Name: Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę analizy progenitorów osadzających się w grasicy i ich potomstwa komórek T u zarodków myszy. Technika łączy hodowlę in vitro z przeszczepem pod torebkę nerki u myszy knockout CD3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez Instytut Pasteura, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'Lymphopoiesis'), REVIVE Future Investment Program i "La Ligue contre le Cancer".

Oświadczenie etyczne: wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kartą Etyki Instytutu Pasteura, zatwierdzoną przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa, oraz zgodnie z wytycznymi UE. Manipulator przeszkolony w zakresie chirurgii małych gryzoni, certyfikowany przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa, wykonuje wszystkie interwencje chirurgiczne. 
UWAGA: Patrz w załączniku tabela 1 przedstawiająca 5-etapową procedurę planowania.
1. Selekcja zarodków
<ol>
	<li>Użyj 36 C57BL/6 CD45.2 żeńskich, 12 żeńskich CD45.1, 12 C57BL/6 CD45.1 męskich i 12 C57BL/6 CD45.2 męskich. Krzyżowanie samic o jednym z męskich genotypów da zarodki CD45.1/2 i CD45.1 wykorzystywane jako źródło TSP lub CD45.2 wykorzystywane jako źródło płatów grasicy biorcy. Umieść wszystkich samców indywidualnie.</li>
	<li>Aby uzyskać zarodki do izolacji E18 TSP, należy umieścić 2 samice w klatce z jednym samcem CD45.1 o godzinie 18:00, 21 dni przed eksperymentem szczepienia. Sprawdź obecność czopa dopochwowego następnego dnia, przed południem. Oddziel podłączone żeńskie.</li>
	<li>Aby uzyskać zarodki E14 do kolonizacji przez TSP, powtórzyć powyższą procedurę (1.2), używając samców CD45.2, 17 dni przed eksperymentem szczepienia.</li>
	<li>W celu uzyskania zarodków do wyizolowania E13 TSP, należy powtórzyć powyższą procedurę (1.2), używając samców C57BL/6 CD45.1, 16 dni przed eksperymentem szczepienia.</li>
</ol>
2. Sekcja zarodków pod poziomym kapturem z przepływem laminarnym
UWAGA: Dwa dni przed eksperymentem z szczepieniem.
<ol>
	<li>Ciężarne samice należy złożyć w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy lub przez stopniowe podawanie gazu CO2 przez co najmniej 5 minut, w nasycającej zamkniętej komorze. Zapewnij śmierć poprzez definitywne zatrzymanie ruchów krążeniowo-oddechowych. Zwilż brzuch 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie w skórze w linii środkowej brzucha i otwórz je, rozsuwając skórę. Otwórz otrzewną kleszczami i nożyczkami, nie dotykając przewodu pokarmowego. Wyciągnij dwudzielną macicę i oddziel ją od pochwy nożyczkami.</li>
	<li>Umieścić macicę na szalce Petriego o wymiarach 90 x 15 mm zawierającej 40-50 ml DPBS i przeciąć poprzecznie między decyduami każdego zarodka.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek z cienką końcówką i cienkich kleszczyków usuń błonę mięśniową macicy, wyjmij zarodki, przecinając między łożyskiem a woreczkiem żółtkowym i usuń amnios, który zatrzymuje zarodki.</li>
	<li>Umieścić zarodki na szalce Petriego o wymiarach 90 x 15 mm zawierającej HBSS + 1% płodowej surowicy cielęcej (FCS). W przypadku zarodków starszych niż E15 należy usunąć głowy nożyczkami przed dalszym rozbiorem.</li>
</ol>
3. Izolacja grasicy
<ol>
	<li>Pod lupą obuoczną umieść zarodek leżący w pozycji leżącej na wznak (widok brzuszny) na mokrej gazie.</li>
	<li>Włóż jeden kleszcz wzdłużnie wzdłuż chrząstki mostka, ściśnij i otwórz siatkę piersiową. Za pomocą zakrzywionych kleszczy odciągnij ścianę klatki piersiowej na bok, aby uwidocznić płaty grasicy po obu stronach tchawicy.</li>
	<li>Ostrożnie przytrzymaj każdy płat, ściskając go pod spodem cienkimi kleszczami i umieść je na szalce Petriego zawierającej 1 ml HBSS + 1% FCS. Odizolować płaty i usunąć otaczającą tkankę łączną za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 1 ml + igieł 26 G 3/8", nie uszkadzając kapsułki.</li>
	<li>Umyj płaty w 3 ml HBSS + 1% FCS, aby wyeliminować komórki krwi. 
	UWAGA: Przed E15 płaty grasicy znajdują się po obu stronach tchawicy, a później łączą się pośrodku, tworząc narząd dwupłatowy.</li>
</ol>
4. Zawiesiny komórek
<ol>
	<li>Rozsuń płatki pod lornetką powiększającą za pomocą dwóch igieł 26 G zamontowanych na strzykawkach o pojemności 1 ml, w HBSS + 1% FCS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi i sortowanie komórek
UWAGA: Wszystkie przeciwciała są wcześniej miareczkowane, aby uzyskać optymalną definicję populacji (miareczkowanie może się różnić w zależności od partii przeciwciał).
<ol>
	<li>Inkubować tymocyty (E13 lub E18) przez 15-30 minut w temperaturze 4 °C ze 100 μl koktajlu biotynylowanych przeciwciał w celu barwienia dodatnich komórek linii (anty-CD19, anty-Gr1, anty-Ter119, anty-NK1.1, anty-CD11c, anty-CD3, anty-CD4, anty-CD8, anty-CD25).</li>
	<li>Aby zmyć nadmiar przeciwciał, odwiruj probówki z 4 ml HBSS + 1% FCS w dawce 280 x g przez 7 minut, wyeliminuj supernatant i ponownie zawiesij osad w świeżym HBSS + 1% FCS. Powtórzyć wirowanie.</li>
	<li>Inkubować komórki znakowane biotyną E18 z mikrogranulkami streptawidyny przez 15 minut w temperaturze 4 °C i dwukrotnie przemyć komórki w HBSS 1% FCS. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml HBSS + 1% FCS. Większość tymocytów E13 jest ujemna pod względem linii produkcyjnej i dlatego nie wymaga wzbogacania MACS przed sortowaniem komórek.</li>
	<li>Przepuść komórki na kolumnie LS, zgodnie z instrukcjami producenta. Gdy cała zawiesina komórkowa dostanie się do kolumny, dodać 2 ml HBSS + 1% FCS. Odzyskać 4 ml przepływu, przez którą przepływa kolumna, i odwirowywać komórki przez 7 minut przy 280 x g.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad zubożonych tymocytów E18 lub całkowitego E13 w 50 μl mieszaniny przeciwciał TSP (anty-CD117 APC, anty-CD135 PE, anty-CD127 PECy7, anty-CD24 FITC, anty-CD44 APCCy7 i streptawidyna Pacific Blue) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki 4 ml HBSS + 1% FCS i ponownie zawieś komórki w 1 ml HBSS + 1% FCS z jodkiem propidyny.</li>
	<li>Posortuj komórki TSPs Lin-CD44+CD117+CD24o niskiej zawartościCD127+CD135+ w FACS (z 4 laserami) na probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 200 μl kompletnej pożywki + 20% FCS. Najpierw bramkuj komórki zgodnie z ich rozmiarem i ziarnistością na kanałach FSC i SSC. Wyeliminuj martwe komórki (barwienie jodkiem propidyny), wyklucz dublety i naoceń fluorescencję w skalach wykładniczych. Około 100 lub 600 TSP można uzyskać odpowiednio z jednej grasicy E13 lub jednej grasicy E18.</li>
</ol>
6. Kolonizacja płatów grasicy E14 z przodkami: technika wiszących kropli
<ol>
