Name: Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metaproteomikę mikrobiologiczną organizmów wodnych: izolację białek i DNA z biomasy morskiej, trawienie trypsynowe i analizę spektrometrii mas LC-MS/MS. Ta metoda umożliwia kompleksowe badanie ekosystemów morskich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Marcosowi Di Falco za jego wiedzę i porady dotyczące przygotowania próbek do nano-LC MS/MS, a także dr Zoranowi Musikowi z University of Regina za analizę LC MS/MS. Prace te były wspierane przez NSERC (DG402214-2011) i CRC (950-221184). Waszyngton był wspierany przez Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems oraz FQRNT.

1. Przygotuj odczynniki
<ol>
	<li>Przygotować roztwór ekstrakcyjny SDS: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5 % glicerol, 10 mM EDTA i 1 % SDS. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować podstawowe odczynniki potrzebne do żelu poliakrylamidowego.
	<ol>
		<li>Przygotować 1,5 M Tris-HCL pH 8,8. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>0,5 M Tris-HCL pH 6,8. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować 10 % SDS. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwory potrzebne do trawienia trypsyny w żelu i ekstrakcji peptydów.
	<ol>
		<li>Przygotować 100 mM wodorowęglanu amonu. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj akcje 1 mln DTT. Zawieszony w 100 mM wodorowęglanie amonu i przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotuj 550 mM zapasów jodoacetamidu. Zawieszony w 100 mM wodorowęglanie amonu i przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotuj zapasy trypsyny 100 ng/μl. Porcję 60 μl rozlać do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór ekstrakcyjny: 1% kwas mrówkowy, 2% acetonitryl.</li>
		<li>Przygotować roztwór do ponownego spożycia: 5% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przeprowadź lizę komórek w jednostce filtrującej z wkładem z komórkami zachowanymi w roztworze stabilizacji RNA
<ol>
	<li>Usunąć roztwór stabilizujący RNA z zespołu filtrującego z wkładem filtrującym (1,5 ml) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml dołączonej na końcu filtra typu luer-lock.</li>
	<li>Odwirować probówkę mikrowirówkową o pojemności 2 ml przez 10 minut przy 17 000 x g, aby osadzać wszelkie resztki komórkowe. Odbywa się to tak, aby filtr w kroku 2.3 nie zatykał się.</li>
	<li>Przenieść supernatant do ultraodśrodkowego filtra o temperaturze 10 K w celu wychwycenia wszelkich białek pochodzących z komórek, które uległy lizie w wyniku zamrożenia/rozmrożenia próbki. Nie wyrzucaj granulek. Zostanie on użyty w kroku 2.5. Odwirować ultraodśrodkową jednostkę filtracyjną przy 3 270 x g przez 30 minut lub do momentu, gdy objętość zmniejszy się do około 600 μl.</li>
	<li>Stopić końcówkę końcówki p10 i zablokować stronę filtra nabojowego bez luer-lock otwartym końcem końcówki. Zapewni to, że bufor ekstrakcyjny i biomasa nie wydostaną się na zewnątrz podczas etapów 2.5-2.7.</li>
	<li>Zawiesić granulkę w 1 ml roztworu ekstrakcyjnego SDS i pipetować ją do oryginalnego wkładu filtrującego. Najprostszym sposobem pipetowania do zespołu filtrującego z wkładem jest ułożenie końcówki p200 na końcówce p1000 i używanie tej podwójnej końcówki do pipetowania.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu ekstrakcyjnego SDS do jednostki filtrującej z wkładem, tak aby całkowita objętość wynosiła około 2 ml i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, obracając w piecu do hybrydyzacji. Umieść 3 pogniecione chusteczki laboratoryjne na dnie stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Parafilm oba końce wkładu filtracyjnego zamknęły się i włożyły wkład filtrujący do probówki o pojemności 50 ml. Zamknij pokrywkę i włóż rurkę do pieca do hybrydyzacji.</li>
	<li>Po 10 minutach umieść filtr Sterivex na piankowym pływaku i zabezpiecz go strzykawką o pojemności 5 ml na końcu typu luer-lock. Pływać i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Pozwól jednostce filtrującej z wkładem ostygnąć i obracaj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (jak w kroku 2.6).</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml usunąć roztwór ekstrakcyjny SDS/lizat komórkowy z filtra do tego samego ultraodśrodkowego zespołu filtracyjnego, co poprzednio (krok 2.3). Dodać 1 ml świeżego roztworu ekstrakcyjnego SDS do jednostki filtrującej z wkładem i mieszać ręcznie przez 30 sekund, a następnie wytłoczyć do ultraodśrodkowego zespołu filtrującego za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml. Ma to na celu przepłukanie jednostki filtrującej wkład, aby upewnić się, że wszystkie białka zostały usunięte.</li>
	<li>Odwirować na ultraodśrodkowym zespole filtrującym przez 45 minut przy 3 270 x g lub do momentu, gdy objętość w jednostce filtrującej będzie mniejsza niż 600 μl.</li>
	<li>Wyrzuć przepływowy i uzupełnij ultraodśrodkową jednostkę filtracyjną świeżym roztworem ekstrakcyjnym SDS.</li>
	<li>Odwirować jednostkę filtrującą przez kolejne 45 minut przy 3,270 x g.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.11 i 2.12 jeszcze dwa razy. Upewnij się, że końcowa objętość w ultraodśrodkowym zespole filtrującym wynosi co najwyżej 600 μl na koniec ostatniego wirowania.</li>
	<li>W tym momencie podziel koncentrat na dwie części. Jedna frakcja zostanie wykorzystana do wytrącania DNA, a druga do wytrącania białek. 
