeśli kriosztat nie posiada chłodzenia komory elementem Peltiera, należy zastosować chłodzenie aerozolem, aby szybko zamrozić OCT wokół tkanki. Następnie należy dodać kolejną cienką warstwę OCT wokół mięśnia, spryskać ją sprayem chłodzącym i odprowadzić ciepło w taki sam sposób, jak w poprzednim kroku. Należy kontynuować dodawanie OCT w małych ilościach i szybko je zamrażać, stosując kombinację sprayu chłodzącego i ekstraktora ciepła, aż cały mięsień zostanie pokryty.Następnie umieść ekstraktor ciepła na górnej powierzchni bloku tkankowego i odczekaj pięć minut przed przystąpieniem do krojenia. Próbka jest teraz gotowa do zamocowania na głowicy mikrotomu. Najpierw dokręć pokrętło, aby zabezpieczyć dysk.Upewnij się, że dysk z preparatem ściśle przylega do głowicy uchwytowej, podczas gdy temperatura w komorze osiąga zakres od -24 do -20 °C. Gdy komora osiągnie odpowiednią temperaturę, ustaw grubość skrawka na 7 µm i rozpocznij przycinanie bloku. Do przesuwania bloku używaj pokręteł grubego i precyzyjnego ustawiania.Gdy przekroje będą gotowe do zebrania, należy dociisnąć ich górne krawędzie do dodatnio naładowanych szkiełek, ogrzanych lampą. Jeśli tkanka została zamrożona prawidłowo, jej powierzchnia powinna mieć kredowobiały kolor. Natomiast tkanka, która została zamrożona niewłaściwie lub rozmroziła się podczas procesu montowania, będzie miała kolor od czerwonego do różowego.Preparaty mogą być przechowywane w zamrażarce niskotemperaturowej do przyszłych analiz. Środkową sekcję brzuszną tkanki można zidentyfikować, mierząc pole powierzchni przekroju poprzecznego na obrazach kontrastu fazowego przy użyciu funkcji obrysowywania w oprogramowaniu do analizy obrazu. Analiza ta pozwala na wyznaczenie zarówno powierzchni, jak i pomiar minimalnej średnicy Ferreta.Gdy pomiary te zaczną osiągać poziom plateau, oznacza to dotarcie do środkowej części brzuszca. Choć producenci dostarczają szczegółowych instrukcji dla większości protokołów barwienia, może być wymagana indywidualna optymalizacja w celu uzyskania optymalnego natężenia barwienia. OCT nie musi być usuwane.W celu uzyskania optymalnego barwienia immunochemicznego należy zastosować komorę nawilżającą. Powinna być ona przykryta folią Parafilm, umieszczona na mokrym ręczniku papierowym i zamknięta w niewielkim pudełku, aby zapobiec wysychaniu skrawków. Podczas procesu barwienia preparatów trwałych, które nie są barwione immunochemicznie, należy zgodnie z protokołem barwienia odwodnić preparaty, przepuszczając je przez roztwory alkoholu o rosnącym stężeniu.Ponieważ medium montażowe nie jest wymywalne w wodzie, należy oczyścić preparaty, zanurzając je na pięć minut w 100% ksylenie. Zapewnia to, że preparaty nie staną się z czasem nieprzezroczyste. Następnie należy przystąpić do montowania i obrazowania przekrojów z obszaru środkowej części brzusznej mięśni piszczelowych przednich, które zostały poddane barwieniu.Z zastosowaniem hematyny i eozyny. Przekroje prawidłowo przetworzone będą charakteryzować się spójną morfologią i równomiernym barwieniem; natomiast mięśnie przetworzone nieprawidłowo, uszkodzone przez mrożenie lub przedwcześnie rozmrożone, wykazują liczne przerwy w strukturze morfologicznej i przypominają rwaną pszenicę.Na tych przekrojach wykonano również immunohistochemię. Barwienia były satysfakcjonujące. Fibronectina jest zabarwiona na zielono, a DAPI widoczny jest w kolorze niebieskim.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania wysokiej jakości skrawków mrożonych z biopsji mięśni w celu oceny architektury mięśniowej. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zająć około czterech do pięciu godzin, pod warunkiem właściwego wykonania wszystkich kroków. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o zapobieganiu rozmrażaniu się mięśni po jej zakończeniu.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak te dotyczące wzrostu i regeneracji, można przeprowadzić inne metody, np. barwienie immunocytochemiczne oraz hybrydyzację in situ.

