Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza kinetyki fenotypu oraz liczby limfocytów T wytworzonych przez progenitorów osiedlających się w grasicy w dniach E 13 lub E 18. Cel ten jest realizowany poprzez wstępną izolację płatów grasicy z embrionów myszy w dniach E 13, E 14 i E 18. W drugim kroku płaty grasicy z dnia E 14 są naświetlane, a następnie kolonizowane komórkami z dnia E 13 lub E 18, wyselekcjonowanymi za pomocą cytometrii przepływowej, przez 48 godzin w metodzie wiszącej kropli.

W ostatnim kroku skolonizowane płaty są przeszczepiane pod torebkę nerkową dorosłych myszy z knockoutem CD3. Ostatecznie można zastosować cytometrię przepływową, aby ocenić obecność potomstwa progenitorów osiedlających się w grasicy z embrionalnych dni E13 i E18 we krwi zwierząt chimerycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do naszych istniejących metod, takich jak hodowla limfocytów T in vitro na komórkach stroma lędźwiowych, jest to, że łączy ona metody umożliwiające pełne dojrzewanie limfocytów T z określonych progenitorów w badaniu trójwymiarowym z przeszczepianiem hodowli organowych grasicy do nienaruszonych myszy biorców, co pozwala na ocenę różnicowania i funkcji progenitorów plastrów grasicy oraz ich potomstwa.

Jako inżynier badawczy z doświadczeniem w chirurgii gryzoni, zademonstruję procedurę. Dwa dni przed eksperymentem z przeszczepianiem, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy przemyć brzuch ciężarnej myszy samicy 70% ethanol i wykonać podłużne nacięcie skóry w linii środkowej, rozsunąć skórę, aby otworzyć nacięcie, a następnie za pomocą pęsety i nożyczek otworzyć otrzewną, unikając dotykania przewodu pokarmowego. Następnie należy wyciągnąć macicę dwurożną i oddzielić ją od pochwy za pomocą nożyczek. Potem umieść macicę w płytce Petriego o wymiarach 90 by 15 mm zawierającej 40 do 50 mL DPBS i wykonaj cięcia poprzeczne pomiędzy decyduą każdego zarodka.

Za pomocą nożyczek z cienkimi końcówkami i precyzyjnej pincety usuń błonę mięśniową macicy, przecinając tkankę między łożyskiem a woreczkiem żółtkowym, aby wyjąć każdy embrion. Następnie usuń błonę owodni, zachowując embriony, i umieść je w nowej szalce Petri zawierającej HBSS z dodatkiem 1% FCS. Aby wyizolować grasicę, umieszczaj embriony pojedynczo w pozycji grzbietnej pod powiększającym szkłem binokularowym.

Następnie wprowadź jedną pęsetę wzdłuż chrząstki mostka, a za pomocą pęsety zakrzywionej uchwyć i otwórz klatkę piersiową. Odsuń ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić płaty grasicy po obu stronach tchawicy. Następnie uchwyć pęsetą precyzyjną tkankę pod grasicą, aby ostrożnie usunąć każdy płat i umieścić je w szalce Petriego zawierającej 1 mL HBSS z dodatkiem 1% FCS.

Następnie za pomocą dwóch pęset precyzyjnych należy usunąć otaczającą tkankę łączną, uważając, aby nie uszkodzić płatów. Następnie płaty należy przemyć w 3 mL HBSS z dodatkiem 1% FCS, aby usunąć erytrocyty i rozpocząć hodowlę organową grasicy płodowej. Płaty grasicy E 14 wyizolowane z embrionów CD 45.2 zgodnie z przedstawioną właśnie procedurą.

Pozostaw płaty na około trzy godziny. Następnie odwiruj świeżo wyizolowane progenitory osiadłe grasicy z embrionów w stadium E 13 lub E 18. Resuspenduj osad w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 500 komórek na 35 µL pożywki.

Następnie nanieś kroplę 35 µL zawiesiny komórkowej do co drugiego dołka płytki terasaki z 60 dołkami i umieść jeden napromieniowany płat na powierzchni każdej kropli. Zamknij płytkę i odwróć ją do góry dnem, aby komórki dotarły do bieguna apikalnego kropli pod wpływem grawitacji, delikatnie uderzając w górną stronę odwróconej płytki, aby wymusić przesunięcie się płatów do krawędzi apikalnej kropli. Następnie inkubuj odwróconą płytkę w inkubatorze z nawilżaniem przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2.

Po skolonizowaniu płatów grasicy należy zweryfikować poziom znieczulenia zwierzęcia biorcy, sprawdzając brak reakcji odruchowych. Następnie należy nanieść kroplę maści do oczu na każde oko i położyć mysz na prawym boku pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Następnie należy ogolić obszar operacyjny tuż powyżej stawu tylnej kończyny.

Następnie założyć sterylną parę rękawiczek i wysterylizować pole operacyjne 70% etanolem oraz 10% roztworem jodyny. Za pomocą skalpela wykonać nacięcie o długości 1,5 centymetra przez tkankę skórną, a następnie nacięcie przez tkankę mięśniową. Teraz wywrzeć lekki nacisk na obie strony nacięcia, aby wypchnąć nerkę z jamy brzusznej, i utrzymywać nerkę w stanie wilgotnym za pomocą roztworu soli fizjologicznej.

Podtrzymuj nerkę za pomocą patyczka higienicznego poza przestrzenią zaotrzewnową i za pomocą dwóch pęset precyzyjnych wykonaj otwór o średnicy od dwóch do trzech milimetrów w torebce. Następnie, trzymając ścianę torebki w pozycji otwartej, ostrożnie wsuń do sześciu przeszczepów płatów grasicy w kierunku krawędzi bieguna nerki, a następnie umieść nerkę z powrotem w przestrzeni zaotrzewnowej. Zaszyj mięśnie szwem ciągłym, a następnie skórę za pomocą pojedynczych węzłów chirurgicznych.

Następnie zwilżono ranę 10% roztworem povidonu jodowego i umieszczono mysz na podgrzewaczu o temperaturze 37°C, monitorując zwierzę oraz ranę chirurgiczną aż do ich pełnego wygojenia, aby określić najlepszą metodę usuwania endogennych tymocytów w celu rozwoju progenitorów kolonizujących. W tym eksperymencie porównano poziomy rekonstytucji limfocytów T w skolonizowanym płacie grasicy po napromieniowaniu lub pięciodniowej terapii deoxyguanozyną. Chociaż w dziewiątym dniu hodowli nie stwierdzono różnic w liczbie limfocytów kolonizujących, to w dwunastym dniu płaty napromieniowane zawierały więcej limfocytów T niż płaty traktowane deoxyguanozyną, co czyni napromieniowanie preferowaną metodą wspomagania rozwoju limfocytów T po kolonizacji grasicy. Aby zbadać potencjał rozwojowy progenitorów osiedlających się w grasicy w dniach E 13 i E 18, napromieniowane płaty grasicy w dniu E 14 skolonizowano równą liczbą obu typów progenitorów; zaobserwowano, że progenitorzy osiedlający się w grasicy w dniu E 13 dały początek mniejszej liczbie tymocytów i limfocytów T podwójnie dodatnich niż progenitorzy osiedlający się w grasicy w dniu E 18.

Częstość występowania dojrzałych komórek CD3-dodatnich była jednak zwiększona, a produkcja dendrytycznych limfocytów T nabłonka została wykryta jedynie w potomstwie progenitorów osiedlających się w grasicy w stadium E 13. Aby przeanalizować potencjał in vivo progenitorów osiedlających się w grasicy w stadiach E 13 i E 18, płaty grasicy skolonizowane każdym z tych typów progenitorów przeszczepiono pod torebkę nerki biorców z nokautem CD3. Jak właśnie wykazano, zgodnie z oczekiwaniami, progenitorzy osiedlający się w grasicy w stadium E 13 szybciej generowali limfocyty T niż progenitorzy w stadium E 18, choć całkowita liczba krążących limfocytów T była znacznie niższa u zwierząt skolonizowanych przez progenitorów z stadium E 13. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny immunologii rozwojowej do eksploracji właściwości subpopulacji limfocytów T, z których niektóre mają ściśle embrionalne pochodzenie w modelu ssaków.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak śledzić różnicowanie i szlaki funkcjonalne progenitorów osiadłych Timex oraz ich potomstwa zarówno w środowisku naturalnym, jak i w warunkach konkurencyjnych.