Name: Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj metodę oceny inżynierii tkankowej przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego w modelu szczura. Protokół obejmuje elektroprzędzenie biodegradowalnego rusztowania polimerowego, implantację do stawu kolanowego oraz analizę histologiczną i biomechaniczną po 16 tygodniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Gabrielowi Aromowi i Michaelowi Yeranosianowi za ich techniczny wkład we wcześniejsze wersje tego projektu. Projekt ten został sfinansowany przez OREF Clinician Scientist Training Grant (NL), H H Lee Surgical Research Grant (NL), Veterans Administration BLR&D Merit Review 1 I01 BX00012601 (DM) oraz Musculoskeletal Transplantation Foundation Young Investigator Award (FP).

UWAGA: Wszystkie operacje na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalny personel weterynaryjny i komitet ds. użytkowania zwierząt przed rozpoczęciem eksperymentów.
1. Przygotowanie elektrowirowanych rusztowań polikaprolaktonowych
<ol>
	<li>Zważyć i rozpuścić poli(ε-kaprolakton) klasy medycznej zakończony estrami w postaci granulek w 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu w celu wytworzenia 10% m/w roztworu polimeru PCL. Pozwól roztworowi mieszać za pomocą płytki mieszającej przez co najmniej 3 godziny, aby zapewnić jednorodny roztwór.</li>
	<li>Elektrowiruj roztwór PCL, aby stworzyć mankiet z wysoce wyrównanych włókien PCL do produkcji rusztowań.
	<ol>
		<li>Przygotuj zestaw do elektroprzędzenia w dygestoriach chemicznych z włączonym wentylatorem przez cały czas. Składa się on z dużego akrylowego pudełka, które będzie służyć jako izolowane medium próżniowe do procesu elektroprzędzenia i ma punkty wejścia dla źródłowego roztworu PCL napędzanego przez źródło napięcia, trzpień zbierający zasilany silnikiem oraz port próżniowy. Dokładnie wyczyść akrylowe pudełko etanolem i przykryj wszystkie powierzchnie arkuszami Parafilm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą zagrozić jakości produktu elektroprzędzonego.</li>
		<li>Załadować około 3 ml powyższego roztworu do strzykawki o pojemności 10 ml z igłą igłą 18 G, 1 1/2 cala. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, popychając strzykawkę do góry. Umieścić roztwór w programowalnej pompie strzykawkowej. Włóż igłę przez mały otwór do akrylowego pudełka, pozostawiając około 1/2 cala igły na zewnątrz akrylowego pudełka w celu zamocowania przewodu źródłowego napięcia.</li>
		<li>Użyj obrotowego trzpienia tokarki o średnicy 30 mm jako kolektora dla wysoce wyrównanych włókien PCL; szczelnie przykryj trzpień cienkim paskiem folii aluminiowej. Zablokuj trzpień w silniku po przeciwnej stronie pudełka w odległości około 15 cm od igły strzykawki.</li>
		<li>Włóż plastikowy wąż do portu podciśnieniowego i podłącz do źródła podciśnienia pod wyciągiem. Włącz źródło podciśnienia i przykryj akrylowe pudełko pokrywką.</li>
		<li>Ustaw szybkość infuzji programowalnej pompy strzykawkowej na 2,5 ml/godz. Włącz silnik, aby uruchomić trzpień z prędkością 3,450 obr./min i podłącz dodatni przewód źródła napięcia do końcówki igły na zewnątrz pudełka za pomocą zacisku krokodylkowego.</li>
		<li>Po rozpoczęciu infuzji roztworu PCL włączyć źródło napięcia i ustawić napięcie robocze 20 kV.</li>
		<li>Mieszać roztwór przez 12 minut, aby uzyskać jednorodny mankiet z 0,5 ml roztworu PCL. 
		UWAGA: Średnio każdy mankiet ma wystarczającą ilość elektroprzędzonego materiału, aby utworzyć dwa sześciopaskowe arkusze, które można wykorzystać do stworzenia łącznie trzech czterowarstwowych rusztowań.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytnij laserowo mankiet PCL, aby utworzyć wiele małych arkuszy na wycinarce VersaLaser Cutter 2.3 działającej przy ustawieniu niskiej próżni, napięciu lądowania 10,0 keV, odległości roboczej 6,4 mm i średnicy sondy 3,0, 
	UWAGA: W tym przykładzie wykorzystano projekt wspomagany komputerowo, aby poinstruować frez, aby tworzył wiele arkuszy rusztowań o wymiarach 1,5 mm x 35 mm x 150 μm z równomiernie rozmieszczonymi otworami o średnicy 150 μm przy 15% powierzchni porów.</li>
	<li>Wytrawianie plazmowe rusztowań PCL za pomocą myjki plazmowej w celu wywołania hydrofilowości powierzchni PCL z przyspieszeniem jonów. Ustaw podciśnienie na 450 mTorr i obrób rusztowania przez 30 sekund z dużą mocą (29,6 W).</li>
	<li>Kąpać rusztowania w 70% etanolu w sterylnym środowisku.</li>
	<li>Pokryj poszczególne rusztowania kolagenem, aby ułatwić adhezję komórkową i proliferację in vivo.
	<ol>
		<li>Stworzyć roztwór powlekający kolagen, rozcieńczając sterylny roztwór kolagenu Purecol 3 mg/ml roztworu wzorcowego kolagenu Purecol 3 mg/ml 10x PBS i 0,1 N NaOH 1:9 w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Dokładnie wymieszać, aby zapewnić jednorodność roztworu.</li>
		<li>Powij pojedyncze rusztowania o wymiarach 1,5 mm x 35 mm x 150 μm cienkowarstwową warstwą powyższego roztworu kolagenu. Pozostawić do wyschnięcia na 24 godziny w sterylnym środowisku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając szwów 5-0 Vicryl, ułóż i przymocuj cztery indywidualne rusztowania o wymiarach 1,5 mm x 35 mm x 150 μm za pomocą ściegu Krackowa, aby stworzyć końcowe, wielowarstwowe, pokryte kolagenem rusztowanie o grubości 0,6 mm, które jest gotowe do implantacji.</li>
</ol>
2. Protokół operacji na szczurach
<ol>
	<li>Wywołaj znieczulenie, umieszczając szczura w komorze inhalacyjnej i podając 2% izofluranu z 2 l/min tlenu. Upewnij się, że szczur jest odpowiednio znieczulony, wywierając nacisk na tylną łapę i oceniając jakąkolwiek reakcję.</li>
	<li>Na niesterylnym tylnym stole wstrzyknąć podskórnie 25 mg/kg ampicyliny i 0,03 mg/kg buprenorfiny.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy. Obetnij sierść z operowanej kończyny tylnej i przygotuj miejsce operacji trzema naprzemiennymi peelingami chlorheksydyny i 70% etanolu.</li>
	<li>Przenieś szczura na stół operacyjny na podgrzewaną podkładkę, aby zapobiec hipotermii. Zabezpiecz stożek nosowy i utrzymuj znieczulenie przez cały zabieg za pomocą 2% izofluranu w 2 l/min tlenu, dostarczonego stożek nosowy. Ułożyć w sterylny sposób, pozostawiając kończynę operacyjną odsłoniętą. </li>
	<li>Przed przystąpieniem do zabiegu należy najpierw potwierdzić odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na ucisk tylnej części stopy.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie o długości 2 cm przyśrodkowo do kolana, wyśrodkowane na poziomie rzepki. Cofnij skórę na boki, aż nacięcie znajdzie się wyśrodkowane nad kolanem.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby wykonać artrotomię przyśrodkową przyrzepki, przecinając tylko przyśrodkowo do rzepki i rozciągając się proksymalnie do poziomu połączenia mięśniowo-ścięgnistego mięśnia czworogłowego i dystalnie do poziomu przyczepu ścięgna rzepki na guzku piszczelowym. Uważaj, aby nie przeciąć ścięgien rzepki lub mięśnia czworogłowego.</li>
	<li>Zwolnij rzepkę bocznie, wykonując pionowe nacięcie o długości 1 cm przez torebkę kolana tuż obok ścięgna rzepki.</li>
	<li>Upewnij się, że kolano jest wyprostowane. Weź parę cienkich nożyczek i przełóż pod rzepką od bocznej do środkowej. Rozłóż nożyczki kilka razy, aby mechanizm prostownika można było przesunąć na dowolną stronę.</li>
	<li>Zginając kolano, przesuń rzepkę na boki, aby odsłonić wnętrze stawu kolanowego. Zapewnić wyraźną wizualizację wcięcia międzykłykciowego i kłykci kości udowej. Za pomocą skalpela przeciąć ACL i PCL w wycięciu.</li>
	<li>Załaduj wiertarkę drutem k 1,6 mm. Umieść końcówkę k-wire na początku ACL w wcięciu międzykłykciowym. Wywierć superolateralnie i zwizualizuj punkt wyjścia po bocznej stronie kości udowej, usuwając w razie potrzeby tkankę miękką za pomocą skalpela. Przełóż drut k kilka razy, aby zapewnić wolne przejście dla przeszczepu.</li>
	<li>Umieść drut k na śladzie ACL na płaskowyżu piszczelowym. Wywierć przednio-bocznie i zwizualizuj punkt wyjścia na przednio-bocznej bliższej kości piszczelowej. W razie potrzeby użyj skalpela, aby oczyścić tkankę miękką, tak aby punkt, w którym drut k wychodzi z kości piszczelowej, był w pełni uwidoczniony.</li>
	<li>Przełóż skróconą igłę Keitha (najlepiej nie większą niż 2 cale długości) przez tunel kości udowej. Przeciągnij dwa końce szwu z jednego końca przeszczepu przez oczko igły Keitha. Użyj igły, aby przeciągnąć jeden koniec przeszczepu przez kanał kości udowej.</li>
	<li>Powtórz poprzedni krok, aby przejść drugi koniec przeszczepu przez tunel piszczelowy.</li>
	<li>Użyj szwu 4-0 Vicryl, aby przymocować koniec kości udowej przeszczepu do otaczającej okostnej lub innej tkanki miękkiej za pomocą szwu ósemkowego. Ręcznie napnij przeszczep z kolanem w wyprostu. Przymocuj piszczelowy koniec przeszczepu do otaczającej okostnej lub innej tkanki miękkiej za pomocą ściegu ósemkowego.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby odciąć nadmiar przeszczepu na obu końcach, pozostawiając 1-2 mm na każdym końcu poza ściegiem ósemkowym.</li>
	<li>Przedłuż kolano i zmniejsz rzepkę. Używając 4-0 vicryl, umieść pojedynczy szew ósemkowy, aby zamknąć przyśrodkową torebkę stawową, zapobiegając bocznemu podwichnięciu rzepki.</li>
