Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego
26 marca 2015
Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.
Ogólnym celem poniższej procedury jest wykorzystanie modelu gryzonia do oceny przeszczepów inżynierii tkankowej w celu wymiany więzadła krzyżowego przedniego. Osiąga się to poprzez wytworzenie biodegradowalnego rusztowania polimerowego. W drugim etapie rusztowanie jest wszczepiane w kolano szczura.
Po 16 tygodniach więzadła neo utworzone z rusztowania są pobierane do analizy histologicznej. Ostatecznie testuje się wytrzymałość biomechaniczną kolagenu w celu oceny jakości tych przeszczepów inżynierii tkankowej do zastosowania w rekonstrukcji ACL. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami oceny rusztowań jest to, że model ten wystawia rusztowanie na działanie złożonego środowiska in vivo, pozostając jednocześnie opłacalnym i łatwiejszym w obsłudze niż większe modele zwierzęce.
Model ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak to, w jaki sposób rusztowanie inżynieryjne zintegruje się ze środowiskiem in vivo, tworząc więzadło neo? Ta technika może prowadzić do nowych metod leczenia i rekonstrukcji ACL. Ponieważ małe modele zwierzęce są pierwszym krokiem do translacji klinicznej, chociaż ta metoda może być wykorzystana do oceny naszego konkretnego rusztowania.
Może być również stosowany do innych kontraktów inżynierii tkankowej, takich jak te z komórkami i czynnikami wzrostu. Optymalizujemy technikę chirurgiczną, modyfikując metody stosowane przez dr Scotta Rodeo i jego współpracowników w szpitalu chirurgii specjalnej w Nowym Jorku. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki elektroprzędzenia i chirurgiczne mogą być trudne do nauczenia się na podstawie samych pisemnych instrukcji.
Podczas elektroprzędzenia polikaprolaktonu tworzy się duże akrylowe pudełko z punktami wejścia dla źródłowego roztworu polikaprolaktonu. Trzpień zbierający zasilany silnikiem i port próżniowy napędzany przez źródło napięcia umieszczone w okapie oparów chemicznych będą potrzebne, aby służyć jako izolowane medium próżniowe dla procesu elektroprzędzenia. Przed rozpoczęciem procedury należy dokładnie wyczyścić pudełko 70% etanolem i przykryć wszystkie powierzchnie arkuszami folii para, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą pogorszyć jakość produktu przędzonego elektronicznie.
Następnie włącz wentylator i załaduj trzy mililitry świeżo przygotowanego polimeru polikaprolaktonu do 10-mililitrowej strzykawki z igłą igłą o rozmiarze 18. Po usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza zamknij roztwór w programowalnej pompie strzykawkowej i włóż igłę do akrylowego pudełka przez port wejściowy, pozostawiając około pół cala igły na zewnątrz pudełka. Następnie szczelnie przykryj obracający się trzpień listwy cienkim paskiem folii aluminiowej i zablokuj trzpień w silniku po przeciwnej stronie pudełka, w odległości około 15 centymetrów od igły strzykawki, aby działał jak kolektor, włóż plastikowy wąż do portu próżniowego.
Następnie podłącz wąż do źródła podciśnienia pod wyciągiem i włącz go. Teraz przykryj akrylowe pudełko pokrywką i ustaw szybkość infuzji programowalnej pompy strzykawkowej na 2,5 mililitra na godzinę. Następnie uziemić przewód ujemny, włączyć silnik, aby uruchomić trzpień z prędkością 3 450 obr./min i użyć zacisku krokodylkowego, aby przymocować dodatni przewód źródła napięcia do końcówki igły na zewnątrz pudełka.
Po rozpoczęciu infuzji roztworu polikaprolaktonu należy włączyć źródło napięcia i ustawić je na napięcie robocze 20 kilowoltów. Po 12 minutach infuzji z 0,5 mililitra roztworu polikaprolaktonu utworzy się jednorodny mankiet. Wyłącz wszystkie urządzenia, w tym napięcie, źródło, silnik, podciśnienie i pompę strzykawkową.
