Name: Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj technikę inżynierii 3D żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej z użyciem komórek mięśni gładkich i śródbłonka. Metoda umożliwia szybkie tworzenie konstruktów o docelowych właściwościach mechanicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Kanadyjską Radę Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią, Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem oraz Centrum Badawcze CHU de Québec.

1. Produkcja i montaż bioreaktora statycznego
<ol>
	<li>Wykonanie zbiornika
	<ol>
		<li>Przygotować probówki wirówkowe o pojemności 50 ml jako zbiornik pożywki hodowlanej dla bioreaktora.</li>
		<li>Wykonaj dwa porty, wiercąc dwa otwory o średnicy 5 mm odpowiednio w odległości 20 mm od dołu i od góry zbiornika. Następnie włóż dwie złączki typu luer w silikonowe rurki o długości 5 mm. Wciśnij te złączki luer przez otwory i uszczelnij wszystkie połączenia klejem silikonowym klasy medycznej.</li>
		<li>Włóż filtr 0,22 μm do górnego portu zbiornika (Rysunek 1A).</li>
		<li>Włóż przegrodę typu luer do dolnego portu zbiornika (Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zespół trzpienia i nasadki
	<ol>
		<li>Wywierć otwór o średnicy 4.5 mm pośrodku wentylowanej nasadki rurki zbiornika, nie uszkadzając membrany filtra, która zakrywa otwory napowietrzające.</li>
		<li>Przygotuj mieszadło (średnica = 4,5 mm, długość = 100 mm) jako trzpień do konstrukcji.</li>
		<li>Przygotuj dwa silikonowe korki stożkowe (długość = 10 mm, średnica środkowego otworu = 4,5 mm).</li>
		<li>Zamontuj trzpień i nasadkę (kompleks trzpień-nasadka) zgodnie z opisem na rysunku 1B.
		<ol>
			<li>Wciśnij trzpień w otwór. Włóż 2 korki na trzpień tak, aby nasadka była między nimi. Dostosuj położenie trzpienia tak, aby jego użyteczna długość wynosiła 78 mm.</li>
			<li>Nałóż podkład, a następnie klej silikonowy klasy medycznej na powierzchnie, które będą się stykać, przed połączeniem ze sobą nasadki i silikonowych stożkowych korków. Usuń nadmiar kleju z nasadki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 1-3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja uchwytów z gazy
	<ol>
		<li>Przygotuj 3 rurki silikonowe (rurka 1: średnica wewnętrzna = 6,4 mm, długość = 5 mm; rurka 2: średnica = 6,4 mm, długość = 10 mm i rurka 3: średnica = 3,1 mm, długość = 12 mm).</li>
		<li>Zamontuj uchwyty gazy zgodnie z opisem na rysunku 1C.
		<ol>
			<li>Przeciąć rurkę 1 wzdłuż i otworzyć ją nad rurą 2. Sklej je ze sobą za pomocą kleju silikonowego.</li>
			<li>Przytnij sterylną gazę chirurgiczną na arkusz o wymiarach 5 cm x 7 cm, a następnie szczelnie zwiń gazę na rurkę 3 wzdłuż najdłuższego boku gazy. Włóż rurkę 1-rurkę 2 kompleks na gazę.</li>
			<li>Dodaj klej silikonowy, aby skleić gazę, tubę 1-tubkę 2 kompleks i tubkę 3. Przyciąć gazę na długość 8 mm.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż i sterylizacja
	<ol>
		<li>Zamontuj kompleks trzpienia-nasadki i uchwyty gazy, jak opisano na rysunku 2.
		<ol>
			<li>Pokryj trzpień smarem klasy medycznej (Rysunek 2A). Umieść uchwyty z gazy na trzpieniu (Rysunek 2B). Odsuń od siebie uchwyty o ustalonej wartości 35 mm.</li>
			<li>Przygotuj formę rurkową, wyjmując dolną część strzykawki o pojemności 10 ml za pomocą piły stołowej (długość końcowa = 8 mm) (Rysunek 2B).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Włóż formę na zespół trzpienia-nasadki wyposażony w uchwyty z gazy (kompleks obudowy-formy), zatrzaskując formę na silikonowym korku (Rysunek 2C).</li>
		<li>Autoklaw zbiornika i kompleksu obudowy-formy. 
		Uwaga: Uważaj, aby mocno trzymać silikonowy korek podczas wkładania formy, aby uniknąć jej oderwania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inżynieria konstruktów na bazie żelu kolagenowego z komórek mięśni gładkich i dojrzewanie statyczne
<ol>
	<li>Konstrukty inżynierskie
	<ol>
		<li>Rozszerz komórki mięśni gładkich aorty świń (pSMC) w175 cm 2 kolbach hodowlanych wypełnionych 20 ml kompletnej pożywki hodowlanej składającej się ze zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco uzupełnionego 10% (v/v) surowicy wieprzowej (PS), 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (pen-strep).</li>
		<li>Przy ≈90% zbiegu odłączyć pSMC (przejście 2-4), wyjmując pożywkę hodowlaną z kolby pSMC, dodając 5 ml roztworu trypsyny (1x w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej, PBS) i inkubując przez 10 minut (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności).</li>
		<li>Zawiesić pSMC w stężeniu 4 x 106 komórek/ml w kompletnej pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Przygotuj roztwór kolagenu zgodnie z wcześniejszym opisem10.
		<ol>
			<li>Ekstrahuj i zbieraj wiązki kolagenu ze ścięgien ogona szczura w roztworze PBS.</li>
			<li>Następnie przenieść włókna kolagenowe do roztworów acetonu (5 min), izopropanolu 70% (v/v) (5 min) i kwasu octowego (0,02 N, 48 godz., 4 °C).</li>
			<li>Zmiksować lepki roztwór i zamrażać w temperaturze -20 °C przez 3 dni.</li>
			<li>Liofilizuj zamrożony roztwór, aby uzyskać gąbki kolagenowe.</li>
			<li>Rozpuścić gąbki kolagenowe w roztworze kwasu octowego (0,02 N) o stężeniu 4 g/l i wirować z siłą 29,581 g przez 45 minut.</li>
			<li>Sterylizuj roztwór kolagenu w procesie dializy z kolejnymi roztworami kwasu octowego (0,02 N, 1 godz.), chloroformu 1% (v/v, 1 godz.) i kwasu octowego (0,02 N, sterylny roztwór zmieniany co 2 dni przez 1 tydzień).</li>
			<li>Zebrać sterylny roztwór kolagenu (4 g/l) w sterylnym kapturze do hodowli komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj komórkowe żele kolagenowe, jak pokazano na rysunku 3.
		<ol>
			<li>Przygotować 50 ml sterylnego roztworu buforowego, mieszając 35 ml DMEM (5x), 4 ml HEPES (1 N), 3 ml NaOH (1 N) w 8 ml sterylnej wody dejonizowanej.</li>
			<li>Przygotować mieszaninę komórek i żelu kolagenowego w pojemniku umieszczonym w lodzie, mieszając 50% (v/v) sterylnego roztworu kolagenu (4 g/l kwasu octowego 0,02 N) z 25% (v/v) roztworu buforowego i 25% (v/v) zawiesiny pSMC w kompletnej pożywce hodowlanej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierzyć pH mieszaniny i upewnić się, że wynosi od 7,0 do 7,4.</li>
		<li>Wlać delikatnie 9 ml mieszaniny komórek i kolagenu do wyżej wymienionego kompleksu obudowy/pleśni (krok 1.4.3, rysunek 3A-B).</li>
		<li>Pozostaw do zżelowania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę pod kapturem hodowli komórkowej (ryc. 3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dojrzewanie w bioreaktorze statycznym
	<ol>
		<li>Usuń pleśń (Rysunek 3C) i ostrożnie przenieś konstrukt do zbiornika zawierającego 35 ml pożywki hodowlanej (Rysunek 3D).</li>
		<li>Inkubować konstrukt (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) w pozycji pionowej przez 1 lub 2 tygodnie dojrzewania statycznego.</li>