	<li>Zamknij skórę biegnącym podskórnym szwem 5-0 Monocryl lub Vicryl, uważając, aby nie zszyć leżącego pod spodem mięśnia ani nie mieć widocznego szwu po zamknięciu skóry.</li>
	<li>Szczurom należy wstrzykiwać podskórnie buprenorfinę co 12 godzin przez łącznie trzy dni po operacji. Sprawdzić, czy w miejscu operowanym nie ma drenażu lub rozejścia się rany w momencie wstrzyknięcia. Utykanie i obrzęk są normalne w ciągu pierwszych kilku dni po zabiegu, ale wszelkie problemy pooperacyjne należy natychmiast rozwiązać we współpracy z personelem weterynaryjnym. Zwierzę może wrócić do mieszkania socjalnego po 2 tygodniach od operacji, kiedy nacięcia chirurgiczne są całkowicie zagojone.</li>
</ol>
3. Protokół zbierania danych
<ol>
	<li>W momencie składania ofiary szczury dusi się pojedynczo w zamkniętej komorze CO2 , a następnie przeprowadza się torakotomię.</li>
	<li>Zbierz zarówno chirurgicznie zrekonstruowane, jak i przeciwległe kończyny, oddzielając je w stawie biodrowym.
	<ol>
		<li>W przypadku zrekonstruowanych kończyn należy usunąć całą tkankę miękką, w tym więzadło krzyżowe tylne i pozostałości po chirurgicznie uszkodzonym natywnym ACL, poprzez dokładne rozwarstwienie, aby wyizolować tylko kość udową, piszczel i przeszczep.</li>
		<li>W przypadku kończyn przeciwległych usuń wszystkie tkanki miękkie z wyjątkiem natywnego ACL, a także kości udowej i piszczelowej przez dokładne rozwarstwienie.</li>
		<li>Użyj narzędzia obrotowego, takiego jak Dremel, aby usunąć całą kość z wyjątkiem 3/4 do 1 cm z każdego końca kompleksu kość udowa-przeszczep-piszczel.</li>
		<li>Podczas tego procesu i podczas badań biomechanicznych należy regularnie i często spryskiwać obszary więzadeł zwykłą solą fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu pobranego kolana, co może fałszywie zmienić wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu analizy histologicznej należy umocować każde kolano indywidualnie w 4% roztworze paraformaldehydu w temperaturze 25 °C przez 48 godzin. Następnie zanurz kolano w roztworze odczynnika Immunocal w celu całkowitego odwapnienia; Proces ten jest zależny od wapiennej zawartości próbki i może trwać do pięciu dni. Codziennie sprawdzaj poszczególne próbki, aby ocenić postęp, ponieważ niepełne odwapnienie może obniżyć jakość próbki. Po zakończeniu wykonaj sekcjonowanie, montaż ślizgowy i barwienie zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Wykonaj badania biomechaniczne w celu oceny zdolności funkcjonalnej więzadła inżynierii tkankowej.
	<ol>
		<li>Zabezpiecz kość udową i piszczelową, owijając drut stalowy ocynkowany o wadze 28 G wokół nasady każdej kości z osobna. Ma to na celu zapobieżenie nieprawidłowym danym z badań biomechanicznych spowodowanemu przedwczesnym uszkodzeniem próbki przy rozciąganiu przy kości, a nie przy więzadle będącym przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Wsadzić kość udową do mieszaniny cementu kostnego z polimetakrylanu metylu (PMMA). Aby to zrobić, wymieszaj dwa składniki cementu i natychmiast użyj lepkiej mieszanki, aby zabezpieczyć kość udową w metalu, całkowicie otaczając trzon kości w cementowanym doniczce z nasadą i przyczepionym więzadłem wystającym swobodnie. Pozwól, aby spontaniczna polimeryzacja wolnorodnikowa stopniowo przekształciła mieszane lepkie składniki w materiał o konsystencji ciasta, a ostatecznie w stałą utwardzoną matrycę. 
		UWAGA: Proces ten trwa kilka minut i można go monitorować, ręcznie oceniając temperaturę bolusa wykonanego z pozostałego cementu; temperatura powinna przejściowo wzrosnąć podczas reakcji polimeryzacji egzotermicznej i ustąpić do RT po zestaleniu się materiału.</li>
		<li>Powtórz ten sam proces powyżej, aby zacementować kość piszczelową, z wyjątkiem utrzymania więzadła kolana przy zgięciu pod kątem 20 ° w celu uzyskania idealnych testów mechanicznych.</li>
		<li>Zamontuj scementowany kompleks kość udowo-graftowo-piszczelowa na aparacie do prób rozciągania i przygotuj się do rejestrowania obciążenia i przemieszczenia w funkcji czasu od początku naprężenia do uszkodzenia. W tym przykładzie użyliśmy modelu 5564 firmy Instron z czujnikiem wagowym 1 kN.</li>
		<li>Wstępnie naprężyć szczepion do 2 N z prędkością narastania 0,5 N/min, a następnie przetestować przeszczep do uszkodzenia przy szybkości odkształcania 0,5 mm/s. W trakcie procesu należy upewnić się, że więzadło ulega uszkodzeniu w połowie substancji oraz że kostna kość udowa i piszczelowa są bezpieczne i nie ulegają przedwczesnemu uszkodzeniu, co może niedokładnie ocenić właściwości biomechaniczne badanego więzadła.</li>
		<li>Za pomocą wygenerowanych krzywych obciążenia-przemieszczenia oblicz obciążenie niszczące i sztywność badanego więzadła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fetto, J. F., Marshall, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+and+diagnosis+of+anterior+cruciate+ligament+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">The natural history and diagnosis of anterior cruciate ligament insufficiency.</a> Clin Orthop Relat Res. (147), 29-38 (1980).</li>
<li>Kim, Y. M., Lee, C. A., Matava, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+results+of+arthroscopic+single-bundle+transtibial+posterior+cruciate+ligament+reconstruction%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical results of arthroscopic single-bundle transtibial posterior cruciate ligament reconstruction: a systematic review.</a> Am J Sports Med. 39 (2), 425-434 (2011).</li>
<li>Andersson, C., Odensten, M., Gillquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knee+function+after+surgical+or+nonsurgical+treatment+of+acute+rupture+of+the+anterior+cruciate+ligament%3A+a+randomized+study+with+a+long-term+follow-up+period%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Knee function after surgical or nonsurgical treatment of acute rupture of the anterior cruciate ligament: a randomized study with a long-term follow-up period.</a> Clin Orthop Relat Res. (264), 255-263 (1991).</li>
<li>Klimkiewicz, J. J., Petrie, R. S., Harner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+treatment+of+combined+injury+to+anterior+cruciate+ligament%2C+posterior+cruciate+ligament%2C+and+medial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Surgical treatment of combined injury to anterior cruciate ligament, posterior cruciate ligament, and medial structures.</a> Clin Sports Med. 19 (3), 479-492 (2000).</li>
<li>Petrigliano, F. A., McAllister, D. R., Wu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction%3A+a+review+of+current+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Arthroscopy%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering for anterior cruciate ligament reconstruction: a review of current strategies.</a> Arthroscopy. 22 (4), 441-451 (2006).</li>
<li>Groot, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+porous+polyurethanes+for+meniscal+reconstruction+and+meniscal+prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Use of porous polyurethanes for meniscal reconstruction and meniscal prostheses.</a> Biomaterials. 17 (2), 163-173 (1996).</li>
<li>Leong, N. L., Petrigliano, F. A., McAllister, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+tissue+engineering+strategies+in+anterior+cruciate+ligament+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Current tissue engineering strategies in anterior cruciate ligament reconstruction.</a> J Biomed Mater Res A. 102 (5), 1614-1624 (2014).</li>
<li>Duling, R. R., Dupaix, R. B., Katsube, N., Lannutti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+electrospun+polycaprolactone+%28PCL%29%3A+a+potential+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of electrospun polycaprolactone (PCL): a potential scaffold for tissue engineering.</a> J Biomech Eng. 130 (1), 011006(2008).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycaprolactone+electrospun+mesh+conjugated+with+an+MSC+affinity+peptide+for+MSC+homing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polycaprolactone electrospun mesh conjugated with an MSC affinity peptide for MSC homing in vivo.</a> Biomaterials. 33 (12), 3375-3387 (2012).</li>
<li>Tillman, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+stability+of+electrospun+polycaprolactone-collagen+scaffolds+in+vascular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction.</a> Biomaterials. 30 (4), 583-588 (2009).</li>
<li>Wise, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilayered+synthetic+human+elastin%2Fpolycaprolactone+hybrid+vascular+graft+with+tailored+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A multilayered synthetic human elastin/polycaprolactone hybrid vascular graft with tailored mechanical properties.</a> Acta Biomater. 7 (1), 295-303 (2011).</li>
<li>Vargel, I., Korkusuz, P., Menceloğlu, Y. Z., Pişkin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+antibiotic+embedded+electrospun+PCL+membranes+for+prevention+of+abdominal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of antibiotic embedded electrospun PCL membranes for prevention of abdominal adhesions.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 81 (2), 530-543 (2007).</li>