	Uwaga: Ilość frakcjonowania zależy od ilości biomasy, która została przefiltrowana i zamierzonych zastosowań produktów. W naszym przypadku dzielimy koncentrat z 10% w kierunku wytrącania DNA i 90% w kierunku wytrącania białka.</li>
</ol>
3. Wytrącanie białka
<ol>
	<li>Dodać 4 objętości metanolu:acetonu (50:50) do jednej objętości koncentratu i wirować przez 10 sekund. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wirować z prędkością 17 000 x g przez 30 minut. Zdekantować supernatant i pozostawić granulkę (może być niewidoczna) do wyschnięcia w speedvacu przez 1 godzinę (lub do wyschnięcia). 
	Uwaga: Nie należy nadmiernie suszyć granulek, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie.</li>
	<li>Zawiesić osad w 25 μl roztworu ekstrakcyjnego SDS. Odstawić na godzinę, a następnie ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Określ ilościowo białko za pomocą zestawu do oznaczania białek i instrukcji producenta.</li>
</ol>
4. Wytrącanie DNA
<ol>
	<li>Dodać roztwór ekstrakcyjny SDS do frakcji koncentratu, która ma być użyta do wytrącania DNA do oznaczenia 500 μl. Ten krok ma po prostu na celu zwiększenie objętości roztworu, co ułatwi pracę z nim.</li>
	<li>Dodać 0,583 objętości odczynnika do wytrącania białek (takiego jak odczynnik do wytrącania białek MPC) i wirować przez 10 sekund. Powinieneś zobaczyć białą formę osadu. 
	Uwaga: Zastosowaliśmy również metody ekstrakcji DNA fenolu: chloroformu, ale jest to trudniejsze ze względu na małe objętości. Uzyskaliśmy lepszą wydajność DNA przy użyciu odczynnika do wytrącania białek MPC.</li>
	<li>Wirować przy 17 000 x g i 4 °C przez 10 min.</li>
	<li>Przenieść supernatant do kolejnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 0,95 objętości izopropanolu. Odwróć 30-40 razy.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Spłukać dwukrotnie 750 μl 70% etanolu.</li>
	<li>Usunąć jak najwięcej etanolu za pomocą pipetowania, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. 
	Uwaga: Nie należy przesuszać DNA, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie.</li>
	<li>Zawiesić w 25 μl buforu o niskim poziomie TE, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).</li>
	<li>Określ ilościowo DNA za pomocą zestawu do oznaczania dsDNA i instrukcji producenta. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym (1%) na 3 μl DNA, aby sprawdzić jego jakość.</li>
</ol>
5. SDS-PAGE Żel z białek
<ol>
	<li>Przygotować bufor do próbek (950 μl buforu do próbek Laemmliego i 50 μl β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość na 15 μg białka lub maksymalnie 20 μl do równej objętości buforu próbki i gotować przez 4 minuty. Próbki można teraz przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykonania SDS-PAGE.</li>
	<li>Przygotuj 10% żel rozpuszczający akryloamid z 5% żelem do układania w stosy.</li>
	<li>Załadować żel próbkami i 4 μl drabinki białkowej. Uruchom żel przy stałym napięciu 120 V, aż znacznik drabinkowy 250 kDa dotrze do żelu rozdzielczego.</li>
	<li>Zabarwić żel za pomocą bejcy na bazie coomassie zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
6. Trawienie trypsyny w żelu i ekstrakcja peptydów
Uwaga: Wszystkie kroki od tego momentu do 6.10 są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
<ol>
	<li>Odetnij nadmiar żelu pod znakiem drabiny 10 kDa dla każdego pasa. Każdy pas ruchu będzie analizowany na MS/MS osobno. Pokrój każdą linię na kwadraty o wymiarach 1 mm x 1 mm, aby zwiększyć powierzchnię, a następnie umieść wszystkie kwadraty z pasa w nisko wiążącej probówce do mikrowirówki. Powtórz to dla wszystkich pasów ruchu. (Można użyć 1% kwasu octowego, aby zapobiec wysychaniu żelu i trudnościom w cięciu). 