		<li>Zainstaluj kamerę internetową (uszczelnioną w celu zapewnienia izolacji) wewnątrz inkubatora przed konstrukcją.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni, odsysając starą pożywkę z portu przegrody typu luer i ponownie napełniając zbiornik równoważną ilością świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar grubości i aktywności metabolicznej konstruktów na bazie żelu SMCs-kolagen podczas hodowli statycznej
	<ol>
		<li>Umieść skanujący interferometr laserowy w kapturze do hodowli komórkowej i obróć go z pozycji pionowej do poziomej za pomocą poziomicy.</li>
		<li>Przenieś bioreaktor do okapu do hodowli komórkowej i wyjmij konstrukt ze zbiornika.</li>
		<li>Przenieś konstrukcję (nadal zamontowaną na trzpieniu) na ścieżkę wiązki laserowej i umieść ją ściśle prostopadle w stosunku do osi wiązki (jak pokazano na rysunku 4).</li>
		<li>Odczytaj wartość wyświetlaną na ekranie skanującego interferometru laserowego, odpowiadającą średnicy zewnętrznej konstrukcji.</li>
		<li>Oblicz grubość ścianki konstrukcji na podstawie jej średnicy zewnętrznej i wewnętrznej (tj. średnicy trzpienia). 
		Uwaga: Kroki od 2.3.1 do 2.3.5 należy powtarzać co godzinę przez pierwsze 12 godzin, a następnie co 24 godziny.</li>
		<li>Użyć 1 ml starej pożywki hodowlanej (próbka pobrana podczas zmiany pożywki, krok 2.2.4) do pomiaru stężenia mleczanu i glukozy za pomocą analizatora gazometrii.</li>
		<li>Użyć 1 ml świeżej pożywki hodowlanej jako poziomu wyjściowego dla pomiarów stężenia glukozy i mleczanu14, 
		Uwaga: Kroki 2.3.6 i 2.3.7 powtarzać co 2 dni po zmianie pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstruowanie zbiorów w celu dalszych charakterystyk mechanicznych i biologicznych
	<ol>
		<li>Po 1 lub 2 tygodniach okresu dojrzewania statycznego przenieś bioreaktor statyczny do okapu do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Delikatnie przenieść dojrzały konstrukt z trzpienia (Dodatkowy film 1) na szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą 40 ml świeżej pożywki hodowlanej (Rysunek 5 i Rysunek 7A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka mechaniczna konstrukcji w kierunku podłużnym i obwodowym
<ol>
	<li>Zainstalować zestaw doświadczalny składający się z testera mikromechanicznego wyposażonego w ogniwo obciążnikowe o natężeniu 5 lub 10 N i kąpieli zawierającej PBS w temperaturze 37 °C, aby utrzymać próbki w warunkach pseudofizjologicznych (rysunek 6).</li>
	<li>Zrównoważyć ogniwo obciążnikowe i ekstensometr. 
	Uwaga: Wyważanie to funkcja zintegrowana z testerem mikromechanicznym, polegająca na resetowaniu wyświetlanej wartości wysuwu i wyświetlanej wartości obciążenia, gdy na maszynie nie jest zamontowana żadna próbka. Funkcja ta umożliwia zdefiniowanie odniesienia dla obu pomiarów.</li>
	<li>Montaż konstrukcji rurowych na aparacie mechanicznym: kierunek wzdłużny. 
	Uwaga: Wzdłużne testy zmęczeniowe należy wykonywać bezpośrednio na całych konstrukcjach rurowych. Użyj własnych urządzeń chwytających, aby połączyć uchwyty z gazy konstrukcji z ogniwem obciążnikowym i z podstawą wanny PBS.
	<ol>
		<li>Zamontować konstrukcję rurową na urządzeniach chwytających (rysunek 7B), postępując zgodnie z procedurą zbioru (sekcja 2.4).</li>
		<li>Owiń urządzenia chwytające i uchwyty z gazy taśmą teflonową, aby zapobiec ślizganiu się uchwytów z gazy podczas testu. Zamontuj próbkę na testerze mikromechanicznym (rysunek 7C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż konstrukcji pierścieniowych na aparacie mechanicznym: kierunek obwodowy. 
	Uwaga: Przeprowadzić obwodowe testy zmęczeniowe na próbkach w kształcie pierścienia wyciętych z konstrukcji rurowych. Użyj dwóch prętów ze stali nierdzewnej jako uchwytów do przytrzymania próbek.
	<ol>
		<li>Zamontuj konstrukcję rurową na rurze z tworzywa sztucznego jako wspornik oznaczony szczelinami 5 mm (Rysunek 7B), po zbiorze (sekcja 2.4).</li>
		<li>Wytnij pierścienie 10 mm z konstrukcji rurowej.</li>
		<li>Zmierzyć długość próbki za pomocą suwmiarki z noniuszem w celu przeprowadzenia dalszych analiz.</li>
		<li>Zamontuj próbkę w kształcie pierścienia na prętach ze stali nierdzewnej testera mikromechanicznego (Rysunek 7C). Upewnij się, że próbka jest umieszczona na środku prętów. 
		Uwaga: Plastikowa rura w kroku 3.4.1 i system cięcia, jak pokazano na rysunku 7B, służą do uniknięcia uszkodzenia konstrukcji podczas cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próba zmęczeniowa na konstrukcjach w kierunku wzdłużnym lub obwodowym.
	<ol>
		<li>Rozciągnij konstrukcję do początkowej długości skrajni.</li>
		<li>Utrzymuj konstrukt w tej pozycji przez 10 minut w pseudofizjologicznym środowisku.</li>
		<li>Zastosuj 10% cykliczne odkształcenie początkowej długości miernika (30 cykli) do konstrukcji z szybkością odkształcenia 5%/s.</li>
		<li>Powtórzyć krok 3.5.3 w krokach przyrostowych 10% odkształcenia cyklicznego, aż do uszkodzenia próbki. 
		Uwaga: Zastosowanie środowiska pseudofizjologicznego wymaga uwzględnienia wyporu i bezwładności układu chwytającego, które mają wpływ na pomiar przyłożonego obciążenia.</li>
		<li>Nagraj tło w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Przesuń ramę ładunkową do początkowej długości skrajni.</li>
			<li>Powtórzyć kroki 3.5.3 i 3.5.4 bez zamontowanej próbki i utrzymując urządzenia chwytające podłączone do ogniwa obciążnikowego (wymagany jest tylko 1 cykl).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Śródbłonek luminalny konstruktów
Uwaga: Po przestrzeganiu protokołu zbioru (sekcja 2.4), konstrukcje wytrzymują przenoszenie w celu zamontowania w bioreaktorze o obrotowych ściankach w celu dalszej endotelializacji.
<ol>
	<li>Konstrukcja bioreaktora o obrotowych ściankach
	<ol>
		<li>Wywierć otwór o średnicy 4.5 mm pośrodku wentylowanej nasadki rurki zbiornika, nie uszkadzając membrany filtra, która zakrywa otwory napowietrzające.</li>
		<li>Wcisnąć trzpień (średnica = 4,5 mm, długość = 40 mm) w otwór i zamocować trzpień zgodnie z opisem w kroku 1.1.2.</li>
		<li>Przygotuj dwie silikonowe podpory w kształcie litery C dla konstrukcji średnica zewnętrzna = 14 mm; średnica wewnętrzna = 8 mm).</li>
		<li>Umieść obracający się silnik na jednym końcu bioreaktora o obrotowych ściankach, a łożysko na drugim końcu (Rysunek 8B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śródbłonek światła
	<ol>
		<li>Namnażać ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w kolbach hodowlanych o długości 25 cm2 z 5 ml pożywki hodowlanej M199 uzupełnionej 10% (v/v) PS, 10% (v/v) FBS, 1% (v/v) pen-strep na płytce Petriego w inkubatorze (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) aż do 90% konfluencji.</li>
