Name: Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj izolację i hodowlę komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura. Ta metoda umożliwia badanie miogenezy bez konieczności ekspansji komórek, co wspiera badania nad regeneracją mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantu Mosaic (017.009.009) od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) oraz grantu Start (S-13-167C) dla młodych badaczy z Fundacji AO. Z.Y.R jest wspierany przez National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Wszystkie eksperymenty opisane w niniejszym dokumencie zostały zatwierdzone przez lokalną Radę ds. Doświadczeń na Zwierzętach z Uniwersytetu Radboud w Nijmegen zgodnie z holenderskimi przepisami ustawowymi i wykonawczymi (RU-DEC 2013-205).
1. Plamki żelowe macierzy zewnątrzkomórkowej
<ol>
	<li>Na dzień przed izolacją wykonaj następujące czynności:
	<ol>
		<li>Rozmrozić podwielokrotny żel z matrycą zewnątrzkomórkową (100 μl) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1,5 godziny. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w zmodyfikowanym podłożu Eagle's firmy Dulbecco; z 4 500 mg/l glukozy, 4 mM L-glutaminą i 110 mg/ml pirogronianu sodu (DMEM). Żel do macierzy zewnątrzkomórkowej należy utrzymywać przez cały czas w temperaturze 4 °C. Uwaga: Nagłe zmiany temperatury spowodują nierównomierną powłokę i tworzenie się kryształów.</li>
		<li>Rozcieńczony roztwór żelu macierzy zewnątrzkomórkowej należy przechowywać na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Schładzaj mikropipetę o pojemności 20 μl przez 10 minut.</li>
		<li>Umieścić szkiełka z 8-dołkową komorą w szalce Petriego o średnicy 100 mm i przenieść naczynie na zimną powierzchnię (np. opakowanie do zamrażania) na 10 minut.</li>
		<li>Użyj wstępnie schłodzonej mikropipety, aby umieścić kroplę 10 μl żelu macierzy zewnątrzkomórkowej w każdym dołku. Trzymaj szalkę Petriego na zimnej powierzchni przez co najmniej kolejne 7 minut (Rysunek 1A).</li>
		<li>Całkowicie usuń pozostały żel macierzy zewnątrzkomórkowej (ryc. 1B) i wysusz studzienki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie mięśni głowy (żwacz, dwubrzuś i dźwigacz górski veli palatini)
<ol>
	<li>Przed rosekcją należy przygotować 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 2% penicyliną-streptomycyną (P/S). Trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Po eutanazji jednego młodego dorosłego szczura (9 tygodni) z CO2/O2 należy odciąć głowę i usunąć skórę z głowy. Przenieś głowę do lodowatego PBS uzupełnionego 2% P/S w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Mięsień żwacz (wywodzący się z 1. łuku skrzelowego)
	<ol>
		<li>Umieść głowę jedną stroną do góry na silikonowej podkładce i przymocuj za pomocą igieł podskórnych (Rysunek 2A).</li>
		<li>Zidentyfikuj śliniankę przyuszną i nerw twarzowy (ryc. 2A). Odsłoń głęboką powięź pokrywającą gruczoł. Przetnij powięź i usuń gruczoł za pomocą nożyczek preparacyjnych. Zidentyfikuj zewnętrzny przewód słuchowy. Prześledź nerw twarzowy z otworu rylcowo-sutkowego i ostrożnie usuń gałęzie skroniowe, jarzmowe i policzkowe za pomocą ostrza skalpela nr 15.</li>
		<li>Uwolnij powierzchowną głowę mięśnia żwacza, usuwając powięź. Zidentyfikuj zarówno powierzchowne, jak i głębokie głowy mięśnia żwacza. Śledź powierzchowną głowę, aż jej grube ścięgniste rozcięgno zostanie wstawione do wyrostka jarzmowego szczęki.</li>
		<li>Oddziel ścięgno od jego pochodzenia w wyrostku jarzmowym za pomocą prostych kleszczy. Przetnij go ostrzem skalpela nr 15 lub nożyczkami do preparowania i ostrożnie żyj (Rysunek 2B).</li>
		<li>Wyciąć powierzchowną głowę żwacza do momentu jej włożenia pod kątem i dolną połową bocznej powierzchni ramienia żuchwy za pomocą ostrza skalpela nr 15 (ryc. 2C). Teraz całkowicie usuń mięsień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego (wywodzący się z 2. łuku skrzelowego)
	<ol>
		<li>Umieść głowę w pozycji leżącej na podkładce silikonowej i przymocuj za pomocą igieł podskórnych (ryc. 3A).</li>
		<li>Usuń podskórną tkankę tłuszczową pokrywającą gruczoły podjęzykowe i podżuchwowe. Następnie usuń powierzchowną powięź i gruczoły za pomocą nożyczek preparacyjnych. Odsłoń mięsień dwubrzuścowy (przedni i tylny brzuch).</li>
		<li>Przytrzymaj przednie ścięgno tylnego brzucha prostymi kleszczami, przetnij je i ostrożnie wypreparuj, aż pojawi się w pęcherzu bębenkowym (ryc. 3B). Zrób to samo po stronie przeciwnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mięsień dźwigacza veli palatini (wywodzący się z 4. łuku skrzelowego)
	<ol>
		<li>Po rozwarstwieniu tylnej części brzucha mięśnia dwubrzuścowego zlokalizuj mięsień rylcowaty, pociągnij go na bok i ostrożnie usuń (ryc. 4A).</li>
		<li>Zlokalizuj ścięgno dźwigacza veli palatini, które przyczepia się do pęcherza bębenkowego (ryc. 4A). Dokładnie go rozetnij i pokrój po obu stronach.</li>
		<li>Poszukaj tchawicy i przełyku, który biegnie za nią. Podnieś przełyk i odsłoń gardło i krtań.</li>
		<li>Zlokalizuj i wypreparuj obszar górnego mięśnia zwężającego gardło. Zidentyfikuj dźwigacz veli palatini i odetnij go po obu stronach (ryc. 4B). 