	<li>Napromieniować (30 Grays = 30 Gy) E14 płaty grasicy z zarodków CD45.2, 3 godziny przed posiewem. 
	UWAGA: Płaty grasicy E14 lub E15 są z powodzeniem stosowane jako biorcy komórek progenitorowych limfocytów T. Stosowanie płatów grasicy biorcy w późniejszych dniach ciąży powoduje przedwczesną martwicę ze względu na większy rozmiar narządu, podczas gdy płaty grasicy we wcześniejszych dniach ciąży rozwijają się słabo, prawdopodobnie z powodu niepełnego rozwoju komórek nabłonka.</li>
	<li>Odwirować posortowane TSP i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej (kompletna pożywka OPTI-MEM z 10% FCS, penicyliną (50 jednostek/ml), streptomycyną (50 μg/ml) i 2β-merkaptoetanolem (50 μM)) tak, aby 35 μl zawierało 500 TSP.</li>
	<li>Umieść 35 μl kropli zawiesiny komórkowej co drugi dołek na 60-dołkowej płytce Terasaki. 
	UWAGA: Krople o objętości 35 μl mogą się stopić, jeśli zostaną umieszczone w sąsiednich studzienkach.</li>
	<li>Umieść jeden napromieniowany płat na powierzchni każdej kropli. Zamknij płytkę Terasaki i odwróć płytkę do góry nogami, aby komórki dotarły grawitacyjnie do wierzchołkowego bieguna kropli.</li>
	<li>Delikatnie uderz w górną stronę odwróconej płytki, aby zmusić płaty do zsunięcia się do wierzchołkowej krawędzi kropli. Inkubować odwróconą płytkę Terasaki w nawilżanym inkubatorze przez 48 godzin w temperaturze 37 °C + 5% CO2 . Po kolonizacji albo hodować E14 thymi w FTOC7, albo przeszczepić pod torebkę nerkową dorosłej myszy biorcy 8.</li>
</ol>
7. Posiew narządów grasicy płodu
<ol>
	<li>Umieścić 3 ml kompletnego podłoża na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Umieścić filtr membranowy izoporowy unoszący się na podłożu. Umieść rozpuszczone płaty na krawędzi membrany za pomocą kleszczy (nie więcej niż 8 płatów na jednej membranie).</li>
	<li>Umieścić szalki Petriego zawierające płatki grasicy na szalce Petriego o średnicy 90 mm wraz z szalką 35 mm bez pokrywy, zawierającą 2 ml wody, aby zapewnić optymalną wilgotność. Inkubować przez 12 dni w temperaturze 37 °C + 5% CO2 .</li>
</ol>
8. Przeszczepy pod torebką nerkową w sterylnych warunkach
UWAGA: Miąższ nerki jest otoczony tkanką łączną tworzącą kapsułkę. Obszar podtorebkowy jest szczególnie bogaty w naczynia krwionośne i limfatyczne, zapewniając w ten sposób odpowiednie środowisko do rozwoju przeszczepów (np. płaty grasicy, wyspy trzustkowe lub serca noworodków). Przeszczepy są zwykle wykonywane na lewej nerce, ponieważ jest ona bardziej dostępna niż prawa nerka. Samce myszy CD3-/- wykorzystano jako biorców, unikając w ten sposób reakcji przeszczep kontra gospodarz z powodu niewielkich antygenów zgodności tkankowej związanych z chromosomem Y, ponieważ określenie płci przed E15 nie jest łatwe.
<ol>
	<li>Wysterylizuj narzędzia i załóż sterylne rękawiczki wzdłuż zabiegu. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu ketaminy 10 mg/ml + ksylazyny 1 mg/ml rozcieńczonego w PBS: (50 do 100 μl na 10 g masy ciała), za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Zweryfikuj znieczulenie, sprawdzając brak odruchów międzypalcowych. Umieść kroplę żelu hydro-Optimune na każdym oku, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. 
	UWAGA: Roztwór należy przygotować doraźnie i ogrzać w temperaturze pokojowej przed wstrzyknięciem. Znieczulenie trwa co najmniej 20 minut. Stopień znieczulenia powinien być kontrolowany przez cały czas trwania zabiegu. Znieczulenie można przedłużyć poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie połowy dawki co 20 min.</li>
	<li>Umieść mysz po prawej stronie, pod poziomą osłoną z przepływem blaszki. Wysterylizuj pole operacyjne 70% etanolem i 10% roztworem jodkowym skóry. Za pomocą kleszczy rozchyl włosy myszy wzdłuż długości 2 cm tuż nad stawem tylnej nogi. Ogolić obszar operacyjny.</li>
	<li>Za pomocą skalpela należy najpierw wykonać nacięcie o długości 1,5 cm, tkankę skórną, a następnie nożyczkami przeciąć tkankę mięśniową. Lekko dociśnij obie strony nacięcia, co wypchnie nerkę z jamy brzusznej.</li>
	<li>Nałóż sól fizjologiczną z patyczkiem kosmetycznym, aby nerki były wilgotne. Jeśli masz trudności z odsłonięciem narządu, użyj płaskich kleszczy, aby wyciągnąć otaczającą tkankę adipocytów, do której przyczepiona jest nerka. Utrzymuj nerkę z dala od jamy zaotrzewnowej za pomocą wacika umieszczonego pod narządem.</li>
	<li>Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków wykonaj otwór o średnicy 2-3 mm w kapsułce (unikaj dotykania miąższu, aby zapobiec krwawieniu). Podczas całego zabiegu chirurgicznego należy utrzymywać odsłoniętą torebkę nerkową w ciągłym nawilżaniu.</li>
	<li>Ostrożnie włóż płaty pod torebkę nerkową, utrzymując ściankę kapsułki otwartą i wsuń przeszczep pod kapsułkę w kierunku bieguna krawędziowego. Umieść do 6 płatów na nerkę.</li>
	<li>Wymień nerkę w jamie zaotrzewnowej. Zszyj rozcięgna mięśniowe, a następnie skórę indywidualnymi węzłami chirurgicznymi. Zwilż ranę 10% roztworem jodu i powidonu. Umieść mysz na podkładce rozgrzanej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Badaj przeszczepioną mysz aż do pełnego wyzdrowienia ze znieczulenia poprzez kontrolę ruchów serca, oddechowych i wąsów, kolorów błony śluzowej, aż do całkowitego wyzdrowienia widzianego przez samodzielne ruchy. 
	UWAGA: Zalecamy wstrzyknięcie roztworu przeciwbólowego (Buprenorfina, 0,1 mg/kg) do mięśni bezpośrednio po operacji i 2 dni po operacji, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu.</li>
	<li>Operowane zwierzę należy trzymać w izolacji do czasu całkowitego wyzdrowienia. Sprawdzaj co drugi dzień szwy rany, aby zweryfikować i zapobiec infekcji. Nigdy nie zaobserwowano zakażenia rany po tym zabiegu. 
	UWAGA: Cotygodniowa analiza komórek krwi obwodowej od myszy szczepionych CD3 / - pozwala nam wykryć populacje pochodzące z grasicy pochodzące od progenitorów E13 lub E18 przy użyciu markera allotypowego CD45 i przeciwciał specyficznych dla linii limfocytów T (Figura 3).</li>
</ol>
9. Analiza potomstwa TSP za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Drażnić FTOC indywidualnie, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek (patrz sekcja 4 protokołu).</li>
	<li>Zawiesiny komórek barwiących z poszczególnych płatów należy zabarwić mieszaniną przeciwciał zawierającą przeciwciała rozpoznające CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE i inkubować zgodnie z opisem w sekcji 5.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w HBSS + 1% FCS + jodku propidyny i przeanalizować w cytometrze przepływowym (patrz wyniki na rysunku 2).</li>
</ol>