Zdejmij trzpień z silnika, zdejmij polimerowy mankiet z trzpienia i wykonaj pojedyncze cięcie poprzeczne, uzyskując prostokątną matę wirowaną elektrycznie. Następnie wytnij laserowo matę, aby uformować wiele małych arkuszy, które są później cięte na paski ułożone w stosy o grubości czterech warstw i zszywane razem, tworząc rusztowania przed rozpoczęciem operacji. Po pierwsze, potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na nacisk tylnej stopy.
Następnie wykonaj dwucentymetrowe pionowe nacięcie przyśrodkowe do kolana wyśrodkowane na poziomie rzepki, w razie potrzeby cofając skórę na boki. Następnie za pomocą skalpela wykonaj artrotomię przyśrodkową przybrzuszną przyśrodkową do rzepki, rozciągając się proksymalnie do poziomu połączenia ścięgnistego mięśnia czworogłowego uda i dystalnie do poziomu przyczepu ścięgna rzepki na guzku piszczelowym. Teraz wykonaj jednocentymetrowe pionowe nacięcie przez torebkę kolana tuż obok ścięgna rzepki, aby uwolnić rzepkę bocznie.
Następnie, upewniając się, że kolano jest wyprostowane, przełóż cienkie nożyczki pod rzepką od boku do strony przyśrodkowej i rozłóż nożyczki kilka razy, aby mechanizm prostownika można było przesunąć w dowolną stronę, zginając kolano. Przełożyć rzepkę na boki, aby odsłonić wnętrze stawu kolanowego, potwierdzając wyraźną wizualizację wcięcia międzykłykciowego i kłykci kości udowej. Następnie przeciąć ACL i PCL w wycięciu.
Teraz umieść końcówkę drutu K o średnicy 1,6 milimetra przymocowanego do wiertarki elektrycznej na początku ACL w wcięciu międzykłykciowym i wiercić z boku, podczas gdy asystent stabilizuje kolano. Następnie kilkakrotnie przełóż drut K do środka i na zewnątrz, aby zapewnić wolne przejście dla przeszczepu. Wizualizuj punkt wyjścia po bocznej stronie kości udowej, usuwając w razie potrzeby tkankę miękką za pomocą skalpela.
Gdy tunel jest czysty, umieść drut K na odcisku ACL na płaskowyżu piszczelowym i wywierć z boku, podczas gdy asystent ustabilizuje kolano. Następnie wizualizuj punkt wyjścia na przednio-bocznej proksymalnej kości piszczelowej za pomocą skalpela, aby w razie potrzeby oczyścić tkankę miękką, tak aby punkt, w którym drut K wychodzi z kości piszczelowej, był w pełni widoczny i przełóż skróconą igłę Keitha o długości nie większej niż dwa cale przez tunel kości udowej. Teraz przeciągnij dwa końce szwu z jednego końca przeszczepu przez ucho igły i użyj igły, aby przeciągnąć jeden koniec przeszczepu przez kanał udowy.
Następnie użyj igły, aby przejść drugi koniec przeszczepu przez tunel piszczelowy za pomocą szwu Vicryl z czterema zerami. Następnie przymocuj koniec kości udowej przeszczepu do otaczającej tkanki miękkiej za pomocą szwu ósemkowego, trzymając kolano w wyprostu, aby wytworzyć ręczne napięcie w przeszczepie. Użyj innego ściegu ósemkowego, aby przymocować piszczelowy koniec przeszczepu do otaczającej tkanki miękkiej, odcinając nadmiar przeszczepu na obu końcach nożyczkami i pozostawiając od jednego do dwóch milimetrów na każdym końcu za ściegiem.
