Name: Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj metodę różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy. Protokół umożliwia generowanie progenitorów neuronalnych i skalowanie do formatu wielodziurkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana ze stypendium na rzecz Rozwoju i Promocji Nauki i Technologii od Ministerstwa Edukacji Tajlandii dla W.W. oraz grantów od Tenovus i Anonymous Trust dla M.P.S.

1. Przygotowanie mediów
UWAGA: Protokół opiera się na użyciu mieszanki dwóch oddzielnych pożywek: DMEM/F12 uzupełnionego zmodyfikowanym suplementem N2 i Neurobasal uzupełnionego suplementem B27, zazwyczaj w stosunku 1:1.
<ol>
	<li>Przygotować zmodyfikowany suplement N2, mieszając składniki w probówce o pojemności 15 ml. Nie wiruj tego ani nie filtruj; Mieszać, odwracając probówkę, aż roztwór będzie klarowny.
	<ol>
		<li>Rozpocząć od odpipetowania 7,2 ml DMEM/F12, następnie dodać 1 ml insuliny o stężeniu 25 mg/ml (uzupełnionej w 0,01 M HCl) i dobrze wymieszać, odwracając probówkę. Mija kilka minut, zanim roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Dodać 1 ml 100 mg/ml apo-transferyny (sporządzonej w wodzie), 33 μl 0,6 mg/ml progesternonu (sporządzonej w etanolu), 100 μl 160 mg/ml (1 M) putrescyny (sporządzonej w wodzie), 10 μl 3 mM seleninu sodu (sporządzonej w wodzie) i 666 μl 7,5% albuminy surowicy bydlęcej i dobrze wymieszać probówkę. Porcję rozpuścić w 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj nośnik.
	<ol>
		<li>Do 250 ml DMEM/F12 dodać 2,5 ml N2. Dobrze wymieszaj, ale nie potrząsaj ani nie filtruj.</li>
		<li>Do 250 ml pożywki neuropodstawowej dodać 5 ml suplementu witaminy B27. Dobrze wymieszaj, ale nie potrząsaj ani nie filtruj.</li>
		<li>Wymieszaj podłoża z kroków 1.2.1 i 1.2.2 w stosunku 1:1. W niektórych przypadkach może być wymagana mieszanka 1:3 (uzupełniona jako mieszanka 1:1 w kroku 1.2.4).</li>
		<li>Do mieszanki dodać 0,5 ml L-glutaminy (stężenie końcowe 0,2 mM) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu (stężenie końcowe 0,1 mM) i dobrze wymieszać bez wstrząsania. Przechowuj media w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni i unikaj wystawiania ich na działanie światła. Ta ostateczna mieszanka nazywa się N2B27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór żelatyny.
	<ol>
		<li>Przygotować 1% roztwór żelatyny w ultraczystej wodzie i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi, przez 15 minut. Ważne jest, aby używana do tego butelka była całkowicie czysta od detergentów lub środków dezynfekujących, dlatego zaleca się, aby używać do tego nowej butelki i płukać ją tylko w ultraczystej wodzie między użyciami. Podwielokrotność 1% roztworu rozdzielić na 50 ml porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy.</li>
		<li>Podwielokrotność 1% żelatyny należy podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do rozpuszczenia i dodać do 500 ml ciepłej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dobrze wymieszaj i odpipetuj tyle, aby pokryć dno każdej studzienki lub płytki. Pozostaw żelatynę na powierzchni przez co najmniej 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Powlekanie komórek
UWAGA: Ten protokół stosuje się jednakowo do mysich ESC hodowanych w 10% surowicy z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF), zastępowania surowicy LIF lub pożywki bez surowicy z LIF i białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP4) lub inhibitorami MEK i GSK3 (pożywka 2i) z LIF lub bez. Jednak czas i skuteczność różnicowania mogą się różnić w zależności od pożywki i komórek (patrz dyskusja). Do pokazanych tutaj eksperymentów użyliśmy mysiej linii ESC 46C (która ma reporter EGFP wbity w jeden z endogennych alleli Sox1), wyhodowaną w GMEM z 10% surowicą i LIF. Aby uzyskać optymalne wyniki, ważne jest, aby komórki zostały zdysocjowane i ponownie posiane w pożywce N2B27; zwykła zmiana pożywki z GMEM/surowicy/LIF na N2B27 zawsze skutkuje zmniejszoną wydajnością różnicowania w porównaniu z ponownym powlekaniem komórek.
<ol>
	<li>Hoduj komórki w GMEM z 10% surowicą, 1 mM pirogronianem sodu, 1x aminokwasami endogennymi, 0,1 M 2-merkaptoetanolem i 100 jednostkami/ml LIF13. Aby uzyskać subkonfluentną hodowlę mysiego ESC, umieść 1 x 106 komórek w kolbie hodowlanej T25, co zajmie 2-3 dni.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem w jasnym polu. Gdy komórki są subkonfluentne i gotowe do przejścia, przepłucz je dwukrotnie w PBS. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek i ponownie umieścić w inkubatorze na 2 - 5 minut. Chociaż trypsyna i inne enzymy mogą być również używane do dysocjacji komórek, mogą mieć negatywny wpływ na przyczepianie komórek, więc trzeba będzie dostosować gęstość posiewu.</li>
