Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie systemu oceny fizjologicznej inicjacji odporności nabytej specyficznej dla szczepionki. Osiąga się to najpierw, wykorzystując genetykę odwrotną do wytworzenia żywych, atenuowanych szczepionek przeciw grypie zawierających specyficzny peptyd immunogenny, a następnie używając zarodka kurcząt do namnażania wirusa. Następnie komórki są pobierane z węzłów chłonnych zaszczepionych myszy, a analiza faksowa służy do śledzenia migracji komórek dendrytycznych.

W następnym teście osiem dodatnich limfocytów T CD reagujących na peptyd immunogenny jest znakowanych i wstrzykiwanych szczepionym myszom, a następnie następuje analiza faksowa w celu zmierzenia proliferacji tych komórek w celu bardziej szczegółowej analizy odpowiedzi immunologicznej. Konkurencyjne lustro dzwonka szpiku kostnego jest wytwarzane przez wstrzyknięcie receptora toksyny błonicy wyrażającego komórki szpiku kostnego do napromieniowanych myszy kongenicznych, które są następnie wystawione na działanie toksyny błonicy. Po pomyślnym wyczerpaniu mysz jest szczepiona i znakowane przeciwciała i tetramery są używane do identyfikacji limfocytów T CD osiem dodatnich.

Rozpoznawanie specyficznego peptydu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wakcynologii, takie jak to, jak działa szczepionka na poziomie neurologicznym, które są głównymi celami komórkowymi i molekularnymi szczepionki, a co najważniejsze, jak możemy ulepszyć obecne strategie profilaktyczne. Procedurę zademonstruje Sanmen Medina.

Nasz kierownik laboratorium i ja W tym protokole generujemy szczepionkę przeciw grypie przystosowaną do zimna przy użyciu szczepu przystosowanego do zimna. A Ann Arbor sześć 60. Jako tło sprzężone z hemaglutyniną i zmodyfikowaną neuraminidazą szczepu A PR 8 34.

Część sekwencji łodygi białka genu neuraminidazy jest zastępowana krótką sekwencją CDNA kodującą peptyd kurczaka syn kału. Peptyd ten jest wysoce immunodominujący w klasie H 2 BMHC. Jedna ograniczona odpowiedź C 57 czarnych myszy i działa jako element identyfikowalny.

Aby rozpocząć płytkę 1 000 002 93 limfocyty T w każdym dołku sześciodołkowej płytki z DMEM zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% paciorkowca pióra. Następnie przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny transfekcji plazmidu na 100 mikrolitrów na studzienkę. Połącz mikrogram każdego plazmidu i napełnij probówkę wstępnie ciepłym podłożem komórkowym opti MEM do 50 mikrolitrów w innej probówce.

Dodać dwukrotność objętości lipektomii 2000 odpowiadającej całkowitej ilości plazmidu do transfekcji i uzupełnić probówkę do 50 mikrolitrów za pomocą opti MEM przed dodaniem mieszanki transfekcyjnej do komórek. Pozostaw na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki i przenieś płytkę do inkubatora na 16 godzin.

Następnego dnia zmień pożywkę na DMEM z 0,3% BSA i 1% paciorkowcem. Następnie przenieś komórki do 33 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na pięć godzin. Po pięciu godzinach.

Dodaj nakładkę miliona komórek MDCK permisywnych na grypę w DMEM uzupełnionym trypiną. Utrzymuj kultury co przez dwa do trzech dni w reżimie inkubacji 33 stopni Celsjusza, aby wytworzyć i wzmocnić wirusa Później usuń zanieczyszczenia za pomocą pięciominutowego wirowania 260 G. Następnie zebrać supernatanty, zaszczepić dziewięcio- do 10-dniowe jaja zarodkowe kur w sterylnych warunkach.

W tym celu należy zrobić otwór w górnej części skorupki jaja i dodać wirusa w rozcieńczeniu 100 x 10 x lub 1 x. Przykryj skorupkę jajka roztopionym woskiem za pomocą bawełnianego wacika i inkubuj zaszczepione jaja kurze przez trzy dni w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Później zbierz płyn Alan Toic z zainfekowanych jaj.

Umyj skorupki jaj 70% etanolem. Otwórz jajko z bardzo delikatnym pęknięciem w górnej części i usuń błonę Alan Toic za pomocą sterylnych kleszczyków. Użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby zebrać jak najwięcej płynu.

Zwykle od sześciu do 10 mililitrów. Odwirować płyn o masie 260 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść oczyszczony płyn Alan Toic do nowych probówek. Po znieczuleniu myszy dawcy i chirurgicznym dostępie do śródpiersia, pobierz węzły chłonne za pomocą zakrzywionych kleszczy.

Przenieś węzły chłonne na sześciodołkową płytkę zawierającą mililitr DMEM. Po usunięciu tkanki łącznej lub tłuszczowej otaczającej węzeł chłonny, zabezpiecz węzeł chłonny jedną igłą i rozbij go drugą igłą. Powinno to spowodować wydostanie się komórek z węzła chłonnego do pożywki w celu zebrania komórek.