<li>Cao, H., McHugh, K., Chew, S. Y., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topographical+effect+of+electrospun+nanofibrous+scaffolds+on+the+in+vivo+and+in+vitro+foreign+body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">The topographical effect of electrospun nanofibrous scaffolds on the in vivo and in vitro foreign body reaction.</a> J Biomed Mater Res A. 93 (3), 1151-1159 (2010).</li>
<li>Joshi, V. S., Lei, N. Y., Walthers, C. M., Wu, B., Dunn, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporosity+enhances+vascularization+of+electrospun+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Macroporosity enhances vascularization of electrospun scaffolds.</a> J Surg Res. 183 (1), 18-26 (2013).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+poly%28epsilon-caprolactone%29+microfiber+and+multilayer+nanofiber%2Fmicrofiber+scaffolds%3A+characterization+of+scaffolds+and+measurement+of+cellular+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration.</a> Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).</li>
<li>Vaz, C. M., van Tuijl, S., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+scaffolds+for+blood+vessel+tissue+engineering+using+a+multi-layering+electrospinning+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Design of scaffolds for blood vessel tissue engineering using a multi-layering electrospinning technique.</a> Acta Biomater. 1 (5), 575-582 (2005).</li>
<li>Kawamura, S., Ying, L., Kim, H. J., Dynybil, C., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+accumulate+in+the+early+phase+of+tendon-bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages accumulate in the early phase of tendon-bone healing.</a> J Orthop Res. 23 (6), 1425-1432 (2005).</li>
<li>Hays, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+early+healing+of+a+tendon+graft+in+a+bone+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel.</a> J Bone Joint Surg Am. 90 (3), 565-579 (2008).</li>
<li>Dagher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+modulates+macrophage+accumulation+in+tendon-bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Immobilization modulates macrophage accumulation in tendon-bone healing.</a> Clin Orthop Relat Res. 467 (1), 281-287 (2009).</li>
<li>Bedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+and+delayed+mechanical+loading+on+tendon-to-bone+healing+after+anterior+cruciate+ligament+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Effect of early and delayed mechanical loading on tendon-to-bone healing after anterior cruciate ligament reconstruction.</a> J Bone Joint Surg Am. 92 (14), 2387-2401 (2010).</li>
<li>Bedi, A., Kawamura, S., Ying, L., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+tendon+graft+healing+between+the+intra-articular+and+extra-articular+ends+of+a+bone+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22HSS+J%22%5BJournal%5D)">Differences in tendon graft healing between the intra-articular and extra-articular ends of a bone tunnel.</a> HSS J. 5 (1), 51-57 (2009).</li>
<li>Fu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+graft+tensioning+on+mechanical+restoration+in+a+rat+model+of+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+using+free+tendon+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg+Sports+Traumatol+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">Effect of graft tensioning on mechanical restoration in a rat model of anterior cruciate ligament reconstruction using free tendon graft.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 21 (5), 1226-1233 (2013).</li>
<li>Fan, H., Liu, H., Wong, E. J., Toh, S. L., Goh, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+study+of+anterior+cruciate+ligament+regeneration+using+mesenchymal+stem+cells+and+silk+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo study of anterior cruciate ligament regeneration using mesenchymal stem cells and silk scaffold.</a> Biomaterials. 29 (23), 3324-3337 (2008).</li>
<li>Landis, J. R., Koch, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+observer+agreement+for+categorical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">The measurement of observer agreement for categorical data.</a> Biometrics. 33 (1), 159-174 (1977).</li>
<li>Joshi, S. M., Mastrangelo, A. N., Magarian, E. M., Fleming, B. C., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-platelet+composite+enhances+biomechanical+and+histologic+healing+of+the+porcine+anterior+cruciate+ligament%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen-platelet composite enhances biomechanical and histologic healing of the porcine anterior cruciate ligament.</a> Am J Sports Med. 37 (12), 2401-2410 (2009).</li>
<li>Leong, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+heparin+mediated+growth+factor+release+from+tissue-engineered+constructs+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo evaluation of heparin mediated growth factor release from tissue-engineered constructs for anterior cruciate ligament reconstruction.</a> J Orthop Res. 10, (2014).</li>
<li>Seo, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+cell+migration+and+angiogenesis+in+a+composite+silk+scaffold+for+tissue-engineered+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Increase in cell migration and angiogenesis in a composite silk scaffold for tissue-engineered ligaments.</a> J Orthop Res. 27 (4), 495-503 (2009).</li>
<li>Freeman, J. W., Woods, M. D., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+the+anterior+cruciate+ligament+using+a+braid-twist+scaffold+design%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of the anterior cruciate ligament using a braid-twist scaffold design.</a> J Biomech. 40 (9), 2029-2036 (2007).</li>
<li>Bashur, C. A., Shaffer, R. D., Dahlgren, L. A., Guelcher, S. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter+and+alignment+of+electrospun+polyurethane+meshes+on+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter and alignment of electrospun polyurethane meshes on mesenchymal progenitor cells.</a> Tissue Eng Part A. 15 (9), 2435-2445 (2009).</li>
<li>Dash, T. K., Konkimalla, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly-%D1%94-caprolactone+based+formulations+for+drug+delivery+and+tissue+engineering%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Poly-є-caprolactone based formulations for drug delivery and tissue engineering: A review.</a> J Control Release. 158 (1), 15-33 (2012).</li>
<li>Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biodegradable+nanofiber+scaffold+by+electrospinning+and+its+potential+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 24 (12), 2077-2082 (2003).</li>
<li>Xu, Y., Ao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+biomechanical+studies+of+inter-strand+healing+in+four-strand+autograft+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg+Sports+Traumatol+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">Histological and biomechanical studies of inter-strand healing in four-strand autograft anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model.</a> Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 17 (7), 770-777 (2009).</li>
<li>Shino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+the+anterior+cruciate+ligament+by+an+allogeneic+tendon+graft.+An+experimental+study+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Replacement of the anterior cruciate ligament by an allogeneic tendon graft. An experimental study in the dog.</a> J Bone Joint Surg Br. 66 (5), 672-681 (1984).</li>
<li>Stasiak, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+device+to+apply+controlled+flexion+and+extension+to+the+rat+knee+following+anterior+cruciate+ligament+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A novel device to apply controlled flexion and extension to the rat knee following anterior cruciate ligament reconstruction.</a> J Biomech Eng. 134 (4), 041008(2012).</li>
<li>Brophy, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+short-duration+low-magnitude+cyclic+loading+versus+immobilization+on+tendon-bone+healing+after+ACL+reconstruction+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Effect of short-duration low-magnitude cyclic loading versus immobilization on tendon-bone healing after ACL reconstruction in a rat model.</a> J Bone Joint Surg Am. 93 (4), 381-393 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Urazy ACL są częstym schorzeniem w ortopedycznej chirurgii sportowej, z ograniczonymi możliwościami rekonstrukcji w chwili obecnej. W celu opracowania odpowiedniego substytutu ACL opartego na inżynierii tkankowej, który umożliwi regenerację in vivo, potrzebny jest odpowiedni model zwierzęcy. W tym badaniu opisano wytwarzanie biodegradowalnego przeszczepu inżynieryjnego, podobnie jak jego implantację in vivo przy użyciu powtarzalnego modelu rekonstrukcji ACL u szczura atymicznego. Model ten można wykorzy...