	<li>Gdy komórki zaczną się unosić z płytki, postukaj w naczynie, aby przemieścić je do zawiesiny pojedynczej komórki. Zebrać komórki do łącznie 10 ml pożywki i odczynnika do dysocjacji komórek, a następnie pipetować do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wiruj komórki w masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml wstępnie ogrzanego N2B27, pipetując w górę i w dół 3 - 5 razy. Podczas pipetowania zawiesiny należy pipetować do boku probówki, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i zapisz stężenie.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek zawierającą żądaną liczbę komórek na jednostkę objętości, która ma być posiana na studzienkę we wstępnie ogrzanym N2B27. Optymalna jest gęstość 10 500 komórek nacm2 w naczyniu 6-dołkowym (tj. 1 x 105 komórek na dołek naczynia 6-dołkowego). W tabeli 1 przedstawiono sugerowaną liczbę komórek nacm2 oraz objętości pożywek galwacznych dla różnych naczyń do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odessać żelatynę z naczynia hodowlanego i umieścić zawiesinę komórek na płytce zgodnie z sugerowaną gęstością i objętością w tabeli 1. Nie obracaj płytek, ponieważ spowoduje to skoncentrowanie komórek do środka. Umieścić kultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 1-2 dni, wymieniając wszystkie nośniki na nowe N2B27. Pipetę należy delikatnie pipetować, ponieważ przepłukiwanie komórek może wpłynąć na gęstość i zmniejszyć efektywność różnicowania w ciągu następnych dni. Tam, gdzie początkowa żywotność po posiewie jest słaba, należy pokryć komórki mieszanką 1:3 pożywki uzupełnionej N2 i B27 i zmienić ją na N2B27 po pierwszych dwóch dniach. Komórki zaczną się różnicować i powinny wykazywać ekspresję Sox1 (widoczną przez zieloną fluorescencję reportera w zastosowanej tutaj linii komórkowej 46C) w ciągu 4 - 6 dni.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne
UWAGA: Protokół może być zastosowany do każdego typu statku. Objętość każdego odczynnika jest opisana na dołek płytki 6-dołkowej i może być skalowana do dowolnej powierzchni. Ponowne zakładanie nie jest zalecane ze względu na niską żywotność po zabiegu.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę różnicującą i utrwalić komórki, dodając 500 μl 4% (v/v) paraformaldehydu, pozostawić na 15 minut.</li>
	<li>Dwukrotnie przemyć i przepuścić komórki za pomocą 2 ml PBS-T (buforowana fosforanem soli fizjologicznej z 0,5% (v/v) tween-20). Komórki mogą być przechowywane w PBS-T przez okres do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zastąp PBS-T 1 ml PBS-T z 10% (v/v) surowicą (tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe). Inkubuj przez 1 godzinę na wahaczu płyty w punkcie RT, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania.</li>
	<li>Po 1 godzinie przemyć komórki dwukrotnie 2 ml PBS-T i inkubować w 500 μl mysiej IgG przeciwko βIII-tubulinie (rozcieńczonej 1:1000 w PBS-T z 10% surowicą). Założyć na talerz kołyskowy i pozostawić O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na tym etapie zawsze chroń naczynie przed światłem. Przemyj komórki dwukrotnie PBS-T, a następnie dodaj 500 μl znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała anty-mysiego IgG (rozcieńczonego do 2 μg/ml w PBS-T z 10% surowicą). Połóż go na kołysce talerza na 1 godzinę przy RT.</li>
	<li>Przepłucz komórki dwukrotnie PBS-T, a następnie dodaj 500 μl DAPI (rozcieńczonego do 0,5 μg/ml w PBS-T) i pozostaw na 5 minut.</li>
	<li>Ponownie umyj komórki i przechowuj je w PBS-T. Komórki są gotowe do sfotografowania i mogą być przechowywane przez okres do 2 tygodni w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że sygnał GFP zanika z czasem, dlatego niewłaściwe jest porównywanie intensywności GFP komórek stałych i żywych lub komórek utrwalonych w różnym czasie.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li>
<li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li>
<li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li>
<li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells%3A+a+new+ES+cell+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li>
<li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li>
<li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Monowarstwowy protokół różnicowania neuronalnego jest stosowany od ponad dekady6. Protokół jest wysoce wydajny, składa się ze zdefiniowanej pożywki i jest wykonany w systemie jednowarstwowym, co sprawia, że system jest bardziej odpowiedni do zastosowań przedklinicznych (np. badań przesiewowych leków). Istnieje jednak kilka krytycznych czynników, które decydują o skuteczności różnicowania. W tym artykule wskazano te czynniki i rozwiązanie dla każdej przeszkody.
Gęstość komór...