<ol><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus organogenesis.</a> Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus%3A+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li>
<li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic%2C+context-dependent%2C+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li>
<li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Flt3%2B+lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li>
<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li>
<li>Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors%3A+plenty+to+choose+from%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26, 678-689 (2007).</li>
<li>Ramond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+waves+of+distinct+hematopoietic+progenitor+cells+colonize+the+fetal+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus.</a> Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).</li>
<li>Allison, J. P., Havran, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+T+cells+with+invariant+gamma+delta+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors.</a> Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>Barbee, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skint-1+is+a+highly+specific%2C+unique+selecting+component+for+epidermal+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).</li>
<li>Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T%2FNK+progenitor+in+murine+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li>
<li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Do analizy różnicowania limfocytów T ex vivo można zastosować dwa główne testy. Ostatnio zgłoszono kohodowlę krwiotwórczych komórek progenitorowych z komórkami zrębu BM, OP9, wyrażającymi ligandy Noth1, delta jak 1 lub 412. Ten test 2D jest łatwy do wykonania, wysoce wydajny i czuły, co pozwala na analizę na poziomie pojedynczej komórki. Jednak ani nie wspiera rozwoju limfocytów T poza etapem DP, ani wytwarzania γδ DETC13, które wymagają bezpośrednich interakcji z nabłonkiem grasicy.
<p...

