Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Ogólnym celem tej procedury jest inżynieria konstruktów rurkowych do regeneracji tkanki naczyniowej. Osiąga się to poprzez połączenie najpierw kolagenu typu pierwszego i komórek mięśni gładkich w geometrii cylindrycznej za pomocą techniki formowania. Drugim krokiem jest dojrzewanie konstruktu w specjalnie zaprojektowanym bioreaktorze statycznym.

Następnie dojrzałe konstrukty są starannie zbierane, a komórki śródbłonka są umieszczane na świetle konstruktu za pomocą aktora bioreaktora o obrotowej ścianie. Ostatecznie przeprowadza się histologię, testy metaboliczne i testy mechaniczne w celu oceny właściwości tych rurkowatych konstruktów. Oryginalność tej techniki polega na tym, że wykorzystuje ona tylko jeden krok do połączenia komórek i kolagenu, aby uzyskać konstrukcję inżynierii tkankowej o ukierunkowanych właściwościach mechanicznych bez dodatkowej obróbki fizycznej lub chemicznej.

Co więcej, konstrukcją można łatwo manipulować dzięki specjalnie zaprojektowanym uchwytom, które pozwalają na manipulację nimi i ogniwami końcowymi. Metoda ta może zapewnić wgląd we wzajemne oddziaływanie między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową podczas wzrostu i przebudowy w celu regeneracji tkanki naczyniowej. Ponadto może być stosowany do wielu docelowych tkanek, takich jak ścięgna, przeszczepy skóry, plaster serca i układ nerwowy.

Aby rozpocząć produkcję i montaż bioreaktora statycznego zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, dołączono szczegółowe informacje na temat zbiornika i gazy, produkcji uchwytu, nasadki trzpienia oraz technik montażu formy obudowy i sterylizacji. Następnie rozwiń komórki mięśni gładkich aorty świń w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych, aż będą zlewać się w 90%. Korzystając ze standardowych technik hodowli, zbierz komórki, a następnie ponownie zawieś je w ilości 4 milionów komórek na mililitr w kompletnej pożywce hodowlanej.

Następnie połącz jedną część roztworu buforowego, dwie części sterylnego roztworu kolagenu w ilości czterech gramów na litr i jedną część zawiesiny komórkowej. W tej kolejności zmierz pH mieszaniny i upewnij się, że mieści się w przedziale od 7,0 do 7,4. Następnie delikatnie wlej mieszaninę kolagenu komórkowego do zmontowanego kompleksu form obudowy.

Upewnij się, że w mieszaninie nie ma pęcherzyków powietrza. Pozostaw żel kolagenowy w temperaturze pokojowej na godzinę w sterylnym środowisku. Po godzinie wyjmij rurkę obudowy i ostrożnie przenieś konstrukt do zbiornika zawierającego 35 mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.

Inkubuj konstrukt w pozycji pionowej przez jeden lub dwa tygodnie dojrzewania statycznego. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa dni, zasysając starą pożywkę z dolnego portu przegrody i ponownie napełniając zbiornik równoważną ilością świeżej kultury. Średni. W razie potrzeby należy zebrać jeden mililitr zarówno starej, jak i świeżej pożywki przy każdej wymianie pożywki w celu analizy biochemicznej co godzinę przez pierwsze 12 godzin, a następnie co 24 godziny.

Usunąć konstrukt z pożywki hodowlanej w sterylnych warunkach i umieścić go prostopadle na ścieżce interferometru laserowego skanującego w celu zmierzenia grubości konstruktu po jednym do dwóch tygodni dojrzewania statycznego. Przenieś bioreaktor do okapu do hodowli komórkowej i delikatnie wyjmij konstrukt z trzpienia. Po uwolnieniu umieść go na szalce Petriego o średnicy 100 milimetrów zawierającej 40 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej.

Następnie ustaw mikromechaniczny tester wyposażony w ogniwo obciążnikowe o pojemności od 5 do 10 niutonów i uchwyty, które rozciągają się do kąpieli PBS utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjmij konstrukt z szalki Petriego i podłącz go do specjalistycznych urządzeń chwytających do testów wzdłużnych i zaprojektowanych tak, aby łączyły się z częścią konstrukcji z gazy bez zgniatania żelu. Użyj taśmy teflonowej, aby zapobiec ślizganiu się urządzeń chwytających podczas testowania.