Embrionalne komórki macierzyste to pluripotencjalne komórki pochodzące z wczesnego zarodka, zdolne do rozmnażania się w nieskończoność in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się we wszystkie typy dorosłych komórek po ponownym wprowadzeniu do odpowiedniego stadium zarodka (poprzez utworzenie chimery), wstrzyknięciu do syngenicznych lub z obniżoną odpornością gospodarzy (poprzez utworzenie potworniaka) lub in vitro pod warunkiem odpowiednich wskazówek1. Różnicowanie in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w linie nerwowe zostało po raz pierwszy opisane w 1995 roku i obejmowało tworzenie wielokomórkowych agregatów zawiesinowych (ciał zarodkowych, EB) w pożywkach zawierających surowicę uzupełnionych morfogenem kwasu retinowego2-4. Od tego czasu opracowano różne protokoły umożliwiające różnicowanie neuronalne5. Wiele z nich nadal wykorzystuje agregację, inne współhodują z indukującymi typami komórek, a niektóre wymagają użycia pożywek bez surowicy. Wszystkie protokoły mają zalety i wady, a dokładna natura wytwarzanych komórek nerwowych lub neuronalnych również różni się w zależności od zastosowanego protokołu.
Idealny protokół byłby solidny, skalowalny i wykorzystywałby w pełni zdefiniowane media i substraty, byłby podatny na nieinwazyjne monitorowanie procesu różnicowania i powodowałby generowanie czystych populacji neuronalnych progenitorów, które mogą być wzorcowane przez zewnętrzne sygnały i różnicować się we wszystkie podtypy neuronalne i glejowe z wysoką wydajnością i wydajnością w stosunkowo krótkim czasie. W ciągu ostatnich kilkunastu lat stosowaliśmy metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów z mysiego ESC w niskiej gęstości, nieprzylegającej do surowicy hodowli jednowarstwowej6-10. Protokół ten spełnia wiele z wyżej wymienionych kryteriów: w naszych rękach skuteczność różnicowania jest dość stała od wielu lat, a różnorodność linii komórkowych może być skalowana w górę lub w dół (z powodzeniem używamy naczyń od płytek 96-dołkowych do szalek o średnicy 15 cm) oraz stosowane podłoża są dobrze zdefiniowane. Proces ten można poddać mikroskopii poklatkowej w celu monitorowania różnicowania, a różne wskazówki dotyczące wzorców mogą być dodawane w celu wywołania generowania różnych typów podtypów neuronów (np. Shh i Fgf8 dla neuronów dopaminergicznych6).
Niemniej jednak, istnieją pewne wyzwania dla pomyślnego zastosowania tego protokołu. Jednym z kluczowych aspektów jest staranne przygotowanie nośników. Media przygotowujemy zawsze we własnym zakresie, pomimo dostępności komercyjnych alternatyw. Jeden z zastosowanych suplementów (N2; patrz Protokół) ma modyfikacje w stosunku do standardowych wersji dostępnych na rynku. Wreszcie, jednym z najważniejszych kroków do skutecznego zastosowania tej metody jest optymalna gęstość komórek podczas posiewu. Dzieje się tak głównie dlatego, że podczas gdy autokrynny charakter jednego z sygnałów indukujących (Fgf411) wymaga, aby obecna była wystarczająca liczba komórek, aby umożliwić optymalną żywotność i różnicowanie, przy zbyt dużych gęstościach różnicowanie jest upośledzone (prawdopodobnie częściowo z powodu autokrynnej produkcji LIF12). Dlatego ważne jest, aby zarówno przygotowanie podłoża, jak i posiew komórek były wykonywane ostrożnie i konsekwentnie, aby zapewnić optymalne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neuropodstawowa średnia</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement, bez surowicy</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Rozpuścić za pomocą sterylnego 0,01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferyny</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Rozpuścić w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Rozpuścić w etanolu</td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Rozpuścić w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Rozpuścić w jałowej wodzie</td></tr><tr><td>Frakcja albuminy bydlęcej V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Upewnij się, że jest całkowicie rozpuszczona przed użyciem, ponieważ glutamina jest zwykle sedymentowana</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>przygotowany we własnym zakresie, jak w Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-dichlorowodorek dichlorowodorku 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Mysz anty &beta; III tubulina Przeciwciało IgG</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-mysie IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>25 cm2 kolba do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Zdolność do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy (ESC) do progenitorów nerwowych pozwala na badanie mechanizmów kontrolujących specyfikację neuronów, jak również generowanie dojrzałych typów komórek nerwowych do dalszych badań. W tym protokole opisujemy metodę różnicowania ESC do neuronalnych komórek progenitorowych przy użyciu monowarstwowej hodowli bez surowicy. Metoda jest skalowalna, wydajna i powoduje wytworzenie ~70% neuronalnych komórek progenitorowych w ciągu 4 - 6 dni. Może być stosowany do ESC z różnych odmian uprawianych w różnych warunkach. Neuronalne komórki progenitorowe mogą być dopuszczone do dalszego różnicowania się w funkcjonalne neurony i glej lub analizowane za pomocą mikroskopii, cytometrii przepływowej lub technik molekularnych. Proces różnicowania jest podatny na mikroskopię poklatkową i może być połączony z wykorzystaniem linii reporterowych do monitorowania procesu specyfikacji neuronalnej. Zapewniamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania pożywek i optymalizacji gęstości komórek, aby umożliwić zastosowanie procesu do większości linii ESC i różnych naczyń do hodowli komórkowych.

