Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro
9 czerwca 2015
Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.
Ogólnym celem tej procedury jest analiza fenotypu, kinetyki generacji i liczby limfocytów T wytwarzanych przez przodków osiadających grasicy E 13 lub E 18. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie płatów grasicy z zarodków myszy E 13, E 14 i E 18. W drugim etapie płaty grasicy E 14 są napromieniowywane, a następnie kolonizowane komórkami E 13 lub E 18 sortowanymi przepływowo przez 48 godzin w wiszącej kropli.
W ostatnim etapie skolonizowane płaty są szczepione pod torebką nerkową dorosłych myszy z nokautem CD three. Ostatecznie cytometria przepływowa może być wykorzystana do oceny obecności potomstwa przodków grasicy E 13 i E 18 we krwi chimerycznych zwierząt. Główną zaletą tej techniki naszych istniejących metod, takich jak hodowla komórek T in vitro na komórkach ine so, jest to, że technika ta łączy metody, które umożliwiają pełne dojrzewanie komórek T od zdefiniowanych komórek progenitorowych w trójwymiarowym teście z przeszczepianiem kultur narządów grasicy u nienaruszonych myszy biorców, umożliwiając ocenę różnicowania i funkcji przodków plastrów grasicy i potomstwa.
Jako inżynier badawczy z doświadczeniem w chirurgii gryzoni, zademonstruję procedurę Dwa dni przed eksperymentem szczepienia w kapturze z przepływem laminarnym, co odwłok ciężarnej samicy myszy za pomocą 70% etanolu i wykonaj podłużne nacięcie w skórze na linii środkowej, rozsuń skórę, aby otworzyć nacięcie, a następnie użyj kleszczy i nożyczek, aby otworzyć otrzewną bez dotykania przewodu pokarmowego. Następnie wyciągnij dwudzielną macicę i użyj nożyczek, aby oddzielić ją od pochwy. Następnie umieść macicę na szalce Petriego o wymiarach 90 na 15 milimetrów zawierającej od 40 do 50 mililitrów DPBS i przetnij poprzecznie między decyduami każdego zarodka.
Użyj nożyczek z cienką końcówką i cienkich kleszczyków, aby usunąć błonę mięśniową macicy przecinającej się między łożyskiem a woreczkiem żółtkowym, aby usunąć każdy zarodek. Następnie usunąć owodnię zatrzymującą zarodki i umieścić je na nowej szalce Petriego zawierającej HBSS plus 1% FCS. Aby wyizolować grasicę, umieść zarodki pojedynczo w pozycji leżącej pod lornetką powiększającą.
Następnie włóż jeden kleszcz wzdłużnie wzdłuż chrząstki mostka i ściśnij i otwórz siatkę piersiową za pomocą zakrzywionych kleszczy. Odciągnij ścianę klatki piersiowej na bok, aby uwidocznić płaty grasicy po obu stronach tchawicy. Następnie uszczypnij pod grasicą cienkimi kleszczami, aby ostrożnie usunąć każdy płat i umieść je na szalce Petriego zawierającej jeden mililitr HBSS plus 1% FCS.
Następnie użyj dwóch cienkich kleszczyków, aby usunąć otaczającą tkankę łączną bez uszkadzania płatów. Następnie umyj płaty w trzech mililitrach HBSS plus 1% FCS, aby wyeliminować czerwone krwinki, aby rozpocząć napromienianie posiewu narządów grasicy płodu. E 14 płaty grasicy wyizolowane z zarodków CD 45.2, jak właśnie wykazano.
Pozwól płatom odpocząć przez około trzy godziny. Następnie odwirować świeżo posortowane przodki osiadania grasicy E 13 lub E 18. Ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 500 komórek na 35 mikrolitrów pożywki.
Następnie umieścić 35 mikrolitrową kroplę zawiesiny komórkowej w co drugiej studzience 60-dołkowej płytki terasaki i umieścić jeden napromieniowany płat na powierzchni każdej kropli. Zamknij płytkę i odwróć ją do góry nogami, aby komórki dotarły grawitacyjnie do wierzchołkowego bieguna kropli, delikatnie uderzając w górną stronę odwróconej płytki, aby zmusić płaty do zsunięcia się do wierzchołkowej krawędzi kropli. Następnie inkubuj odwróconą płytkę w nawilżanym inkubatorze przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Po skolonizowaniu płatów grasicy należy zweryfikować poziom znieczulenia zwierzęcia biorcy poprzez brak reakcji odruchowej. Następnie umieść kroplę maści do oczu na każdym oku i umieść mysz po jego prawej stronie pod kapturem z przepływem laminarnym. Następnie ogol obszar chirurgiczny tuż nad stawem tylnej nogi.