T limfocyty, posiadające αβ lub receptor γδ limfocytów T (TcR), różnicują się w wyspecjalizowanym narządzie, grasicy. W pełni rozwinięta grasica jest zorganizowana w dwóch odrębnych regionach: korze mózgowej, w której rozwijają się przodkowie grasicy i gdzie tymocyty, które produktywnie reorganizują β i α geny łańcuchowe, są ratowane przed zaprogramowaną śmiercią (proces znany jako selekcja pozytywna); oraz rdzeń, w którym usuwane są wybrane tymocyty o zbyt silnej reaktywności na samoligandy (selekcja ujemna)1,2. Grasica pochodzi z warstwy endodermalnej trzeciego worka gardłowego, która jest później otoczona komórkami mezenchymalnymi3. Jest kolonizowany przez hematopoetyczne komórki progenitorowe począwszy od dnia embrionalnego E12, a następnie wymagana jest ciągła rekrutacja do prawidłowego rozwoju limfocytów T4. Imigranci grasicy ewoluują przez kolejne etapy rozwoju, koordynowane przez ściśle regulowany program, inicjowany i utrzymywany przez aktywację szlaku sygnałowego Notch na tymocytach po interakcji z jego ligandem, delta podobnym do 4, ulegającym ekspresji na komórkach nabłonka grasicy (TEC)5.
Rozwój tymocytu rozpoczyna się w tak zwanych stadiach podwójnie ujemnych (DN) CD4-CD8. Tymocyty DN można dalej podzielić w zależności od ekspresji CD25 i CD44 na DN1 (CD25-CD44+), DN2 (CD25+CD44+), DN3 (CD25+CD44-) i DN4 (CD25-CD44-). CD24 (HSA) i CD117 (c-Kit) dalej dzielą przedział DN1 na 5 podzbiorów, w których DN1a i b odpowiadają wczesnym przodkom grasicy (ETP). Tymocyty przegrupowują łańcuchy TcR δ, β i α w stopniu DN i przechodzą selekcję wstępną TcR (stopnie DN3-DN4). Następnie przechodzą do przedziału podwójnie dodatniego (DP) CD4 + CD8 +, w którym łańcuch α TcR zmienia układ przed selekcją pozytywną i ujemną. Na tym etapie większość tymocytów jest eliminowana i tylko niewielki procent (3-5%) dociera do przedziału dojrzałych limfocytów T CD4 + lub CD8 +.
Szlak różnicowania limfoidalnego przechodzi przez etapy HSC, które generują multipotencjalne progenitory (MPP) i limfoidalne multipotencjalne progenitory (LMPP), które utraciły potencjał erytrocytów i megakariocytów6. LMPP są fenotypowo definiowane przez brak zróżnicowanych markerów komórek krwi (linia ujemna, Lin-), ekspresję c-Kit (CD117), Sca-1 i Flt3/Flk2 (CD135) oraz brak wykrywalnych poziomów łańcucha α receptora interleukiny (IL)-7 (IL-7rα lub CD127). LMPP dalej różnicują się w wspólne limfoidalne komórki progenitorowe (CLP)7, które na tym etapie utraciły zdolność do wytwarzania komórek szpikowych. CLP zachowują potencjał limfocytów (limfocytów B i T), komórek NK, DC i wrodzonych komórek limfoidalnych (ILC) i różnią się od LMPP ekspresją CD127 i brakiem wysokich poziomów Sca-1.
Chociaż natura przodków osadzających się w grasicy (TSP) była szeroko dyskutowana8, ostatnio stało się jasne, że TSP zmieniają fenotyp, potencjał różnicowania i funkcję w trakcie rozwoju9. Przeprowadziliśmy testy in vitro i in vivo, aby scharakteryzować TSP, wyizolowane przez sortowanie komórek FACS z E13 (pierwsza fala) lub E18 (druga fala). Hodowle płodowych narządów grasicy (FTOC) z napromieniowanymi płatami grasicy skolonizowanymi przez równą liczbę progenitorów E13 i E18, noszących różne markery allotypowe, pozwoliły śledzić ich potomstwo w podobnym środowisku rozwojowym i ujawniły wewnętrzne właściwości komórki, różne dla obu typów komórek progenitorowych. Płaty grasicy skolonizowane przez E13 lub E18 TSP umożliwiały rozwój bez selekcji ze względu na konkurencję między oboma przodkami. Przeszczepienie in vivo skolonizowanych płatów grasicy wykazało ponadto, że również dojrzałe potomstwo E13 i E18 TSP ma różne właściwości biologiczne in vivo. TSP z pierwszej fali szybko generują limfocyty T, ale powodują niewielką liczbę limfocytów T αβ i γδ. Wśród tych ostatnich wykryliśmy Vγ5Vδ1 limfocyty T nabłonka dendrytycznego (DETC), które mają niezmienny TcR, migrują do naskórka, gdzie pełnią funkcję w gojeniu się ran i są wytwarzane tylko podczas rozwoju embrionalnego10. Natomiast TSP z drugiej fali potrzebują więcej czasu na wytworzenie dużej liczby limfocytów T TcR+ i nie są w stanie wygenerować DETC.

