Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest skrócenie klasycznego podejścia Yamanaki do iPS poprzez bezpośrednie generowanie indukowanych komórek progenitorowych neuronów z biopsji skóry pacjenta do zastosowań terapeutycznych. Jest to realizowane poprzez wykonanie w pierwszej kolejności biopsji gruboigłowej u pacjenta w celu pozyskania pierwotnych fibroblastów, które mogą być hodowane in vitro. Drugim krokiem jest namnożenie a następnie zainfekowanie hodowanych fibroblastów wirusami kodującymi czynniki reprogramujące w celu wywołania transdyferencjacji.

Następnie, domniemane kolonie konwertowanych indukowanych progenitorowych komórek neuralnych (INPC) muszą zostać starannie wyselekcjonowane poprzez walidację wizualną, a następnie wyizolowane poprzez manualny pobór około 20 dni po infekcji. Ostatnim krokiem jest monoklonalna ekspansja komórek IPC w medium do indukcji neuronalnej, z końcowym ukierunkowaniem na różnicowanie in vitro; wykorzystuje się również mikroskopię immunofluorescencyjną, aby wykazać, że bezpośrednio konwertowane komórki IPC pochodzące od pacjenta są zdolne do różnicowania się w komórki neuronalne oraz glejowe, co czyni je praktycznie nieograniczonym źródłem do zastosowań biomedycznych. Przewaga tej techniki bezpośredniej konwersji nad istniejącymi metodami, takimi jak wyprowadzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych metodą Yamanaki i ich późniejsze różnicowanie, jest dwupłaszczyznowa.

Konwersja DI w wielopotencjalne indukowane neurogeniczne komórki macierzyste, które nazywamy komórkami INS, jest nie tylko znacznie szybsza, ale również bezpieczniejsza. W związku z tym procedura transdyferencjacji znacznie ułatwi wytwarzanie komórek specyficznych dla pacjenta do zastosowań terapeutycznych i drastycznie obniży ryzyko powstawania guzów w porównaniu z komórkami IPS. Dzięki temu jesteśmy obecnie w stanie usunąć dwie główne przeszkody w dzisiejszej medycynie regeneracyjnej.

Zapewnia to bezpieczeństwo kliniczne i efektywność. Aby rozpocząć biopsję wycinaną, należy zdezynfekować skórę pacjenta, a następnie znieczulić miejsce pobrania biopsji, podając śródskórnie od 0,5 do 1 ml chlorowodorku mepiwakainy. Pobrać biopsję skóry, używając sterylnego wycinaka do biopsji o średnicy 3 mm.

Przepłucz biopsjat roztworem DPBS (fosforanowym buforem solnym Doubecha) z dodatkiem 1 µL/mL gentamycyny. Usuń tkankę tłuszczową z biopsjatu za pomocą skalpela i pęsety. Następnie przepłucz biopsjat dwukrotnie buforem przed jego całkowitym odessaniem.

Przykryj biopsjat pastą dys i inkubuj przez 16 do 18 godzin w temperaturze 4 °C. Po inkubacji całkowicie odessij pastę dys, a następnie dwukrotnie przemyj biopsjat roztworem DPBS. Usuń naskórek za pomocą pęsety, po czym ponownie dwukrotnie przemyj biopsjat roztworem DPBS.

Następnie należy dodać dwa mililitry kolagenazy typu II i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml. Dodać kolagenazę do uzyskania całkowitej objętości pięciu mililitrów. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C.

Odwiruj próbkę przez pięć minut przy 180 ×g, a następnie odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 10 ml medium DMEM z surowicą cielęcą i gentamycyną przed ponownym wirowaniem przez pięć minut przy 180 ×g. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 1,5 ml tego samego medium. Następnie przenieś próbkę do T 25 adherentnej kolby do hodowli tkanek i inkubuj w 37 °C i 5% CO2, wymieniając medium co trzy dni przez około dwa tygodnie.

Gdy komórki osiągną konfluencję wokół fragmentów skóry, należy dokonać ich pasażowania z użyciem trypsyny EDTA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dalszą ekspansję komórek prowadzi się poprzez wymianę medium co trzeci dzień oraz pasażowanie po osiągnięciu konfluencji. Po wykluczeniu kontaminacji mycoplasma za pomocą standardowych testów, należy przygotować komórki do eksperymentu z bezpośredniej konwersji poprzez jednorazowe przemycie komórek DPBS, a następnie odessanie DPBS i dodanie 2,5 milliliters trypsyny EDTA. Po inkubacji komórek przez pięć minut w temperaturze 37 degrees Celsius i 5%CO2, należy delikatnie opukać kolbę, aby odkleić komórki.

Resuspender komórki w 2,5 milliliters medium do fibroblastów i przenieść do probówki o pojemności 15 milliliters. Wirować probówkę z prędkością 180 ×g przez pięć minut, a następnie odessać nadsącz. Resuspender komórki w jednym milliliter medium do fibroblastów i pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Przed wysiewaniem należy policzyć komórki za pomocą komory licznikowej. 30 000 komórek na dołek. Komórki w płytce 24-dołkowej inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Etapy postępowania z wirusem muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza z zastosowaniem odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym maski chirurgicznej, aby zapobiec ekspozycji błon śluzowych.

Aby przeprowadzić infekcję, należy najpierw zastąpić istniejące medium komórkowe 100 µL medium do fibroblastów. Następnie rozmrożone alikwoty T4, KLF4, SOX2 oraz cmix sendai virus resuspendować w 1 mL medium do fibroblastów. Dodać każdy wirus do komórek z MOI wynoszącym 3 i delikatnie wymieszać; inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Po 24 godzinach odessać medium i dodać 500 µL medium do indukcji neuronalnej; hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2, zmieniając medium co drugi dzień. W szóstym dniu po infekcji przygotować sześciodołkowe płytki pokryte lamininą.

Dodaj 1 ml lamininy o stężeniu 1 µg/ml w DPBS do płytek 6-dołkowych i przechowuj płytki w temperaturze 4 °C przez 24 h. Siódmego dnia po infekcji rozsiej komórki, używając DPBS-EDTA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj 500 µl DMEM-F 12 i przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml. Następnie odwiruj próbkę przy 180 ×g przez 5 min.

Odssać nadsącz i zawiesić osad w 1,5 milliliters medium indukcyjnego do neuronów, wysiać komórki na lamininowe płytki sześciodołkowe i dodać inhibitor kinazy ROCK do stężenia końcowego 10 micromolar. Inkubować komórki w temperaturze 39 stopni Celsius, 5%CO2, wymieniając medium co drugi dzień od 14 dnia. Po infekcji hodować komórki w 37 stopni Celsius, 5%CO2; kolonie neuroepitelialne stają się widoczne około 17 dnia po infekcji, co można zweryfikować za pomocą mikroskopii kontrastowej.

Powinny być one wystarczająco duże, aby można je było pobrać około 20. dnia po infekcji, dzień przed przesianiem do 48-dołkowej płytki z lamininą, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dzień później odessaj lamininę z płytek i dodaj 200 µL medium do indukcji neuronalnej do dołków. Płytki 6-dołkowe zawierające kolonie przeznaczone do pobrania przemyj raz DPBS przed dodaniem 2 mL medium do indukcji neuronalnej.

Po dodaniu pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej, mechanicznie wyizoluj komórki, skrobiąc obszar wokół kolonii cienką igłą w celu usunięcia okolicznych komórek, a następnie pobierz kolonie za pomocą końcówek do pipety. Użyj pipety 200 µL ustawionej na 50 µL. Przenieś każdą kolonię do osobnego dołka laminowanej płytki 48-dołkowej i mechanicznie przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek, pipetując ciecz w górę i w dół 10 razy.

Dodaj inhibitor kinazy R do komórek w stężeniu końcowym 10 micromolar. Hoduj komórki na płytce 48-dołkowej w temperaturze 37 degrees Celsius i 5%CO2 przez dwa dni. Wymieniaj medium co drugi dzień, aż komórki osiągną 80 do 90%co konfluencji.

Z zaproszeniem do protokołu tekstowego dotyczącego ekspansji i kriokonserwacji IPC w celu różnicowania IPC w kierunku hodowli linii neuronalnej. Komórki na płytkach powlekanych lamininą. Jak wcześniej, należy zmienić medium na medium do różnicowania neuronalnego, gdy komórki osiągną około 70% konfluencji, a następnie kontynuować wymianę medium co drugi dzień przez trzy tygodnie.

Nie należy rozdzielać komórek podczas różnicowania po trzech tygodniach; komórki powinny wykazywać ekspresję markera neuronalnego TUJ1, aby uzyskać bardziej dojrzałe neurony i podtypy neuronalne. Kontynuować różnicowanie do trzech miesięcy w celu różnicowania IPC, konkretnie w stronę linii glejowej. Zmienić medium na medium do indukcji gleju, zawierające 20 ng/mL epidermal growth factor, aby zaindukować różnicowanie w prekursorowe komórki glejowe.

Co drugi dzień przez około dwa tygodnie usuń połowę pożywki i zastąp ją świeżą pożywką. W tym okresie, po osiągnięciu 100% konfluencji po dwóch tygodniach, komórki należy pasażować w stosunku od 1:3 w obecności 10 µM inhibitora kinazy R. Dalsze różnicowanie komórek w astrocyty przeprowadza się poprzez zmianę pożywki na komercyjnie dostępną pożywkę do astrocytów, gdy komórki są niemal konfluentne; przy kontynuowaniu wymiany pożywki co drugi dzień, po około siedmiu dniach komórki zaczynają wykazować ekspresję markerów astrocytów.

Jeśli podczas protokołu różnicowania komórki osiągną 100% konfluencji, należy je przesiać w stosunku jeden do dwóch. W obecności 10 µM inhibitora kinazy RO zakażenie fibroblastów wirusami T 4K LF four, SOX two oraz cmix sendi i hodowla w warunkach medium neuroindukcyjnego doprowadziły do zmiany morfologii fibroblastów i późniejszego pojawienia się kolonii. 17 dni po zakażeniu wygenerowane monoklonalne linie komórkowe można namnażać; wykazują one pozytywne barwienie na markery komórek macierzystych neuronów, takie jak SOX two, SOX one, neston i PAC six, a także na marker proliferacji KI 67, podczas gdy nie wykazują ekspresji markera pluripotencji T four.

Ponadto, poprzez dodanie czynników wzrostu neuronalnego do pożywki hodowlanej, komórki progenitorowe neuronów mogą zostać zróżnicowane w neurony poprzez zastosowanie różnicowania w astrocyty. Linie komórek progenitorowych neuronów indukowane zgodnie z protokołem mogą być również różnicowane w linie glejowe, co ocenia się na podstawie analizy typowych zmian morfologicznych oraz barwienia przeciwko GFAP. Dzięki tej bezpośredniej konwersji generujemy multipotencjalne indukowane komórki progenitorowe neuronów z fibroblastów pacjentów w ciągu od trzech do czterech tygodni.

Komórki te mogą znaleźć zastosowanie w licznych aplikacjach biomedycznych. Implikacje tej techniki obejmują terapię, diagnostykę i modelowanie schorzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, a także innych stanów neurologicznych.