Uwaga: Bezpośrednio po rozbiorze ostrożnie usuń ścięgno i tkankę łączną z każdego mięśnia pod mikroskopem stereoskopowym. Szybko zanurz wszystkie próbki w etanolu 70% i przenieś je do lodowatego PBS uzupełnionego 2% P/S w probówce o pojemności 15 ml.
</li></ol>
</li>
</ol>
3. Izolacja komórek satelitarnych
<ol>
	<li>Wykonaj następujące kroki przygotowawcze do izolacji SC z 3 grup mięśni:
	<ol>
		<li>Przygotować 7,5 ml 0,1% pronazy w DMEM. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm. Wstępnie ogrzać roztwór w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut przed izolacją.</li>
		<li>Przygotuj 35 ml DMEM uzupełnionego 10% surowicą końską (HS) i 1% P/S. Również wstępnie ogrzany w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Przygotować 15 ml pożywki hodowlanej, która składa się z DMEM uzupełnionego 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurczaka (CEE). Wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Sześć plastikowych pipet (10 ml) pokryć HS i wysuszyć przez co najmniej 10 minut przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W kapturze hodowlanym przenieś każdy mięsień do dołka na płytce 6-dołkowej. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij mięsień na małe kawałki o wielkości około 2 mm. Uważaj, aby nie rozdrabniać tkanki zbyt mocno.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 2,5 ml 0,1% roztworu pronazy do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Delikatnie wstrząsnąć płytką po 20, 40 i 60 minutach. Uwaga: Dokładny czas trwania inkubacji zależy od takich czynników, jak wiek i wyrost zwierząt.</li>
	<li>Monitoruj pod mikroskopem. Sprawdź fragmenty mięśni i zatrzymaj trawienie enzymatyczne, gdy wiązki włókien staną się luźne (ryc. 5).</li>
	<li>Dodać 2,5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P/S. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówki przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.</li>
	<li>Dodać 5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P / S. Pipetować roztwór w górę iw dół za pomocą 10 ml plastikowej pipety (rozcieranie) co najmniej 20 razy, aby homogenizować tkankę.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 200 x g przez 4 minuty. Zebrać sklarowany osad i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P/S. Ponownie odpipetować plastikową pipetą o pojemności 10 ml, aż fragmenty tkanki łatwo przejdą przez pipetę.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 200 x g przez 4 minuty i zebrać supernatant do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umieścić sitko (40 μm) na probówce o pojemności 50 ml i przenieść supernatant zawierający zdysocjowane komórki na filtr. Przemyć 1 ml DMEM w celu maksymalnego odzyskania komórek.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 1 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Zawiesić osad w pożywce hodowlanej o objętości 300 μl i policzyć komórki w hemocytometrze.</li>
</ol>
4. Różnicowanie komórek satelitarnych na plamkach żelowych macierzy zewnątrzkomórkowej
<ol>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać 1,5 x 103 komórki w 10 μl pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Pokrywy szkiełek komór zabezpiecz taśmą i zaznacz miejsca czarnym markerem na spodniej stronie szkła obiektu.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety nanieś kroplę 10 μl zawiesiny komórek na miejsce żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropla zawiesiny komórek została prawidłowo umieszczona na miejscu. Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 400 μl pożywki hodowlanej (DMEM uzupełnione 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% CEE) i inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: W tym momencie świeżo wyizolowane SC są poddawane masywnemu urazowi (trawienie enzymatyczne i ostre roztarcie) i muszą dojść do siebie. Nie należy zakłócać pracy komórek przez pierwsze trzy dni 37. Następnie pożywkę hodowlaną można zmienić w zależności od rodzaju eksperymentu. 
	Plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej można wysiewać z dużą gęstością komórek (1,5-2,5 x 103/20 μl) w celu przeprowadzenia testu różnicowania. Pożywkę hodowlaną (DMEM uzupełnioną 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurczaka) można wymieniać co trzeci dzień.</li>
	<li>Alternatywnie, jeśli pożądane jest rozwijanie i przekazywanie, wykonaj następujące kroki:
	<ol>
		<li>Rozmrozić podwielokrotny żel z matrycą zewnątrzkomórkową (500 μl) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1,5 godziny. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w DMEM i postępować zgodnie z zaleceniami określonymi w ppkt 1.1.1.</li>
		<li>Schładzać pipetę o pojemności 10 ml przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść trzy kolby T75 na zimną powierzchnię (np. opakowanie do zamrażania) na 10 minut.</li>
		<li>Za pomocą wstępnie schłodzonej pipety umieścić 1 ml żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej w każdej kolbie. Sprawdź, czy powierzchnia jest całkowicie pokryta. Trzymaj kolby na zimnej powierzchni przez co najmniej kolejne 7 minut (Rysunek 1A).</li>
		<li>Całkowicie usunąć pozostały żel do macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą pipety o pojemności 10 ml i suszyć studzienki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Po zliczeniu zawiesić świeżo wyizolowane SC w 10 ml pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurzych) i nasiona w wstępnie powlekanych kolbach T75.</li>
		<li>Po trzech dniach zmieniaj podłoże (i co trzeci dzień), aż do osiągnięcia 80% zbiegu. W celu pasażowania należy umyć kolby T75 trzykrotnie PBS. Następnie dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny i inkubować przez trzy minuty w temperaturze 37 °C. Zawiesić ponownie w 9 ml pożywki hodowlanej (DMEM uzupełnionej 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurzych) i wirować przy 200 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Po zliczeniu ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 1 000 μl pożywki hodowlanej i zamrozić komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

SC z różnych mięśni skrzelowych głowy wyizolowano od jednego 9-tygodniowego szczura rasy Wistar i hodowano bezpośrednio na plamkach żelu macierzy zewnątrzkomórkowej bez uprzedniego rozszerzania i pasażowania. Po izolacji komórki policzono i wysiewano w tym samym zagęszczeniu komórek. W przypadku równoległej izolacji trzech różnych mięśni ta metoda trwa około 4 godzin. Aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli, krytycznym krokiem jest szybkie mycie w alkoholu 70% po rozwarstwieniu mięśni.
