Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Celem niniejszej procedury jest ekstrakcja białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej pochodzącej z wody morskiej, a następnie otrzymanie peptydów tryptycznych do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas. Jest to realizowane poprzez wstępną lizę komórek uprzednio zgromadzonych na filtrze wkładzie. Drugim krokiem jest zagęszczenie lizatu komórkowego przy użyciu ultraodśrodkowych jednostek filtrujących.

Następnie lizat rozdziela się na dwie frakcje: jedną do wytrącania białek i drugą do wytrącania DNA. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie trawienia białek trypsyną w żelu i ekstrakcja peptydów odpowiednich do analizy metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. W końcowej fazie można zastosować analizę bioinformatyczną w celu identyfikacji białek wykazujących ekspresję w próbce, natomiast wyizolowane DNA można wykorzystać do analiz metagenomicznych i/lub analiz genu 16 S-R-R-N-A.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest możliwość jednoczesnej izolacji białka i DNA z tej samej próbki. Aby rozpocząć, należy wypchnąć roztwór stabilizujący RNA z jednostki filtra kartridżowego do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml, używając strzykawki 60 ml podłączonej do końcówki lure lock wirówki filtracyjnej. Probówkę do mikrowirówki o pojemności 2 ml wiruje się przez 10 minut przy 17 000 ×g w celu osadzenia resztek komórkowych. Następnie nadsącz przenosi się do jednostki filtra ultrawirówkowego 10 K, aby wychwycić białka pochodzące z komórek, które uległy lizie w próbce.

Nie wyrzucaj osadu. Odwiruj jednostkę filtra ultrawirówkowego z prędkością 3 270 ×g przez 30 minut lub do momentu, aż objętość zmniejszy się do około 600 µl. W międzyczasie stop grocik końcówki P 10 i zablokuj stronę jednostki filtra kartridżowego bez złącza luer lock otwartym końcem grocika.

Zapewni to, że bufor do ekstrakcji i biomasa nie wydostaną się na zewnątrz podczas kolejnych etapów. Należy zawiesić osad w jednym mililitrze roztworu ekstrakcyjnego SDS i przenieść go pipetą do oryginalnej jednostki filtra w kartridżu. Najprostszym sposobem pipetowania do jednostki filtra w kartridżu jest nałożenie końcówki P 200 na końcówkę P 1000 i użycie tej podwójnej końcówki do pipetowania. Do jednostki filtra w kartridżu należy dodać dodatkowy jeden mililitr roztworu ekstrakcyjnego SDS, tak aby całkowita objętość wynosiła około dwóch mililitrów.

Film pomocniczy. Zamknąć końcówkę Luer-lock jednostki filtra kartridżowego i umieścić jednostkę filtra kartridżowego w probówce 50 ml. Następnie umieścić trzy zgniecione chusteczki laboratoryjne na dnie stożkowej probówki 50 ml.

Zamknij pokrywkę i umieść probówkę w inkubatorze do hybrydyzacji, aby inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym obracaniu. Po 10 minutach umieść filtr na pływaku z pianki i zabezpiecz go za pomocą strzykawki 5 ml na końcówce luer lock; inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut. Następnie pozwól jednostce z filtrem kartridżowym ostygnąć i rotować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po ostygnięciu wypchnij roztwór ekstrakcyjny SDS (lizat komórkowy) z filtra za pomocą strzykawki 60 ml do tej samej ultrawirówkowej jednostki filtrującej.

Podobnie jak wcześniej, dodaj jeden mililitr świeżego roztworu ekstrakcyjnego SDS do jednostki filtra kartridżowego i mieszaj ręcznie przez 30 sekund. Następnie wypłucz zawartość filtra do jednostki filtra ultrawirówkowego za pomocą strzykawki o pojemności 60 mililitrów, aby upewnić się, że wszystkie białka zostały usunięte i zebrane. Przeprowadź wirowanie jednostki filtra ultrawirówkowego przez 45 minut przy 3 270 ×g lub do momentu, aż objętość w jednostce filtra będzie mniejsza niż 600 µL.

Odrzuć filtrat i dopełnij jednostkę filtra ultrawirówkowego świeżym roztworem do ekstrakcji SDS. Wiruj jednostkę filtra przez kolejne 45 minut przy 3 270 ×g, a następnie powtórz ten krok jeszcze dwukrotnie. Upewnij się, że końcowa objętość w jednostce filtra ultrawirówkowego po ostatnim wirowaniu nie przekracza 600 µl.

Na tym etapie należy zmierzyć objętość koncentratu i podzielić go na dwie części. Jedna frakcja zostanie wykorzystana do precypitacji DNA, a druga do precypitacji białek. W celu precypitacji białek do jednej objętości koncentratu należy dodać cztery objętości mieszaniny metanolu i acetonu w stosunku 50:50, wymieszać na wirówce typu vortex przez 10 sekund, a następnie inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.

Następnego dnia odwiruj mieszaninę z prędkością 17 000 ×g przez 30 minut. Po odlaniu nadsączu pozostaw osad do wyschnięcia w wirówce próżniowej (speed vac) przez jedną godzinę. Nie należy nadmiernie wysuszyć osadu, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie.

Zawiesić osad w 25 µL roztworu do ekstrakcji SDS. Odstawić na jedną godzinę, a następnie ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół. Przeprowadzić elektroforezę białek w żelu SDS-PAGE zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zminimalizowania kontaminacji; dla każdej ścieżki odciąć nadmiar żelu poniżej markera 10 kDa.

Każda ścieżka zostanie poddana analizie na tandemowym spektrometrze mas. Oddzielnie należy pociąć każdą ścieżkę na kwadraty o wymiarach 1 mm na 1 mm, aby zwiększyć powierzchnię, a następnie umieścić wszystkie kwadraty z danej ścieżki w probówce do mikrocentryfugi o niskim wiązaniu. Powtarzając tę czynność dla wszystkich ścieżek, można zastosować 1% kwas octowy, aby zapobiec wysychaniu żelu i utrudnionemu cięciu.

Należy przeprowadzić trawienie trypsyną w żelu i ekstrakcję peptydów zgodnie z opisem w protokole tekstowym lub przeprowadzić precypitację DNA, dodając roztwór do ekstrakcji SDS do frakcji stężonej przeznaczonej do precypitacji DNA, aż do osiągnięcia poziomu 500 µL. Krok ten służy jedynie zwiększeniu objętości roztworu, aby ułatwić pracę. Następnie należy dodać 0,583 objętości odczynnika do precypitacji białek, takiego jak odczynnik MPC do precypitacji białek, i wymieszać na wirówce typu vortex.

Przez 10 sekund odwiruj próbkę w wirówce z prędkością 17 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aż powstanie biały osad. Po wirowaniu przenieś nadsącz do drugiej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 0,95 objętości izopropanolu; odwróć probówkę 30–40 razy, a następnie wiruj przez 10 minut w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością, po czym ostrożnie odlej i usuń nadsącz. Następnie przemyj osad dwukrotnie 750 µL 70% etanolu.

Za pomocą pipety usuń jak największą ilość etanolu, a następnie pozostaw osad do wyschnięcia na powietrzu. Nie należy nadmiernie wysuszyć DNA, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie po wyschnięciu. Zawieś osad w 25 µL buforu P8 o niskim stężeniu soli.

Ilość DNA należy określić za pomocą zestawu do oznaczania dwuniciowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Należy również przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym 3 µL DNA w celu sprawdzenia jego jakości; peptydy poddano analizie spektrometrii tandemowej. Dla każdej próbki wygenerowano ponad 23 000 widm, na podstawie których zidentyfikowano peptydy i białka.

Skład taksonomiczny i funkcjonalny metaproteomów przeanalizowano przy użyciu kombinacji programu blast P oraz pakietu oprogramowania metagenome analyzer. Białka przypisane do alpha proteobacteria były najliczniej reprezentowane w zbiorze danych. Zdecydowana większość z nich została przypisana do kladu SAR R 11.

Klad Roter z grupy Alpha Proteobacteria był również silnie reprezentowany i zidentyfikowany. Najczęściej w wodach powierzchniowych. Białka przypisane do chorób bakteryjnych były równomiernie rozmieszczone między powierzchnią a maksimum chlorofilu, natomiast białka bakterii wiciowatych zidentyfikowano w większym stopniu przy maksimum chlorofilu.

Białka gammaproteobakterii były równomiernie rozłożone w całej kolumnie wody, podczas gdy białka betaproteobakterii występowały głównie w warstwie powierzchniowej. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu trzech dni.