Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura
20 lipca 2015
Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek satelitarnych z reprezentatywnych mięśni pochodzących z pierwszego, drugiego i czwartego łuku ramiennego w celu ich hodowli na macierzy zewnątrzkomórkowej. Plamy żelowe. Osiąga się to poprzez uprzednią sekcję mięśni podniebiennych masakry, digastric i levada vli młodego dorosłego szczura.
W drugim etapie komórki satelitarne z każdej próbki mięśni są izolowane przez enzymatyczne, trawienie i czas trwania. Komórki są następnie hodowane na żelach macierzy zewnątrzkomórkowej. Ostatecznie, dynamiczny stan miogenezy satelitarnych kultur komórkowych można śledzić poprzez barwienie interesujących markerów mięśniowych.
Rozszczep wargi i podniebienia jest jedną z najczęstszych wad rozwojowych czaszki u ludzi. Gdy występuje rozszczep, konieczna jest naprawa chirurgiczna w celu zamknięcia ubytku i umożliwienia prawidłowego rozwoju mowy, zwłóknienia i wadliwej regeneracji mięśni, jednak może utrudnić funkcjonalną regenerację mięśni podniebienia miękkiego. Po naprawie rozszczepu podniebienia można zademonstrować innowacyjną metodę hodowli świeżo wyizolowanych komórek satelitarnych przy użyciu powłok żelowych egzomacierzy komórkowej o wielkości zaledwie milimetra.
Pozwala to uniknąć konieczności rozbudowy. Na dzień przed izolacją umieścić osiem komór studzienkowych w 100-milimetrowej szalce Petriego i przenieść szalkę na zimną powierzchnię. Po 10 minutach użyj wstępnie napełnionej mikropipety, aby dozować pojedynczą 10 mikrolitrową kroplę żelu do macierzy zewnątrzkomórkowej do każdej studzienki.
Po schłodzeniu szkiełek przez kolejne siedem minut, całkowicie usuń pozostały żel i wysusz studzienki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc następnego dnia. Aby wypreparować mięsień masakry, usuń skórę z głowy dziewięciotygodniowego szczura i użyj igieł podskórnych, aby przymocować głowę do boku. Na silikonowej podkładce odizoluj śliniankę przyuszną i nerw twarzowy oraz usuń gruczoł.
Następnie, za pomocą ostrza skalpela numer 15, ostrożnie usuń nerw twarzowy. Zidentyfikuj powierzchowną głowę mięśnia żwacza. Następnie za pomocą prostych kleszczy oddzielić ścięgno od jego pochodzenia w procesie jarzmowym, a następnie ostrożnie przeciąć ścięgno nożyczkami preparacyjnymi.
Za pomocą skalpela rozetnij powierzchowną głowę masakry, aż do jej włożenia pod kątem i dolną połową bocznej powierzchni ramusa żuchwy. Aby wypreparować tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego, przymocuj głowę w pozycji leżącej na plecach za pomocą igieł i usuń podskórny tłuszcz pokrywający gruczoły podjęzykowe i podżuchwowe. Odsłoń przednie i tylne brzuchy mięśni żołądka, a następnie przytrzymaj przednie ścięgno tylnego brzucha za pomocą prostych kleszczy wciętych, ostrożnie wypreparuj ścięgno do jego początku w błonie bębenkowej.
Aby wypreparować mięsień podniebienny lewady vli, zlokalizuj mięsień haloidalny rylcowa. Pociągnij go na bok i ostrożnie usuń tkankę mięśniową. Następnie zlokalizuj ścięgno lewady vli palatino, które wstawia się do bębenka bębenkowego i dokładnie je wypreparuj.
Następnie podnieś przełyk zza tchawicy. Zidentyfikuj obszar podniebienia miękkiego, w którym wkłada się podniebienie levada vli i odetnij mięsień. Następnie zanurz mięsień w 70% etanolu i przenieś go do lodowatego PBS uzupełnionego antybiotykami.
Aby wyizolować komórki satelitarne, przenieś każdy mięsień do indywidualnych dołków płytki sześciodołkowej i pokrój tkanki na małe dwumilimetrowe kawałki. Uważając, aby nie rozdrabniać zbytnio mięśni. Następnie ostrożnie inkubuj fragmenty tkanek w 2,5 mililitra 0,1% roztworu pronazy na dołek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut, delikatnie wstrząsając co 20 minut.
Kiedy wiązki włókien wykazują rozluźniony wygląd po 2,5 mililitra DMEM uzupełnionym surowicą końską i antybiotykami do każdej studzienki i przenieś strawione tkanki do indywidualnych 15-mililitrowych stożkowych probówek. Odwirować zawiesiny tkanek i zdekantować supernatanty. Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki do każdej probówki i homogenizuj tkankę za pomocą 10-mililitrowej plastikowej pipety.
Ponownie odwiruj tkanki i przenieś supernatanty do nowych 15-mililitrowych stożkowych probówek. Następnie dodaj pięć dodatkowych mililitrów pożywki do probówek i ponownie trzykrotnie oceń kawałki tkanki, aż fragmenty łatwo przejdą przez pipetę. Po kolejnym odwirowaniu wciągnąć supernatanty do odpowiednich probówek i przefiltrować zawiesiny komórek przez sitka o wielkości 40 mikrometrów do pojedynczych probówek o pojemności 50 mililitrów.
Umyj sitka jednym mililitrem DMEM, aby uzyskać maksymalny odzysk komórek. Następnie odwiruj komórki, ponownie zawieś granulki w świeżym, pożywce i policz komórki, aby wyhodować izolowane komórki satelitarne. Następnie rozcieńczyć zawiesiny komórkowe do 1,5 razy 10 do trzech komórek na 10 mikrolitrów pożywki hodowlanej.
Następnie dodaj 10 mikrolitrów komórek na każdą wcześniej przygotowaną plamkę żelu macierzy zewnątrzkomórkowej i inkubuj żele w temperaturze 37 stopni Celsjusza po sześciu godzinach. Ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego miejsca żelu i włóż szkiełka z powrotem do inkubatora. Po trzech dniach natychmiast po izolacji zainicjuj różnicowanie komórek poprzez dodanie odpowiedniej pożywki hodowlanej.
Ponad 90% świeżo wyizolowanych komórek satelitarnych wykazuje ekspresję pakietu siódmego Czwartego dnia pakiet siódmy i MyoD są wyrażane przez komórki satelitarne ze wszystkich grup mięśniowych. Mój OG jest wysoko wyrażony w siódmym dniu we wszystkich grupach mięśniowych. Cztery dni po wysianiu na macierz zewnątrzkomórkową, plamki żelowe, proliferujące komórki zaczynają się łączyć i tworzyć małe wielojądrowe rurki mio, które wyrażają ciężki łańcuch miozyny w siódmym i dziesiątym dniu.
Długie i dobrze zorganizowane rurki myo są widoczne do 10 dnia. Można również zaobserwować drganie rurki mięśniowej. Protokół ten pozwala na badanie komórek satelitarnych pochodzących z mięśni głowy Brer i oferuje nowe możliwości leczenia rozszczepu skóry. Pacjentów.
Przegląd
Ten protokół opisuje izolację i hodowlę komórek satelitarnych z mięśni głowy pochodzących z wyrostków skrzelowców 9-tygodkowej szczury. Metoda ta pozwala na badanie miogenezy bez konieczności ekspansji i przesadzania komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Odnowa mięśni
Tło
- Komórki satelitarne są kluczowe dla regeneracji mięśni.
- Śluz i rozszczep podniebienia to powszechne wady wrodzone twarzoczaszki.
- Rozumienie zachowania komórek satelitarnych może pomóc w opracowaniu terapii tych stanów.
- Badanie koncentruje się na mięśniach z różnych łuków skrzelowców.
Cel badania
- Izolacja komórek satelitarnych z określonych mięśni głowy.
- Hodowla tych komórek na żelach z macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Śledzenie różnicowania miogennego za pomocą specyficznych markerów mięśniowych.
Stosowane metody
- Dysekcja mięśni głowy pochodzących z wyrostków skrzelowców u szczura.
- Trawienie enzymatyczne w celu izolację komórek satelitarnych.
- Hodowla komórek na milimetrowych plamkach żelu macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Śledzenie różnicowania poprzez barwienie markerami mięśniowymi.
Główne wyniki
- Ponad 90% izolowanych komórek satelitarnych ekspresuje Pax7 w ciągu czterech dni.
- Myogenina jest wysoce ekspresowana w ciągu siedmiu dni we wszystkich grupach mięśniowych.
- Wielojądrzaste miotubi tworzą się w ciągu dziesięciu dni, co wskazuje na pomyślne różnicowanie.
- Obserwuje się drżenie miotubów, co pokazuje funkcjonalne dojrzewanie.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę badania komórek satelitarnych.
- Oferuje wgląd w mechanizmy regeneracji mięśni.
- Wyniki mogą przyczynić się do opracowania strategii terapeutycznych dla pacjentów z rozszczepem podniebienia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles enables precise modeling of muscle regeneration relevant to craniofacial disorders. This system supports predictive evaluation of regenerative strategies and informs early-stage therapeutic development for tissue engineering applications. The approach enhances translational continuity for muscle repair interventions in complex anatomical contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of myogenic pathways in disease-relevant craniofacial muscle systems.
- Supports biological de-risking by isolating primary satellite cells from distinct muscle origins.
- Facilitates functional target validation for regenerative medicine approaches.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vitro platform for quantitative assessment of myogenic differentiation.
- Standardizes assay conditions using millimeter-scale extracellular matrix gel spots.
- Enables reproducible evaluation of candidate compounds or biomaterials on muscle stem cell function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for cleft palate and craniofacial muscle regeneration.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of tissue engineering strategies.
- Enables risk-adjusted advancement of regenerative therapies targeting muscle repair.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the early discovery and preclinical validation continuum for muscle regeneration therapies, bridging target validation and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on satellite cell behavior and myogenic differentiation in head muscles.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound or biomaterial evaluation.
- Analytics: Provides marker-based readouts (Pax7, MyoD, myogenin) for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical models of craniofacial muscle repair.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse muscle regeneration studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in regenerative target selection and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of muscle stem cell assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for early-stage regenerative programs and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of muscle regeneration assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary muscle dissection and cell isolation techniques.
- Needs access to specialized cell culture and imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and marker analysis.
- Adaptation may be needed for other muscle types or species.
- Limited by the availability of primary tissue and scalability for high-throughput applications.
