Mysi model odrzucenia naczyniowego indukowanego alloimmunologicznie i miażdżycy tętnic po przeszczepie
17 maja 2015
Opisujemy protokół szczepienia interpozycji aorty u myszy. Celem protokołu jest dostarczenie modelu, za pomocą którego można badać procesy patologiczne i strategie terapeutyczne związane z reakcjami alloimmunologicznymi w tętnicach i wynikającymi z nich zmianami tętniczymi, które przyczyniają się do niewydolności przeszczepu narządu.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie transplantacji zastępczej aorty metodą koniec-do-końca u myszy w celu zbadania odrzucania naczyń krwionośnych oraz arteriosklerozy przeszczepu. Cel ten osiąga się poprzez pobranie fragmentu aorty brzusznej od myszy dawcy, a następnie przeszczepienie go ortotopowo do aorty wewnątrznerkowej allogenicznego biorcy, który różni się genetycznie od dawcy.
W ostatnim kroku wycina się przeszczepiony segment naczynia i analizuje go pod kątem rozwoju arteriosklerozy przeszczepu. Ostatecznie zakres arteriosklerozy przeszczepu oraz immunologicznego odrzucenia allograftu naczyniowego można ocenić poprzez pomiar pogrubienia intimy i zwężenia światła naczynia, a także za pomocą analizy immunohistochemicznej tkanki w celu stwierdzenia akumulacji komórek odpornościowych.
Zazwyczaj osoby rozpoczynające naukę tej procedury potrzebują czasu, aby opanować technikę mikrochirurgiczną, ponieważ wymaga ona wysokiego poziomu zręczności i praktyki w celu jej perfekcyjnego opanowania. Jednak dzięki wytrwałej praktyce metoda ta powinna być dostępna dla większości badaczy. W związku z tym procedurę demonstruje pani Winnie, utalentowana neurochirurg, oraz Adam Roso, utalentowany doktorant w moim laboratorium. Rozpocznij od umieszczenia myszy dawcy w pozycji grzbietowej na czystej, cienkiej płytce z pleksiglasu owiniętej sterylną ściereczką pod mikroskopem operacyjnym przy powiększeniu 8,30x.
Po potwierdzeniu odpowiedniej znieczulenia chirurgicznego za pomocą ucisku palca u nogi, za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj pojedyncze cięcie w linii środkowej od łonka do wyrostka ZipID. Następnie użyj małego rozwieracza, aby otworzyć ściany brzucha, odsłaniając jamę brzuszną. Następnie za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką delikatnie odsuń jelita w kierunku górnym, w lewą stronę zwierzęcia.
Przykryć tkankę gazą zwilżoną solą fizjologiczną i przesunąć organy rozrodcze w dół, aby zlokalizować aortę podnerkową oraz żyłę główną dolną lub IVC. Następnie za pomocą pęsety chirurgicznej nr 5 oddzielić aortę od IVC na wysokości lewej tętnicy nerkowej w pobliżu rozwidlenia. Następnie użyć szwów z monofilamentowego poliamidu 10-0, aby podwiązać małe odgałęzienia w pobliżu aorty.
Po oddzieleniu aorty i IVC dawcy, nasyć naczynie solą fizjologiczną, przykryj odsłoniętą jamę zwilżoną gazą i odstaw dawcę do sterylnego obszaru. Następnie umieść mysz biorcy pod mikroskopem i oddziel aortę biorcy od IVC w sposób, który został właśnie zademonstrowany. Następnie umieść dwa czteromilimetrowe zaciski naczyniowe, proksymalnie i dystalnie względem interesowanego odcinka, w odstępie około pięciu milimetrów.
Następnie, używając mikronozyczek typu vanous tube engine, wykonaj pojedynczą poziomą aortotomię i wyresektuj nie więcej niż 0,5 millimeters aorty brzusznej, aby przygotować miejsce na przeszczep aorty od dawcy. Przenieś dawcę z powrotem pod mikroskop i przetnij odcinek przeszczepu o długości od trzech do czterech millimeter, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie użyj igły 25 gauge o długości five eight, aby przepłukać wyciętą aortę solą fizjologiczną z heparyną.