Podczas izolacji SC ważne jest, aby pociąć tkankę mięśniową na małe kawałki (około 2 mm), ale unikaj zbyt dużego mielenia, ponieważ spowoduje to małą wydajność komórek z powodu uszkodzenia komórek. Należy również dokładnie sprawdzić czas trwania trawienia enzymatycznego pod mikroskopem, aby uniknąć dalszych uszkodzeń. Celem trawienia jest dysocjacja włókien mięśniowych. Ponieważ ponad 90% wyizolowanych komórek wykazuje ekspresję Pax7, dalsze oczyszczanie nie jest wymagane (ryc. 6-8). Pozwala to uniknąć dodatkowych etapów oczyszczania w innych metodach, takich jak wstępne powlekanie na niepowlekanych naczyniach14,37,38, frakcjonowanie na Percoll39,40 lub sortowanie fluorescencyjne lub magnetyczne komórek41,43. W celu roztarcia konieczne jest wywołanie ścinania między fragmentami tkanki a otwarciem końcówki pipety, ponieważ umożliwia to mechaniczne uwolnienie SC. Jeśli rozcieranie pipetą o pojemności 10 ml (końcówka o średnicy wewnętrznej: 1 mm) jest trudne, można najpierw użyć pipety o pojemności 5 ml (końcówka o średnicy wewnętrznej: 2 mm). Alternatywnie, szklane pipety Pasteura mogą być cięte na żądaną średnicę i mogą być używane. Metoda ta jest prosta, skuteczna i pozwala na jednoczesną izolację SC z różnych próbek mięśniowych.
Płytki hodowlane dla SC mogą być również pokryte żelatyną lub kolagenem, ale nasze poprzednie badania pokazują, że żel macierzy zewnątrzkomórkowej jest znacznie lepszy dla utrzymania potencjału miogennego niż kolagen38. Plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej o wielkości milimetra (10 μl/Ø 2 mm lub 20 μl/Ø 4 mm) umożliwiają badanie proliferacji i różnicowania SC przy ograniczonej liczbie komórek. Do testu różnicowania potrzeba około 8 do 20 razy mniej komórek w porównaniu z płytką 24-dołkową (Ø 15,6 mm) i około 80 do 200 razy mniej w porównaniu z szalkami Petriego 35 mm (Ø 35 mm)14,38.
Ponieważ żel do macierzy zewnątrzkomórkowej jest drogi, ta metoda jest również bardziej opłacalna. Ponadto prowadnice studzienki można zastąpić szkiełkami nakrywkowymi z tworzywa sztucznego, aby jeszcze bardziej obniżyć koszty. Do przygotowania plamek żelowych macierzy zewnątrzkomórkowej niezbędne jest nocne suszenie szkiełek komorowych. Ponieważ plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej są przezroczyste, konieczne jest oznaczenie plam na dolnej stronie za pomocą podświetlenia. Szkiełka komór są zamocowane na szalce Petriego w celu łatwej manipulacji. Dalsza ekspansja hodowli komórkowych nie jest konieczna, co daje możliwość badania SC mniejszych mięśni lub małych próbek mięśni. Alternatywnie, np. w przypadku PCR lub konstruktów mięśniowych, jeśli potrzebnych jest więcej komórek, świeżo wyizolowane SC można najpierw namnażać w kolbach T75, jak wskazano powyżej.
SC wyizolowane przy użyciu tego protokołu nie nadają się do dalszego oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej bezpośrednio po izolacji. Trawienie z pronazą powoduje intensywne trawienie antygenów powierzchniowych14. Surowica końska i płodowa surowica bydlęca, które są używane do hodowli komórek, muszą być najpierw odpowiednio scharakteryzowane przed izolacją, ponieważ różne numery partii w różny sposób wpływają na proliferację i różnicowanie mioblastów.
W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie mięśniami wywodzącymi się z łuków skrzelowych i mezodermy głowy (np. mięśni zewnątrzgałkowych)24. Wykazano jednoznacznie, że mięśnie głowy i kończyn mają bardzo różne właściwości. Wydaje się, że mięśnie żwaczy u starych zwierząt zachowują swoje zdolności regeneracyjne w porównaniu z mięśniami kończyn25,26. SC z mięśni zewnątrzgałkowych posiadają solidną zdolność proliferacji i różnicowania porównywalną z SC z mięśni głowy i wykazują większy potencjał wszczepienia niż SC mięśni kończyn24.
