Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek satelitarnych z reprezentatywnych mięśni pochodzących z pierwszego, drugiego i czwartego łuku żuchwowego w celu ich hodowli na macierzy zewnątrzkomórkowej. Plamy żelowe. Osiąga się to poprzez wstępne wycięcie mięśnia żwacza, dwbrzuszkowego i mięśnia podniebiennego u młodego dorosłego szczura.

W drugim kroku komórki satelitarne z każdej próbki mięśnia są izolowane poprzez trawienie enzymatyczne w określonym czasie. Następnie komórki są hodowane na żelach macierzy pozakomórkowej. Ostatecznie dynamiczny stan miogenezy w hodowlach komórek satelitarnych może być monitorowany poprzez barwienie na wybrane markery mięśniowe.

Rozszczep wargi i podniebienia jest jedną z najczęstszych wad rozwojowych czaszkowo-twarzowych u ludzi. W przypadku wystąpienia rozszczepu konieczna jest korekcja chirurgiczna w celu zamknięcia defektu i umożliwienia prawidłowego rozwoju mowy. Jednak włóknienie oraz zaburzona regeneracja mięśni mogą utrudniać funkcjonalny powrót do sprawności mięśni podniebienia miękkiego. Po chirurgicznej korekcji rozszczepu podniebienia można zaprezentować innowacyjną metodę hodowli świeżo wyizolowanych komórek satelitarnych z wykorzystaniem punktowych powłok z żelu macierzy pozakomórkowej o rozmiarze zaledwie jednego milimetra.

Pozwala to uniknąć konieczności ekspansji. Jeden dzień przed izolacją umieść szkiełka z komorami ośmiodołkowymi w 100 milimetrowej szalce Petriego, a następnie przenieś szalkę na chłodną powierzchnię. Po 10 minutach, używając napełnionej mikropipety, nanieś do każdego dołka pojedynczą kroplę 10 µL żelu macierzy pozakomórkowej.

Po schłodzeniu szkiełek przez kolejne siedem minut całkowicie usuń pozostały żel i pozostaw do wyschnięcia dołków w temperaturze 37 °C przez noc. Aby wypreparować mięsień żwacza, usuń skórę z głowy dziewięciotygodniowego szczura i za pomocą igieł hipodermicznych przymocuj głowę bokiem. Na podkładce silikonowej wyizoluj gruczoł ślinowy przyuszny oraz nerw twarzowy, a następnie usuń gruczoł.

Następnie, używając ostrza skalpela nr 15, ostrożnie usuń nerw twarzowy. Zidentyfikuj powierzchowną głowę mięśnia żwacza. Następnie, za pomocą pęsety prostej, oddziel ścięgno od jego przyczepu na wyrostku jarzmowym, a następnie ostrożnie przetnij ścięgno nożyczkami preparacyjnymi.

Za pomocą skalpela przeprowadź preparację powierzchownej części mięśnia żwacza aż do jego przyczepu w kącie oraz dolnej połowie powierzchni bocznej gałęzi żuchwy. Aby wypreparować brzusiec tylny mięśnia dwubrzuchszczowego, unieruchom głowę w pozycji na plecach za pomocą igieł i usuń tkankę tłuszczową podskórną pokrywającą gruczoły podjęzykowe i podżuchwowe. Odsłoń przedni i tylny brzusiec mięśnia dwubrzuchszczowego, a następnie, trzymając przednią część ścięgna brzuszca tylnego prostą pęsetą, ostrożnie przetnij i wypreparuj ścięgno aż do jego przyczepu w pęcherzyku błonnym.

Aby wypreparować mięsień dźwigacz podniebienia miękkiego, zlokalizuj mięsień szyjowo-językowy. Odciągnij go bocznie i ostrożnie usuń tkankę mięśniową. Następnie zlokalizuj ścięgno mięśnia dźwigacza podniebienia miękkiego, które przyczepia się do bąbelka słuchowego, i ostrożnie je wypreparuj.

Następnie odsuń przełyk znad tchawicy. Zidentyfikuj obszar podniebienia miękkiego, w którym włożony jest podniebienny żagiew i przetnij mięsień. Następnie zanurz mięsień w 70% etanolu i przenieś go do lodowatego PBS z dodatkiem antybiotyków.

Aby wyizolować komórki satelitarne, należy przenieść każdy mięsień do oddzielnych studni płytki sześciodołkowej i pociąć tkanki na małe, dwumilimetrowe fragmenty, dbając o to, aby nie rozdrobnić mięśni zbyt mocno. Następnie fragmenty tkanki należy ostrożnie inkubować w 2,5 ml 0,1% roztworu pronazy na studnię w temperaturze 37 °C przez 60 minut, delikatnie wstrząsając co 20 minut.

Gdy pęczki włókien wykazują poluzowanie, do każdej studzienki dodaj 2,5 ml DMEM uzupełnionego o surowicę konia i antybiotyki, a następnie przenieś strawione tkanki do oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 15 ml. Odwiruj zawiesiny tkankowe i odlej nadsączki. Następnie dodaj pięć ml pożywki do każdej probówki i zhomogenizuj tkankę za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml.

Ponownie odwiruj tkanki, a nadsącz przelej do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Następnie dodaj do probówek kolejne 5 ml pożywki i ponownie trituruj fragmenty tkanek, aż będą one łatwo przechodzić przez pipetę. Po kolejnym wirowaniu pobierz nadsącz do odpowiednich probówek i przefiltruj zawiesiny komórkowe przez sita o oczkach 40 µm do oddzielnych probówek o pojemności 50 ml.

Przepłucz sita jednym mililitrem DMEM, aby maksymalnie odzyskać komórki. Następnie odwiruj komórki, resuspenduj osady w świeżym medium i policz komórki, aby móc hodować wyizolowane komórki satelitarne. Następnie rozcieńcz zawiesiny komórkowe do stężenia 1,5 × 10³ komórek na 10 µL pożywki hodowlanej.

Następnie nanieś 10 µL komórek na każdą z wcześniej przygotowanych plamek żelu macierzy pozakomórkowej i inkubuj żele w temperaturze 37 °C przez sześć godzin. Ostrożnie dodaj 400 µL pożywki hodowlanej do każdej plamki żelu i umieść szkiełka z powrotem w inkubatorze. Po trzech dniach rozpocznij różnicowanie komórek poprzez dodanie odpowiedniej pożywki hodowlanej bezpośrednio po izolacji.

Ponad 90% świeżo wyizolowanych komórek satelitarnych wykazuje ekspresję Pax7. Do czwartego dnia Pax7 oraz MyoD są ekspresywne w komórkach satelitarnych ze wszystkich grup mięśniowych. Myogenina jest silnie ekspresyjna w siódmym dniu we wszystkich grupach mięśniowych. Cztery dni po wysianiu na macierz zewnątrzkomórkową (plamki żelowe), proliferujące komórki zaczynają się fuzować i tworzyć małe wielojądrowe miotuby, które w siódmym i dziesiątym dniu wykazują ekspresję ciężkiego łańcucha miozyny.

Do 10. dnia widoczne są długie i dobrze zorganizowane miotubule. Można również zaobserwować drgania miotubul. Protokół ten umożliwia badanie komótek satelitarnych pochodzących z mięśni głowy szczura i oferuje nowe możliwości leczenia pacjentów z rozszczepem podniebienia.