Następnie zamontuj konstrukcję na mikro testerze mechanicznym. Następnie wykonaj próbę zmęczeniową w kierunku wzdłużnym, najpierw rozciągając konstrukcję do początkowej długości skrajni i przytrzymując ją tam przez 10 minut. Następnie zastosuj 30 cykli 10% cyklicznego szczepu z szybkością 5% na sekundę.

Zwiększaj odkształcenie przez przyrostowe kroki 10% cyklicznego odkształcenia, aż próbka nie wykona testów w kierunku obwodowym. Najpierw podziel próbkę na 10-milimetrowe konstrukcje pierścieniowe. Następnie zamontuj pierścienie na prętach ze stali nierdzewnej używanych zamiast uchwytów.

Podobnie jak w przypadku testów kierunku wzdłużnego, najpierw rozciągnij konstrukcję do początkowej długości skrajni i przytrzymaj ją tam przez 10 minut. Następnie zastosuj 30 cykli 10% cyklicznego szczepu z szybkością 5% na sekundę. Gdy konstrukcja dojrzeje i zostanie wyjęta z trzpienia, przymocuj konstrukcję na obu końcach do zbiornika i umieść ją w zespole zbiornika.

Jak pokazano tutaj. Napełnij zewnętrzną część zbiornika 30 mililitrami kultury. Średni. Następnie wypełnij 75% objętości światła konstruktu mieszaniną białek, a następnie zamknij oba końce konstruktu.

Aby uniknąć wycieku roztworu białkowego, umieść bioreaktor w inkubatorze i obracaj bioreaktor pod kątem 4,02 razy 10 do ujemnych pięciu GForce przez jedną godzinę, aby pokryć powierzchnię światła białkami podczas powlekania luminacji. Zbierz ludzkie komórki żyły pępowinowej i komórek jasowych hodowane standardowymi technikami, gdy są one w 90% zlewające się, Resus zawiesza komórki i uzupełnia pożywkę hodowlaną M1 99. Następnie zobacz ludzką żyłę pępowinową i komórki urotelialne w świetle konstruktu.

Przy gęstości 1000 komórek na centymetr kwadratowy zamknij górne końce konstrukcji, aby uniknąć wycieku roztworu komórkowego. Inkubuj konstrukty umieszczone w kulturze bioreaktora o obrotowej ścianie przez dwa dni przy stałym obrocie 4,02 razy 10 do ujemnej siły 5G. Podczas statycznego dojrzewania konstruktów naczyń gwałtownie zmniejszyła się zewnętrzna średnica struktur wzrostu komórkowego.

Jak pokazano tutaj, średnica konstruktów zmniejszyła się o 60% w stosunku do ich początkowej wartości w pierwszym dniu hodowli statycznej. Do siódmego dnia konstrukty zmniejszyły się o prawie 85%Zarówno podłużne, jak i obwodowe cykle odkształcania konstruktów miały właściwości lepkosprężyste typowe dla konstruktów na bazie kolagenu. Ogólnie rzecz biorąc, konstrukty były silniejsze w kierunku wzdłużnym w porównaniu z kierunkiem obwodowym w tym samym zakresie odkształceń, barwienie triconem Massen przeprowadzone na konstruktach śródbłonka wykazało wysoce jednorodny śródbłonek.

Komórki mięśni gładkich wykazywały wrzecionowatą morfologię i wydawały się jednorodnie rozproszone w ścianie, podczas gdy komórki śródbłonka wydawały się dobrze rozsiane po stronie światła. Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biomechaniką i medycyną regeneracyjną do zbadania mechanicznego zachowania tkanek zmodyfikowanych i natywnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś teraz dobrze zrozumieć, w jaki sposób konstrukty naczyniowe mogą być szybko modyfikowane i w końcu stać się wystarczająco mocne, aby można je było obsługiwać i używać do mechanicznego kondycjonowania w dynamicznym atorze. Mamy nadzieję, że nasze starania i wyniki przekonały Państwa o wysokim potencjale komórek w modelu macierzy zewnątrzkomórkowej do rozwoju biologicznie funkcjonalnych tkanek.