	Uwaga: Minimalizacja zanieczyszczenia ma kluczowe znaczenie na tym etapie, dlatego krojenie żelu odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego na szklanej formie żelowej SDS-PAGE używanej do produkcji żelu.</li>
	<li>Usuwanie plam
	<ol>
		<li>Dozować 50 μl 100 mM wodorowęglanu amonu do każdej probówki o niskim stopniu wiązania, zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Odessać i wyrzucić 150 μl.</li>
		<li>Powtórz kroki 6.2.1 i 6.2.2.</li>
		<li>Odessać i wyrzucić 95 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i odczekać 5 min. Odessać i wyrzucić 45 μl i odczekać 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>redukcja
	<ol>
		<li>Dozować 50 μl naziemnej telewizji cyfrowej (10 mM, rozcieńczony w 100 mM wodorowęglanu amonu), zamknąć nakrętkę i odczekać 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alkilowania
	<ol>
		<li>Dozować 50 μl jodoacetamidu (55 mM, rozcieńczonego w 100 mM wodorowęglanu amonu), zamknąć nakrętkę i odczekać 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dozować 100 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Odessać i wyrzucić 195 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>myć
	<ol>
		<li>Dozować 50 μl wodorowęglanu amonu, zamknąć nakrętkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. Odessać i wyrzucić 120 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i odczekać 5 min. Odessać i wyrzucić 45 μl.</li>
		<li>Dozować 50 μl acetonitrylu, odczekać 5 minut.</li>
		<li>Odessać i wyrzucić 75 μl i odczekać 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>trawienie
	<ol>
		<li>Dozuj 25-30 μl 6 ng/μl trypsyny (aż wszystkie fragmenty żelu zostaną pokryte). Zamknij nakrętkę i odczekaj 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować przez noc (minimum 4,5 godziny) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odstawić w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja i transfer peptydów
	<ol>
		<li>Dozować 30 μl roztworu ekstrakcyjnego i przykryć pokrywką na 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Odessać 30 μl i dozować zasysaną objętość do nowej, oznakowanej probówki o niskiej zawartości wiązania.</li>
		<li>Dozować 12 μl roztworu ekstrakcyjnego i 12 μl acetonitrylu do oryginalnej probówki (z żelem). Zamknij nakrętkę i inkubuj przez 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Odessać 15 μl i umieścić w nowej probówce.</li>
		<li>Powtórz kroki (6.9.3 i 6.9.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść nowe rurki w SpeedVac do wyschnięcia.</li>
	<li>Zawiesić w 50 μl roztworu do refuzji. Wirować na podłożu przez 10 minut, aby ponownie zawiesić.</li>
	<li>Odpipetować roztwór peptydu do fiolek nano/LC lub płytek 96-dołkowych odpowiednich do pracy nano/LC MS/MS.</li>
</ol>

<ol><li>Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+and+their+roles+in+fundamental+biogeochemical+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles.</a> Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).</li>
<li>El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+assemblages+and+short-lived+blooms+in+coastal+northwest+Atlantic+Ocean+bacterioplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton.</a> Environmental microbiology. , (2014).</li>
<li>Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrography+shapes+bacterial+biogeography+of+the+deep+Arctic+Ocean%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean.</a> The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).</li>
<li>Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+16S+ribosomal+RNA+sequences+for+phylogenetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972(1986).</li>
<li>Williams, T. J., Long, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metaproteomic+assessment+of+winter+and+summer+bacterioplankton+from+Antarctic+Peninsula+coastal+surface+waters%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters.</a> The ISME journal. 6 (10), (2012).</li>
<li>Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flexibility+of+enigmatic+SAR324+revealed+through+metagenomics+and+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics.</a> Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).</li>
<li>Venter, J. C., Remington, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+genome+shotgun+sequencing+of+the+Sargasso+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea.</a> Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).</li>
<li>Tyson, G. W., Chapman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+structure+and+metabolism+through+reconstruction+of+microbial+genomes+from+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment.</a> Nature. 428, 37-43 (2004).</li>
<li>Schneider, T., Riedel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+proteomics%3A+analysis+of+structure+and+function+of+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities.</a> Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li>
<li>Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaproteomics%3A+harnessing+the+power+of+high+performance+mass+spectrometry+to+identify+the+suite+of+proteins+that+control+metabolic+activities+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities.</a> Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).</li>
<li>Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+quantitative+metaproteomics+and+protein-stable+isotope+probing+into+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology.</a> The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).</li>
<li>Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteorhodopsin+in+the+ubiquitous+marine+bacterium+SAR11%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11.</a> Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).</li>