Zerwanie więzadła krzyżowego przedniego (ACL) jest jednym z najczęstszych urazów więzadeł kolana1. Ponieważ pęknięty ACL nie jest w stanie zagoić się bez interwencji chirurgicznej, ograniczenia w czynnościach życia codziennego, a także uczestnictwie w sporcie zmuszają ponad 175 000 pacjentów do poddawania się operacji każdego roku2, przy szacowanym koszcie miliarda dolarów rocznie3. Obecnie do rekonstrukcji więzadeł stosuje się autoprzeszczep lub przeszczep allogeniczny. Chociaż wysokie wskaźniki sukcesu można osiągnąć zarówno w przypadku autoprzeszczepu, jak i wymiany przeszczepu allogenicznego, te opcje rekonstrukcji wiążą się z poważnymi powikłaniami4. Tkanka autoprzeszczepu wiąże się z chorobowością miejsca dawczego i jest ograniczona w podaży, szczególnie w przypadkach ponownego pęknięcia lub uszkodzenia wielowięzadłowego. Z drugiej strony, tkanka przeszczepu allogenicznego wiąże się z opóźnioną integracją przeszczepu, niepożądaną reakcją zapalną, teoretycznym ryzykiem infekcji i ograniczoną podażą5. Syntetyczne, nieulegające degradacji przeszczepy zostały opracowane w latach 1970. i 1980., ale były utrudnione przez przedwczesne pęknięcie przeszczepu, reakcje na ciała obce, osteolizę i zapalenie błony maziowej6. W wyniku tych poważnych obaw obecnie w Stanach Zjednoczonych nie ma dostępnych syntetycznych przeszczepów do użytku klinicznego.
Ze względu na te ograniczenia w istniejących opcjach przeszczepów oraz najnowsze osiągnięcia w biologii, inżynierii i medycynie regeneracyjnej, pojawiło się duże zainteresowanie rozwiązaniem inżynierii tkankowej do przeszczepu ACL. Obecne strategie inżynierii tkankowej wykorzystują degradowalne materiały biologiczne i syntetyczne, aby umożliwić wrastanie tkanki gospodarza przy jednoczesnym unikaniu ograniczeń związanych ze stałą implantacją materiału syntetycznego7.
Polikaprolakton (PCL) to biodegradowalny polimer, który jest zatwierdzony przez FDA do wielu zastosowań medycznych, w tym do bariery adhezyjnej i opatrunków na rany8, który był używany w szerokiej gamie zastosowań, w tym w inżynierii naczyniowej, kostnej, chrzęstnej, nerwowej, skórnej i przełyku5,9-16. Korzystna biokompatybilność, stosunkowo długi okres półtrwania in vivo, odpowiednia wytrzymałość mechaniczna i wysoka elastyczność przyczyniają się do popularności tego polimeru w inżynierii tkankowej. W modelu gojenia się ran u gryzoni wykazano, że wszczepiony elektroprzędzony PCL jest nieimmunogenny i integruje się z lokalną tkanką bez działań niepożądanych13. Obraz SEM elektroprzędzonego PCL pokazano na rysunku 1.
Przy obecnych standardach regulacyjnych FDA, skuteczność i bezpieczeństwo zarówno w małych, jak i dużych modelach zwierzęcych byłyby wymagane, aby PCL lub jakikolwiek inny zmodyfikowany przeszczep ACL mógł zostać przeniesiony do badań klinicznych w Stanach Zjednoczonych. Dodatkowo, warunki in vivo mogą często zwiększyć właściwości przeszczepu ACL in vitro z wykorzystaniem inżynierii tkankowej. Wcześniej opisano szczurzy model autologicznej rekonstrukcji ACL ze ścięgnem zginacza długiego palca, w którym odcięto natywny ACL, wywiercono tunele udowe i piszczelowe, a przeszczep poddano i zabezpieczono na miejscu szwem17-22. W tym artykule opiszemy modyfikację tego modelu w celu oceny inżynieryjnych zamienników ACL, a nie rekonstrukcji opartej na autoprzeszczepie (ryc. 2).
Chociaż istnieje wiele modeli zwierzęcych do inżynierii tkankowej więzadeł, szczur jest korzystny w porównaniu z większymi modelami z wielu powodów. Do zalet tych należą łatwiejsza hodowla i obsługa, mniej względów etycznych i niższe koszty17,23. Ponadto model szczura był szeroko stosowany jako model do ortopedycznej regeneracji tkanek, w tym inżynierii tkanki chrzęstnej, ścięgien i kości24. W szczególności wybrano atymiczne nagie szczury ze względu na brak odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek25, co pozwoliło na ostateczne wszczepienie ksenogenicznych komórek dawcy w tym modelu w celu dalszego ulepszenia zmodyfikowanego przeszczepu w przyszłości. W tym artykule opisano wytwarzanie i chirurgiczną implantację bezkomórkowego, biodegradowalnego przeszczepu polimerowego w atymicznym szczurzym modelu rekonstrukcji ACL.