Rozkład rodzaju włókien i skład miozyny różnią się w zależności od grupy mięśni, a także między gatunkami. Mięśnie wywodzące się z pierwszego łuku skrzelowego u ludzi zawierają zarówno wolne, jak i szybkie włókna (podtypy IIA i IIX), miozyny noworodkowe i miozyny typowe dla rozwoju mięśnia sercowego. U gryzoni mięśnie te zawierają około 95% włókien szybkich: miozyny IIA i IIb)44-46. Badania nad mięśniami ptaków pokazują, że SC z różnych typów włókien mięśniowych różnią się zdolnością różnicowania. SC z szybkich włókien różnicują się tylko w szybkie włókna mięśniowe, podczas gdy SC z wolnych włókien mogą różnicować się w oba typy włókien47. Ponadto odsetek SC w szybkich włóknach mięśniowych jest niższy niż w wolnych włóknach mięśniowych48,49. Wskazuje to, że rozkład rodzaju włókien musi być brany pod uwagę w badaniach nad mięśniami w okolicy twarzoczaszki. Podobnie jak mięśnie rozszczepu podniebienia, LVP u gryzoni zawiera prawie wyłącznie włókna szybkie50. Z tego powodu SC z LVP nadają się do badań przedklinicznych w dziedzinie rozszczepu podniebienia.
Protokół ten oferuje nowe możliwości badania SC pochodzących z mięśni skrzelowych głowy lub innych mniejszych mięśni lub próbek mniejszych mięśni. Ułatwi to opracowanie nowych terapii poprawiających regenerację mięśni w okolicy szczękowo-twarzowej w stanach takich jak rozszczep podniebienia, ale także w innych schorzeniach wpływających na mniejsze mięśnie.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Około 1:500 do 1:1,000 noworodków wykazuje rozszczep obejmujący wargę i/lub podniebienie (CLP); dlatego jest to najczęstsza wrodzona wada rozwojowa u ludzi1. Mięśnie podniebienia miękkiego mają kluczowe znaczenie dla funkcjonowania podniebienia miękkiego podczas mówienia, połykania i ssania. Jeśli występuje szczelina podniebienia miękkiego, mięśnie te są nieprawidłowo wstawione do tylnego końca kości podniebiennej.
Podniebienie miękkie porusza się w górę i w dół podczas mowy, zapobiegając ucieczce powietrza przez nos. Dzieci z rozszczepem podniebienia nie mają tej funkcji kontrolnej, co powoduje zjawisko znane jako dysfunkcja gardła2,3. Chociaż protokoły leczenia są różne, chirurgiczna naprawa podniebienia miękkiego ma miejsce we wczesnym dzieciństwie (w wieku 6-36 miesięcy)4. Nieprawidłowo zbudowane mięśnie podniebienia miękkiego można skorygować chirurgicznie5-7, jednak dysfunkcja wewnętrzno-gardłowa utrzymuje się u 7% do 30% pacjentów2,3,8-10.
Zdolność mięśni szkieletowych do regeneracji poprzez działanie komórek satelitarnych (SC) jest dobrze znana11,12. Po urazie mięśnia SC są aktywowane i migrują do miejsca urazu. Następnie rozmnażają się, różnicują i łączą się, tworząc nowe włókna mięśniowe lub naprawiając uszkodzone13. Spoczynkowe SC wyrażają czynnik transkrypcyjny Pax714,15, podczas gdy ich potomstwo, proliferujące mioblasty, dodatkowo wyrażają miogenny czynnik determinacyjny 1 (MyoD)16. Różnicujące się mioblasty zaczynają wyrażać miogeninę (MyoG)17. Końcowe różnicowanie mioblastów jest zaznaczone przez tworzenie włókien mięśniowych i ekspresję białek specyficznych dla mięśni, takich jak łańcuch ciężki miozyny (MyHC)16,18.
Ostatnio, w medycynie regeneracyjnej zastosowano kilka strategii mających na celu poprawę regeneracji mięśni kończyn19-23. Szczegółowe badania nad mięśniami skrzelowymi głowy są również ważne, ponieważ niedawno wykazano, że różnią się one od innych mięśni pod kilkoma względami24. W przeciwieństwie do mięśni kończyn sugeruje się, że mięśnie głowy skrobakowe zawierają mniej SC25, wolniej się regenerują, a po urazie powstaje więcej włóknistej tkanki łącznej26 Ponadto proliferujące SC z mięśni skrzelowych głowy wyrażają również inne czynniki transkrypcyjne. Na przykład Tcf21, czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny za tworzenie mięśni twarzoczaszki, jest silnie wyrażany w regeneracji mięśni głowy, ale prawie nie w regenerujących się mięśniach kończyn25. Mięśnie podniebienia miękkiego pacjentów z CLP są zwykle mniejsze i gorzej zorganizowane w porównaniu z normalnymi mięśniami podniebienia27,28. Zarówno wolne, jak i szybkie włókna są obecne w mięśniach podniebienia miękkiego, ale wolne włókna są bardziej obfite. Natomiast mięśnie rozszczepowe zawierają większą ilość szybkich włókien, a także zmniejszone zaopatrzenie w naczynia włosowate w porównaniu z normalnymi mięśniami podniebienia miękkiego29-31. Szybkie włókna są bardziej podatne na urazy wywołane skurczem31-33. Towarzyszące temu słabe ukrwienie naczyń włosowatych może również sprzyjać zwłóknieniu34,35. Wszystkie te aspekty mogą przyczyniać się do słabej regeneracji mięśni podniebienia miękkiego po chirurgicznym zamknięciu rozszczepu36. W związku z tym kluczowe znaczenie ma protokół izolacji i charakterystyki SC mięśni głowy skrzelowych. Daje to możliwość badania biologii SC mięśni skrzelowych głowy. Ponadto można opracować nowe terapie oparte na inżynierii tkankowej w celu wspomagania regeneracji mięśni po operacji CLP i innych schorzeniach zagrażających okolicy twarzoczaszki.
