Name: Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: Poznaj metodę oceny odpowiedzi limfocytów T pamięciowych i efektorowych u bydła za pomocą długotrwale hodowanego testu ELISPOT związanego z interferonem γ. Technika ta pozwala badać korelację między odpowiedzią komórkową a skutecznością szczepionki przeciwko bakteriom prątkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 oraz Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant nr 2011-67015-30736 z USDA National Institute of Food and Agriculture. Dziękujemy Jessice Pollock, Emmie Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce'owi Peschowi, Molly Stafne, Allenowi Jensenowi i Tracy Porter za doskonałą pomoc techniczną, a także Rebecce Madison, Dougowi Ewingowi, Katie Pille, Jayowi Steffenowi, Davidowi Lubbersowi, Robinowi Zeisnessowi i Davidowi Panthenowi za doskonałą opiekę i obchodzenie się ze zwierzętami.

1. Przygotuj następujące rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotować pełne RPMI (cRMPI), dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) o stężeniu 10 % (objętość / objętość), glutaminę (2 μM), pirogronian sodu (1 μM), aminokwasy endogenne (0,1 μM), penicylinę-streptomycynę (100 jednostek / ml penicyliny i 0,1 mg / ml streptomycyny) i 2-merkaptoetanol (50 mM) do RPMI 1640.</li>
	<li>Przygotować 2 X kwaśną dekstrozę cytrynianu, mieszając cytrynian sodu (77 μM), kwas cytrynowy (38 μM) i dekstrozę (122 μM) w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Przygotować Ca2+ Mg2+ sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) o pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na2HPO4 (dwuzasadowy, 10 mM), KH2PO4 (jednozasadowy, 2 mM) w wodzie destylowanej; dostosować pH do 7,2.</li>
	<li>Przygotować PBS 1% (PBS 1% BSA) dodając albuminę surowicy bydlęcej do PBS (objętość / waga, 1 g / 100 ml PBS).</li>
	<li>Przygotuj PBS + 0,05 % tween 20 (PBST), dodając 0,05 % tween 20 do PBS (objętość / objętość, 500 μl tween 20 / 1 l PBS).</li>
	<li>Przygotować 100 mM bufor Tris HCL pH 8,2 mieszając Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Przygotować 35 % roztwór etanolu, rozcieńczając alkohol etylowy (czystość ≥99,5%) w wodzie destylowanej (objętość / objętość, 35 ml alkoholu etylowego / 100 ml wody destylowanej).</li>
	<li>Filtr sterylizuje cRPMI, 2 x kwaśny cytrynian dekstrozy, PBS, PBS 1 % BSA przy użyciu filtrów 0,22 μm.</li>
</ol>
2. Długoterminowe hodowle komórek (protokół 14-dniowy)
(Dzień pierwszy)
<ol>
	<li>Przygotować roztwory antygenowe o stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe stężenie w cRPMI. Wybór antygenu ma kluczowe znaczenie i powinien być dostosowany do celu badania.</li>
	<li>Rozcieńczyć rekombinowane antygeny M. tuberculosis TB10.4 i antygen Ag85A do 2 μg / ml (każdego antygenu; końcowe stężenie wynosi 1 μg / ml).</li>
	<li>Rozcieńczyć oczyszczoną pochodną białka M. bovis (PPD-B, Prionics Ag) do 10 μg / ml (końcowe stężenie wynosi 5 μg / ml).</li>
	<li>Rozcieńczyć rekombinowany wczesny wydzielniczy cel antygenowy 6 (ESAT-6) i białko fuzyjne białka filtratu 10 (CFP-10) (rESAT-6:CFP10) do 2 μg / ml (końcowe stężenie 1 μg / ml). 