Należy zadbać o to, aby końcówka igły nie stykała się z naczyniem, a następnie umieścić naczynie w pojemniku z heparynową solą fizjologiczną w lodzie. W ciągu 30 minut od wycięcia należy umieścić dawczy przeszczep aorty w pozycji ortotopowej u biorcy, dopasowując orientację anatomiczną przeszczepu do orientacji biorcy. Następnie należy delikatnie chwycić tunica externa naczynia i za pomocą pęsety numer pięć lekko ją odsunąć.
Następnie za pomocą pęsety przeprowadź igłę z jednowłóknistą nicią poliamidową o rozmiarze 0 przez całą grubość ściany naczynia, aby przymocować przeszczep aorty dawcy do wycięcia naczynia biorcy w celu wykonania szwów ciągłych. Umieść szwy stabilizujące na godzinie dziewiątej zarówno w górnym, jak i dolnym końcu przeszczepu. Następnie rozpocznij anastomozę od górnego końca przeszczepu, zaczynając od godziny trzeciej.
Zeszyj resekowane końce za pomocą dwóch szwów ciągłych i przymocuj szew do szwu stabilizującego. Następnie odwróć przeszczep i kontynuuj szew ciągły w stronę grzbietowej części naczynia, aż do miejsca jego początku.
Wykonaj szew. Zabezpiecz szew, nie wywierając zbyt dużego nacisku na naczynie, a następnie powtórz czynność szycia dla dolnego anastomozy. Po zakończeniu anastomozy.
Zwolnij dystalny zacisk mikronaczyniowy, aby umożliwić wsteczny przepływ krwi przez naczynie. Jeśli nie stwierdzono krwawienia, zwolnij zacisk proksymalny. Jeśli nie zaobserwowano przeszkód w przepływie krwi, użyj pęsety, aby delikatnie chwycić jeden koniec szwów stabilizujących i lekko odchylić naczynie w celu inspekcji jego tylnej ściany.
Jeśli nie zaobserwowano marszczenia i stwierdzono silny wzorzec tętna w naczyniach dawcy i biorcy, należy za pomocą aplikatorów z bawełnianym końcem wprowadzić jelita z powrotem do jamy brzusznej. Na koniec, używając uchwytu do igieł i kleszczyków grof, należy zamknąć ścianę brzuszną, stosując szwy polipropylowe 5-0 i szew ciągły. Warstwę skóry należy zamknąć tymi samymi szwami, stosując szew śródskórny.
W celu oceny powodzenia operacji można obserwować funkcje motoryczne kończyn tylnych. Stopień immunologicznie zapośredniczonego uszkodzenia naczyniowego allograftu jest badany poprzez ilościową ocenę pogrubienia intimy i zwężenia światła w przeszczepionych segmentach aorty w 30. dniu po transplantacji.
Rzeczywiście, jak zaobserwowano, w segmentach tętnic allograftu rozwija się znaczne pogrubienie intimy i niedrożność światła, podczas gdy w kontrolnych segmentach tętnic ISO nie obserwuje się żadnych zmian. Ponadto rekrutację leukocytów do tętnicy allograftu można ocenić, badając immunohistochemicznie akumulację limfocytów T CD4+ i CD8+ oraz makrofagów. Zgodnie z oczekiwaniami, po rozwoju w obrębie intimy tkanek tętniczych dawcy wykryto wszystkie trzy typy komórek odpornościowych.
Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu transportu do analizy alloimmunologicznie zapośredniczonej redukcji naczyniowej oraz stenozy tętnic po przeszczepie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół wszczepiania pomostu aortalnego u myszy, mający na celu badanie odrzucania naczyniowego oraz tętnicowej miażdżycy przeszczepu. Procedura polega na przeszczepieniu segmentu aorty brzusznej od myszy dawcy do allogenicznego biorcy w celu analizy rozwoju tętnicowej miażdżycy przeszczepu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia transplantacji
- Biologia naczyniowa
- Immunologia
Wstęp
- Przeszczepianie interpozycyjne aorty jest modelem służącym do badania reakcji alloimmunologicznych.
- Arterioskleroza przeszczepu jest istotną przyczyną niepowodzenia transplantacji organów.
- Zrozumienie immunologicznie zapośrednicowanego odrzucania naczyń jest kluczowe dla poprawy wyników transplantacji.
- Model ten pozwala na ocenę procesów patologicznych w przeszczepach.
Cel badania
- Aby dostarczyć model do badania odrzucania naczyniowego w transplantacjach narządów.
- Aby przeanalizować mechanizmy leżące u podłoża tętnicowstecznienia przeszczepu.
- Aby ocenić strategie terapeutyczne zapobiegające niewydolności przeszczepu.
Zastosowane metody
- Pobranie segmentu aorty brzusznej od myszy dawcy.
- Ortotopowe przeszczepienie segmentu aorty do aorty śródnerkowej biorcy o innym genotypie.
- Wycięcie przeszczepionego segmentu naczyniowego do analizy.
- Ocena pogrubienia intimy i zwężenia światła naczynia za pomocą analizy immunohistochemicznej.
Główne wyniki
- Pomiar pogrubienia tuniki wewnętrznej i zwężenia światła w przeszczepach.
- Identyfikacja akumulacji komórek odpornościowych w tkance przeszczepu.
- Ocena zakresu arteriosklerozy przeszczepu.
- Wgląd w mechanizmy immunologicznego odrzucania naczyń allograftu.
Wnioski
- Model przeszczepu interpozycyjnego aorty jest skuteczny w badaniu tętnicowej arteriosklerozy przeszczepu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów odrzucania naczyniowego.
- Model ten może pomóc w opracowaniu strategii mających na celu zwiększenie wskaźnika sukcesu przeszczepiania.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przewlekłe odrzucanie naczyniowe oraz arterioskleroza przeszczepu pozostają głównymi przeszkodami w długoterminowym sukcesie transplantacji narządów, prowadząc do późnej niewydolności przeszczepu i ograniczania portfolio badawczego. Opisany model interpozycji aorty mysiej umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz walidację celów w przypadku immunologicznie zapośredniczonego uszkodzenia naczyń, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w wyborze kandydatów na etapie przedklinicznym. System ten stanowi istotną translacyjnie platformę do badania szlaków alloimmunologicznych i oceny strategii interwencyjnych w kontrolowanych, powtarzalnych warunkach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną celów immunologicznych zaangażowanych w odrzucanie naczyniowe i tętnicową miażdżycę.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie alloimmunologicznego uszkodzenia w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Ułatwia analizę rekrutacji komórek immunologicznych i przebudowy naczyniowej w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowaną platformę in vivo do ilościowej oceny pogrubienia błony wewnętrznej i zwężenia światła naczynia.
- Umożliwia powtarzalny pomiar infiltracji komórek odpornościowych z wykorzystaniem immunohistochemii.
- Wspiera standaryzację analiz w celu oceny potencjalnych terapii celujących w odrzucenie naczyniowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z patologią kliniczną, odtwarzając kluczowe cechy tętnicowego miażdżycenia przeszczepu in vivo.
- Umożliwia przejście od odkryć mechanistycznych do przedklinicznych testów skuteczności środków immunomodulujących.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o ocenę ryzyka, dostarczając predykcyjnych wyników dotyczących uszkodzenia przeszczepu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten łączy wczesną fazę odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając weryfikację hipotez, ograniczanie ryzyka związanego z celem terapeutycznym oraz ilościową ocenę uszkodzeń naczyniowych w ramach jednego schematu postępowania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie mechanizmów alloimmunologicznych oraz udziału komórek odpornościowych w patologii naczyniowej.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki w zakresie pogrubienia tuniki wewnętrznej oraz nacieku immunologicznego.
- Analityka: Zapewnia ustandaryzowane odczyty histologiczne i immunohistochemiczne do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Modeluje klinicznie istotne punkty końcowe do oceny kandydatów w badaniach przedklinicznych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji dla różnych szczepów myszy i interwencji, co pozwala na szerokie zastosowanie w portfolio badawczym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad odrzucaniem naczyniowym.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę in vivo tętniczonapiastowości przeszczepu w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go i priorytetyzuje kandydatów z potwierdzoną ochroną naczyniową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia postępy skorygowane o ryzyko oraz porównywalność międzyprogramową w badaniach nad przeszczepami.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga zaawansowanej wiedzy i szkolenia z zakresu mikrochirurgii w celu powtarzalnego tworzenia modelu.
- Wymaga dostępu do instrumentarium chirurgicznego oraz infrastruktury do analiz histologicznych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami.
- Możliwość dostosowania do różnych szczepów myszy oraz ukierunkowanych interwencji w badaniach nad mechanizmami.
- Przepustowość może być ograniczona przez złożoność techniczną i biegłość operatora.