<table><tbody><tr><td>Polikaprolakton o jakości medycznej z końcami estrowymi (&amp;epsilon;-kaprolakton), forma granulowana (MW = 110,000)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel Absorbable Polymers</a></td><td></td><td>Polimer syntetyzowany na zamówienie o pożądanej masie cząsteczkowej</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-heksafluoropropan-2-ol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td>Rozpuszczalnik dla polimeru PCL</td></tr><tr><td>Igła ścięta 18 G x 1&amp;#189;"</td><td>BD Medical</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Programowalna pompa strzykawkowa Remote Infuse/Withdraw</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>Grawer laserowy VersaLaser VLS2.30</td><td>Microgeo USA</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzona oczyszczarka plazmowa 115&amp;nbsp;V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>Trawienie plazmowe bezpośrednio przed powlekaniem kolagenem w celu modyfikacji powierzchni</td></tr><tr><td>Standardowy roztwór kolagenu PureCol, 3&amp;nbsp;mg/ml</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5015-A</td><td>Wymieszać roztwór PureCol, 10x PBS i 0,1&amp;nbsp;N NaOH w stosunku 8:1:2,5, a następnie rozcieńczyć 1:9 w 1x PBS</td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, 5-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>1086471</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne, 4-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>6540072</td><td></td></tr><tr><td>Ostre nożyczki preparacyjne (proste; 4,5&amp;nbsp;cala)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Wodorochlorek buprenorfiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9275</td><td>Stosować dawkę 0,03 mg/kg zarówno śródoperacyjnie, jak i po operacji w celu kontroli bólu</td></tr><tr><td>Ampicylina, do wstrzykiwań</td><td>Henry Schein</td><td>1185678</td><td>Stosować dawkę 25 mg/kg podskórnie podczas zabiegu</td></tr><tr><td>Drut K-wire, 1,6 mm</td><td>Spectrum Surgical</td><td>SI040062</td><td></td></tr><tr><td>Igła Keitha, prosta 1&amp;#189;"</td><td>Delasco Dermatology Lab &amp;amp; Supply</td><td>KE-112</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dekalcyfikujący Immunocal</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491030</td><td></td></tr><tr><td>Akrylowy cement kostny Opticryl (PMMA) (monomer i polimer)</td><td>US Dental Depot</td><td>OPTICRYL 100410&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do badań wytrzymałości na rozciąganie Instron Model 5564</td><td>Instron</td><td>5564</td><td>Można zastosować dowolne porównywalne urządzenie do badań rozciągania</td></tr></tbody></table>

atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Zerwanie więzadła krzyżowego przedniego (ACL) jest częstym urazem więzadła, które często wymaga operacji, ponieważ ACL nie goi się dobrze bez interwencji. Obecne strategie leczenia obejmują rekonstrukcję więzadeł za pomocą autoprzeszczepu lub przeszczepu allogenicznego, z których każdy ma swoje ograniczenia. W związku z tym istnieje zainteresowanie zaprojektowaniem przeszczepu opartego na inżynierii tkankowej do zastosowania w rekonstrukcji ACL. Opisujemy wytwarzanie elektroprzędzonego przeszczepu polimerowego do stosowania w inżynierii tkankowej ACL. Ten przeszczep polikaprolaktonu jest biokompatybilny, biodegradowalny, porowaty i składa się z wyrównanych włókien. Ponieważ do oceny takiego przeszczepu niezbędny jest model zwierzęcy, w niniejszym artykule opisano wewnątrzstawowy model rekonstrukcji ACL u szczurów, który można wykorzystać do oceny przeszczepów zmodyfikowanych, w tym tych obsianych komórkami ksenogenicznymi. Przedstawiono reprezentatywne wyniki badań histologicznych i biomechanicznych po 16 tygodniach od operacji, przy czym przeszczepy są testowane natychmiast po implantacji, a przeciwległe natywne ACL służą jako kontrole. Niniejsze badanie dostarcza powtarzalnego modelu zwierzęcego, za pomocą którego można ocenić przeszczepy ACL wykonane metodą inżynierii tkankowej i demonstruje potencjał podejścia medycyny regeneracyjnej do leczenia zerwania ACL.