<table><tbody><tr><td>Plastikowe płytki Petriego o wymiarach 90 x 15 mm i 35 x 15 mm.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Pobieranie próbek</td></tr><tr><td>26 g i frac38; " Strzykawki 0,45 x 10 mm z igłami</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Zawieszenie komórek</td></tr><tr><td>Tkanina kotwiąca z siatki nylonowej sterylizowana 50/50 mm kawałki.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtracja komórek</td></tr><tr><td>Etanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Działania w zakresie sterylności</td></tr><tr><td>Jodek Powidon 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td> Działania w zakresie <td>sterylności</td></tr><tr><td>Ketamina 100 mg/ml (roztwór podstawowy)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Środek znieczulający</td></tr><tr><td>Ksylazyna 100 mg/ml w PBS (roztwór podstawowy)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Środek znieczulający i zwiotczający mięśnie</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/ml roztwór podstawowy</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Morfiniczny środek przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Żel oftalmiczny (0,2% cyklosporyny)</td><td>Schering-Plough Zdrowie</td><td></td> zwierząt <td>Ochrona oczu</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>do izolacji zarodków</td></tr><tr><td>HBSS Zbilansowany roztwór soli Hanksa (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>do wypłukiwania krwi i preparować zarodki</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Pożywka do hodowli</td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>dodatek do hodowli Penicilina</td></tr><tr><td>i streptomycyna</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antybiotyki do hodowli</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>dodatek do kultur</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny LEICA MZ6</td><td>10445111 Okular</td> wizyjny LEICA <td>MZ6</td><td>W-PL10x/23</td></tr><tr><td>Źródło zimnej lampy</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Dwa włókna gęsiej szyi dostosowane</td></tr> do <tr><td>elastomeru</td><td>silikonowego World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Podkładka preparcyjna</td></tr><tr><td>Łyżka, okrągła i perforowana</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Narzędzia do preparacji</td></tr><tr><td>Fine Nożyczki do tęczówki</td><td>Narzędzia do nauki o naczyniu</td><td>14090-09</td><td>Narzędzia do preparowania</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia do</td> nauki o naprawie szczegółów <td>15018-10</td><td>Narzędzia do preparowania</td></tr><tr><td>Kleszcze: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>FST</td><td>11253-25</td><td>Narzędzia do preparacji</td></tr><tr><td>2 pary cienkich prostych kleszczy zegarmistrzowskich Dumont #5 11 cm cienkie końcówki.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Narzędzia do preparowania</td></tr><tr><td>Nić poliamidowa z igłą 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>do szwów</td></tr><tr><td>Uchwyt do igieł</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>do szwów</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>Do utrzymywania temperatury myszy podczas znieczulenia</td></tr><tr><td>Izopor membranowy RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td> Do płytek <td>FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 dołków</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>Do techniki wiszącej</td></tr><tr><td>kropli Waciki z gazy sterylne 7,5 x 7,5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>Do stosowania roztworu dezynfekującego</td></tr><tr><td>Przeciwciała znakowane fluorescencją lub biotyną</td><td>BD Biosciences, Biolegend lub e-Biocsiences&nbsp;</td><td>Numer klonu patrz tabela poniżej</td><td>Barwienie komórek</td></tr><tr><td>MACS Kolumny/Mikrogranulki streptawidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Myszy z wyczerpaniem komórek</td></tr> Charles <tr><td></td><td>Rivers Laboratories (CD45.1) i Janvier Labs&nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 LUB CD45.2</td><td>Źródło komórek i płatów grasicy</td></tr><tr><td>Myszy</td><td>CDTA Orl&eacute; ans, Francja</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Eksperyment szczepienia</td></tr></tbody></table>

charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Charakterystyka progenitorów osadzających się w grasicy jest ważna dla zrozumienia przed-grasiczych etapów rozwoju limfocytów T, niezbędna do opracowania strategii wymiany limfocytów T u pacjentów limfonowych z limfopeną. Badaliśmy przodków osadzania się grasicy od mysiego embrionalnego dnia 13 i 18 thymi za pomocą dwóch uzupełniających się technik in vitro i in vivo, obie oparte na metodzie "wiszącej kropli". Metoda ta pozwoliła na kolonizację napromieniowanych płatów grasicy płodu przodkami grasicy E13 i/lub E18 wyróżniającymi się markerami allotypowymi CD45, a tym samym podążanie za ich potomstwem. Kolonizacja populacjami mieszanymi pozwala na analizę autonomicznych różnic we właściwościach biologicznych komórek progenitorowych, podczas gdy kolonizacja dowolną populacją usuwa ewentualne konkurencyjne naciski selekcyjne. Skolonizowane płaty grasicy mogą być również szczepione u samców myszy biorców z niedoborem odporności, co pozwala na analizę dojrzałego potomstwa limfocytów T in vivo, takich jak dynamika populacji obwodowego układu odpornościowego i kolonizacja różnych tkanek i narządów. Posiewy narządów grasicy płodu ujawniły, że progenitorzy E13 szybko rozwinęli się we wszystkie dojrzałe komórki CD3 + i dali początek kanonicznej podgrupie limfocytów T γδ, znanej jako endrytyczne nabłonkowe limfocyty T. Dla porównania, przodkowie E18 mają opóźnione różnicowanie i nie byli w stanie wytworzyć dendrytycznych komórek T nabłonka. Monitorowanie krwi obwodowej myszy CD3-/- szczepionych grasicą wykazało ponadto, że przodkowie osadzający się grasicy E18 generują z czasem większą liczbę dojrzałych limfocytów T niż ich odpowiedniki E13, co jest cechą, której nie można było docenić w krótkoterminowych hodowlach płodowych narządów grasicy.

Aby wybrać metodę usuwania endogennych tymocytów z płatów grasicy, która zapewni najlepszy rozwój kolonizujących progenitorów, porównano poziomy rekonstytucji limfocytów T w płatach grasicy skolonizowanych po napromieniowaniu lub 5-dniowej kuracji deoksyguanozyną (d-Gua). Wyniki wykazują, że choć w 9. dniu hodowli nie stwierdzono różnic, w 12. dniu płaty napromieniowane zawierały więcej limfocytów T niż te traktowane d-Gua. Zatem napromieniowanie jest bardziej odpowiednie niż kuracja d-Gua w celu uzyskania rozwoju limfoc...