Następnie wykonaj parę sterylnych rękawiczek i wysterylizuj pole operacyjne 70% etanolem i 10% roztworem JOD DY DER. Za pomocą skalpela wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie przez tkankę skórną, a następnie nacięcie przez tkankę mięśniową. Teraz lekko dociśnij obie strony nacięcia, aby wypchnąć nerkę z jamy brzusznej i utrzymuj nerkę wilgotną roztworem soli fizjologicznej.
Utrzymuj nerkę za pomocą wacika na zewnątrz jamy zaotrzewnowej i użyj dwóch cienkich kleszczyków, aby zrobić otwór w torebce o średnicy od dwóch do trzech milimetrów. Następnie, trzymając ściankę torebki otwartą, ostrożnie wsuń do sześciu przeszczepów płata grasicy pod krawędź bieguna nerkowego i umieść nerkę z powrotem w jamie zaotrzewnowej. Zszyj mięsień nerwicą, a następnie zszyj skórę z indywidualnymi węzłami chirurgicznymi.
Następnie zwilż ranę 10% roztworem powidonu jodku i umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, monitorując zwierzę i ranę chirurgiczną, aż obie w pełni wyzdrowieją, aby określić najlepszą metodę zubożenia endogennych tymocytów dla rozwoju kolonizujących przodków. W tym eksperymencie porównano poziomy rekonstytucji limfocytów T w skolonizowanym płacie grasicy po napromieniowaniu lub pięciodniowym leczeniu deoksy guine. Chociaż w dziewiątym dniu hodowli nie stwierdzono różnicy w liczbie kolonizujących limfocytów, napromieniowane płaty zawierały więcej limfocytów T niż te traktowane deoksygwineą w 12 dniu, co sprawia, że napromienianie jest preferowanym leczeniem ułatwiającym rozwój komórek T po kolonizacji grasicy w celu zbadania potencjału rozwojowego przodków grasicy E 13 i E 18 osadzających się tutaj. Napromieniowane płaty grasicy E 14 były skolonizowane równą liczbą dwóch typów komórek progenitorowych, jak zaobserwowano, przodkowie osiadania grasicy E 13 spowodowali powstanie mniejszej liczby tymocytów i podwójnie dodatnich limfocytów T niż przodkowie osiadania grasicy E 18.
Częstość występowania dojrzałych komórek CD 3 dodatnich została jednak zwiększona, a wytwarzanie komórek T nabłonka dendrytycznego wykryto tylko u potomstwa przodków osiadających grasicy E 13 w celu analizy potencjału in vivo przodków osiadających grasicy E 13 i E 18 płaty grasicy skolonizowane każdym typem komórek progenitorowych zostały przeszczepione pod torebką nerkową biorców CD z nokautem trzecim. Jak właśnie pokazano, zgodnie z oczekiwaniami. Progenitorzy osadzający się grasicy E 13 spowodowali powstanie limfocytów T szybciej niż prekursorzy E 18, chociaż liczba krążących komórek T była znacznie niższa u zwierząt skolonizowanych przez przodka grasicy E 13 Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii rozwojowej do zbadania właściwości podzbioru limfocytów T, Niektóre z nich mają ścisłe pochodzenie embrionalne w modelu ssaków.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prześledzić zróżnicowane i funkcjonalne szlaki osiedlania się przodków Timex i ich potomstwa w środowisku naturalnym i w warunkach konkurencji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodologię analizy progenitorów osiedlających się w tymusie i ich potomstwa komórek T za pomocą technik in vivo i in vitro. Badanie koncentruje się na kinetyce wytwarzania, fenotypie i liczbie komórek T produkowanych z tych progenitorów.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Tło
- Progenitory osiedlające się w tymusie odgrywają kluczową rolę w rozwoju komórek T.
- Zrozumienie ich kinetyk i różnicowania jest istotne dla badań immunologicznych.
- Badanie wykorzystuje zarodki myszy do zbadania tych progenitorów.
- Istniejące metody często nie pozwalają na pełne dojrzewanie komórek T z określonych progenitorów.
Cel badania
- Charakteryzowanie progenitorów osiedlających się w tymusie.
- Analiza wytwarzania i fenotypu ich potomstwa komórek T.