	UWAGA: Antygeny te są immunodominującymi antygenami indukującymi IFN-γ prątków gruźlicy i mogą być włączone w celu stymulacji PBMC u zwierząt zakażonych M. bovis. Zwierzęta szczepione BCG lub M. bovis ΔRD1 nie reagują na rESAT-6:CFP10, ponieważ region kodujący te antygeny (tj. RD1) jest usunięty w tych szczepach. rESAT-6:CFP10 użyty w tych badaniach był miłym prezentem od dr C. Miniona z Uniwersytetu Stanowego Iowa. TB10.4 i antygen Ag85A są antygenami immunodominującymi obecnymi w zjadliwych i szczepionkowych szczepach M. bovis 37. PPDB, jako oczyszczona pochodna białka, jest kompleksem kilku antygenów, w tym antygenów wspólnych z prątkami niegruźliczymi. Zakażone zwierzęta potencjalnie reagują na wszystkie antygeny (a mianowicie: TB10.4, Ag 85A, rESAT-6:CFP10 i PPDb), podczas gdy zwierzęta szczepione nie powinny reagować na rESAT-6:CFP10 11.</li>
	<li>Płytka 500 μl / basenik roztworu antygenu w poczwórnych duplikatach dla każdego zwierzęcia na płytce 24-dołkowej. W tym protokole użyj antygenów jako puli; Dlatego na tym etapie należy użyć wszystkich studzienek zawierających wszystkie antygeny i nie ma żadnych kontroli (takich jak Null lub Mitogen). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO2 . Normalna temperatura bydła wynosi 39 °C; w związku z tym niektórzy badacze wykorzystują 39 °C do hodowli komórek bydlęcych. Ponadto, w niektórych przypadkach w przypadku komórek ludzkich, hodowla komórkowa w temperaturze 39 °C zapewnia dodatkowe korzyści26,30.</li>
	<li>Strzykawki w połączeniu z 16 lub 18 g, igły podskórne z 6 ml 2 X dekstrozy kwasu cytrynianowego i pobrać 60 ml krwi bydlęcej przez nakłucie żyły szyjnej.</li>
	<li>Wyizolować PBMC przez wirowanie w gradiencie standardowej gęstości frakcji kożucha krwi obwodowej, dostosowując stężenie komórek do 4 X 106 komórek / ml, jak opisano przez Maue i wsp. 27 Rozdział 27</li>
	<li>Dodać komórki (500 μl / studzienkę) do wstępnie załadowanej 24-dołkowej płytki antygenu, poczwórnie dla każdego zwierzęcia (krok 2.5). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO2 .</li>
</ol>
(Dzień trzeci i siódmy)
<ol start="9">
	<li>Stosując sterylną technikę, ostrożnie usunąć 500 μl supernatantu z każdej studzienki, nie naruszając warstwy komórkowej.</li>
	<li>Uzupełnić objętość studzienki, dodając 500 μl / studzienkę cRPMI zawierającą IL-2 (30 U / μl, tj. 15 U / studzienkę; rekombinowana ludzka IL-2 Sigma I7908). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO2 .</li>
</ol>
(dni 10 i 12)
<ol start="11">
	<li>Stosując sterylną technikę, usunąć 750 μl supernatantu z każdej studzienki. Uzupełnić objętość 750 μl / studzienkę cRPMI (bez IL-2). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO2 .</li>
</ol>
3. Test ELISPOT (protokół trzydniowy)
(Dzień pierwszy (12 dzień długoterminowego protokołu hodowli))
<ol>
	<li>Płytkę ELISPOT należy odpowiednio oznaczyć dla każdego zestawu próbek, aby uniknąć błędów podczas powlekania komórek: komórki długoterminowe plus komórki prezentujące antygen (APC), komórki długoterminowe bez APC oraz komórki ex vivo / krótkotrwałe (ryc. 1). Powtórzenia dla każdego leczenia (tj. stymulacji antygenowej) powinny być wykonywane co najmniej dwukrotnie.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała wychwytującego, rozcieńczając mysie przeciwciało przeciw bydłu IFN-γ (MCA2112, klon CC330) w PBS (8 μg / ml).</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej należy wstępnie zwilżyć studzienki płytki ELISPOT 15 μl / studzienkę 35% etanolu przez 1 min. Aby zapobiec uszkodzeniu membrany, nie należy dotykać dna studzienek końcówkami pipet w żadnym momencie podczas testu.</li>
	<li>Umyj płytkę sześciokrotnie 300 μl / studzienkę PBS. Płyn myjący należy wyrzucić przez odwrócenie płytki. Mycie należy wykonywać szybko, nie dopuszczając do wyschnięcia dołków płytkowych.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl / studzienkę wychwytu przeciwciała anty-IFN-γ (z kroku 1 powyżej). Inkubować w temperaturze 4 °C O/N (przechowywać płytkę w torbie do przechowywania zapinanej na zamek błyskawiczny).</li>
</ol>
(Dzień drugi (13 dzień długoterminowego protokołu hodowli))
<ol start="6">
	<li>Przygotować roztwory antygenu o stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe. Zabiegi to: brak stymulacji (cRPMI), PPD-B (20 μg/ml, stężenie końcowe: 10 μg/ml), koktajl białkowy TB10,4 i Ag85A (2 μg/ml każdego białka, stężenie końcowe: 1 μg/ml każdego białka), rESAT-6:CFP10 (dla zakażenia M. bovis, 2 μg/ml, stężenie końcowe: 1 μg/ml), oraz kontrola pozytywna, takich jak szkarłatka (20 μg / ml, końcowe stężenie: 10 μg / ml). Zamiast PWM można stosować inne mitogeny (np. konkanawalinę A). 