		<li>Przygotować 1,5 ml roztworu do powlekania białek na konstrukt wymagany dla optymalnej adhezji komórek, rozcieńczając mieszaninę koncentratu białkowego do 10,5 ng/ml w pożywce do hodowli komórek śródbłonka bez surowicy.</li>
		<li>Zmierz długość konstrukcji za pomocą suwmiarki z noniuszem.</li>
		<li>Oblicz objętość światła V i obszar świetlny A konstrukcji jako: V = Dw2 L/4 i A = Dw L odpowiednio (gdzie Din jest średnicą wewnętrzną odpowiadającą średnicy trzpienia, a L jest długością konstrukcji).</li>
		<li>Umieścić konstrukcję na środku zbiornika zgodnie z procedurą zbioru (sekcja 2.4). Użyj silikonowego wspornika w kształcie litery C, aby przymocować konstrukcję na obu końcach do zbiornika (Rysunek 8A).</li>
		<li>Napełnij zbiornik 35 ml pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Wypełnić 75% obliczonej objętości światła konstruktu (V) roztworem białkowym przygotowanym w kroku 4.2.2. Zamknij oba końce konstruktu, aby uniknąć wycieku roztworu powlekającego białko (ryc. 8A).</li>
		<li>Zamontuj system bioreaktora o obrotowych ściankach wewnątrz okapu do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Umieścić bioreaktor w inkubatorze o temperaturze 37 °C i rozpocząć obrót bioreaktora z siłą 4,02 x 10-5 g przez 1 godzinę, aby umożliwić powłokę luminalną, jak pokazano na rysunku 8B.</li>
		<li>Otwórz górną kończynę konstruktu i odessaj roztwór powłoki białkowej ze światła.</li>
		<li>Odłączyć HUVEC (przejście 2-3), wyjmując pożywkę hodowlaną z kolby HUVEC i dodając 3 ml roztworu trypsyny (1x w PBS). Inkubować przez 5 minut (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności).</li>
		<li>Zawiesić HUVEC w stężeniu 4 x 106 komórek/ml w pożywce z dodatkiem M199.</li>
		<li>Wewnątrz kaptura do hodowli komórkowej HUVEC wysiewa nasiona do światła konstruktu o gęstości 1,000 komórek/cm2 15. Zamknij górne końce konstrukcji, aby uniknąć wycieku roztworu HUVEC.</li>
		<li>Inkubować konstrukty (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) umieszczone w bioreaktorze o obrotowych ściankach (rysunek 8B) i hodować przez 2 dni przy stałym obrocie o sile 4,02 x 10-5 g.</li>
		<li>Po 2 dniach hodowli w sterylnych warunkach zebrać konstrukt i przygotować go do dalszej charakterystyki biologicznej, jak opisano w sekcji 2.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+smooth+muscle+tissues%3A+regulating+cell+phenotype+with+the+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold.</a> Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).</li>
<li>Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).</li>
<li>Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+arterial+grafts+from+human+fibroblasts+and+fibrin+using+a+multi-graft+pulsed+flow-stretch+bioreactor+with+noninvasive+strength+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring.</a> Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).</li>
<li>Lee, C., Singla, A., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of collagen.</a> International journal of pharmaceutics. 221 (1-2), 1-22 (2001).</li>
<li>Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+biomaterials+for+scaffold-based+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+bioscience%22%5BJournal%5D)">Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering.</a> Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).</li>
<li>Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+type+I+collagen%3A+fusion+of+fibril+subunits+and+the+influence+of+fibril+diameter+on+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties.</a> Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).</li>
<li>Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+measurements+with+micro-devices%3A+mechanical+properties+of+hydrated+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface+%2F+the+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).</li>
<li>Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+of+collagen-fibrin+co-gels+reflects+transition+from+series+to+parallel+interactions+with+increasing+collagen+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content.</a> Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004(2012).</li>
<li>Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Matrix+Metalloproteinase-2+in+the+Remodeling+of+Cell-Seeded+Vascular+Constructs+Subjected+to+Cyclic+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain.</a> Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-Based+Substrates+with+Tunable+Strength+for+Soft+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+science%22%5BJournal%5D)">Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering.</a> Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).</li>
<li>Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+orchestrate+the+assembly+of+type+I+collagen+via+alpha2beta1+integrin%2C+RhoA%2C+and+fibronectin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization.</a> The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).</li>
<li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+characterisation+of+vascular+grafts+cultured+in+a+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor.</a> Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).</li>
<li>Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+%28HUVEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).</a> Current protocols in microbiology. 4, 4B(2007).</li>
<li>Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Small-diameter vascular tissue engineering.</a> Nature reviews. Cardiology. , (2013).</li>
<li>Weinberg, C., Bell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood+vessel+model+constructed+from+collagen+and+cultured+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells.</a> Science. 231 (4736), 397-400 (1986).</li>
<li>Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Mechanical+Properties+of+Collagen+Scaffolds+Should+Be+Tested+in+a+Pseudo-Physiological+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment.</a> Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).</li>
<li>Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboflavin+and+collagen%3A+New+crosslinking+methods+to+tailor+the+stiffness+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Letters%22%5BJournal%5D)">Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels.</a> Materials Letters. 74, 58-61 (2012).</li>
<li>Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+genipin+crosslinking+and+biomolecule+conditioning+in+collagen-based+biopolymer%3A+Potential+for+vascular+media+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).</li>
<li>Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+pseudophysiological+environment+on+the+elastic+and+viscoelastic+properties+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels.</a> International journal of biomaterials. 2012, 319290(2012).</li>
</ol>