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza kinetyki fenotypu oraz liczby limfocytów T wytworzonych przez progenitorów osiedlających się w grasicy w dniach E 13 lub E 18. Cel ten jest realizowany poprzez wstępną izolację płatów grasicy z embrionów myszy w dniach E 13, E 14 i E 18. W drugim kroku płaty grasicy z dnia E 14 są naświetlane, a następnie kolonizowane komórkami z dnia E 13 lub E 18, wyselekcjonowanymi za pomocą cytometrii przepływowej, przez 48 godzin w metodzie wiszącej kropli.W ostatnim kroku skolonizowane płaty są przeszczepiane pod torebkę nerkową dorosłych myszy z knockoutem CD3. Ostatecznie można zastosować cytometrię przepływową, aby ocenić obecność potomstwa progenitorów osiedlających się w grasicy z embrionalnych dni E13 i E18 we krwi zwierząt chimerycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do naszych istniejących metod, takich jak hodowla limfocytów T in vitro na komórkach stroma lędźwiowych, jest to, że łączy ona metody umożliwiające pełne dojrzewanie limfocytów T z określonych progenitorów w badaniu trójwymiarowym z przeszczepianiem hodowli organowych grasicy do nienaruszonych myszy biorców, co pozwala na ocenę różnicowania i funkcji progenitorów plastrów grasicy oraz ich potomstwa.Jako inżynier badawczy z doświadczeniem w chirurgii gryzoni, zademonstruję procedurę. Dwa dni przed eksperymentem z przeszczepianiem, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy przemyć brzuch ciężarnej myszy samicy 70% ethanol i wykonać podłużne nacięcie skóry w linii środkowej, rozsunąć skórę, aby otworzyć nacięcie, a następnie za pomocą pęsety i nożyczek otworzyć otrzewną, unikając dotykania przewodu pokarmowego. Następnie należy wyciągnąć macicę dwurożną i oddzielić ją od pochwy za pomocą nożyczek. Potem umieść macicę w płytce Petriego o wymiarach 90 by 15 mm zawierającej 40 do 50 mL DPBS i wykonaj cięcia poprzeczne pomiędzy decyduą każdego zarodka.Za pomocą nożyczek z cienkimi końcówkami i precyzyjnej pincety usuń błonę mięśniową macicy, przecinając tkankę między łożyskiem a woreczkiem żółtkowym, aby wyjąć każdy embrion. Następnie usuń błonę owodni, zachowując embriony, i umieść je w nowej szalce Petri zawierającej HBSS z dodatkiem 1% FCS. Aby wyizolować grasicę, umieszczaj embriony pojedynczo w pozycji grzbietnej pod powiększającym szkłem binokularowym.Następnie wprowadź jedną pęsetę wzdłuż chrząstki mostka, a za pomocą pęsety zakrzywionej uchwyć i otwórz klatkę piersiową. Odsuń ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić płaty grasicy po obu stronach tchawicy. Następnie uchwyć pęsetą precyzyjną tkankę pod grasicą, aby ostrożnie usunąć każdy płat i umieścić je w szalce Petriego zawierającej 1 mL HBSS z dodatkiem 1% FCS.Następnie za pomocą dwóch pęset precyzyjnych należy usunąć otaczającą tkankę łączną, uważając, aby nie uszkodzić płatów. Następnie płaty należy przemyć w 3 mL HBSS z dodatkiem 1% FCS, aby usunąć erytrocyty i rozpocząć hodowlę organową grasicy płodowej. Płaty grasicy E 14 wyizolowane z embrionów CD 45.2 zgodnie z przedstawioną właśnie procedurą.Pozostaw płaty na około trzy godziny. Następnie odwiruj świeżo wyizolowane progenitory osiadłe grasicy z embrionów w stadium E 13 lub E 18. Resuspenduj osad w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 500 komórek na 35 µL pożywki.Następnie nanieś kroplę 35 µL zawiesiny komórkowej do co drugiego dołka płytki terasaki z 60 dołkami i umieść jeden napromieniowany płat na powierzchni każdej kropli. Zamknij płytkę i odwróć ją do góry dnem, aby komórki dotarły do bieguna apikalnego kropli pod wpływem grawitacji, delikatnie uderzając w górną stronę odwróconej płytki, aby wymusić przesunięcie się płatów do krawędzi apikalnej kropli. Następnie inkubuj odwróconą płytkę w inkubatorze z nawilżaniem przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Po skolonizowaniu płatów grasicy należy zweryfikować poziom znieczulenia zwierzęcia biorcy, sprawdzając brak reakcji odruchowych. Następnie należy nanieść kroplę maści do oczu na każde oko i położyć mysz na prawym boku pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza. Następnie należy ogolić obszar operacyjny tuż powyżej stawu tylnej kończyny.Następnie założyć sterylną parę rękawiczek i wysterylizować pole operacyjne 70% etanolem oraz 10% roztworem jodyny. Za pomocą skalpela wykonać nacięcie o długości 1,5 centymetra przez tkankę skórną, a następnie nacięcie przez tkankę mięśniową. Teraz wywrzeć lekki nacisk na obie strony nacięcia, aby wypchnąć nerkę z jamy brzusznej, i utrzymywać nerkę w stanie wilgotnym za pomocą roztworu soli fizjologicznej.Podtrzymuj nerkę za pomocą patyczka higienicznego poza przestrzenią zaotrzewnową i za pomocą dwóch pęset precyzyjnych wykonaj otwór o średnicy od dwóch do trzech milimetrów w torebce. Następnie, trzymając ścianę torebki w pozycji otwartej, ostrożnie wsuń do sześciu przeszczepów płatów grasicy w kierunku krawędzi bieguna nerki, a następnie umieść nerkę z powrotem w przestrzeni zaotrzewnowej. Zaszyj mięśnie szwem ciągłym, a następnie skórę za pomocą pojedynczych węzłów chirurgicznych.Następnie zwilżono ranę 10% roztworem povidonu jodowego i umieszczono mysz na podgrzewaczu o temperaturze 37°C, monitorując zwierzę oraz ranę chirurgiczną aż do ich pełnego wygojenia, aby określić najlepszą metodę usuwania endogennych tymocytów w celu rozwoju progenitorów kolonizujących. W tym eksperymencie porównano poziomy rekonstytucji limfocytów T w skolonizowanym płacie grasicy po napromieniowaniu lub pięciodniowej terapii deoxyguanozyną. Chociaż w dziewiątym dniu hodowli nie stwierdzono różnic w liczbie limfocytów kolonizujących, to w dwunastym dniu płaty napromieniowane zawierały więcej limfocytów T niż płaty traktowane deoxyguanozyną, co czyni napromieniowanie preferowaną metodą wspomagania rozwoju limfocytów T po kolonizacji grasicy. Aby zbadać potencjał rozwojowy progenitorów osiedlających się w grasicy w dniach E 13 i E 18, napromieniowane płaty grasicy w dniu E 14 skolonizowano równą liczbą obu typów progenitorów; zaobserwowano, że progenitorzy osiedlający się w grasicy w dniu E 13 dały początek mniejszej liczbie tymocytów i limfocytów T podwójnie dodatnich niż progenitorzy osiedlający się w grasicy w dniu E 18.Częstość występowania dojrzałych komórek CD3-dodatnich była jednak zwiększona, a produkcja dendrytycznych limfocytów T nabłonka została wykryta jedynie w potomstwie progenitorów osiedlających się w grasicy w stadium E 13. Aby przeanalizować potencjał in vivo progenitorów osiedlających się w grasicy w stadiach E 13 i E 18, płaty grasicy skolonizowane każdym z tych typów progenitorów przeszczepiono pod torebkę nerki biorców z nokautem CD3. Jak właśnie wykazano, zgodnie z oczekiwaniami, progenitorzy osiedlający się w grasicy w stadium E 13 szybciej generowali limfocyty T niż progenitorzy w stadium E 18, choć całkowita liczba krążących limfocytów T była znacznie niższa u zwierząt skolonizowanych przez progenitorów z stadium E 13. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny immunologii rozwojowej do eksploracji właściwości subpopulacji limfocytów T, z których niektóre mają ściśle embrionalne pochodzenie w modelu ssaków.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak śledzić różnicowanie i szlaki funkcjonalne progenitorów osiadłych Timex oraz ich potomstwa zarówno w środowisku naturalnym, jak i w warunkach konkurencyjnych.

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Charakterystyka tymicznych komórek macierzystych w zarodku mysiego przy użyciu badań in vivo i in vitro

Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Ten film demonstruje protokół generowania funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu z niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC za pomocą trójwymiarowego systemu hodowli grasicy. Jednoczesna hodowla niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC z endogennymi płatami grasicy płodowymi myszy zubożonymi w limfocyty spowodowała pomyślne dojrzewanie limfocytów T do utworzenia emigrantów grasicy pochodzących z iPSC CD8αβ + + MHC klasy I + (iTE).

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania emigrantów grasicy pochodzących od iPSC

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Badanie rdzeniastych komórek nabłonka grasicy in vitro zakończyło się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ obecne systemy hodowli 2D nie naśladują scenariusza in vivo. Opisany w niniejszym dokumencie system hodowli 3D - zmodyfikowany model hodowli organotypowej skóry - okazał się doskonały w rekapitulacji proliferacji mTEC, różnicowaniu i utrzymywaniu ekspresji genów rozwiązłości.

Organotypowy model kohodowli 3D wspierający proliferację, różnicowanie i ekspresję genów rozwiązłych komórek nabłonka grasicy

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

W tym artykule opisujemy protokół charakteryzujący odpowiedzi immunoglobuliny (Ig) zależnej od T i niezależnej od T u myszy za pomocą testu ELISA. Ta metoda stosowana samodzielnie lub w połączeniu z cytometrią przepływową pozwoli naukowcom zidentyfikować różnice w odpowiedziach izotypu Ig za pośrednictwem komórek B u myszy po immunizacji antygenu T zależnej i niezależnej od T.

Charakterystyka odpowiedzi izotypu immunoglobuliny zależnej i niezależnej od grasicy u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Poznaj metodę analizy progenitorów osadzających się w grasicy i ich potomstwa komórek T u zarodków myszy. Technika łączy hodowlę in vitro z przeszczepem pod torebkę nerki u myszy knockout CD3.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Przeglądaj więcej filmów