Ogólnie, SC można uzyskać po dysocjacji tkanki mięśniowej14. Mielenie, trawienie enzymatyczne i rozcieranie są na ogół wymagane do uwolnienia SC z ich niszy. SC można oczyszczać przez wstępne powlekanie na niepowlekanych naczyniach14,37,38, frakcjonowanie na Percoll39,40 lub sortowanie fluorescencyjne lub magnetyczne41-43. Tutaj przedstawiamy nowy ekonomiczny i szybki protokół izolacji komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych młodych dorosłych szczurów. Protokół ten opiera się na poprzednim manuskrypcie14 i jest specjalnie dostosowany do małych próbek tkanek. Opisano izolację SC od reprezentatywnych mięśni pochodzących z 1, 2i 4 łukuskrzelowego. Po izolacji, niewielka liczba komórek satelitarnych jest hodowana na plamkach żelu macierzy zewnątrzkomórkowej o wielkości milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć wymogu rozbudowy i przechodzenia SC.

<table><tbody><tr><td>Igła podskórna 25&nbsp; G 0,5&nbsp; x&nbsp; 25&nbsp; m</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Braun</td><td>BC154R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokleszcze proste</td> Ostrze skalpela chirurgicznego <td>Braun</td><td>BD330R</td><td></td></tr><tr><td>No&nbsp; 15</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol 70%</td><td>Denteck</td><td>2,010,005</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko Permanox, 8-komorowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>177445</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli komórkowych (100 x 20 mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterylna stożkowa probówka wirówkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylna stożkowa probówka wirówkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (40 &mu; m)</td><td>Gibco</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta serologiczna</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; &mikro; l FT20</td><td>Greiner bio-one</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, bez czerwieni fenolowej</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>10&nbsp; KU</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, wysoka glukoza, suplement GlutaMAX, pirogronian&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>3600511</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ekstrakt z zarodków kurczaka</td><td>MP Biomedicals</td><td>2850145</td><td>20 ml</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Zwłóknienie i wadliwa regeneracja mięśni mogą utrudniać funkcjonalną regenerację mięśni podniebienia miękkiego po naprawie rozszczepu podniebienia. Powoduje to uporczywe problemy z mową, połykaniem i ssaniem. Systemy hodowli in vitro, które umożliwiają badanie komórek satelitarnych (miogennych komórek macierzystych) z mięśni głowy, mają kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii opartych na inżynierii tkankowej w celu promowania regeneracji mięśni po operacji. Systemy te stworzą nowe perspektywy leczenia pacjentów z rozszczepem podniebienia. Przedstawiono protokół izolacji, hodowli i różnicowania komórek satelitarnych z mięśni głowy. Izolacja opiera się na trawieniu enzymatycznym i rozcieraniu w celu uwolnienia komórek satelitarnych. Ponadto protokół ten obejmuje innowacyjną metodę wykorzystującą powłoki żelowe macierzy zewnątrzkomórkowej o rozmiarach milimetrowych, która wymaga jedynie niewielkiej liczby komórek satelitarnych do testów różnicowania.

Stosując ten protokół, mięsień żwacza (jedna strona) daje 0,8-1 x 106 komórek, mięsień dwubrzuźczyk (brzusiec tylny) daje 1,5-2 x 105 komórek, a mięsień podnoszący podniebienie miękkie daje 1-1,5 x 105 komórek. Wydajność komórek zależy od rodzaju mięśnia, szczepu oraz wieku zwierzęcia. W celu porównania trzech grup mięśni, świeżo wyizolowane komórki SC wysiano przy tej samej gęstości komórek (1,5 x 103/10 µl). Bezpośrednio po izolacji ponad 90% świeżo wyizolowanych komórek wykazuje ekspresję Pax7 (Rycina 6).
Kultury z 4., 7. i 10. dnia barwiono przeciwciałami przeciwko Pax7, MyoD, MyoG i MyHC metodą immunocytochemiczną. W każdej kulturze policzono pięć dowolnie wybranych pól widzenia przy użyciu obiektywu 20X. W 4. dniu Pax7 i MyoD ulegają ekspresji we wszystkich grupach mięśniowych (ryciny 6, 7 i 8), jednak potomstwo SatCs z mięśnia żwacza i mięśnia dwubrzuchego zaczyna wykazywać ekspresję miogeniny wcześniej niż mięsień dźwigacz podniebienia miękkiego (rycina 9). W 10. dniu ekspresja MyoG jest znacznie zredukowana we wszystkich grupach (rycina 9). Kilka dni po wysianiu na kropelki żelu z macierzą pozakomórkową proliferujące komórki zaczynają się fuzować i tworzyć wielojądrowe miotuby, które wykazują ekspresję ciężkiego łańcucha miozyny. Małe miotuby są wyraźnie widoczne w 7. dniu (rycina 10). W 10. dniu można zaobserwować drgania miotub (film 1).
<img alt="Układ eksperymentalny do badania równowagi statycznej z szalkami Petriego na stole laboratoryjnym; badanie rozkładu masy." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Krople żelu macierzy pozakomórkowej w szkiełku z komorami. (A) W celu ułatwienia manipulacji należy umieścić szkiełko z 8 komorami w szalce Petriego o średnicy 100 mm. Do każdej komory należy nanieść pipetą 10 µl żelu macierzy pozakomórkowej, a następnie pozostawić na zimnej powierzchni (7 min). (B) Szkiełko z komorami po usunięciu nadmiaru żelu macierzy pozakomórkowej.
<img alt="Innervacja motoryczna mięśni twarzy świni; schemat z opisem; badanie naukowe nad szlakami neuronalnymi." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Disekcja mięśnia żwacza. (A) Głowa zwierzęcia w widoku bocznym. Ucho (E), gruczoł ślinowy przyuszny (P) i nerw twarzowy (VII). (B) Rozcięgno ścięgniste (Te) powierzchownej części mięśnia żwacza (Ms) i mięśnia skroniowego (T). Oddzielenie ścięgna od miejsca przyczepu za pomocą pęsety. (C) Ostrożna disekcja mięśnia aż do jego przyczepu na gałęzi żuchwy. E: ucho, P: gruczoł ślinowy przyuszny, VII: nerw twarzowy, T: mięsień skroniowy, Ms: powierzchowna część mięśnia żwacza, Te: ścięgno, Mp: głęboka część mięśnia żwacza.
<img alt="Schemat anatomii myszy przedstawiający położenie gruczołów i strukturę mięśniową." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Disekcja brzuszka tylnego mięśnia dwubrzuźczastego. (A) Głowa zwierzęcia w pozycji na plecach. Zlokalizuj gruczoł podżuchwowy (Sg), mięsień żwacza (M), nerw twarzowy (VII) oraz mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy (SCM). Usuń gruczoł podżuchwowy. (B) Zlokalizuj brzuszek przedni (AD) i tylny (PD) mięśnia dwubrzuźczastego. Za pomocą pęsety prostej chwyć ścięgno przednie brzuszka tylnego, przetnij je i ostrożnie wypreparuj aż do jego przyczepu w bąbelku słuchowym (ty). E: ucho, Sg: gruczoł podżuchwowy, VII: nerw twarzowy, M: mięsień żwacza, SMC: mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, AD: brzuszek przedni mięśnia dwubrzuźczastego, PD: brzuszek tylny mięśnia dwubrzuźczastego, Ty: bąbelek słuchowy.
<img src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4new.jpg" align="Figure 4" alt="Disekcja gruczołów ślinowych muszki owocówki, schemat przedstawia pozycje anatomiczne, etykiety i skalpel." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 4: Disekcja mięśnia podnoszącego podniebienie miękkie. (A) Widok ogólny po wycięciu mięśnia dwubrzuśnego (brzuszek tylny). Można zlokalizować mięsień stylistrohyoidalny (St) oraz ścięgno mięśnia podnoszącego podniebienie miękkie. Należy zwrócić uwagę na tchawicę (T) i przełyk (Es) przebiegające za nim. (B) Po uniesieniu tchawicy i przełyku odsłonięta zostaje gardziel (P). Widoczny jest teraz mięsień podnoszący podniebienie miękkie, który biegnie bocznie w stronę podniebienia miękkiego. Strzałka wskazuje wycięty mięsień konstriktor górny gardła; zwróć uwagę na mięśnie podnoszące podniebienie miękkie po obu stronach. E: ucho, St: mięsień stylistrohyoidalny, VII: nerw twarzowy, M: mięsień żwacz, AD: brzuszek przedni mięśnia dwubrzuśnego, PD: brzuszek tylny mięśnia dwubrzuśnego, T: tchawica, Es: przełyk, P: gardziel, *mięsień podnoszący podniebienie miękkie.
<img alt="Obraz z mikroskopu histologicznego; obserwacja próbki tkanki; dwa opisane przekroje, A i B." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wygląd tkanki mięśniowej (A) przed i (B) po trawieniu enzymatycznym pronazą. Zauważalnie pęczki mięśniowe wydają się rozluźnione po trawieniu enzymatycznym.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, barwienie DAPI i Pax7, wizualizacja jąder komórkowych, obraz immunofluorescencyjny." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig6highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Immunobarwienie Pax 7. Świeżo wyizolowane komórki satelitarne (SCs), naniesione na żel z macierzy zewnątrzkomórkowej po zakończeniu izolacji (około 6 godzin po początkowym trawieniu tkanki). Policzono pięć dowolnych pól z użyciem obiektywu 10X, uzyskując średnio 210 komórek na pole. Około 90% komórek jest dodatnich pod kątem Pax 7. DAPI: niebieski, Pax7: czerwony. Pasek skali, 100 µm.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i wykresy słupkowe przedstawiające różnicowanie komórek Pax7 i MyoD w dniu 4 i 7." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Immunobarwienie Pax7 i MyoD. Hodowle z dnia 4, 7 i 10 poddano barwieniu przeciwciałami przeciwko Pax7 oraz immunobarwieniu MyoD. (A–C) i (D–F) Reprezentatywne mikrofotografie hodowli z dnia 4 i 7 z mięśnia żwacza. (G i H) Liczbę jąder Pax7+ i MyoD+ w jednym polu widzenia mikroskopu policzono i wyrażono jako procent całkowitej liczby jąder (DAPI). DAPI: niebieski, Pax7: czerwony, a MyoD: zielony. Pasek skali, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy różnicowania komórek mięśniowych w mięśniach żwaczu, dwubrzuśnym i dźwigaczu podniebienia miękkiego; tabela danych." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Rozkład Pax7±/MyoD± w kulturach z jednojądrowych komórek z mięśnia żwacza, dwubrzuśnego i dźwigacza podniebienia miękkiego. (A–C) Kultury w 4., 7. i 10. dniu barwiono przeciwciałami przeciwko Pax7 oraz przeprowadzono immunostening MyoD. Całkowita liczba komórek została określona na podstawie całkowitej liczby jąder (DAPI). (D) Ilościowa analiza danych komórek Pax7±/MyoD±. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna dla DAPI i MyoG w dniu 4. i 7.; wykres i tabela procentowej zawartości komórek MyoG+." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Immunobarwienie miogeniny. Kultury z dnia 4., 7. i 10. zabarwiono przeciwciałami przeciwko miogeninie. (A–D) Reprezentatywne mikrofotografie kultur z dnia 4. i 7. pochodzących z mięśnia dźwigacza podniebiennego. (E) Liczbę jąder MyoG+ na pole widzenia mikroskopu policzono i wyrażono jako procent całkowitej liczby jąder (DAPI). (F) Ilościowa analiza danych dla komórek MyoG+. DAPI: niebieski, miogenina: zielony. Pasek skali, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna różnicowania komórek barwionych DAPI, wykazująca ekspresję MyHC w dniach 4, 7 i 10." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Immunobarwienie ciężkiego łańcucha miozyny. Kultury z dnia 4, 7 i 10 zabarwiono przeciwciałami przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny (MyHC). Reprezentatywne mikrofotografie kultur z dnia 4, 7 i 10 pochodzących z mięśnia dwubrzuśnego (DIG). W dniu 7 obecne są małe miotuby, natomiast w dniu 10 widoczne są długie i dobrze zorganizowane miotuby. Pasek skali, 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Wideo 1: Drgania miotub. Przedstawiono przykłady dwóch reprezentatywnych pól z drgającymi miotubami dla kultur z 10. dnia z mięśnia dwubrzuśnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.</a>

Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek satelitarnych z reprezentatywnych mięśni pochodzących z pierwszego, drugiego i czwartego łuku żuchwowego w celu ich hodowli na macierzy zewnątrzkomórkowej. Plamy żelowe. Osiąga się to poprzez wstępne wycięcie mięśnia żwacza, dwbrzuszkowego i mięśnia podniebiennego u młodego dorosłego szczura.W drugim kroku komórki satelitarne z każdej próbki mięśnia są izolowane poprzez trawienie enzymatyczne w określonym czasie. Następnie komórki są hodowane na żelach macierzy pozakomórkowej. Ostatecznie dynamiczny stan miogenezy w hodowlach komórek satelitarnych może być monitorowany poprzez barwienie na wybrane markery mięśniowe.Rozszczep wargi i podniebienia jest jedną z najczęstszych wad rozwojowych czaszkowo-twarzowych u ludzi. W przypadku wystąpienia rozszczepu konieczna jest korekcja chirurgiczna w celu zamknięcia defektu i umożliwienia prawidłowego rozwoju mowy. Jednak włóknienie oraz zaburzona regeneracja mięśni mogą utrudniać funkcjonalny powrót do sprawności mięśni podniebienia miękkiego. Po chirurgicznej korekcji rozszczepu podniebienia można zaprezentować innowacyjną metodę hodowli świeżo wyizolowanych komórek satelitarnych z wykorzystaniem punktowych powłok z żelu macierzy pozakomórkowej o rozmiarze zaledwie jednego milimetra.Pozwala to uniknąć konieczności ekspansji. Jeden dzień przed izolacją umieść szkiełka z komorami ośmiodołkowymi w 100 milimetrowej szalce Petriego, a następnie przenieś szalkę na chłodną powierzchnię. Po 10 minutach, używając napełnionej mikropipety, nanieś do każdego dołka pojedynczą kroplę 10 µL żelu macierzy pozakomórkowej.Po schłodzeniu szkiełek przez kolejne siedem minut całkowicie usuń pozostały żel i pozostaw do wyschnięcia dołków w temperaturze 37 °C przez noc. Aby wypreparować mięsień żwacza, usuń skórę z głowy dziewięciotygodniowego szczura i za pomocą igieł hipodermicznych przymocuj głowę bokiem. Na podkładce silikonowej wyizoluj gruczoł ślinowy przyuszny oraz nerw twarzowy, a następnie usuń gruczoł.Następnie, używając ostrza skalpela nr 15, ostrożnie usuń nerw twarzowy. Zidentyfikuj powierzchowną głowę mięśnia żwacza. Następnie, za pomocą pęsety prostej, oddziel ścięgno od jego przyczepu na wyrostku jarzmowym, a następnie ostrożnie przetnij ścięgno nożyczkami preparacyjnymi.Za pomocą skalpela przeprowadź preparację powierzchownej części mięśnia żwacza aż do jego przyczepu w kącie oraz dolnej połowie powierzchni bocznej gałęzi żuchwy. Aby wypreparować brzusiec tylny mięśnia dwubrzuchszczowego, unieruchom głowę w pozycji na plecach za pomocą igieł i usuń tkankę tłuszczową podskórną pokrywającą gruczoły podjęzykowe i podżuchwowe. Odsłoń przedni i tylny brzusiec mięśnia dwubrzuchszczowego, a następnie, trzymając przednią część ścięgna brzuszca tylnego prostą pęsetą, ostrożnie przetnij i wypreparuj ścięgno aż do jego przyczepu w pęcherzyku błonnym.Aby wypreparować mięsień dźwigacz podniebienia miękkiego, zlokalizuj mięsień szyjowo-językowy. Odciągnij go bocznie i ostrożnie usuń tkankę mięśniową. Następnie zlokalizuj ścięgno mięśnia dźwigacza