W naszym doświadczeniu obejmującym 92 operacje szczurów wykonane przez jednego chirurga, średni czas operacyjny od nacięcia do zamknięcia rany wynosił 16,9 min, przy odchyleniu standardowym 4,7 min. W momencie uśmiercenia szczury ważyły 356 ± 23 g. Wszystkie szczury dobrze zniosły zabieg i nie wystąpiły żadne powikłania. Bezpośrednio po operacji zauważono, że szczury obciążają operowaną kończynę, jednak wykazywały lekkie utykanie. W ciągu jednego tygodnia po zabiegu wszystkie szczury poruszały się bez widocznego utykania...

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest wykorzystanie modelu gryzoni do oceny inżynieryjnych przeszczepów tkankowych do zastępowania więzadła krzyżowego przedniego. Jest to realizowane poprzez najpierw wytworzenie biodegradowalnego rusztowania polimerowego, a w drugim kroku implantację tego rusztowania do kolana szczura.Po 16 tygodniach nowe więzadła powstałe z rusztowania są pobierane do analizy histologicznej. Ostatecznie badana jest wytrzymałość biomechaniczna kolagenu, aby ocenić jakość tych sztucznie wyhodowanych przeszczepów tkankowych pod kątem zastosowania w rekonstrukcji ACL. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z innymi metodami oceny rusztowania są fakt, że model ten wystawia rusztowanie na złożone środowisko in vivo, pozostając jednocześnie kosztowo efektywnym i łatwiejszym w obsłudze niż modele na większych zwierzętach.Model ten może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak: w jaki sposób zaprojektowane rusztowanie zintegruje się ze środowiskiem in vivo, aby utworzyć nowy więzadło? Technika ta może doprowadzić do opracowania nowych metod leczenia i rekonstrukcji ACL. Ponieważ modele zwierzęce są pierwszym krokiem do translacji klinicznej, metoda ta może zostać wykorzystana do oceny naszego konkretnego rusztowania.Metodę tę można zastosować również do innych konstruktów inżynierii tkankowej, np. tych zawierających komórki i czynniki wzrostu. Optymalizujemy technikę chirurgiczną, modyfikując metody stosowane przez dr. Scotta Rodeo i współpracowników w Hospital for Special Surgery w Nowym Jorku. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy elektroprzędzenia oraz kroki chirurgiczne mogą być trudne do opanowania wyłącznie na podstawie instrukcji pisemnych.Podczas elektroprzędzenia rusztowań z polikaprolaktonu niezbędna będzie duża akrylowa komora z punktami wlotowymi dla roztworu polikaprolaktonu, napędzany silnikiem kolektor w postaci wałka oraz port próżniowy zasilany źródłem napięcia, umieszczone w dygestorium, aby zapewnić izolowane środowisko próżniowe dla procesu elektroprzędzenia. Przed rozpoczęciem procedury należy dokładnie oczyścić komorę 70% etanolem i pokryć wszystkie powierzchnie arkuszami parafilmu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogłyby obniżyć jakość produktu otrzymanego w procesie elektroprzędzenia.Następnie włącz wentylator i pobierz 3 mL świeżo przygotowanego polimeru polikaprolaktonu do strzykawki o pojemności 10 mL z tępą igłą o rozmiarze 18G. Po usunięciu pęcherzyków powietrza zamocuj strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej i wprowadź igłę do akrylowej obudowy przez port wlotowy, pozostawiając około pół cala igły na zewnątrz obudowy. Następnie szczelnie owiń obracający się trzpień tokarski cienkim paskiem folii aluminiowej i zamocuj trzpień w silniku po przeciwnej stronie obudowy, w odległości około 15 cm od igły strzykawki, aby pełnił funkcję kolektora; w porcie próżniowym zamocuj plastikowy wąż.Następnie podłącz wąż do źródła próżni w dygestorium i włącz je. Teraz przykryj akrylową skrzynkę pokrywą i ustaw szybkość infuzji w programowalnej pompie strzykawkowej na 2,5 milliliters per hour. Następnie uziemij ujemny przewód, włącz silnik, aby mandrel obracał się z prędkością 3, 450 RPM i za pomocą klipsa krokodylka przymocuj dodatni przewód źródła napięcia do końcówki igły na zewnątrz skrzynki.Gdy rozpocznie się infuzja roztworu polikaprolaktonu, należy włączyć źródło napięcia i ustawić je na napięcie robocze 20 kV. Po 12 minutach infuzji z 0,5 ml roztworu polikaprolaktonu uformuje się jednorodna opaska. Wyłączyć całe wyposażenie, w tym źródło napięcia, silnik, pompy próżniowej oraz pompę strzykawkową.Zdejmij trzpień z silnika, usuń polimerową mankietkę z trzpienia i wykonaj jedno cięcie poprzeczne, aby uzyskać prostokątną matę elektroprzędzioną. Następnie przetnij matę laserowo, tworząc wiele małych arkuszy, które zostaną później pocięte na paski, ułożone w czterech warstwach i zszyte razem w celu utworzenia rusztowań przed rozpoczęciem operacji. Najpierw potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na ucisk tylnej stopy.Następnie wykonaj dwucentymetrowe pionowe nacięcie przyśrodkowo w obrębie kolana, wycentrowane na poziomie rzepki, odsuwając skórę bocznie w razie potrzeby. Dalej, za pomocą skalpela wykonaj przyśrodkową parapatellarną artrotomię tuż przyśrodkowo od rzepki, rozciągając ją proksymalnie do poziomu połączenia mięśniowo-ścięgnistego mięśnia czworogłowego oraz dystalnie do poziomu przyczepu więzadła rzepki do guzka piszczelowego. Teraz wykonaj jednocentymetrowe pionowe nacięcie przez torebkę stawową kolana tuż bocznie od więzadła rzepki, aby uwolnić rzepkę bocznie.Następnie, upewniając się, że kolano jest wyprostowane, wprowadź parę cienkich nożyczek pod rzepkę od strony bocznej do przyśrodkowej i rozchyl nożyczki kilka razy, aby mechanizm wyprostny można było przesunąć na dowolną stronę podczas zginania kolana. Przesuń rzepkę bocznie, aby odsłonić wnętrze stawu kolanowego, potwierdzając wyraźną widoczność wcięcia międzykłykciowego oraz kłykci kości udowej. Następnie przetnij ACL i PCL w obrębie wcięcia.Następnie należy umieścić końcówkę drutu K o średnicy 1,6 mm przymocowanego do wiertarki udarowej w miejscu przyczepu ACL w wpukłości międzykłykciowej i wiercić w kierunku górno-bocznym, podczas gdy asystent stabilizuje kolano. Następnie należy kilkakrotnie wprowadzić i wycofać drut K, aby upewnić się, że przejście dla przeszczepu jest drożne. Należy zlokalizować punkt wyjścia na bocznej stronie kości udowej, usuwając w razie potrzeby skalpelem wszelkie tkanki miękkie.Po udrożnieniu tunelu należy umieścić drut K w miejscu przyczepu ACL na plateau piszczelowym i wykonać wiercenie bocznie, podczas gdy asystent stabilizuje kolano. Następnie należy zlokalizować punkt wyjścia na przednio-bocznej części proksymalnej piszczeli, używając skalpela do usunięcia tkanek miękkich w razie potrzeby, tak aby miejsce wyjścia drutu K z piszczeli było w pełni widoczne, a następnie przeprowadzić skróconą igłę Keitha o długości nie większej niż dwie cale przez tunel kostny udowy. Teraz należy przełożyć dwa końce nici z jednego końca przeszczepu przez ucho igły i za pomocą igły przeciągnąć jeden koniec przeszczepu przez tunel udowy.Następnie za pomocą igły przeprowadź drugi koniec przeszczepu przez tunel piszczelowy, używając nici Vicryl 4-0. Dalej, przymocuj koniec udowy przeszczepu do otaczających tkanek miękkich szwem w kształcie ósemki, utrzymując kolano w wyproście, aby wytworzyć manualne napięcie w przeszczepie. Użyj kolejnego szwu w kształcie ósemki, aby przymocować koniec piszczelowy przeszczepu do otaczających tkanek miękkich, odcinając nadmiar przeszczepu na obu końcach nożyczkami i pozostawiając jeden do dwóch milimetrów na każdym końcu za szwem.Na koniec wyprostuj kolano i zredukuj rzepkę. Następnie, używając nici Vicryl 4-0, wykonaj pojedynczy szew w kształcie ósemki w celu zamknięcia przyśrodkowej torebki stawowej, aby zapobiec bocznemu podwichnięciu rzepki, a skórę zamknij ciągłym szwem śródskórnym nicią Monocryl lub Vicryl 5-0. W 16. tygodniu po rekonstrukcji analiza histologiczna przekrojonego kolana wykazuje, że macierz rusztowania zostaje w znacznym stopniu nacieknięta przez fibroblasty wydzielające eozynofilowy kolagen, przy dobrej integracji z tunelami kostnymi.W tym eksperymencie właściwości biomechaniczne stawu oceniono bezpośrednio po uśmierceniu zwierząt. Wszystkie badane próbki uległy zniszczeniu w części środkowej, co wykazano na krzywych małych przemieszczeń uzyskanych w badaniu rozciągania. Dla każdej grupy obliczono obciążenie krytyczne oraz sztywność.W 16. tygodniu po implantacji polimerowy przeszczep elektroprzędziony wykazywał niemal dwukrotny wzrost obciążenia szczytowego i sztywności w porównaniu z przeszczepem badanym bezpośrednio po implantacji. Mimo to wartości te nadal były niższe niż w przypadku natywnego ACL. Po opanowaniu techniki zabieg chirurgiczny na zwierzęciu można przeprowadzić w około 15 minut. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zadbać o staranne zamknięcie rany, tak aby żadna szew nie była widoczna z zewnątrz.Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić inne analizy końcowe, takie jak dodatkowe barwienia i testy biochemiczne. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie inżynierii tkankowej do oceny wielu opcji przeszczepów w zabiegach rekonstrukcji ACL. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wytworzyć rusztowanie polimerowe do implantacji w gryzoniem modelu rekonstrukcji ACL.Należy pamiętać, że praca z żywymi zwierzętami może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie się do zaleceń weterynaryjnych oraz noszenie środków ochrony indywidualnej.