<li>Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaproteomic+analysis+of+a+winter+to+spring+succession+in+coastal+northwest+Atlantic+Ocean+microbial+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton.</a> The ISME journal. , 1-13 (2014).</li>
<li>Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metaproteomics+reveals+ocean-scale+shifts+in+microbial+nutrient+utilization+and+energy+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction.</a> The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).</li>
<li>Williams, T. J., Cavicchioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+metaproteomics%3A+deciphering+the+microbial+metabolic+food+web%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web.</a> Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).</li>
<li>Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+nutrient+stresses+at+intersecting+Pacific+Ocean+biomes+detected+by+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers.</a> Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).</li>
<li>Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+synthase+interreplacement+in+diatom+cultures+and+communities%3A+Implications+for+the+persistence+of+B12+use+by+eukaryotic+phytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton.</a> Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).</li>
<li>Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawley%2C+AK+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).</li>
<li>Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+volume+%281-3L%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).</li>
<li>Thompson, M., Chourey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+approach+for+deep+proteome+measurements+from+small-scale+microbial+biomass+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical%22%5BJournal%5D)">Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples.</a> Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).</li>
<li>Lu, X., Digestion Zhu, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLu%2C+X+%22Tube-Gel%22">Tube-Gel</a>. , 1948-1958 (2005).</li>
<li>Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+a+detergent+lysis%2Fcleanup+methodology+with+intact+protein+fractionation+for+enhanced+proteome+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization.</a> Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).</li>
<li>Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+proteomic+characterization+of+%22Candidatus+Nitrosopelagicus+brevis%22%3A+An+ammonia-oxidizing+archaeon+from+the+open+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).</li>
<li>Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+expedition%3A+northwest+Atlantic+through+eastern+tropical+Pacific%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific.</a> PLoS biology. 5 (3), e77(2007).</li>
<li>Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+chemolithoautotrophy+among+ubiquitous+bacteria+lineages+in+the+dark+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean.</a> Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).</li>
<li>Rinke, C., Schwientek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+microbial+proteome+preservation+techniques+applicable+to+autonomous+environmental+sample+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection.</a> Frontiers in microbiology. 2, 215(2011).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li>
<li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Informatics+and+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3(2012).</li>
<li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGAN+analysis+of+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li>
<li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li>
<li>Ea Ottesen,, Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li>
<li>Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Konserwacja próbki jest kluczem do badań metaproteomicznych, a wcześniejsze prace wykazały, że roztwór stabilizujący RNA jest użytecznym buforem do przechowywania komórek przed ekstrakcją białka 28. Idealnie byłoby, gdyby próbki były przechowywane in situ , aby zanegować zmiany w ekspresji białek podczas obchodzenia się z 33,34. W rzeczywistości opracowano technologie pobierania próbek i utrwalania in situ , które pozwalają na autonomiczne pobieranie i przechowywanie próbek za pomo...

Mikroorganizmy są wszechobecne i odgrywają istotną rolę w cyklach biogeochemicznych Ziemi 1. Obecnie dostępnych jest wiele podejść molekularnych do charakteryzowania struktury i funkcji społeczności drobnoustrojów. Najczęściej spotykana jest analiza sekwencji genów 16S rRNA amplifikowanych metodą PCR ze środowiskowego DNA 2–4. Wadą analizy genu 16S rRNA jest to, że dostarcza ona jedynie informacji na temat tożsamości filogenetycznej i struktury społeczności, z niewielką ilością informacji na temat funkcji metabolicznej. Natomiast podejścia takie jak metagenomika, metatranskryptomika i metaproteomika dostarczają informacji na temat struktury społeczności i metabolizmu. Metagenomika, czyli analiza zawartości genów w zbiorowisku organizmów, dostarcza informacji o strukturze i potencjale funkcjonalnym zbiorowiska 5–8. Chociaż ten potencjał funkcjonalny jest silny, może nie odpowiadać aktywności metabolicznej organizmów. Genotyp organizmu jest reprezentowany przez jego geny, z których każdy może być transkrybowany do RNA i dalej tłumaczony na białko, co daje fenotyp. Dlatego, aby pomóc w zrozumieniu funkcjonalnej aktywności mikrobiologicznej w środowisku, należy przeprowadzić analizę postgenomiczną 9. Metatranskryptomika, czyli analiza transkryptów RNA, jest przydatna, ponieważ ujawnia, które geny są transkrybowane w danym środowisku. Jednak poziomy mRNA nie zawsze odpowiadają odpowiadającym im poziomom białka ze względu na regulację translacyjną, okres półtrwania RNA oraz fakt, że dla każdego mRNA 10 można wygenerować wiele kopii białka.