podniebienia miękkiego, które przyczepia się do bąbelka słuchowego, i ostrożnie je wypreparuj.Następnie odsuń przełyk znad tchawicy. Zidentyfikuj obszar podniebienia miękkiego, w którym włożony jest podniebienny żagiew i przetnij mięsień. Następnie zanurz mięsień w 70% etanolu i przenieś go do lodowatego PBS z dodatkiem antybiotyków.Aby wyizolować komórki satelitarne, należy przenieść każdy mięsień do oddzielnych studni płytki sześciodołkowej i pociąć tkanki na małe, dwumilimetrowe fragmenty, dbając o to, aby nie rozdrobnić mięśni zbyt mocno. Następnie fragmenty tkanki należy ostrożnie inkubować w 2,5 ml 0,1% roztworu pronazy na studnię w temperaturze 37 °C przez 60 minut, delikatnie wstrząsając co 20 minut.Gdy pęczki włókien wykazują poluzowanie, do każdej studzienki dodaj 2,5 ml DMEM uzupełnionego o surowicę konia i antybiotyki, a następnie przenieś strawione tkanki do oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 15 ml. Odwiruj zawiesiny tkankowe i odlej nadsączki. Następnie dodaj pięć ml pożywki do każdej probówki i zhomogenizuj tkankę za pomocą plastikowej pipety o pojemności 10 ml.Ponownie odwiruj tkanki, a nadsącz przelej do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Następnie dodaj do probówek kolejne 5 ml pożywki i ponownie trituruj fragmenty tkanek, aż będą one łatwo przechodzić przez pipetę. Po kolejnym wirowaniu pobierz nadsącz do odpowiednich probówek i przefiltruj zawiesiny komórkowe przez sita o oczkach 40 µm do oddzielnych probówek o pojemności 50 ml.Przepłucz sita jednym mililitrem DMEM, aby maksymalnie odzyskać komórki. Następnie odwiruj komórki, resuspenduj osady w świeżym medium i policz komórki, aby móc hodować wyizolowane komórki satelitarne. Następnie rozcieńcz zawiesiny komórkowe do stężenia 1,5 × 10³ komórek na 10 µL pożywki hodowlanej.Następnie nanieś 10 µL komórek na każdą z wcześniej przygotowanych plamek żelu macierzy pozakomórkowej i inkubuj żele w temperaturze 37 °C przez sześć godzin. Ostrożnie dodaj 400 µL pożywki hodowlanej do każdej plamki żelu i umieść szkiełka z powrotem w inkubatorze. Po trzech dniach rozpocznij różnicowanie komórek poprzez dodanie odpowiedniej pożywki hodowlanej bezpośrednio po izolacji.Ponad 90% świeżo wyizolowanych komórek satelitarnych wykazuje ekspresję Pax7. Do czwartego dnia Pax7 oraz MyoD są ekspresywne w komórkach satelitarnych ze wszystkich grup mięśniowych. Myogenina jest silnie ekspresyjna w siódmym dniu we wszystkich grupach mięśniowych. Cztery dni po wysianiu na macierz zewnątrzkomórkową (plamki żelowe), proliferujące komórki zaczynają się fuzować i tworzyć małe wielojądrowe miotuby, które w siódmym i dziesiątym dniu wykazują ekspresję ciężkiego łańcucha miozyny.Do 10. dnia widoczne są długie i dobrze zorganizowane miotubule. Można również zaobserwować drgania miotubul. Protokół ten umożliwia badanie komótek satelitarnych pochodzących z mięśni głowy szczura i oferuje nowe możliwości leczenia pacjentów z rozszczepem podniebienia.

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z głowowych mięśni gałkowych szczura

Ten film demonstruje izolację komórek satelitarnych z tkanek mięśni rozgałęzionych głowy szczura poprzez rozwarstwienie tkanek, trawienie enzymatyczne, a następnie mechaniczne i odśrodkowe oczyszczanie. Komórki są następnie wysiewane w studzienkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową w celu różnicowania w mioblasty, a ostatecznie w miotubki i dojrzałe włókna mięśniowe.

Technika izolowania komórek satelitarnych z tkanki mięśniowej głowy szczura

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Systemy hodowli in vitro okazały się niezbędne dla naszego zrozumienia miogenezy kręgowców. Jednak wiele pozostaje do nauczenia się na temat rozwoju i wzrostu mięśni szkieletowych innych niż ssaki, szczególnie w taksonach podstawowych. Skuteczny i solidny protokół izolowania dorosłych komórek macierzystych tej tkanki, miogennych komórek prekursorowych (MPC) i utrzymywania ich samoodnawiania, proliferacji i różnicowania w warunkach hodowli pierwotnej, pozwala na identyfikację konserwatywnych i...

Przygotowanie pierwotnych miogennych kultur komórek prekursorowych/mioblastów z bazalnych linii kręgowców

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Precyzyjna identyfikacja komórek satelitarnych jest niezbędna do badania ich funkcji w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. W artykule przedstawiono protokół identyfikacji komórek satelitarnych na wycinkach dorosłych mięśni szkieletowych za pomocą barwienia opartego na immunofluorescencji.

Identyfikacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami Pax7 i Laminin

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj izolację i hodowlę komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura. Ta metoda umożliwia badanie miogenezy bez konieczności ekspansji komórek, co wspiera badania nad regeneracją mięśni.

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Przeglądaj więcej filmów