Najpierw przepuść cały materiał tkankowy przez nylonowy filtr o grubości 70 mikronów, aby uzyskać zawiesinę komórek gotową do odwirowania. Ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach buforu RBC Lysing. Pozwól, aby reakcja lizy trwała trzy minuty w temperaturze pokojowej i zakończ ją dwumililitrowym dodatkiem lodowatego PBS, przystąp do barwienia komórek zgodnie z protokołem tekstowym.

Pamiętaj, aby użyć trzepania płytki, aby usunąć i wyrzucić super nazwany przed inkubacją przeciwciała. Znakowane limfocyty T dawcy od dostępnych na rynku myszy transgenicznych TCR inkubują 5 milionów komórek w jednym mililitrze PBS z pięcioma mikromolowymi CFSE. Pozwól inkubacji trwać przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności.

Następnie zbierz komórki w ilości 2 milionów na 100 mikrolitrów PBS i wstrzyknij myszom kongenicznym biorcy 100 mikrolitrów bolusa poprzez wstrzyknięcie do zatoki zaoczodołowej. Po trzech do pięciu dniach należy poddać myszy eutanazji, pobrać węzły chłonne śródpiersia i przygotować zawiesinę pojedynczej komórki do cytometrii przepływowej. Tak jak poprzednio.

Następnie zidentyfikuj komórki dawcy, barwiąc zawiesiny pojedynczych komórek w koktajlu przeciwciał. Do analizy. Pozostawić jeden kanał FL cytometru przepływowego otwarty, aby określić profil rozcieńczenia CFSE.

Po usunięciu i odkażeniu kości piszczelowych i udowych myszy poddanej eutanazji, zbierz je w naczyniu z DMEM. Odetnij końce kości ostrymi nożyczkami i przepłucz szpik kostny do DMEM. Teraz, stosując standardowe metody, napromieniuj sześcio- do ośmiotygodniowych samic myszy za pomocą promiennika źródła cezu 1 37 dwie do czterech godzin po napromieniowaniu myszy, znieczulij myszy i przeszczep im komórki szpiku kostnego dawcy poprzez wstrzyknięcie do zatoki zaoczodołowej 2 milionów komórek w 100 mikrolitrach PBS Przez następne dwa tygodnie, Podawaj myszom od 2,5 do pięciu miligramów Baala na kilogram w ich wodzie pitnej.

Zaczynając dwa dni przed szczepieniem, podawaj 50 nanogramów DT rozcieńczonych w 50 mikrolitrach PBS kropla po kropli bezpośrednio do nozdrzy znieczulonych myszy. Leczenie należy kontynuować przez trzy dni po szczepieniu. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat generowania końcowego modelu myszy.

Zaszczep myszy rekombinowaną żywym atenuowanym grypą za pomocą wstrzyknięcia donosowego w znieczuleniu. Dostarczenie 1000 PFU szczepionki z pipety o pojemności 200 mikrolitrów w 50 mikrolitrach PBS Generacja rekombinowanych, żywych, atenuowanych szczepionek przeciw grypie może być osiągnięta przez transfekcję plazmidów kodujących osiem segmentów wirusa grypy pod kontrolą dwukierunkowych promotorów. Szczepionka przeciw grypie przystosowana do przeziębienia zwykle zawiera sześć segmentów szczepu przystosowanego do zimna, a także kwas hialuronowy i północno-czerwony wybranego szczepu grypy, np. H, jeden N.

Adaptacja na zimno pozwala na ograniczoną replikację wirusa w temperaturze 33 stopni Celsjusza, temperaturze górnych dróg oddechowych u myszy i ludzi, ale nie pozwala na replikację w dolnych drogach oddechowych, więc nie może powodować fuzji zapalenia płuc. PCR zastosowano w celu zastąpienia konserwatywnego regionu w łodydze wirusowej neuraminidazy identyfikowalnym peptydem pochodzącym z OVA. Identyfikowalny model peptydowy został zaszczepiony myszom między trzema a sześcioma dniami po szczepieniu.

Identyfikowalne białko syn kał wykryto w węzłach chłonnych drenujących płuca. Wieloparametryczną cytometrię przepływową wykorzystano do ilościowego określenia prezentacji antygenu pochodzącego ze szczepionki w czasie rzeczywistym. Podobnie, infuzja limfocytów T specyficznych dla kału syn pozwoliła na ilościowe określenie specyficznych dla szczepionki odpowiedzi limfocytów T CD 8 w celu oceny funkcji specyficznych dla genu podczas szczepienia.

Wykorzystano model mysi łączący technologię DTR i konkurencyjną kyirę szpiku kostnego. W związku z tym utrata funkcji genów była ukierunkowana na określone przedziały komórkowe w trakcie odpowiedzi immunologicznej na szczepienie. Po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobre zrozumienie, jak analizować szlaki molekularne i fizjologiczne zaangażowane w modulację odporności indukowanej szczepionką u gospodarza.

Ponadto technika ta dostarczy nowych informacji na temat docelowych komórek szczepionki, co przyczyni się do dalszej wyceny nowych platform szczepionkowych.