Z tych powodów metaproteomika jest obecnie uznawana za ważne narzędzie mikrobiologii środowiskowej. Powszechne analizy metaproteomiczne wykorzystują podejście proteomiczne typu shotgun, w którym prawie pełny zestaw białek w złożonej próbce jest jednocześnie oczyszczany i analizowany, zwykle poprzez trawienie enzymatyczne do peptydów i analizę na spektrometrze masowym. Późniejsza tandemowa spektrometria mas (MS/MS) "odcisk palca peptydu" jest stosowana do określenia sekwencji peptydów i potencjalnego białka pochodzenia poprzez przeszukiwanie bazy danych białek (w celu zapoznania się z przeglądem patrz 11). Prace proteomiczne przeszły długą drogę w ciągu ostatnich 25 lat dzięki zwiększonej dostępności danych genomicznych oraz wzrostowi czułości i dokładności spektrometrów masowych, co pozwala na wysokoprzepustową identyfikację i kwantyfikację białek 11,12. Ponieważ białka są końcowym produktem ekspresji genów, dane metaproteomiczne mogą pomóc w ustaleniu, które organizmy są aktywne w danym środowisku i jakie białka eksprymują. Jest to korzystne przy próbie określenia, w jaki sposób określony zestaw zmiennych środowiskowych wpłynie na fenotyp organizmu lub społeczności. Na wczesnym etapie badania metaproteomiczne oparte na MS/MS w oceanie wykorzystano do identyfikacji określonych białek w docelowych liniach drobnoustrojów, przy czym pierwsze badanie koncentrowało się na napędzanej światłem proteorodopsyny pompy protonowej w bakteriach morskich SAR11 13. Niedawne analizy metaproteomiczne pozwoliły na wyjaśnienie zróżnicowanych wzorców ekspresji białek w złożonych społecznościach. Przykładem może być identyfikacja czasowych zmian w metabolizmie na wybrzeżu północno-zachodniego Oceanu Atlantyckiego 14 lub na Półwyspie Antarktycznym 5. Inne badania opisywały różnice we wzorcach ekspresji białek w różnych skalach przestrzennych, na przykład wzdłuż geograficznego transektu od wiru oceanicznego o niskiej zawartości składników odżywczych do wysoce produktywnego przybrzeżnego systemu upwellingu 15. W celu dalszych przeglądów metaproteomiki polecamy Schneider i in. (2010) 9 oraz Williams i wsp. (2014) 16. W ostatnich latach zastosowano również ukierunkowaną proteomikę w celu ilościowego określenia ekspresji określonych szlaków metabolicznych w środowisku 17,18.
Istnieją trzy główne fazy analizy metaproteomicznej. Pierwszą fazą jest przygotowanie próbki, która obejmuje pobranie próbki, lizę komórek i koncentrację białka. Pobieranie próbek w mikrobiologii morskiej często obejmuje filtrację wody morskiej przez filtr wstępny w celu usunięcia większych komórek eukariotycznych, cząstek i bakterii związanych z cząstkami, a następnie filtrację w celu wychwycenia wolno żyjących komórek drobnoustrojów, zwykle przy użyciu jednostki filtrującej z wkładem 0,22 μm 19,20. Filtry te są zamknięte w plastikowym cylindrze, a protokół lizy komórek i ekstrakcji białek, który można przeprowadzić w jednostce filtrującej, byłby cennym narzędziem. Po uzyskaniu biomasy komórki muszą zostać poddane lizie, aby umożliwić ekstrakcję białka. Można zastosować kilka metod, w tym lizę glizy na bazie chlorowodorku guanidyny 21 i metody lizy oparte na dodecylosiarczanie sodu (SDS). Chociaż detergenty, takie jak SDS, są bardzo skuteczne w niszczeniu błon i rozpuszczaniu wielu rodzajów białek, stężenia tak niskie jak 0,1% mogą zakłócać trawienie białek i analizę SM 22. Poważne zaniepokojenie budzi negatywny wpływ SDS na efektywność trawienia trypsyny, zdolność rozdzielczą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami oraz tłumienie lub akumulację jonów wewnątrz źródła jonów 23.
Druga faza to frakcjonowanie i analiza, gdzie białka są poddawane trawieniu enzymatycznemu, a następnie analizie LC MS/MS, co daje wzór fragmentacji m/z, który może być użyty do ustalenia podstawowej sekwencji aminokwasowej początkowego peptydu tryptycznego. Można przeprowadzić różne metody mineralizacji w zależności od rodzajów użytych detergentów, a także dalszego przebiegu spektrometrii mas. W naszym protokole elektroforeza 1-D PAGE, po której następuje usunięcie SDS z żelu, jest stosowana w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń detergentem. Analiza białek, które są trudne do rozpuszczenia, takich jak białka błonowe, wymaga użycia wysokich stężeń SDS lub innych detergentów. Prowadzi to do problemów z kompatybilnością z elektroforezą żelową SDS. Jeśli cel badania wymaga solubilizacji tych trudnych do rozpuszczania białek, można zastosować system rurka-żel 22,24. Metoda rurkowo-żelowa polega na włączeniu białek do matrycy żelowej bez użycia elektroforezy. Następnie wszelkie detergenty używane do rozpuszczania są usuwane przed trawieniem białka.
Trzecia faza to analiza bioinformatyczna. W tej fazie dane dotyczące peptydów MS/MS są przeszukiwane w bazie danych translowanych sekwencji nukleotydów w celu określenia, które peptydy i białka są obecne w próbce. Identyfikacja peptydów zależy od bazy danych, w której są przeszukiwane. Dane metaproteomiczne morskie są często przeszukiwane w bazach danych składających się z genomów referencyjnych, danych metagenomicznych, takich jak zestaw danych Global Ocean Sampling 25, a także genomów amplifikowanych pojedynczymi komórkami z nieuprawianych linii 26,27. Identyfikacja białek może być również zwiększona poprzez włączenie sekwencji metagenomicznych z tej samej próbki, z której uzyskano dane metaproteomiczne 5.