athymic-rat-model-for-evaluation-engineered-anterior-cruciate

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Model antymicznych szczurów do oceny inżynieryjnych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Modele in vivo krytycznych wymiarów kości u ssaków są niezbędne dla badaczy badających mechanizmy leczenia i terapie ortopedyczne. W tym miejscu wprowadzamy protokół tworzenia powtarzalnych, segmentowych ubytków kości udowej u szczurów stabilizowanych za pomocą stabilizacji zewnętrznej.

Wiarygodny i powtarzalny model segmentalnej wady kości udowej o krytycznej wielkości u szczurów stabilizowany za pomocą niestandardowego stabilizatora zewnętrznego

Ten artykuł przedstawia częściowy protokół heterotopowego przeszczepu płata kostno-skórnego u szczurów i jego potencjalne wyniki w obserwacji średnioterminowej.

Częściowy heterotopowy model przeszczepu kończyn tylnych u szczurów

Tutaj prezentujemy model uszkodzenia chrząstki śródstawowej w kolanie szczura wywołany cyklicznym obciążeniem, generowany przez 60 cyklicznych uciśnięć powyżej 20 N, skutkujących uszkodzeniem chrząstki kłykciowej kości udowej u szczurów.

Nieinwazyjna metoda generowania modelu uszkodzenia chrząstki stawowej w kolanie szczura wywołanego cyklicznym obciążeniem

Ten protokół ustanawia model pełnogrubych wad chrząstki (FTCD) poprzez wiercenie otworów w rowku bloczkowym kości udowej szczurów i mierzenie późniejszego zachowania bólowego i zmian histopatologicznych.

Opracowanie i ocena szczurzego modelu ubytków chrząstki pełnej grubości

Nieinwazyjne uszkodzenie ACL jest niezawodną i klinicznie istotną metodą inicjowania pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów (PTOA) u myszy. Ta metoda uszkodzeń pozwala również na ilościowe określenie in vivo aktywności proteazy w stawie we wczesnych punktach po urazie przy użyciu aktywowanych proteazą sond bliskiej podczerwieni i fluorescencyjnego obrazowania odbicia.

Nieinwazyjne uszkodzenie więzadła krzyżowego przedniego (ACL) wywołane kompresją i obrazowanie in vivo aktywności proteazy u myszy

W niniejszym artykule opisujemy chirurgiczną metodę transekcji więzadła krzyżowego przedniego (ACL) jako wiarygodny model wywoływania choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u gryzoni oraz metody pobierania płynu maziowego kolana, pomiaru obrzęku kolana i oceny ciężkości choroby zwyrodnieniowej stawów.

Przecięcie więzadła krzyżowego przedniego i płukanie płynu maziowego w modelu gryzoni w celu zbadania zapalenia stawów i pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów

Badanie to ustanowiło model defektu półsegmentalnego szczura kości udowej do oceny mechanicznej i osteogenicznej wydajności materiałów zastępczych kości w warunkach nośnych, bez użycia wewnętrznego lub zewnętrznego fiksacji.

Model defektu kości dwułopowatej półsegmentalnej u szczurów do oceny wydajności substytucji kości w obszarach nośnych

Procedura demonstruje metodologię elastografii rezonansu magnetycznego w celu monitorowania wyników inżynierii tkankowej konstruktów adypogennych i osteogennych poprzez nieinwazyjną lokalną ocenę właściwości mechanicznych z wykorzystaniem mikroskopowej elastografii rezonansu magnetycznego (μMRE).

Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego w ocenie wzrostu konstruktów inżynierii tkankowej

Do przyszłych zastosowań jako łatka do naprawy częściowych zerwań więzadła krzyżowego przedniego (ACL), ludzkie komórki pochodzące z ACL zostały wyizolowane z tkanki uzyskanej podczas procedur rekonstrukcyjnych, namnażone in vitro i wyhodowane na rusztowaniach inżynierii tkankowej. Następnie przeprowadzono adhezję komórkową i morfologię, aby potwierdzić biokompatybilność na powierzchni rusztowania.

Chirurgiczne pobieranie, izolacja i ekspansja in vitro ludzkich komórek pochodzących z więzadła krzyżowego przedniego do zastosowań w inżynierii tkankowej

Poznaj metodę oceny inżynierii tkankowej przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego w modelu szczura. Protokół obejmuje elektroprzędzenie biodegradowalnego rusztowania polimerowego, implantację do stawu kolanowego oraz analizę histologiczną i biomechaniczną po 16 tygodniach.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Przeglądaj więcej filmów