- Ulepszenie istniejących metod in vitro hodowli komórek T.
Zastosowane metody
- Izolacja płatków tymusowych z zarodków myszy E 13, E 14 i E 18.
- Napromieniowanie płatków tymusowych E 14 z następującą kolonizacją za pomocą przepływowych E 13 lub E 18 komórek.
- Przeszczepienie skolonizowanych płatków pod torebkę nerki dorosłych myszy knockout CD trzy.
- Cytometria przepływowa do oceny obecności potomstwa komórek T we krwi chimerycznych zwierząt.
Główne wyniki
- Metodologia pozwala na pełne dojrzewanie komórek T z określonych progenitorów.
- Udana ocena różnicowania i funkcji progenitorów tymusowych.
- Wykazana obecność potomstwa E 13 i E 18 w chimerycznych myszach.
- Ulepszone zrozumienie dynamiki rozwoju komórek T.
Wnioski
- Ta technika zapewnia nowatorskie podejście do badania dojrzewania komórek T.
- Łączy metody in vitro i in vivo dla kompleksowej analizy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia biologii progenitorów tymusowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding thymic progenitor kinetics enables predictive modeling of T-cell reconstitution in lymphopenic settings, informing cell therapy design. The method bridges in vitro progenitor assessment with in vivo functional validation, reducing mechanistic ambiguity in early immunotherapeutic target validation. This supports de-risking of hematopoietic stem cell and progenitor-based strategies by clarifying developmental timelines and subset-specific output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of progenitor-intrinsic differentiation potential by isolating E13 and E18 thymic settling progenitors to assess autonomous T-cell lineage commitment.
- Operational Value: Uses CD45 allotypic markers to distinguish progenitor inputs without genetic manipulation, preserving native phenotype for accurate functional comparison.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The hanging drop colonization assay provides a standardized, reproducible 3D microenvironment to quantify progenitor engraftment and early thymic seeding efficiency.
- Operational Value: Allows side-by-side comparison of progenitor batches under identical stromal conditions, minimizing niche variability and improving assay consistency across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal tracking of mature T-cell output in vivo via grafting into immunodeficient hosts, revealing delayed but expanded E18-derived peripheral T-cell reconstitution not seen in short-term cultures.
- Operational Value: Supports assessment of durable immune reconstitution, a key predictor for long-term efficacy in T-cell replacement therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This method situates progenitor characterization between early discovery (phenotypic screening) and preclinical validation, linking in vitro colony-forming potential to in vivo immune reconstitution metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing progenitor subsets for intrinsic differentiation kinetics and subset bias, such as dendritic epithelial T-cell generation.
- Screening: Delivers quantitative engraftment and early colonization metrics under controlled stromal conditions, enabling progenitor batch comparability.
- Analytics: Employs flow cytometry to measure progeny phenotype, frequency, and temporal dynamics in blood and grafts, providing multiparametric readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Connects progenitor input to functional T-cell output in vivo, enabling prediction of peripheral immune reconstitution kinetics and tissue colonization potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating hematopoietic or lymphoid progenitors across disease models, provided thymic stromal support and immunocompromised recipients are available.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking progenitor phenotype to defined T-cell outputs, including subset-specific maturation like dendritic epithelial T cells.
- Operational Value: Standardizes progenitor assessment via irradiation-conditioned thymic lobes and hanging drop colonization, improving inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in progenitor-based therapies by predicting both speed and magnitude of T-cell reconstitution.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of progenitor sources based on developmental tempo and long-term output potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection, thymic lobe isolation, and sterile surgical grafting under kidney capsule.
- Dependent on access to irradiated fetal thymic lobes, flow cytometry for progenitor sorting, and immunocompromised recipient strains (e.g., CD3−/−).
- Necessitates standardized hanging drop incubation conditions (37°C, 5% CO2, 48h) to ensure consistent progenitor-thymic lobe interaction.
- Requires validation of graft survival and lymphocyte egress to accurately assess peripheral T-cell reconstitution over time.
- Limited to murine systems; extrapolation to human progenitors requires cross-species thymic stromal compatibility testing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
Embryo Dissection
2:52
Thymus Isolation
3:49
E14 Thymic Lobe Progenitor Colonization: Hanging Drop Technique
4:53
Grafting Under the Kidney Capsule
6:22
Results: Representative Thymic Settling Progenitor (TSP) Propagation
8:07
Conclusion