Tutaj udostępniamy protokół generowania peptydów odpowiednich do analizy opartej na MS/MS z biomasy mikrobiologicznej zebranej przez filtrację i przechowywanej w roztworze stabilizującym RNA. Opisany tutaj protokół pozwala na wyizolowanie DNA i białka z tej samej próbki, tak aby wszystkie etapy prowadzące do wytrącenia białka i DNA były identyczne. Z praktycznego punktu widzenia wymagana jest mniejsza filtracja, ponieważ do ekstrakcji białek i DNA wymagany jest tylko jeden filtr. Pragniemy również potwierdzić, że protokół ten powstał w wyniku połączenia, adaptacji i modyfikacji dwóch wcześniej opublikowanych protokołów. Etapy lizy komórek są zaadaptowane z Saito i in. (2011) 28, a składnik trawienia trypsyny w żelu jest zaadaptowany z Shevchenko i in. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0,22 &mu; m jednostka filtrująca</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Próbkowanie</td></tr><tr><td>RNAlater Roztwór stabilizacyjny</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Próbkowanie</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1 lub TB0196-500G Ekstrakcja</td><td>białka / SDS PAGE żel</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Ekstrakcja białka</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>15-21-3</td><td>Ekstrakcja białka / SDS PAGE żel</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>6381-92-6</td><td>Ekstrakcja białka</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Ekstrakcja białka</td></tr><tr><td>10K Amicon Filter</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Ekstrakcja białek</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td></td></tr><tr><td>Aceton Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>Odczynnik do wytrącania</td></tr><tr><td>białek MPC</td><td>Epicenter</td><td>mmP03750</td><td>Wytrącanie DNA</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>Wytrącanie DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania ilościowego DNA Qubit dsDNA BR</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Zestaw do oznaczania ilościowego DNA</td></tr><tr><td>Qubit Protein Zestaw do oznaczania białek</td><td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>Kwantyfikacja białek</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Bio Basic</td><td>57-50-1</td><td>SDS PAGE żel</td></tr><tr><td>TEM</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE</td></tr> żel <tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE żel</td></tr><tr><td>30% Akrylamid</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>Żel SDS PAGE</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Żel SDS PAGE</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE</td></tr> żel <tr><td>B-merkaptoetanol</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE</td></tr><tr><td>żel Laemmli Bufor do próbek</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE żel</td></tr><tr><td>Precision Plus Białko Kalejdoskop Drabinka</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE żel</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>W żelu Trypsyna</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>Płyn do trawienia trypsyny w żelu</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Trawienie trypsyny w żelu</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>Trawienie</td></tr> <tr>trypsyny w żelu<td>HPLC klasa H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>W żelu Trawienie trypsyny</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Bio Basic</td><td>144-48-9</td><td>Trawienie trypsyny w żelu</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Trawienie trypsyny w żelu</td></tr><tr><td>Białko LoBind Tube 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>Trawienie trypsyny w żelu</td></tr><tr><td>2 ml Fiolka ROBO 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>Trawienie trypsyny w żelu</td></tr><tr><td>Wkładka PP BM, bez sprężyny</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td><td>Trawienie trypsyny w żelu</td></tr></tbody></table>

przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Technologie metaomiczne, takie jak metagenomika, metatranskryptomika i metaproteomika, mogą pomóc w zrozumieniu struktury i metabolizmu społeczności drobnoustrojów. Chociaż metagenomika jest potężna, sama w sobie może jedynie wyjaśnić potencjał funkcjonalny. Z drugiej strony, metaproteomika umożliwia opis wyrażonego in situ metabolizmu i funkcji zbiorowiska. W tym miejscu opisujemy protokół lizy komórek, izolacji białek i DNA, a także trawienia i ekstrakcji peptydów z morskich komórek drobnoustrojów zebranych na jednostce filtrującej z wkładem (takiej jak jednostka filtrująca Sterivex) i przechowywanej w roztworze stabilizującym RNA (takim jak RNAlater). W badaniach proteomicznych opartych na spektrometrii mas identyfikacja peptydów i białek odbywa się poprzez porównanie widm masowych tandemowych peptydów z bazą danych translowanych sekwencji nukleotydów. Uwzględnienie metagenomu próbki w bazie danych wyszukiwania zwiększa liczbę peptydów i białek, które można zidentyfikować na podstawie widm masowych. W związku z tym w tym protokole DNA jest izolowane z tego samego filtra, który może być następnie wykorzystany do analizy metagenomicznej.