	UWAGA: na tym etapie antygeny składają się z czterech różnych metod leczenia i nie są używane jako pula (jak w kroku 2.5). Cztery zabiegi to: NS, PPDb, koktajl białkowy (TB10.4 i Ag85A stanowią jeden zabieg) oraz PWM.</li>
</ol>
4. Krótkoterminowa hodowla komórkowa i izolacja komórek przylegających (APC)
<ol>
	<li>Pobrać 60 ml krwi od tych samych zwierząt, które wykrwawiły się w 1. dniu (pod: hodowla długoterminowa, protokół 14-dniowy) i wyizolować PBMC jak poprzednio.</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek do 2 X 106 komórek / ml. Wyraźnie oznacz probówki, aby zapobiec nieprawidłowej alokacji podczas powlekania komórek. Komórki te zostaną wykorzystane do izolacji APC, a także jako krótkoterminowa hodowla komórkowa (krok 6.5). Oznaczyć probówki zarówno numerem zwierzęcia, jak i rodzajem hodowli (w tym przypadku: ex vivo, krótkotrwałe lub świeże komórki).</li>
	<li>Usunąć nadmiar przeciwciał wychwytujących z ELISPOT metodą odwrócenia płytki. Umyj płytki 6 razy za pomocą 300 μl PBST.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej PBST. Pobrać pipetą 50 μl zawiesin komórkowych do studzienek oznaczonych jako komórki długoterminowe plus APC. Zablokuj inne studzienki za pomocą 200 μl / studzienki cRPMI. Inkubować 90 minut w temperaturze lub 39 °C. Wstępnie podgrzać cRPMI do lub 39 °C (konieczne dla kolejnych etapów). Świeże PBMC nieużywane do izolacji komórek adherentnych (APC) będą potrzebne w kolejnych krokach i powinny być przechowywane.</li>
</ol>
5. Hodowane komórki
<ol>
	<li>Podczas 90-minutowej inkubacji (etap 4.4, etap hodowli krótkoterminowej i etap izolacji komórek przylegających) należy zebrać komórki hodowane długoterminowo.</li>
	<li>Używając pipet o pojemności 5 lub 10 μl, pipetuj media z komórkami w górę i w dół w celu odłączenia komórek, połącz poczwórne powtórzenia z każdego zwierzęcia w jedną probówkę o pojemności 15 ml. Odwirowywać probówki przez 5 minut przy 400 g.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki. Usunąć osad komórkowy. Dodać 5 ml PBS, w razie potrzeby delikatnie zawiesić osad. Powtórzyć wirowanie. Powtórz krok prania dwukrotnie. Odrzuć supernatant przez odwrócenie probówki i delikatnie ponownie zawieś komórki w 1 ml cRPMI. Dostosuj stężenie komórek do 2 X 105 komórek / ml.</li>
</ol>
6. Posiewanie świeżych i hodowlanych PBMC
<ol>
	<li>Po 90 minutach inkubacji wstrząsać płytkami na wytrząsarce przez 30 sekund. Usunąć nieprzylegające komórki przez odwrócenie płytki. Odpipetować 150 μl / studzienkę ciepłego cRPMI (od kroku 4, pod: Etap izolacji komórek krótkotrwałych i komórek adherentnych (APC)).</li>
	<li>Wstrząśnij talerzami i wylej płyn do mycia. Powtórz pranie 3 razy. Dodaj 100 μl / studzienkę każdego antygenu do odpowiednich studzienek (wstępnie znakowanych).</li>
	<li>Aby umieścić komórki na płytkach, należy pipetować 100 μl / studzienkę długotrwałej zawiesiny komórek hodowlanych (2 x 105 komórek / ml) do studzienek oznaczonych jako komórki długoterminowe plus APC. Upewnij się, że długoterminowe komórki dodane na tym etapie pochodzą od tego samego zwierzęcia, co APC już znajdujące się w studni. Nie mieszaj APC i komórek hodowanych długoterminowo od różnych zwierząt.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl / basenik długotrwałej zawiesiny komórek hodowlanych (2 x 105 komórek / ml) do studzienek bez APC w celu oceny zapotrzebowania APC na długoterminową odpowiedź hodowli.</li>
	<li>Dodać 100 μl / studzienkę komórek krótkotrwałych (świeżo wyizolowanych i dostosowanych do 2 x 106 komórek / ml) w celu oceny odpowiedzi ex vivo. Inkubować płytki O/N w inkubatorze o temperaturze 39 °C / 5 % CO2 . Upewnij się, że talerze leżą płasko i nie układaj talerzy w stos. 