Nie otrzymano żadnego finansowania od organizacji lub agencji, które mogą wystąpić w konflikcie interesów.

W środowisku inżynierów tkanek naczyniowych podjęto ogromne wysiłki, aby odtworzyć warstwę osłonki środkowej odpowiedzialną za stabilność mechaniczną naczyń krwionośnych16. Od czasu pionierskiej pracy Weinberga i Bella17, kolagen jest szeroko stosowany jako rusztowanie w inżynierii tkanki naczyniowej ze względu na jego biokompatybilność, właściwości nieimmunogenne i dostępność. Jednak zastosowanie kolagenu stanowi duże wyzwanie dla naukowców, ponieważ materiał ten nie jest łatwy w obsłudze ze względu na nieodłączny brak sztywności mechanicznej. Manipulacje podczas przygotowania rusztowania mogą uszkodzić rusztowania, narażając je na szwank do dalszego użytkowania.
Technika opisana w tej pracy pozwala: i) na inżynierię komórkowych żeli kolagenowych w geometrię w kształcie rurki; ii) inżynieria tkanek biologicznych wystarczająco mocnych, aby można było z nimi obchodzić się po krótkim okresie dojrzewania statycznego (1 lub 2 tygodnie); iii) ocena właściwości mechanicznych i lepkosprężystych takich rurkowatych tkanek biologicznych w 2 kierunkach. Komórki zawarte w żelu odgrywają kluczową rolę w przebudowie macierzy kolagenowej. W okresie dojrzewania kurczliwe SMC doprowadziły do zagęszczenia żeli, dając konstrukcję o wyższej stabilności mechanicznej, którą można było ocenić w kierunku wzdłużnym i obwodowym. Następnie, HUVEC umieszczone po stronie luminalnej konstruktów wytworzyły jednorodny i żywotny śródbłonek, demonstrując w ten sposób przydatność żeli kolagenowych do zastosowań w inżynierii tkanek naczyniowych.
Bioreaktor zaprezentowany w tej pracy został specjalnie zaprojektowany, aby zapewnić optymalne środowisko dla wzrostu komórek podczas dojrzewania statycznego. Ponadto urządzenia opracowane do charakteryzowania właściwości mechanicznych i lepkosprężystych konstrukcji zostały zaprojektowane w celu zmniejszenia wszelkich potencjalnych uszkodzeń związanych z manipulacją tak delikatnymi materiałami. W związku z tym bioreaktor statyczny został wyposażony w filtr 0,22 μm i membranę filtracyjną na nasadce (krok 1.1.2, rysunki 1A i B), które umożliwiały wymianę gazową między pożywką hodowlaną wewnątrz zbiornika a inkubatorem, przy jednoczesnym utrzymaniu sterylnego środowiska hodowli. Przegroda typu luer na dnie została wykorzystana jako port do pobierania próbek pożywki hodowlanej i zmiany podczas hodowli statycznej. Podczas produkcji konstrukcji i charakterystyki należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych etapów. Wszystkie manipulacje (wykonane w kroku 2.1.1 i w kolejnych krokach), które mogły zmienić sterylność systemu, zostały przeprowadzone w sterylnym kapturze biologicznym. Przygotowanie mieszaniny komórek i żelu kolagenowego przeprowadzono na lodzie w celu opóźnienia procesu żelowania (kroki 2.1.4 do 2.1.7). Na etapie 2.1.7 wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w mieszaninie przed żelowaniem są potencjalnymi obszarami koncentracji naprężeń, które mogą zagrozić stabilności konstrukcji. Dlatego usunięcie takich pęcherzyków powietrza wymaga lekkiego potrząśnięcia zespołem lub użycia podciśnienia medycznego przez 3 minuty w celu odgazowania w sterylnych warunkach. Wreszcie, uchwyty zostały specjalnie zaprojektowane do utrzymywania osi trzpienia centralnie w formie rurowej podczas żelowania oraz do umożliwienia delikatnej manipulacji konstruktami podczas zbioru (usunięcie trzpienia, sekcja 2.4), do śródbłonka oraz do ułatwienia montażu na układzie mechanicznym (testy wzdłużne).
Niniejszy protokół proponuje oryginalne, łatwe do opracowania alternatywne podejście do wzmacniania konstruktów żeli kolagenowych w oparciu o naturalny wrodzony potencjał kurczliwy SMC. Powszechne techniki wzmacniania matryc kolagenowych obejmują stosowanie fizycznych i chemicznych środków sieciujących, które mogą mieć szkodliwy wpływ na interakcje komórka-macierz18–20. Technika wytwarzania przedstawiona w tej pracy pozwala na kierowanie tym napędzanym komórkami procesem przebudowy w celu uzyskania konstruktu inżynierii tkankowej o ukierunkowanych właściwościach mechanicznych bez żadnej obróbki fizycznej lub chemicznej.
Scharakteryzowanie właściwości mechanicznych i lepkosprężystych uwodnionych żeli kolagenowych jest dużym wyzwaniem. W tym ujęciu niniejszy protokół opisuje oryginalną, prostą i skuteczną metodę oceny właściwości mechanicznych rurkowatych tkanek miękkich. Charakterystykę tę można przeprowadzić nie tylko w kierunku obwodowym, ale także w kierunku wzdłużnym, bezpośrednio na całej konstrukcji rurowej. Podczas charakterystyki mechanicznej, temperatura, środowisko wodne, pH i siła jonowa to tylko niektóre z czynników środowiskowych, o których wiadomo, że drastycznie wpływają na mechaniczne zachowanie tkanek biologicznych21. W związku z tym niniejsza praca sugeruje oryginalną konfigurację i protokół mechanicznej charakterystyki tkanek biologicznych w wysoce odtwarzalnym środowisku pseudofizjologicznym (roztwór soli w temperaturze 37 °C i pH 7,4). O ile nam wiadomo, tego rodzaju charakterystyka nigdy nie została opisana nigdzie indziej.
Podsumowując, technika zaproponowana w tej pracy wykazuje wysoki potencjał bezpośredniego mieszania komórek z kolagenem w zastosowaniach inżynierii tkanki naczyniowej. Metoda ta, wraz z charakterystyką mechaniczną i procesem endotelializacji, stanowią protokoły o wysokiej wartości wielowartościowej. W związku z tym, dzięki niewielkim modyfikacjom ustawień i protokołów przy zachowaniu tego samego uzasadnienia, można spełnić główne wymagania dotyczące inżynierii ekwiwalentów tkanki naczyniowej, takie jak szybkie i nieskomplikowane przetwarzanie, w tym endotelializacja, oraz możliwość transpozycji do szerokiego zakresu tkanek miękkich o różnych długościach i średnicach. Co więcej, różne przylegające typy komórek, białka ECM i formowane geometrie mogą być badane pod kątem wielu ukierunkowanych zastosowań, takich jak między innymi ścięgna inżynieryjne, przeszczepy skóry, łaty sercowe, nerwy. Chociaż właściwości mechaniczne konstruktów są zachęcające, nadal są one niższe niż w przypadku tkanek rodzimych. W tym kontekście jesteśmy przekonani, że bardzo krótki okres dojrzewania statycznego jest kluczowym krokiem w kierunku dynamicznej stymulacji w bioreaktorze, prowadząc w ten sposób do wyższej integralności strukturalnej i stabilności mechanicznej. Jednak możliwość szybkiego wytwarzania inżynierii tkankowej komórkowych konstruktów na bazie kolagenu, nadających się do analiz mechanicznych i histologicznych, sprawia, że opisany tutaj bioreaktor statyczny jest użytecznym i obiecującym narzędziem zapewniającym wgląd w wzajemne oddziaływanie między komórkami a ECM podczas wzrostu i przebudowy, a nawet do wykorzystania jako model dla terapii i systemów dostarczania leków.

Inżynieria tkanek naczyniowych przewiduje różne strategie mające na celu wytwarzanie naczyń inżynieryjnych, w tym przeszczepy oparte na syntetycznych rusztowaniach, naczynia krwionośne oparte na arkuszach komórkowych (TEBV) i TEBV oparte na komponentach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Wśród tych podejść polimery syntetyczne wykazują dobre właściwości mechaniczne, ale mają wspólną wadę, jaką jest brak bioaktywności1. Metoda oparta na arkuszach komórkowych pozwala na wytwarzanie zmodyfikowanych substytutów naczyniowych o wysokich właściwościach mechanicznych, ale czas potrzebny do wytworzenia takich przeszczepów wynosi około 28 tygodni2. Naturalne biopolimery ECM, takie jak kolagen, elastyna, fibryna3lub ich kombinacja, pozostają złotym standardem w tworzeniu rusztowań inżynierii tkankowej. Dzieje się tak przede wszystkim z tego powodu, że materiały te mają ogólnie dobrą biokompatybilność, a jednocześnie są w stanie indukować funkcjonalne odpowiedzi komórkowe4-5. Wśród tych biopolimerów kolagen typu I jest jednym z najobficiej występujących i dominujących białek nośnych ECM w wielu tkankach, takich jak skóra, naczynia krwionośne i ścięgna. Przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad właściwościami mechanicznymi kolagenu6–8, ale przeprowadzono tylko kilka badań dotyczących przebudowy komórkowej żeli kolagenowych podczas dojrzewania statycznego. Przebudowa komórkowa odnosi się do modyfikacji strukturalnych macierzy kolagenowej wywołanych przez komórki, które mogą wpływać na stabilność sieci włókien kolagenowych9. Jako naturalne rusztowanie, stosunkowo duże ilości kolagenu typu I mogą być izolowane, sterylizowane i przechowywane z różnych źródeł, takich jak ścięgna ogona szczura10. Zrozumienie interakcji komórkowych z kolagenem i związanych z nimi ogólnych zachowań mechanicznych komórkowych rusztowań kolagenowych (konstruktów) jest niezbędnym krokiem do budowy tkanek. TEBV na bazie kolagenu mogą być przetwarzane przez bezpośrednie mieszanie komórek z kolagenem podczas przygotowywania żelu i dalej formowane w określone kształty, takie jak rurowe i płaskie11. Komórki naczyniowe wewnątrz żeli namnażają się i przebudowują kolagen typu I12. W ten sposób metoda ta omija potrzebę specyficznej makroporowatości, która stanowi jeden z istotnych problemów w rozwoju rusztowań do zastosowań w inżynierii tkankowej. Jednak główną wadą żeli kolagenowych są ich niskie właściwości mechaniczne w porównaniu z materiałami syntetycznymi13.
W tym badaniu, żywa tkanka o jednorodnym rozmieszczeniu komórek została zaprojektowana przez bezpośrednie mieszanie kolagenu z komórkami w jednoetapowym procesie. "Bioreaktory statyczne" zostały użyte do 1 lub 2 tygodni statycznego dojrzewania ucelulolizowanych żeli kolagenowych (bez zastosowania zewnętrznych dynamicznych ograniczeń mechanicznych). Podczas hodowli nastąpiła przebudowa macierzy kolagenowej, zapewniając w ten sposób strukturalne wzmocnienie konstruktów. Co więcej, konstrukty te były gotowe do przeniesienia do bioreaktora o obrotowych ściankach i uzyskano jednorodny śródbłonek. Ponadto w niniejszej pracy zaproponowano również specjalny protokół badań mechanicznych w celu zapewnienia odpowiedniego nowatorskiego podejścia do charakteryzowania właściwości mechanicznych rurkowatych tkanek miękkich.
Podsumowując, ta praca przedstawia metodę szybkiego wytwarzania i dojrzewania in vitro tkanek naczyniowych, które są wystarczająco mocne, aby można je było obsługiwać nie tylko do charakterystyki biologicznej i mechanicznej, ale także do dalszego mechanicznego kondycjonowania w dynamicznym bioreaktorze, co jest uważane za kluczowy krok w regeneracji tkanek.

<table><tbody><tr><td>CellTreat 50 ml Probówki do bioterapii</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229-475</td><td>Probówka wirówkowa</td></tr><tr><td>Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8" króciec węża. PP. 25/pk</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-45503-04</td><td>Złączki Luer do "portu wymiany gazu"</td></tr><tr><td>Żeński adapter króćca węża luer x 1/8". PP. 25/pk</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-45500-04</td><td>Złączki Luer do "portu pobierania próbek medium"</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex L/S 17. 25 stóp</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-17</td><td>Rurka 1 i 2 do chwytaków z gazy</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex L/S 16. 25 ft.</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td>Rurka 3 do chwytaków z gazy</td></tr><tr><td>Klej silikonowy Silastic Medical, typ A</td><td>Klej Dow Corning-Silicon</td><td></td> <td>do produkcji bioreaktora statycznego</td></tr><tr><td>Polyvent 4 Filtry odpowietrzające naczynia</td><td>Whatman</td><td>6713-0425</td><td>Filtr do "portu wymiany gazu"</td></tr><tr><td>Pręt. PP. mieszanie. 8' '</td><td>Scienceware</td><td>377660008</td><td>Korek trzpienia</td></tr><tr><td>guma silikonowa 00 PK12</td><td>VWR</td><td>59590-084</td><td>Korek do wkładania trzpienia do wentylowanej nasadki probówki wirówkowej</td></tr><tr><td>Smary Krytox PFPE/PTFE Dupont</td><td></td><td>GPL 202</td><td>Smar klasy medycznej do pokrywania trzpienia</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Xiameter RTV-4130-J podstawa i utwardzacz</td><td>Dow</td> <td>Corning-C</td> <td>w kształcie silikonu do śródbłonka</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowane podłoże Eagle, DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Gibco (Life Technology)</td><td>11995-065</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Czysty aceton (99%)</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>AP0102</td><td>Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy (klasa HPLC, 99,9%)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC610080040</td><td>Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu</td></tr><tr><td>0,02 N kwas octowy (lodowaty kwas octowy, klasa HPLC, 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FL070494</td><td>Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu</td></tr><tr><td>Roztwór chloroformu (99%)&nbsp;</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>CR 0179</td><td>Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163716</td><td>Substancja chemiczna do przygotowania konstrukcji</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Laboratoire Mat Inc.</td><td>SR-0169</td><td>Substancja chemiczna do przygotowania konstrukcji</td></tr><tr><td>LaserMike 136</td><td>LaserMike</td><td>Series 183B</td><td>Skaningowy interferometr laserowy&nbsp;</td></tr><tr><td>ElectroPulse MicroTester</td><td>Instron</td> <td>Corporation-Tester</td> <td>mikromechaniczny</td></tr><tr><td>HyClone Media M199/EBSS, 500&nbsp; ml</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30253.01</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu HI - 500&nbsp; ml</td><td>Gibco</td><td>SH 30396.03</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Surowica świńska (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9783</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP661-50</td><td>Roztwór soli</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T17CN Nasadka odpowietrzająca Czerwony</td><td>Sarstedt Inc.</td><td>83.1812.002</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>ColorpHast- paski wskaźnikowe pH (pH = 6,5-10,0)</td><td>EMD</td><td>9583</td><td>Pomiary pH</td></tr><tr><td>Matrigel Matrigel Błona podstawna Matrix Matrix Matrix Factor Reduced (Zmniejszona liczba czynników wzrostu błony podstawnej), fiolka 5 ml</td><td>BD Biosciences - Discovery Labware</td><td>356230</td><td>Koncentrat mieszanki białkowej do procesu endotelializacji</td></tr><tr><td>LifeCam VX-3000</td><td></td> <td>Pomiar</td><td></td></tr> <tr><td>grubości firmy MicrosoftAnalizator biochemiczny, DxC600</td><td>Beckman Coulter Unicell</td> <td>Synchron-Pomiary</td> <td>stężeń glukozy i mleczanu</td></tr><tr><td>Włókna kolagenowe</td><td>Ogony szczurów-Kolagen</td><td></td> <td>wyekstrahowano w laboratorium</td></tr><tr><td>Komórki mięśni gładkich świń (pSMC)Aorty</td> <td>świń-pSMC</td> <td>wyizolowano w laboratorium</td><td></td></tr> <tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Ludzkie żyły pępowinowe</td><td>- </td><td>HUVEC wyizolowano w laboratorium</td></tr></tbody></table>

inżynieria 3d cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Materiały syntetyczne są znane z inicjowania klinicznych powikłań, takich jak stany zapalne, zwężenia i infekcje, gdy są wszczepiane jako substytuty naczyń krwionośnych. Kolagen jest szeroko stosowany w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych i jest uważany za ważną alternatywę dla materiałów syntetycznych ze względu na jego nieodłączną biokompatybilność (tj. niską antygenowość, stan zapalny i reakcje cytotoksyczne). Jednak ograniczone właściwości mechaniczne i związana z tym niska zdolność ręczna żeli kolagenowych utrudniły ich stosowanie jako materiałów rusztowań w inżynierii tkanki naczyniowej. Dlatego uzasadnieniem tej pracy było po pierwsze zaprojektowanie komórkowych żeli kolagenowych w geometrię w kształcie rurki, a po drugie, wzmocnienie komórek mięśni gładkich napędzanej reorganizacją macierzy kolagenowej w celu uzyskania tkanek wystarczająco sztywnych, aby można było się nimi posługiwać.
Opisana tutaj strategia opiera się na bezpośrednim łączeniu komórek kolagenu i mięśni gładkich (konstruktu) w cylindryczną geometrię 3D za pomocą techniki formowania. Proces ten wymaga okresu dojrzewania, podczas którego konstrukty są hodowane w bioreaktorze w warunkach statycznych (bez stosowania zewnętrznych dynamicznych ograniczeń mechanicznych) przez 1 lub 2 tygodnie. "Bioreaktor statyczny" zapewnia monitorowane i kontrolowane sterylne środowisko (pH, temperatura, wymiana gazowa, dostarczanie składników odżywczych i usuwanie odpadów) dla konstrukcji. W okresie hodowli przeprowadzono pomiary grubości w celu oceny sterowanej przez komórki przebudowy macierzy kolagenowej, a także zmierzono zużycie glukozy i tempo produkcji mleczanu w celu monitorowania aktywności metabolicznej komórek. Na koniec oceniono właściwości mechaniczne i lepkosprężyste powstałych konstrukcji rurowych. W tym celu opracowano specjalne protokoły i ukierunkowane know-how (manipulacja, chwytanie, praca w nawodnionym środowisku itp.), aby scharakteryzować zmodyfikowane tkanki.

Niniejsza praca opisuje wytwarzanie inżynieryjnych rurkowatych konstruktów na bazie kolagenu zawierających komórki naczyniowe. Już po 1 hr wczesnej żelacji mieszanina komórek i kolagenu została bezpośrednio uformowana w trójwymiarową geometrię rurkową o średnicy zewnętrznej równej średnicy odpowiedniej formy (około 14 mm). Przez cały okres dojrzewania statycznego pomiary wykazały szybką redukcję średnicy zewnętrznej rurkowatych struktur zkomórkowionych, co przedstawiono w Tabeli 1. Średnica zkomórkowanych żeli kolagenowych skurczyła się o około 60% wartości początkowej po 1 dniu hodowli statycznej oraz o prawie 85% w ciągu 7 dni (Film Uzupełniający 2). SMCs wewnątrz konstruktów są odpowiedzialne za obserwowany skurcz i związane z nim wzmocnienie mechaniczne, ponieważ zjawisko to nie występuje w niekomórkowanych rusztowaniach kolagenowych. Należy zauważyć, że nie zastosowano żadnego rodzaju gradientu (termicznego, biochemicznego, mechanicznego ani innych). Kompaktacja indukowana przez komórki doprowadziła do powstania materiału o większej gęstości kolagenu, który można było manipulować i poddawać obciążeniom mechanicznym (Filmy Uzupełniające 3 i 4).
Aby powiązać przebudowę indukowaną przez komórki z ogólnymi właściwościami mechanicznymi i lepkosprężystymi, przeprowadzono testy zmęczeniowe konstruktów (Filmy uzupełniające 5 i 6). Testy te polegały na cyklicznym odkształcaniu konstruktów (30 razy) przy różnych stałych odkształceniach (10%, 20% i 30% początkowej długości pomiarowej) oraz rejestrowaniu naprężeń jako odpowiedzi konstruktów na wymuszenie mechaniczne w czasie. Reprezentatywne wyniki dla jednego konstruktu przedstawiono na Rysunku 9. Konstrukt wytrzymał wyższe naprężenia w kierunku podłużnym (75 kPa) niż w kierunku obwodowym (16 kPa) przy zastosowaniu tego samego zakresu odkształcenia (odkształcenie 30%). Jednocześnie, w każdym cyklu, szczytowa wartość naprężenia osiągana dla docelowego maksymalnego odkształcenia malała w czasie. Takie zachowanie jest typowe dla wysokich właściwości lepkosprężystych wykazywanych przez te konstrukty oparte na kolagenie.
Aktywność biologiczną scentralizowanych konstruktów oceniano podczas statycznego dojrzewania. W związku z tym aktywność metaboliczną SMCs oceniano poprzez pomiar zużycia glukozy i produkcji mleczanu podczas statycznej hodowli. Próbki pożywki pobierano co 2 dni, a stężenia glukozy i mleczanu mierzono za pomocą analizatora gazów krwi. Stały wzrost zużycia glukozy i produkcji mleczanu, w połączeniu ze znacznym kurczeniem się konstruktów, potwierdza aktywność SMCs przez cały okres statycznej hodowli (Rycina 10).
Zwiększona stabilność mechaniczna wynikająca z remodelowania napędzanego przez komórki umożliwiła manipulację konstruktami oraz późniejszy proces endotelizacji. Barwienie trichromem Massona wykonane na endotelizowanych konstruktach wykazało wysoce jednorodne śródbłonie. SMC wykazywały morfologię wrzecionowatą i wydawały się jednorodnie rozproszone w ścianie, podczas gdy HUVEC wydawały się dobrze rozprzestrzenione po stronie luminalnej (Rycina 11).
<img alt="Schemat konfiguracji zbiornika z filtrami, wentylowaną zakrętką i uchwytami z gazy; opisane komponenty." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Komponenty statycznego bioreaktora. Statyczny bioreaktor składał się z modyfikowanej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (A) oraz zakrętki wyposażonej w trzpień (B). Probówka służyła jako zbiornik na pożywkę i była wyposażona w port dla filtra 0,22 µm do wymiany gazowej oraz w septum do pobierania i wymiany pożywki. Trzpień znajdujący się w wentylowanej zakrętce umożliwiał wytwarzanie konstruktów o kształcie rurkowatym. Uchwyty z gazy (C) zostały zaprojektowane i wykonane w celu wspierania żelowania konstruktów na trzpieniu. Ponadto uchwyty te pozwalały na manipulowanie konstruktami po statycznym dojrzewaniu oraz ich mocowanie do aparatury mechanicznej. Zewnętrzna średnica trzpienia wynosiła 4,7 mm.
<img alt="Schemat metody formowania rurkowego: montaż kompleksu trzpienia i nakrętki z uchwytami z gazy do zestawu obudowy formy." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Montaż statycznego bioreaktora. Etapy montażu bioreaktora przed sterylizacją. Uchwyty z gazy zamontowano na trzpieniu (A) w stałej odległości. Wprowadzono formę (B) i mocno przymocowano ją do silikonowego stopra (C). Średnica zewnętrzna trzpienia wynosiła 4.7 mm.
<img alt="Schemat statycznego bioreaktora; mieszanina komórek i kolagenu w systemie obudowa-forma z procesem medium hodowlanego." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wytwarzanie konstruktów w warunkach sterylnych. Mieszaninę komórek i kolagenu wlano do zespołu obudowa-forma (A) i pozostawiono do żelowania na 1 hr w temperaturze pokojowej (B). Następnie usunięto formę (C), zmontowano statyczny bioreaktor (D) i przeniesiono go do zbiornika w celu statycznego dojrzewania konstruktu w inkubatorze (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności). Średnica zewnętrzna trzpienia wynosiła 4.7 mm.
<img alt="Ustawienie dyfrakcji laserowej: droga wiązki, cień konstruktu, ekran; schemat eksperymentalny badania optycznego." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pomiar grubości/średnicy zewnętrznej konstruktów.Do pomiaru średnic zewnętrznych konstruktów wykorzystano interferometr skaningowy laserowy. Konstrukt umieszczono na drodze wiązki laserowej, co spowodowało powstanie cienia. Szerokość cienia, odpowiadająca średnicy zewnętrznej konstruktu, została następnie zmierzona i wyświetlona na ekranie.
<img alt="Schemat badania wytrzymałości tkanek na rozciąganie; pomiar odkształcenia i naprężenia przy oświetleniu lightboxem." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wygląd morfologiczny pobranego konstruktu. (A) Bezpośrednio po żelowaniu oraz (B) po przebudowie indukowanej przez komórki podczas statycznego dojrzewania przez 2 tygodnie.
<img alt="Układ do testów biomechanicznych z testerem mikromechanicznym, pompą, systemem grzewczym i kąpielą PBS w 37°C." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Układ eksperymentalny do charakteryzacji mechanicznej. Składał się on z testera mikromechanicznego wyposażonego w ogniwo pomiarowe 5 lub 10 N oraz kąpieli zawierającej PBS w 37 °C w celu utrzymania próbek w warunkach pseudofizjologicznych.
<img alt="Pozyskiwanie i przygotowanie próbek; hodowla w szalce Petriego; testowanie układu mechanicznego w PBS w temperaturze 37°C." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig7highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Przygotowanie próbek do charakterystyki mechanicznej. Pozyskiwanie próbek (A) i ich przygotowanie (B) do testów zmęczeniowych przeprowadzonych w kierunkach podłużnym i obwodowym (C). Średnica zewnętrzna trzpienia wynosiła 4,7 mm.
<img alt="Schemat i konfiguracja bioreaktora z obrotową ścianą do hodowli komórek; obejmuje silnik i silikonowe wsporniki." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig8highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Bioreaktor z obrotową ścianą. (A) Konstrukcje rurkowe zostały zmontowane w centrum zbiornika przy użyciu silikonowych wsporników w kształcie litery C. Oba końce konstrukcji zostały zamknięte, aby zapobiec wyciekowi roztworu HUVECs. (B) Konstrukcje były hodowane w inkubatorze (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) w rotacji przy sile 4.02 x 10-5 g przez 2 dni.
<img alt="Wykresy naprężenia w funkcji czasu, ε=10%-30%, ilustrujące odpowiedź materiału podczas obciążenia cyklicznego w eksperymencie." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig9highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Charakterystyka mechaniczna. Wyniki testów zmęczeniowych przeprowadzonych na konstruktach w kierunku podłużnym (A) i obwodowym (B) po przebudowie indukowanej przez komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/52812fig9highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres tempa zużycia glukozy i produkcji mleczanu, analiza biochemiczna w czasie." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig10highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Aktywność metaboliczna SMC w żelach kolagenowych. Pomiary tempa zużycia glukozy i tempa produkcji mleczanu przeprowadzano analizatorem gazometrii krwi co 2 dni, po wymianie podłoża hodowlanego. Świeże podłoże hodowlane służyło jako poziom bazowy dla pomiarów stężeń glukozy i mleczanu.
<img alt="Histologia tkanki naczyniowej; komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich; obrazy mikroskopowe; oznaczenia EC, SMC." src="/files/ftp_upload/52812/52812fig11highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11: Endotelializacja światła naczynia. Obrazy histologiczne radialnych przekrojów poprzecznych konstrukcji rurkowatych. Barwienie trichromem Massona konstrukcji rurkowatych hodowanych statycznie przez 1 tydzień (A) i 2 tygodnie (B). Barwienie H &amp; E konstrukcji rurkowatej (C).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Czas</td >
			<td >Grubość (mm)</td >
			<td >Kompakcja (%) </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >0 hr</td >
			<td >4.83 ± 0.02</td >
			<td >0 ± 0</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2 hr</td >
			<td >4.26 ± 0.02</td >
			<td >12 ± 0</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >4 hr</td >
			<td >4.21 ± 0.03</td >
			<td >13 ± 1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >6 hr</td >
			<td >4.06 ± 0.10</td >
			<td >16 ± 2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >12 hr</td >
			<td >3.16 ± 0.07</td >
			<td >35 ± 1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 dzień</td >
			<td >2.08 ± 0.11</td >
			<td >57 ± 2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >1 tydzień</td >
			<td >0.68 ± 0.07</td >
			<td >86 ± 1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2 tygodnie</td >
			<td >0.36 ± 0.00</td >
			<td >93 ± 0</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Szybka kompakcja średnicy konstrukcji podczas statycznego dojrzewania.Grubość ścianek konstrukcji oraz stopień kompakcji w funkcji czasu statycznej hodowli. Kompakcję mierzono poprzez wyznaczanie średnicy zewnętrznej konstrukcji rurkowych za pomocą skaningowego interferometru laserowego (Series 183B, LaserMike 136). Po 24 hr konstrukcje skompaktowały się do 57% ± 2% swoich wymiarów formowanych. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). Jedyną przyczyną tak znacznych zmian była obecność i aktywność żywych komórek mięśni gładkich.
Wideo uzupełniające 1: Pozyskiwanie nienaprawianych kolagenowych żeli kanalikowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video1.mov" target="_blank">Aby obejrzeć ten film, kliknij tutaj.</a>
Wideo uzupełniające 2: Kompakcja rurkowatych żeli kolagenowych napędzana przez komórki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video2.m4v" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.</a>
Wideo uzupełniające 3: Manipulacja nieprzebudowanymi kolagenowymi żelami kanaliowymi.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video3.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.</a>
Wideo uzupełniające 4: Manipulacja przebudowanymi przez komórki żelami kolagenowymi w strukturach rurkowych.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video4.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.</a>
Wideo uzupełniające 5: Podłużny test zmęczeniowy (przy 30%) na przebudowanych przez komórki żelach kolagenowych w formie rurek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video5.mov" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby obejrzeć ten film.</a>
Wideo uzupełniające 6: Obwodowy test zmęczeniowy (przy 30%) na przebudowanych przez komórki kolagenowych żelach rurkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video6.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.</a>

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie rurkowych konstruktów do regeneracji tkanki naczyniowej. Jest to realizowane poprzez wstępne połączenie kolagenu typu I oraz komórek mięśni gładkich w geometrii cylindrycznej z wykorzystaniem techniki odlewania. Drugim krokiem jest dojrzewanie konstruktu w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze statycznym.Następnie dojrzałe konstrukty są ostrożnie zbierane, a komórki śródbłonka osadzane są w świetle konstruktu przy użyciu bioreaktora z obrotową ścianą. W końcowym etapie przeprowadza się badania histologiczne, testy metaboliczne oraz testy mechaniczne, aby ocenić właściwości tych konstrukcji rurkowych. Oryginalność tej techniki polega na tym, że wykorzystuje ona tylko jeden etap łączenia komórek i kolagenu w celu uzyskania konstruktu inżynierii tkankowej o docelowych właściwościach mechanicznych, bez konieczności stosowania dodatkowych zabiegów fizycznych lub chemicznych.Co więcej, konstrukt można łatwo manipulować dzięki specjalnie zaprojektowanym uchwytom, które umożliwiają jego obsługę oraz mocowanie łączników końcowych. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat oddziaływań między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową podczas wzrostu i przebudowy w procesie regeneracji tkanki naczyniowej. Ponadto można ją zastosować w przypadku wielu docelowych tkanek, takich jak ścięgna, przeszczepy skóry, łaty serca oraz układ nerwowy.Aby rozpocząć, należy wykonać i złożyć statyczny bioreaktor zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym; zawarto w nim szczegóły dotyczące zbiornika i gazy, wykonania uchwytów, nakrętki trzpienia oraz montażu formy obudowy i technik sterylizacji. Następnie należy namnożyć komórki mięśni gładkich aorty świni w kolbie do hodowli tkanek o powierzchni 175 cm² aż do osiągnięcia 90% konfluencji. Korzystając ze standardowych technik hodowli, należy zebrać komórki, a następnie resuspenderować je w pełnej pożywce hodowlanej w stężeniu 4 milionów komórek na ml.Następnie połączyć jedną część roztworu buforowego, dwie części sterylnego roztworu kolagenu o stężeniu 4 g/L oraz jedną część zawiesiny komórkowej. W tej kolejności zmierzyć pH mieszaniny i upewnić się, że mieści się ono w przedziale od pH 7,0 do 7,4. Następnie ostrożnie przelać mieszaninę komórkowo-kolagenową do zmontowanego kompleksu formy obudowy.Upewnij się, że w mieszaninie nie ma pęcherzyków powietrza. Pozostaw żel kolagenowy w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w środowisku sterylnym. Po godzinie wyjmij rurkę osłonową i ostrożnie przenieś konstrukt do zbiornika zawierającego 35 milliliters podgrzanego wcześniej pożywki hodowlanej.Inkubować konstrukt w pozycji pionowej przez jeden lub dwa tygodnie w celu statycznego dojrzewania. Wymieniać pożywkę co dwa dni, odsysając zużytą pożywkę przez dolny port przegrody i napełniając zbiornik równą ilością świeżej pożywki. W razie potrzeby, podczas każdej wymiany pożywki, pobierać jeden mililitr zarówno starej, jak i świeżej pożywki do analizy biochemicznej co godzinę przez pierwsze 12 godzin, a następnie co 24 godziny.Wyjmij konstrukt z pożywki hodowlanej w warunkach sterylnych i umieść go prostopadle na drodze wiązki skanującego interferometru laserowego, aby zmierzyć grubość konstruktu po jednym do dwóch tygodniach dojrzewania statycznego. Przenieś bioreaktor do komory z laminarnym przepływem powietrza i delikatnie zdejmij konstrukt z trzpienia. Po zwolnieniu go, umieść go w szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 40 mL świeżej pożywki hodowlanej.Następnie należy przygotować mikromechaniczny tester wyposażony w ogniwo obciążeniowe o zakresie od 5 do 10 N oraz uchwyty sięgające do kąpieli z PBS utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Wyjąć konstrukt z szalki Petriego i przymocować go do specjalistycznych uchwytów do testów wzdłużnych, zaprojektowanych tak, aby łączyć się z gazyową częścią konstruktu bez zgniatania żelu. Użyć taśmy teflonowej, aby zapobiec poślizgowi uchwytów podczas testowania.Następnie zamocuj konstrukt w mikromechanicznym testerze. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie testu zmęczeniowego w kierunku wzdłużnym, polegającego najpierw na rozciągnięciu konstruktu do jego początkowej długości pomiarowej i utrzymaniu go w tym stanie przez 10 minut. Następnie zastosuj 30 cykli 10% odkształcenia cyklicznego z prędkością 5% na sekundę.Zwiększaj odkształcenie w krokach co 10% odkształcenia cyklicznego, aż do momentu uszkodzenia próbki podczas testów w kierunku obwodowym. Najpierw podziel próbkę na pierścieniowe konstrukcje o długości 10 mm. Następnie zamocuj pierścienie na prętach ze stali nierdzewnej, stosowanych zamiast uchwytów.Podobnie jak w przypadku testów w kierunku podłużnym, najpierw rozciągnij konstrukt do jego początkowej długości pomiarowej i utrzymaj go w tym stanie przez 10 minut. Następnie zastosuj 30 cykli 10% odkształcenia cyklicznego z prędkością 5% na sekundę. Po dojrzeniu konstruktu i zdjęciu go z trzpienia, przymocuj oba jego końce do zbiornika i umieść go w zestawie zbiornika.Jak pokazano tutaj. Napełnić zewnętrzną część zbiornika 30 mililitrami pożywki hodowlanej. Następnie wypełnić 75% objętości światła konstrukcji mieszaniną białek, a następnie zamknąć oba końce konstrukcji.Aby uniknąć wycieku roztworu białek, umieść bioreaktor w inkubatorze i obracaj go z przyspieszeniem 4,02 × 10⁻⁵ GForce przez jedną godzinę, aby pokryć powierzchnię luminalną białkami podczas procesu powlekania światła. Zbierz ludzkie komórki żyły pępowinowej oraz komórki nabłonka moczowego hodowane standardowymi technikami, gdy osiągną 90% konfluencji. Resuspenduj komórki w uzupełnionym pożywce hodowlanej M1 99. Następnie wprowadź ludzkie komórki żyły pępowinowej i komórki nabłonka moczowego do światła konstrukcji.Przy gęstości 1000 komórek na centymetr kwadratowy zamknąć górne końce konstrukcji, aby zapobiec wyciekowi zawiesiny komórkowej. Inkubować konstrukcje w rotacyjnym bioreaktorze ściennym przez dwa dni przy stałej rotacji wynoszącej 4,02 × 10⁻⁵G. Podczas statycznego dojrzewania konstrukcji naczyniowych zewnętrzna średnica struktur wzrostu komórkowego gwałtownie uległa zmniejszeniu.Jak pokazano tutaj, średnica konstruktów zmniejszyła się o 60% ich wartości początkowej w pierwszym dniu hodowli statycznej. Do siódmego dnia konstrukt zarówno wzdłużny, jak i obwodowy, uległ zmniejszeniu o niemal 85%. Cykle odkształceń wzdłużnych i obwodowych konstruktów wykazywały właściwości wiskoelastyczne typowe dla konstruktów opartych na kolagenie. Ogólnie rzecz biorąc, konstrukty były wytrzymalsze w kierunku wzdłużnym w porównaniu z kierunkiem obwodowym w tym samym zakresie odkształceń. Barwienie trichromem Massona wykonane na konstruktach śródbłonkowych wykazało wysoce jednorodne śródbłonie.Komórki mięśni gładkich wykazywały wrzecionowatą morfologię i wydawały się jednorodnie rozproszone w ścianie, podczas gdy komórki śródbłonka wydawały się dobrze rozprzestrzenione po stronie światła. Po jego opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biomechaniki i medycyny regeneracyjnej do badania właściwości mechanicznych tkanek inżynieryjnych i natywnych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć teraz dobrą wiedzę na temat tego, jak można szybko wytwarzać konstrukty naczyniowe, aby ostatecznie stały się one wystarczająco wytrzymałe, by można było nimi manipulować i wykorzystać je do kondycjonowania mechanicznego w bioreaktorze dynamicznym. Mamy nadzieję, że nasze wysiłki i wyniki przekonały Państwa o wysokim potencjale komórek w modelu macierzy zewnątrzkomórkowej dla rozwoju funkcjonalnych tkanek biologicznych.