W ramach demonstracji przeprowadziliśmy protokół na dwóch próbkach wody morskiej pobranych z powierzchni oraz z maksimum chlorofilu w oceanie przybrzeżnym w północnej Kanadzie. Podczas rejsu 6-7 L wody morskiej przepuszczono przez filtr wstępny GF/D 3 µm, a następnie komórki mikrobowe zebrano na wkład filtracyjny 0,22 µm zgodnie z protokołem Walsh et al. 20. Komórki natychmiast przechowywano w roztworze stabilizującym RNA do czasu dalszej obróbki. Po powrocie do laboratorium przeprowadziliśmy protokół...

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Celem niniejszej procedury jest ekstrakcja białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej pochodzącej z wody morskiej, a następnie otrzymanie peptydów tryptycznych do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas. Jest to realizowane poprzez wstępną lizę komórek uprzednio zgromadzonych na filtrze wkładzie. Drugim krokiem jest zagęszczenie lizatu komórkowego przy użyciu ultraodśrodkowych jednostek filtrujących.Następnie lizat rozdziela się na dwie frakcje: jedną do wytrącania białek i drugą do wytrącania DNA. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie trawienia białek trypsyną w żelu i ekstrakcja peptydów odpowiednich do analizy metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. W końcowej fazie można zastosować analizę bioinformatyczną w celu identyfikacji białek wykazujących ekspresję w próbce, natomiast wyizolowane DNA można wykorzystać do analiz metagenomicznych i/lub analiz genu 16 S-R-R-N-A.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest możliwość jednoczesnej izolacji białka i DNA z tej samej próbki. Aby rozpocząć, należy wypchnąć roztwór stabilizujący RNA z jednostki filtra kartridżowego do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, używając strzykawki 60 ml podłączonej do końcówki lure lock wirówki filtracyjnej. Probówkę do mikrowirówki o pojemności 2 ml wiruje się przez 10 minut przy 17 000 ×g w celu osadzenia resztek komórkowych. Następnie nadsącz przenosi się do jednostki filtra ultrawirówkowego 10 K, aby wychwycić białka pochodzące z komórek, które uległy lizie w próbce.Nie wyrzucaj osadu. Odwiruj jednostkę filtra ultrawirówkowego z prędkością 3 270 ×g przez 30 minut lub do momentu, aż objętość zmniejszy się do około 600 µl. W międzyczasie stop grocik końcówki P 10 i zablokuj stronę jednostki filtra kartridżowego bez złącza luer lock otwartym końcem grocika.Zapewni to, że bufor do ekstrakcji i biomasa nie wydostaną się na zewnątrz podczas kolejnych etapów. Należy zawiesić osad w jednym mililitrze roztworu ekstrakcyjnego SDS i przenieść go pipetą do oryginalnej jednostki filtra w kartridżu. Najprostszym sposobem pipetowania do jednostki filtra w kartridżu jest nałożenie końcówki P 200 na końcówkę P 1000 i użycie tej podwójnej końcówki do pipetowania. Do jednostki filtra w kartridżu należy dodać dodatkowy jeden mililitr roztworu ekstrakcyjnego SDS, tak aby całkowita objętość wynosiła około dwóch mililitrów.Film pomocniczy. Zamknąć końcówkę Luer-lock jednostki filtra kartridżowego i umieścić jednostkę filtra kartridżowego w probówce 50 ml. Następnie umieścić trzy zgniecione chusteczki laboratoryjne na dnie stożkowej probówki 50 ml.Zamknij pokrywkę i umieść probówkę w inkubatorze do hybrydyzacji, aby inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym obracaniu. Po 10 minutach umieść filtr na pływaku z pianki i zabezpiecz go za pomocą strzykawki 5 ml na końcówce luer lock; inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut. Następnie pozwól jednostce z filtrem kartridżowym ostygnąć i rotować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po ostygnięciu wypchnij roztwór ekstrakcyjny SDS (lizat komórkowy) z filtra za pomocą strzykawki 60 ml do tej samej ultrawirówkowej jednostki filtrującej.Podobnie jak wcześniej, dodaj jeden mililitr świeżego roztworu ekstrakcyjnego SDS do jednostki filtra kartridżowego i mieszaj ręcznie przez 30 sekund. Następnie wypłucz zawartość filtra do jednostki filtra ultrawirówkowego za pomocą strzykawki o pojemności 60 mililitrów, aby upewnić się, że wszystkie białka zostały usunięte i zebrane. Przeprowadź wirowanie jednostki filtra ultrawirówkowego przez 45 minut przy 3 270 ×g lub do momentu, aż objętość w jednostce filtra będzie mniejsza niż 600 µL.Odrzuć filtrat i dopełnij jednostkę filtra ultrawirówkowego świeżym roztworem do ekstrakcji SDS. Wiruj jednostkę filtra przez kolejne 45 minut przy 3 270 ×g, a następnie powtórz ten krok jeszcze dwukrotnie. Upewnij się, że końcowa objętość w jednostce filtra ultrawirówkowego po ostatnim wirowaniu nie przekracza 600 µl.Na tym etapie należy zmierzyć objętość koncentratu i podzielić go na dwie części. Jedna frakcja zostanie wykorzystana do precypitacji DNA, a druga do precypitacji białek. W celu precypitacji białek do jednej objętości koncentratu należy dodać cztery objętości