Na koniec wyprostuj kolano i zmniejsz rzepkę. Następnie za pomocą czteropunktowego szwu Vicryl umieść pojedynczy szew ósemkowy, aby zamknąć przyśrodkową torebkę stawową, zapobiegając bocznemu podwichnięciu rzepki i zamknij skórę biegnącym podskórnym szwem Monocryl lub Vicryl z pięcioma zerami. Po 16 tygodniach od rekonstrukcji analiza histologiczna wyciętego kolana wykazuje, że macierz rusztowania staje się w dużej mierze naciekana przez fibroblasty, wydzielając kolagen eozynofilowy z dobrą integracją z tunelami kostnymi.
W tym eksperymencie właściwości biomechaniczne stawu oceniano natychmiast po uśmierceniu. Wszystkie badane próbki uległy uszkodzeniu w środkowej substancji przy użyciu krzywych o niskim przemieszczeniu wygenerowanych w wyniku prób rozciągania. Obciążenie niszczące i sztywność zostały obliczone dla każdej grupy.
Po 16 tygodniach od implantacji przeszczep polimeru electro spon w przybliżeniu podwoił szczytowe obciążenie i sztywność przeszczepu badanego bezpośrednio po implantacji. Chociaż wartości te były nadal niższe niż w przypadku natywnego ACL Po opanowaniu operacji na zwierzętach można przeprowadzić w około 15 minut. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o wykonaniu dobrego zamknięcia, w którym żaden szew nie jest widoczny z zewnątrz.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne analizy punktów końcowych, takie jak dodatkowe barwienie i testy biochemiczne. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową do oceny wielu opcji przeszczepów w celu rekonstrukcji ACL. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć rusztowanie polimerowe do implantacji w modelu rekonstrukcji ACL u gryzoni.
Nie zapominaj, że praca z żywymi zwierzętami może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak przestrzeganie zaleceń weterynaryjnych i noszenie środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół oceny konstruktów inżynierii tkankowej z wykorzystaniem modelu gryzoni do rekonstrukcji więzadła krzyżowego przedniego (ACL). Szczegółowo opisano proces wytwarzania biodegradowalnego rusztowania polimerowego oraz jego implantację w kolanie szczura, a następnie analizę histologiczną po 16 tygodniach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biomechanika
- Chirurgia ortopedyczna
Wstęp
- Modele zwierzęce są kluczowe dla testowania graftów inżynierii tkankowej.
- Biodegradowalne polimery otrzymywane metodą elektroprzędzenia są obiecujące w rekonstrukcji ACL.
- Ocena in vivo pozwala uzyskać wiedzę na temat wydajności rusztowania.
- Modele gryzoni są kosztowo efektywne i łatwiejsze w utrzymaniu niż większe zwierzęta.
Cel badania
- Wytworzenie biodegradowalnego rusztowania polimerowego do zastąpienia ACL.
- Ocena wydajności rusztowania w modelu szczurzym.
- Ocena wytrzymałości biomechanicznej nowych więzadeł utworzonych z rusztowania.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie biodegradowalnego rusztowania polimerowego metodą elektroprzędzenia.
- Implantacja rusztowania do stawu kolanowego w modelu szczura.
- Pobranie nowych więzadeł po 16 tygodniach do analizy.
- Badania histologiczne i biomechaniczne w celu oceny jakości przeszczepu.
Główne wyniki
- Pomyślna fabrykacja i implantacja biodegradowalnego rusztowania.
- Obserwacja formowania się nowych więzadeł po 16 tygodniach.
- Analiza histologiczna wykazała obiecującą integrację tkankową.
- Badania biomechaniczne wykazały odpowiednią wytrzymałość do rekonstrukcji ACL.
Wnioski
- Model gryzoni pozwala na skuteczną ocenę wszczepów inżynierii tkankowej.
- Biodegradowalne rusztowania polimerowe wykazują potencjał w naprawie ACL.