engineering-3d-cellularized-collagen-gels-for-vascular-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieria 3D Komórkowych Żeli Kolagenowych dla Regeneracji Tkanki Naczyniowej

Tworzenie mikrotkanek przy użyciu cylindrycznych żeli kolagenowych, nazywanych modułami, które zawierają zatopione komórki, a ich powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.

Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Innowacyjna technika biofabrykacji została opracowana w celu inżynierii trójwymiarowych konstrukcji, które przypominają cechy architektoniczne, komponenty i właściwości mechaniczne tkanki in vivo. Technika ta wykorzystuje nowo opracowany materiał protektorowy, kauczuk BSA, który przenosi szczegółowe cechy przestrzenne, odtwarzając architekturę in vivo szerokiej gamy tkanek.

Trójwymiarowa technologia biomimetyczna: nowatorski biokauczuk tworzy zdefiniowane architektury w mikro i makroskali w hydrożelach kolagenowych

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Proponujemy protokół ekspansji komórek na makroporowatych mikronośnikach i ich wykorzystanie jako systemu dostarczania w bioreaktorze perfuzyjnym do tworzenia zdecelularizowanej matrycy tkankowej. Uwzględniamy również różne techniki określania proliferacji komórek i żywotności komórek hodowanych na mikronośnikach. Ponadto wykazujemy funkcjonalność komórek po hodowlach w bioreaktorach.

Rekombinowane mikronośniki peptydowe kolagenu I do ekspansji komórek i ich potencjalne zastosowanie jako system dostarczania komórek w modelu bioreaktora

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Poznaj technikę inżynierii 3D żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej z użyciem komórek mięśni gładkich i śródbłonka. Metoda umożliwia szybkie tworzenie konstruktów o docelowych właściwościach mechanicznych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Przeglądaj więcej filmów