mieszaniny metanolu i acetonu w stosunku 50:50, wymieszać na wirówce typu vortex przez 10 sekund, a następnie inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.Następnego dnia odwiruj mieszaninę z prędkością 17 000 ×g przez 30 minut. Po odlaniu nadsączu pozostaw osad do wyschnięcia w wirówce próżniowej (speed vac) przez jedną godzinę. Nie należy nadmiernie wysuszyć osadu, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie.Zawiesić osad w 25 µL roztworu do ekstrakcji SDS. Odstawić na jedną godzinę, a następnie ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół. Przeprowadzić elektroforezę białek w żelu SDS-PAGE zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zminimalizowania kontaminacji; dla każdej ścieżki odciąć nadmiar żelu poniżej markera 10 kDa.Każda ścieżka zostanie poddana analizie na tandemowym spektrometrze mas. Oddzielnie należy pociąć każdą ścieżkę na kwadraty o wymiarach 1 mm na 1 mm, aby zwiększyć powierzchnię, a następnie umieścić wszystkie kwadraty z danej ścieżki w probówce do mikrocentryfugi o niskim wiązaniu. Powtarzając tę czynność dla wszystkich ścieżek, można zastosować 1% kwas octowy, aby zapobiec wysychaniu żelu i utrudnionemu cięciu.Należy przeprowadzić trawienie trypsyną w żelu i ekstrakcję peptydów zgodnie z opisem w protokole tekstowym lub przeprowadzić precypitację DNA, dodając roztwór do ekstrakcji SDS do frakcji stężonej przeznaczonej do precypitacji DNA, aż do osiągnięcia poziomu 500 µL. Krok ten służy jedynie zwiększeniu objętości roztworu, aby ułatwić pracę. Następnie należy dodać 0,583 objętości odczynnika do precypitacji białek, takiego jak odczynnik MPC do precypitacji białek, i wymieszać na wirówce typu vortex.Przez 10 sekund odwiruj próbkę w wirówce z prędkością 17 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aż powstanie biały osad. Po wirowaniu przenieś nadsącz do drugiej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 0,95 objętości izopropanolu; odwróć probówkę 30–40 razy, a następnie wiruj przez 10 minut w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością, po czym ostrożnie odlej i usuń nadsącz. Następnie przemyj osad dwukrotnie 750 µL 70% etanolu.Za pomocą pipety usuń jak największą ilość etanolu, a następnie pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu. Nie należy nadmiernie wysuszyć DNA, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie po wyschnięciu. Zawieś osad w 25 µL buforu P8 o niskim stężeniu soli.Ilość DNA należy określić za pomocą zestawu do oznaczania dwuniciowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Należy również przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym 3 µL DNA w celu sprawdzenia jego jakości; peptydy poddano analizie spektrometrii tandemowej. Dla każdej próbki wygenerowano ponad 23 000 widm, na podstawie których zidentyfikowano peptydy i białka.Skład taksonomiczny i funkcjonalny metaproteomów przeanalizowano przy użyciu kombinacji programu blast P oraz pakietu oprogramowania metagenome analyzer. Białka przypisane do alpha proteobacteria były najliczniej reprezentowane w zbiorze danych. Zdecydowana większość z nich została przypisana do kladu SAR R 11.Klad Roter z grupy Alpha Proteobacteria był również silnie reprezentowany i zidentyfikowany. Najczęściej w wodach powierzchniowych. Białka przypisane do chorób bakteryjnych były równomiernie rozmieszczone między powierzchnią a maksimum chlorofilu, natomiast białka bakterii wiciowatych zidentyfikowano w większym stopniu przy maksimum chlorofilu.Białka gammaproteobakterii były równomiernie rozłożone w całej kolumnie wody, podczas gdy białka betaproteobakterii występowały głównie w warstwie powierzchniowej. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu trzech dni.

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Przepływ pracy metaproteomiki drobnoustrojów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych nadających się do analizy opartej na tandemowej spektrometrii masowej

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Metaproteomika kliniczna oferuje wgląd w ludzki mikrobiom i jego wpływ na choroby. Wykorzystaliśmy moc obliczeniową platformy Galaxy do opracowania modułowego przepływu pracy bioinformatycznego, który ułatwia złożoną analizę metaproteomiczną opartą na spektrometrii mas i charakteryzację różnych typów próbek klinicznych istotnych dla badań nad chorobami.

Przepływ pracy metaproteomiki klinicznej wdrożony w ramach platformy bioinformatycznej Galaxy w celu analizy interakcji gospodarz-mikrobiom leżących u podstaw chorób człowieka

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Poznaj metaproteomikę mikrobiologiczną organizmów wodnych: izolację białek i DNA z biomasy morskiej, trawienie trypsynowe i analizę spektrometrii mas LC-MS/MS. Ta metoda umożliwia kompleksowe badanie ekosystemów morskich.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów