Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy
14 maja 2015
Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.
Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy do linii nerwowej w hodowli komórek jednowarstwowych bez surowicy. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie naczynia hodowlanego żelatyną. W drugim etapie embrionalne komórki macierzyste są łączone w zawiesinę pojedynczej komórki w pożywce różnicowej i rozcieńczane do odpowiedniej gęstości posiewu.
W ostatnim etapie komórki są wysiewane na płytce pokrytej żelem ENC. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna służy do potwierdzenia sukcesu różnicowania poprzez wizualizację interesujących markerów neuronalnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ posiew o odpowiedniej gęstości ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia dobrego zróżnicowania.
Istnieje kilka czynników, które wpływają na gęstość poszycia, zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio. Przed posiewem komórki podgrzej porcję 1% żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż się rozpuszczą. Następnie wymieszaj żelatynę z 500 mililitrami ciepłego PBS i przykryj dno pojemnika do hodowli komórkowej tylko taką ilością roztworu, aby pokryć powierzchnię podczas powlekania żelatyny.
Przepłukać sub confluent culture mysich komórek macierzystych embr dwa razy w PBS. Następnie dodaj jeden mililitr odczynnika dysocjacyjnego do kultury. Po dwóch do pięciu minutach postukaj w naczynie, aby usunąć monowarstwę do zawiesiny pojedynczej komórki i zebrać kulturę w sumie 10 mililitrów pożywki i odczynnika do dysocjacji komórek.
Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj je w wirówce. Następnie, po dokładnym zassaniu supinatu, ponownie zawieś osad w 10 mililitrach wstępnie ogrzanego N two B 27, opierając się o bok rurki. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, należy teraz policzyć komórki rejestrujące stężenie i ponownie zawiesić je na odpowiedniej liczbie komórek na jednostkę objętości na studzienkę w podgrzanym N dwa B 27 zgodnie z tabelą.
Następnie odessać żelatynę z naczynia hodowlanego i pokryć komórki płytką bez obracania pojemnika. Umieść kultury w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Wymiana pożywki co jeden do dwóch dni.
Dzięki świeżemu N-2 B 27 komórki zaczną się różnicować i wykazywać skarpetki, jedną ekspresję w ciągu czterech do sześciu dni, aby wybarwić komórki do obrazowania immunofluorescencyjnego. Usuń pożywkę różnicującą z kultur i utrwal komórki w 500 mikrolitrach 4% Para formaldehydu po 15 minutach, umyj i przeniknij komórki dwa razy dwoma mililitrami PBS z tween. Następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą godzinnej inkubacji komórek.
W jednym mililitrze PBS tween uzupełniony surowicą na kołysku talerzowym po umyciu komórek, jak właśnie pokazano. Przy 500 mikrolitrach mysiej IgG przeciwko beta trzy tubuliny do kultur w celu nocnej inkubacji na kołysku płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia.
Po umyciu komórek inkubować próbki w znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałie drugorzędowym anty-US IgG w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem z kołysaniem po jednej godzinie. Ponownie opłucz komórki i zabarwij je w 500 mikrolitrach DPI przez pięć minut. Na koniec, po ostatnim umyciu komórek, przechowuj je w PBS tween przez okres do dwóch tygodni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Dopóki nie zostanie zobrazowany. W tym eksperymencie do śledzenia różnicowania neuronalnego wykorzystano embrionalne komórki macierzyste myszy z endogennym reporterem SOX one GFP. Szóstego dnia komórki zostały utrwalone i wybarwione pod kątem markera neuronalnego beta trójki tubuliny.
Przy optymalnej gęstości komórki różnicowały się w neuronalne komórki progenitorowe i neurony, podczas gdy umieszczenie go w większej gęstości skutkowało zmniejszeniem liczby komórek SOX jeden GFP i beta trzech tubuliny. Objętość pojemnika na hodowlę komórkową wpływa również na optymalną gęstość posiewu. Na przykład komórki hodowane na płytce 96-dołkowej wymagają gęstości komórek około 10 razy wyższej.
Komórki posiażone w sześciodołkowym naczyniu hodowlanym, aby osiągnąć optymalną i dwie gęstości komórek konfluencji. Podczas różnicowania embrionalne komórki macierzyste stopniowo zmieniają swoją morfologię. Na przykład na tych obrazach można zaobserwować morfologię komórek i kolonii od pierwszego do szóstego dnia po wypaleniu w optymalnej gęstości komórek.
Czwartego dnia komórki zaczynają stawać się neuronalnymi progenitorami, o czym świadczy pojawienie się zielonego sygnału fluorescencyjnego z reportera SOX one GFP. Szóstego dnia większość komórek jest dodatnia pod względem SOX jeden. Chociaż oczekuje się, że istnieją pewne komórki nienerwowe Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zainicjować różnicowanie nerwowe komórek macierzystych myszy emry w monowarstwowej hodowli komórkowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w progenitory neuronalne z wykorzystaniem beztłuszczowej metody monowarstwy. Podejście to pozwala na generowanie dojrzałych typów komórek neuronalnych i nadaje się do skalowania w formacie wielodobinkowym w celu przeprowadzenia screeningu związków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wstęp
- Embrionalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Progenitory neuronalne są niezbędne do badania rozwoju układu nerwowego.
- Metody hodowli bezsurowiczych mogą zwiększyć powtarzalność.
- Odpowiednia gęstość wysiewu jest kluczowa dla skutecznego różnicowania.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody generowania progenitorów neuronalnych.
- Ułatwienie badania procesów specyfikacji neuronalnej.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego screeningu związków wpływających na różnicowanie neuronalne.
Zastosowane metody
- Powlekanie naczyń hodowlanych żelatyną.
- Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z embrionalnych komórek macierzystych.
- Wysiewanie komórek na płytki powleczone żelatyną.
- Wykorzystanie mikroskopii immunofluorescencyjnej w celu potwierdzenia sukcesu różnicowania.
Główne wyniki
- Skuteczne różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w neuralne komórki progenitorowe.
- Wizualizacja markerów neuralnych potwierdzająca różnicowanie.
- Ustalenie optymalnych gęstości wysiewu dla efektywnego różnicowania.
- Metoda jest skalowalna i może być stosowana w badaniach przesiewowych związków chemicznych.
Wnioski
- Metoda monowarstwy bezsurowiczej jest skuteczna w generowaniu progenitorów neuronalnych.
- Immunofluorescencja jest niezawodną techniką oceny różnicowania.
- Niniejszy protokół może zostać dostosowany do różnych zastosowań badawczych w neurologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia skalowalną generację progenitorów neuronalnych z embrionalnych komórek macierzystych myszy w zdefiniowanym, wolnym od surowicy systemie monowarstwowym, co wspiera wczesny etap walidacji punktów uchwytu oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w procesie poszukiwania leków w neurobiologii. Metoda ta zapewnia reprodukowalną, ilościową platformę do oceny wpływu związków na różnicowanie neuronalne, co ułatwia identyfikację wiodących cząsteczek i zwiększa wiarygodność predykcyjną w potokach przedklinicznych. Jej kompatybilność z liniami reporterowymi oraz formatami kultur o wysokiej gęstości pozwala na integrację z procesami przesiewowymi w badaniach nad modulacją szlaków i zaangażowaniem punktów uchwytu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów specyfikacji neuronalnej oraz funkcjonalną walidację celów neurorozwojowych poprzez różnicowanie ukierunkowane.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zdefiniowany system bezsurowiczy, który ogranicza zmienność i zwiększa powtarzalność między eksperymentami a liniami komórkowymi.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę zmian wywołanych przez związki chemiczne w wydajności progenitorów neuronalnych i ekspresji markerów, dostarczając informacji o zaangażowaniu celu i modulacji szlaków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie homogennej populacji progenitorów neuronalnych, odpowiedniej do przesiewania związków chemicznych oraz oceny fenotypowej różnicowania neuronalnego.
- Wartość operacyjna: Możliwość adaptacji do formatów wielodołkowych (np. 96-dołkowych) z optymalizacją skalowalnej gęstości wysiewu, co umożliwia zastosowania o średniej i wysokiej przepustowości.
- Gotowość do analizy: Kompatybilność z immunofluorescencją, cytometrią przepływową oraz odczytami molekularnymi w celu wieloparametrycznej analizy wydajności różnicowania i ekspresji markerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia przejście od generowania progenitorów neuronalnych do dojrzewania funkcjonalnych neuronów i gleju, co wspiera modelowanie procesów związanych z chorobami.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Ułatwia badanie determinacji linii komórkowych i dynamiki różnicowania z wykorzystaniem linii reporterowych (np. SOX1-GFP) w celu monitorowania specyfikacji neuronalnej w czasie rzeczywistym.
- Użyteczność przedkliniczna: Pozwala na ocenę wpływu związków na dojrzewanie neuronalne i różnicowanie glejowe, co wspiera badania z zakresu farmakologii bezpieczeństwa i mechanizmów działania.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celów terapeutycznych poprzez analizę mechanistyczną różnicowania neuronów oraz umożliwiając opracowanie testów do przesiewania związków w ramach portfolio badań nad układem nerwowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących ścieżek rozwoju neurologicznego oraz walidację celów poprzez ukierunkowane różnicowanie i odczyty oparte na markerach.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów w hodowli monowarstwowej, przy czym gęstość wysiewu jest krytycznym parametrem dla spójnego generowania progenitorów neuronalnych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki za pomocą immunofluorescencji (np. SOX1-GFP, βIII-tubulin) i cytometrii przepływowej w celu pomiaru wydajności różnicowania oraz odpowiedzi na zastosowane związki.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne generowanie progenitorów neuronalnych z późniejszym dojrzewaniem do funkcjonalnych neuronów i gleju, co wspiera ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zdefiniowany, skalowalny protokół umożliwia ponowne zastosowanie w wielu liniach ESC, naczyniach hodowlanych i kampaniach przesiewowych, co zmniejsza nakład pracy związany z ponownym opracowywaniem metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w ścieżkach różnicowania neuronów.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane warunki bezsurowicze poprawiają powtarzalność i skalowalność w różnych laboratoriach i liniach komórkowych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) poprzez umożliwienie wczesnej oceny wpływu związków na determinację linii neuronów i efektywność różnicowania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w dziedzinie neuronauk w oparciu o analizę ryzyka poprzez mechanistyczne ograniczanie ryzyk i walidację szlaków sygnałowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie hodowli komórek macierzystych, technik różnicowania oraz mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Zależne od dostępu do inkubatorów CO2, wirówek, mikroskopów oraz odczynników takich jak żelatyna, N2B27, odczynniki do dysocjacji i przeciwciała.
- Wymaga standaryzacji gęstości wysiewu oraz procedur powlekania żelatyną pomiędzy użytkownikami i ośrodkami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do różnych linii ESC lub konstruktów reporterowych może wymagać optymalizacji gęstości wysiewu i czasu różnicowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na gęstość wysiewu oraz konieczność starannej dysocjacji monowarstwy, aby uniknąć agregacji lub niepełnego uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
