Mysi model odrzucenia naczyniowego indukowanego alloimmunologicznie i miażdżycy tętnic po przeszczepie

Opisujemy protokół szczepienia interpozycji aorty u myszy. Celem protokołu jest dostarczenie modelu, za pomocą którego można badać procesy patologiczne i strategie terapeutyczne związane z reakcjami alloimmunologicznymi w tętnicach i wynikającymi z nich zmianami tętniczymi, które przyczyniają się do niewydolności przeszczepu narządu.

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie kompleksowego przeszczepu śródpozycyjnego aorty u myszy w celu zbadania odrzucenia naczyniowego i miażdżycy przeszczepów. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw segmentu aorty brzusznej od myszy dawcy. Segment jest następnie ortodontycznie przeszczepiany miejscowo do aorty wewnątrznerkowej biorcy allogenicznego, który jest genetycznie różny od dawcy.

W ostatnim etapie przeszczepiony segment naczynia jest wycinany i analizowany pod kątem rozwoju miażdżycy przeszczepu. Ostatecznie, zakres miażdżycy tętnic przeszczepionych i przeszczepu allogenicznego za pośrednictwem układu immunologicznego. Odrzucenie naczyniowe można ocenić poprzez pomiar pogrubienia błony wewnętrznej i zwężenia światła, a także poprzez analizę immunohistochemiczną tkanki pod kątem akumulacji komórek odpornościowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej procedurze potrzebują czasu, aby oswoić się z techniką mikrochirurgiczną, ponieważ wymaga ona wysokiego poziomu zręczności i praktyki mistrza. Jednak metoda powinna być osiągalna dla większości badaczy z praktyką staranności u pacjentów. Tak więc demonstracja procedury z panią Winnie kończy się utalentowanym neurochirurgiem i Adamem Roso, utalentowanym doktorantem w moim laboratorium Zacznij od umieszczenia myszy dawcy w pozycji leżącej na plecach na czystej, cienkiej płycie z pleksiglasu owiniętej sterylną zasłoną pod mikroskopem operacyjnym pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu 830x.

Po potwierdzeniu odpowiedniego znieczulenia chirurgicznego przez uszczypnięcie palca u nogi, użyj sterylnych nożyczek, aby wykonać pojedyncze nacięcie w linii środkowej od łona do procesu ZipID. Następnie za pomocą małego retraktora otwórz ściany brzucha, odsłaniając jamę brzuszną. Następnie użyj sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby delikatnie cofnąć jelita górnie po lewej stronie zwierzęcia.

Przykryj tkankę gazą zwilżoną solą fizjologiczną i przesuń narządy rozrodcze niżej, aby zlokalizować aortę podnerkową i żyłę główną dolną lub IVC. Teraz użyj kleszczy medycznych numer pięć, aby oddzielić aortę od IVC w lewej tętnicy nerkowej w pobliżu rozwidlenia. Następnie użyj 10 zerowych nici monofilamentowych z poliamidu, aby podwiązać małe gałęzie w pobliżu aorty.

Po oddzieleniu aorty dawcy i IVC należy nasącić naczynie solą fizjologiczną, przykryć odsłonięty ubytek zwilżoną gazą i odstawić dawcę w sterylne miejsce. Teraz umieść mysz biorcy pod mikroskopem i oddziel aortę biorcy od IVC, co właśnie pokazano. Następnie umieść dwa czteromilimetrowe zaciski mikronaczyniowe, proksymalne i dystalne do interesującego segmentu, w odległości około pięciu milimetrów od siebie.

Następnie, za pomocą mikronożyczek z silnikiem rurki łopatkowej, wykonaj pojedynczą otomię aorty poziomej i wyciąć nie więcej niż 0,5 milimetra aorty brzusznej, aby pomieścić przeszczep aorty dawcy. Zwróć dawcę do mikroskopu i przeciąć trzy-czteromilimetrowy segment przeszczepu, jak właśnie pokazano. Następnie użyj igły o rozmiarze 25 i pięciu ośmiu, aby przepłukać wyciętą aortę heparynizowaną solą fizjologiczną.

Uważając, aby końcówka igły nie stykała się z naczyniem i umieścić naczynie w pojemniku z solą fizjologiczną z heparyny lodowej na lodzie. W ciągu 30 minut od wycięcia należy umieścić przeszczep aorty dawcy w pozycji ortotopowej u biorcy, dopasowując odpowiednią orientację anatomiczną przeszczepu do orientacji biorcy. Następnie delikatnie chwyć osłonkę zewnętrzną naczynia i użyj kleszczy numer pięć, aby ją lekko odwrócić.

Teraz użyj kleszczyków, aby wbić igłę przymocowaną do nici monofilamentowej z poliamidu 10 zero przez całą grubość ściany naczynia, aby przymocować przeszczep aorty dawcy do wyciętego naczynia biorcy w celu umieszczenia ciągłych szwów. Pozycja. Szwy podtrzymujące na godzinie dziewiątej zarówno w górnym, jak i dolnym końcu przeszczepu. Następnie zaczynając od górnego końca przeszczepu od zespolenia na godzinie trzeciej.

Wycięty kończy się dwoma szwami biegnącymi i mocuje szew do szwu podporowego. Następnie odwróć przeszczep i kontynuuj szew biegnący do grzbietowej części naczynia. Spotkanie z początkiem.

Trzymaj szew. Zabezpiecz szew bez wywierania dużego nacisku na naczynie i powtórz szycie dla dolnego zespolenia. Po zakończeniu zespolenia.

Zwolnij dystalny zacisk mikronaczyniowy, aby umożliwić wsteczny przepływ krwi przez naczynie. Jeśli nie obserwuje się krwawienia, zwolnij proksymalny zacisk. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych przeszkód związanych z krwią, użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić jeden koniec szwów podtrzymujących i lekko odwrócić naczynie, aby sprawdzić tylną ścianę naczynia.

Nie należy zaobserwować marszczenia się, jeśli obserwuje się energiczny puls zarówno w naczyniu dawcy, jak i biorcy, należy użyć aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby przywrócić jelita do jamy brzusznej. Na koniec użyj uchwytu na igłę i kleszczyków Grof, aby zamknąć ścianę brzucha za pomocą pięciu zerowych szwów polipropylenowych i ciągłego szycia. Za pomocą zamknięcia podskórnego zamknij warstwę skóry tymi samymi szwami.

Funkcję motoryczną kończyn tylnych można obserwować, aby ocenić powodzenie operacji. Bada się ilość uszkodzeń naczyń przeszczepu allogenicznego za pośrednictwem układu immunologicznego, określając ilościowo pogrubienie błony wewnętrznej i zwężenie światła w przeszczepionych segmentach aorty w 30 dniu. Po przeszczepie.

Rzeczywiście, jak zaobserwowano, w odcinkach tętnicy przeszczepu allogenicznego dochodzi do znacznego pogrubienia błony wewnętrznej i okluzji światła, podczas gdy w segmentach tętnicy kontrolnej przeszczepu ISO nie obserwuje się żadnych zmian. Ponadto rekrutację leukocytów do tętnicy przeszczepu allogenicznego można ocenić, badając akumulację limfocytów T i makrofagów CD 4 i CD 8 dodatnich za pomocą immunohistochemii. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie trzy typy komórek odpornościowych wykryto w błonie wewnętrznej tkanek tętniczych dawcy po opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transportem do zbadania alloimmunologicznej redukcji naczyń krwionośnych i przeszczepu stwardnienia tętniczego.