- Metoda ta stanowi kosztowo efektywną alternatywę dla modeli na większych zwierzętach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół ustanawia powtarzalny model gryzoni do oceny konstruktów więzadła krzyżowego przedniego wytworzonych metodami inżynierii tkankowej, wypełniając tym samym krytyczną lukę w przedklinicznej walidacji podejść medycyny regeneracyjnej. Dzięki umożliwieniu oceny integracji rusztowania, tworzenia się nowego więzadła oraz parametrów biomechanicznych w kosztowo efektywnym systemie, protokół ten wspiera wczesne ograniczanie ryzyka strategii naprawy ACL przed przejściem do badań na większych zwierzętach lub studiów klinicznych. Model ten ułatwia uzyskanie wglądu w mechanizmy interakcji między przeszczepem a organizmem gospodarza, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w ramach procesów rozwoju inżynierii tkankowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie biozgodności i biodegradowalności rusztowania w środowisku żywego stawu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowaną platformę do oceny wydajności ksenogenicznych przeszczepów zasianych komórkami, bez zakłóceń wynikających z odrzucenia immunologicznego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera walidację funkcjonalnych celów poprzez korelację strukturalnych właściwości przeszczepu z efektami na poziomie tkankowym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników histologicznych i biomechanicznych do oceny jakości przeszczepu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalnych wskaźników tworzenia się nowego więzadła po 16 tygodniach w celu porównawczego przesiewu rusztowań.
- Gotowość analizy: Ustanawia obciążenie krytyczne i sztywność jako kluczowe zmienne zależne do oceny skuteczności zaprojektowanego przeszczepu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Demonstruje naciekanie kolagenu i odkładanie macierzy eozynofilnej jako biomarkery integracji przeszczepu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia bezpośrednie porównanie wszczepionych graftów z przeciwstronnymi natywnymi kontrolami ACL w celu oceny postępów z uwzględnieniem ryzyka.
- Pewność prognostyczna: Mierzy zależną od czasu poprawę biomechaniczną, wykazując dwukrotny wzrost maksymalnego obciążenia i sztywności w 16. tygodniu w porównaniu z okresem bezpośrednio po implantacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez dotyczących parametrów konstrukcji rusztowania oraz umożliwiając ilościowe porównanie kolejnych wersji przeszczepów przed identyfikacją wiodącego kandydata.
- Biologia odkrywcza: Bada, w jaki sposób rusztowania z elektroprzędzionej polikaprolaktonu integrują się z środowiskiem in vivo w celu utworzenia nowych więzadeł.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowaną analizę histologiczną infiltracji fibroblastów i wydzielania kolagenu w 16. tygodniu.
- Analityka: Generuje dane z testów rozciągania w celu obliczenia obciążenia krytycznego i sztywności jako ilościowych punktów końcowych.
- Badania translacyjne: Łączy wydajność rusztowania z tworzeniem nowych więzadeł, dostarczając informacji dla ciągłości badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny model gryzoni do oceny różnych opcji przeszczepów inżynierii tkankowej, w tym tych z komórkami i czynnikami wzrostu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w procesie integracji przeszczepu z organizmem biorcy poprzez bezpośrednią wizualizację infiltracji tkankowej.
- Wartość operacyjna: Stanowi kosztowo efektywną i technicznie możliwą do zarządzania alternatywę dla modeli na większych zwierzętach w celu iteracyjnej oceny rusztowań.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o progi biomechaniczne i histologiczne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na przeszczepy z uwzględnieniem ryzyka dzięki standaryzowanym ocenom wyników po 16 tygodniach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie elektroprzędzenia, technik chirurgicznych u gryzoni oraz pooperacyjnego przetwarzania histologicznego.
- Niezbędna jest aparatura do elektroprzędzenia z kontrolą napięcia, obrotem trzpienia oraz zintegrowanym systemem próżniowym w dygestorium.
- Wymagana jest standaryzacja technik szycia oraz kontrola naprężenia, aby zapewnić spójną implantację przeszczepu.
- Uwzględnia kwestie adaptacji w przypadku przeszczepów zasianych komórkami ksenogenicznymi oraz systemów dostarczania czynników wzrostu.
- Metoda jest ograniczona 16-tygodniowym punktem końcowym, który może nie uchwycić długoterminowego przebudowywania przeszczepu lub mechanizmów jego niewydolności.