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Porady i zasady dotyczące przygotowania kryostatów mięśniowych do analizy histologicznej

W niniejszym filmie zaprezentowano techniki błyskawicznego mrożenia i sekcjonowania tkanki zarodkowego mózgu myszy. Przedstawiono przydatne wskazówki dotyczące obsługi kriostatu, w tym metody rozwiązywania problemów, które można zastosować podczas cięcia, aby zapewnić, że uzyskane przekroje tkankowe będą wolne od pęknięć i innych zniekształceń.

Szybkie mrożenie i kriosekcjonowanie mózgu myszy w stadium E12.5

Ten film opisuje procedurę szybkiego zamrażania tkanki mięśniowej i uzyskiwania jej cienkich odcinków. Technika ta może pomóc w badaniu kacheksji związanej z rakiem w mysich modelach raka jelita grubego.

Błyskawiczne zamrażanie tkanki mięśniowej do cięcia: protokół uzyskiwania ultracienkich skrawków szybko zamrożonej mysiej tkanki mięśniowej

Analiza tkanek mięśni szkieletowych w celu określenia właściwości strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych jest znacznie ułatwiona dzięki odpowiedniemu przygotowaniu.  Protokół ten opisuje odpowiednie metody przygotowania tkanki mięśni szkieletowych do szerokiego zakresu badań fenotypowania.

Klasyfikacja i zamrażanie tkanek w modelach chorób mięśni szkieletowych

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół indukcji ostrej regeneracji mięśni szkieletowych u dorosłych myszy i późniejszych manipulacji mięśni, takich jak rozwarstwienie, zamrażanie, cięcie, rutynowe barwienie i analiza obszaru przekroju poprzecznego włókien mięśniowych.

Indukcja ostrej regeneracji mięśni szkieletowych przez wstrzyknięcie kardiotoksyny

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Ten protokół opisuje procedurę zamrażania tkanek mięśniowych poprzez zanurzanie ich bezpośrednio w ciekłym azocie. Protokół ten podkreśla również nowy kriowial, który może uniknąć "ogólnego efektu" gazowego azotu, gdy ciekły azot styka się z powierzchnią tkanki próbki.

Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

Aktywna autofagia jest związana z produktywną regeneracją mięśni, która jest niezbędna do aktywacji komórek macierzystych mięśni (MuSC). W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania in situ LC3, markera autofagii w MyoD-dodatnich MuSC skrawków tkanki mięśniowej od myszy kontrolnych i rannych.

In Situ Barwienie immunofluorescencyjne autofagii w komórkach macierzystych mięśni

Opisany tutaj jest protokół bezpośredniego znakowania immunologicznego martwiczych włókien mięśniowych w kriosekcjach mięśni. Komórki martwicze są przepuszczalne dla białek surowicy, w tym immunoglobuliny G (IgG). Ujawnienie wychwytu IgG przez włókna mięśniowe umożliwia identyfikację i ilościowe określenie włókien mięśniowych, które ulegają martwicy niezależnie od stanu mięśni.

Znakowanie immunologiczne zwyrodnienia włókien mięśniowych w biopsjach mięśni

Ten protokół opisuje metody używane do przygotowania fałdów głosowych szczurów do histochemicznego badania nerwowo-mięśniowego.

Przygotowanie fałdu głosowego szczura do analiz nerwowo-mięśniowych

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Naucz się przygotowywać kriosekcje z biopsji mięśniowych bez artefaktów zamrażania. Metoda obejmuje szybkie zamrażanie w izopentanie, wbudowanie w OCT i barwienie do analizy histologicznej.

Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

Przeglądaj więcej filmów