W niniejszym eksperymencie wykorzystaliśmy linię komórkową 46C14, będącą mysimi embrionalnymi komórkami macierzystymi z endogennym reporterem Sox1-GFP, w celu śledzenia różnicowania neuronalnego. Dzięki zastosowaniu tej linii komórkowej ekspresję białka Sox1, będącego markerem progenitorów neuronalnych, można wykryć za pomocą zielonej fluorescencji. Gęstość wysiewu jest krytycznym czynnikiem warunkującym różnicowanie neuronalne. Mysie embrionalne komórki macierzyste wysiewano na płytki 6-dołkowe z różną gęstoś...

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest różnicowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych w kierunku linii neuronalnej w bezserwatkowej monowarstwowej hodowli komórkowej. Jest to realizowane poprzez uprzednie pokrycie naczynia hodowlanego żelatyną. W drugim kroku embrionalne komórki macierzyste są zawieszone w formie zawiesiny pojedynczych komórek w medium do różnicowania, a następnie rozcieńczone do odpowiedniej gęstości wysiewu.W ostatnim kroku komórki są wysiewane na płytkę powlekaną żelem ENC. Ostatecznie, w celu potwierdzenia sukcesu różnicowania, stosuje się mikroskopię immunofluorescencyjną, aby zwizualizować interesujące nas markery neuronalne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wysianie komórek z odpowiednią gęstością jest kluczowe dla uzyskania dobrego różnicowania.Istnieje kilka czynników, które bezpośrednio i pośrednio wpływają na gęstość wysiewu. Przed wysiewaniem komórek ogrzać alikwot 1% żelatyny w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Następnie wymieszać żelatynę z 500 mililitrami ciepłego PBS i pokryć dno naczynia do hodowli komórkowej niewielką ilością roztworu, wystarczającą do pokrycia powierzchni podczas nakładania żelatyny.Subkonfluentną kulturę embrionalnych komórek macierzystych myszy przemyć dwukrotnie w PBS. Następnie do kultury dodać jeden mililitr odczynnika do dysocjacji. Po dwóch do pięciu minutach opukać naczynie, aby odłączyć monowarstwę i uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, a następnie zebrać kulturę do łącznie 10 mililitrów pożywki i odczynnika do dysocjacji komórek.Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj je w wirówce. Następnie, po ostrożnym odessaniu nadsączu, resuspenduj osad w 10 ml podgrzanego medium N2B27, uderzając go o ściankę probówki. Aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, odlicz teraz komórki, zapisując ich stężenie, a następnie resuspenduj je w podgrzanym medium N2B27 w odpowiedniej liczbie komórek na jednostkę objętości na dołek, zgodnie z tabelą.Następnie odessać żelatynę z naczynia hodowlanego i wysiać komórki, nie potrząsając pojemnikiem. Umieścić hodowle w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37°C i przy 5% dwutlenku węgla. Wymieniać pożywkę co jeden do dwóch dni.Po zastosowaniu świeżego N2 B27 komórki zaczną różnicować się i wykazywać ekspresję SOX1 w ciągu czterech do sześciu dni. Aby zabarwić komórki do obrazowania immunofluorescencyjnego, należy usunąć pożywkę różnicującą z kultur i utrwalić komórki w 500 µL 4% paraformaldehydu. Po 15 minutach należy dwukrotnie przemyć i permeabilizować komórki za pomocą 2 mL PBS z Tweenem. Następnie, w celu zablokowania niespecyficznego wiązania, należy inkubować komórki przez jedną godzinę.W jednym mililitrze PBS tween z dodatkiem surowicy, na wytrząsarce do płytek, po uprzednim przemyciu komórek zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Do kultur dodaje się 500 µL przeciwciał IgG mysich przeciwko beta three tubulinie i inkubuje przez noc na wytrząsarce do płytek w temperaturze 4 °C. Następnego dnia.Po przemyciu komórek inkubuj próbki z wtórnym przeciwciałem anty-US IgG znakowanym fluorescencyjnie w temperaturze pokojowej, z osłoną przed światłem i przy stałym kołysaniu przez jedną godzinę. Ponownie przemyj komórki, a następnie barw je w 500 µL DPI przez pięć minut. Na koniec, po ostatnim przemyciu komórek, przechowuj je w PBS tween przez maksymalnie dwa tygodnie w temperaturze 4 °C.Do momentu obrazowania. W tym eksperymencie zastosowano embrionalne komórki macierzyste myszy z endogennym reporterem GFP dla białka SOX1 w celu śledzenia różnicowania neuronalnego. W szóstym dniu komórki utrwalono i zabarwiono na marker neuronalny beta-III tubulinę.Przy optymalnej gęstości komórki różnicowały się w progenitorów neuronalnych i neurony, podczas gdy zastosowanie wyższej gęstości skutkowało zmniejszoną liczbą komórek wykazujących ekspresję SOX1 GFP oraz beta-III tubuliny. Objętość naczynia hodowlanego również wpływa na optymalną gęstość wysiewu. Na przykład komórki hodowane na płytce 96-dołkowej wymagają gęstości komórek około 10 razy wyższej niż w tym przypadku.Komórki wysiano do sześciodołowej płytki hodowlanej, aby osiągnąć optymalną oraz dwukrotnie wyższą gęstość konfluencji komórek. Podczas różnicowania embrionalne komórki macierzyste stopniowo zmieniają swoją morfologię. Na przykład na tych obrazach można zaobserwować morfologię komórek i kolonii od pierwszego do szóstego dnia po wysianiu przy optymalnej gęstości komórek.W czwartym dniu komórki zaczynają przekształcać się w progenitorów neuronalnych, co potwierdza pojawienie się zielonego sygnału fluorescencyjnego z raportora SOX one GFP. Do szóstego dnia większość komórek wykazuje pozytywny wynik dla SOX one. Choć spodziewana jest obecność niektórych komórek nieneuronalnych, po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak inicjować różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w monowarstwie hodowli komórkowej.

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Różnicowanie neuronów z mysich zarodkowych komórek macierzystych w kulturze monowarstwowej wolnej od surowicy

Opracowaliśmy nowy protokół w celu zwiększenia wydajności różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe in vitro. Zróżnicowane komórki ES nabyły cechy neuronów ruchowych, co potwierdzono poprzez wykazanie ekspresji markerów neuronalnych i neuronów ruchowych z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych.

Efektywna różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w neurony ruchowe

Film demonstruje protokół, który wykorzystuje pożywki bez surowicy do generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pożądane stężenie embrionalnych komórek macierzystych, zawieszonych w podłożu niezawierającym surowicy, jest posiewane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych żelatyną. Przy optymalnym zagęszczeniu komórek komórki wytwarzają autokrynne czynniki sygnalizacyjne, które wraz z czynnikami indukującymi różnicowanie neuronalne w pożywce wolnej...

Generowanie progenitorów nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych w kulturach jednowarstwowych bez surowicy

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Film prezentował metodę hodowli komórkowej do różnicowania neuronalnych komórek progenitorowych w neurony. Poprzez inkubację komórek w pożywce bogatej w składniki odżywcze uzupełnionej czynnikami wzrostu, komórki progenitorowe dojrzewały do neuronów z rozwiniętymi aksonami i dendrytami. Środek stabilizujący zapewniał żywotność komórek i chronił przed uszkodzeniami oksydacyjnymi w całym procesie różnicowania.

Różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych w neurony

Ten film demonstruje technikę różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w połączoną w sieć populację neuronów z funkcjonującymi synapsami. Przedstawiono w nim etapy związane z różnicowaniem embrionalnych komórek macierzystych w neurony, indukcją tworzenia sieci neuronalnej i wzbogacaniem kultury w neurony połączone w sieć.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w populację neuronów połączonych w sieć

Surowica stosowana w hodowlach embrionów zawiera nieznane składniki, które mogą wpływać na wynik eksperymentów, szczególnie w badaniach dotyczących interakcji sygnałowych. Tutaj wykorzystaliśmy system hodowli natlenionej bez surowicy i wykazaliśmy, że zarodki myszy w połowie ciąży hodowane przez 16-40 godzin wykazują rozwój morfologiczny porównywalny z zarodkami rozwijającymi się w macicy.

Rozwój embrionalny myszy w systemie hodowli całych zarodków bez surowicy

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Poznaj metodę różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy. Protokół umożliwia generowanie progenitorów neuronalnych i skalowanie do formatu wielodziurkowego.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Przeglądaj więcej filmów