	UWAGA: Jeśli pożądana jest analiza fenotypu komórki, cytometria przepływowa może być wykonana jako test pomocniczy. Komórki są siane na 96-dołkowych płytkach dolnych U (zamiast płytek ELISPOT), jak opisano dla testu ELISPOT. Adsorpcję przeciwciał wychwytujących (kroki od 3.4 do 3.5) należy pominąć. Komórki są następnie inkubowane O/N w temperaturze 39 °C / 5 % CO2 i przeprowadzany jest standardowy protokół barwienia komórek. Odczynniki do barwienia komórek znajdują się w tabeli odczynników.</li>
</ol>
Dzień trzeci (14 dzień długoterminowego protokołu hodowli)
<ol start="6">
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało wykrywające (mysie przeciwciało przeciw bydłu IFN-γ, klon CC302) do 5 μg / ml w PBS 1 % BSA. Wylać płyny ze studzienek i płytek myjących: sześć razy za pomocą PBST (300 μl / studzienka), umieszczając na wytrząsarce za każdym razem na 10 sekund przed i pomiędzy płukaniami, raz z dH2O (300 μl / studzienka), dodatkowo 6 razy z PBST (300 μl / studzienka) i dwa razy z PBS (300 μl / studzienka). Po wyjęciu komórek z płytek i jeżeli nie występują żadne obawy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego, procedury mogą być wykonywane poza komorami bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Wylej płyn do mycia. Usuń jak najwięcej płynu do mycia, stukając talerzem o ręczniki papierowe. Dodać przeciwciało detekcyjne (100 μl / studzienkę).</li>
	<li>Inkubować płytki przez 120 minut w temperaturze lub 39 °C. Na tym etapie inkubacji przygotuj alkaliczny roztwór fosfatazy zgodnie z instrukcjami producenta. Trzydzieści minut przed użyciem (tj. 90 minut po dodaniu przeciwciała wykrywającego do studzienek) rozcieńczyć odczynnik w PBST. Delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać odczynniki i inkubować w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 120 minutach inkubacji odrzucić nadmiar przeciwciał wykrywających przez odwrócenie płytki. Umyj płytkę 6 razy PBST (300 μl / dobrze). Usuń jak najwięcej płynu do mycia, stukając talerzem o ręczniki papierowe.</li>
	<li>Dodaj 100 μl / studzienkę alkalicznego roztworu fosfatazy (z kroku 3 powyżej). Inkubować płytki przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Wylać płyn i umyć każdą płytkę 6 razy PBST (300 μl / studzienkę).</li>
	<li>Przygotować roztwór substratu zgodnie z instrukcjami producenta (Vector Blue AP substrate III): Rozcieńczyć odczynniki w 100 mM buforze Tris HCL pH 8,2. Odpipetować 50 μl / studzienkę roztworu substratu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej, aż zacznie rozwijać się niebieski kolor (około 30 minut). Wylać płyn i umyć płytki dużą ilością dH2O. Zdjąć dolną płytę, aby odsłonić membranę, umyć z powrotem studzienki i pozostawić płytkę do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Odczytać płytki w analizatorze obrazu immunospot lub czytniku ELISPOT (Tabela 1) lub ręcznie za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Alternatywnie, trzymaj talerze w ciemności w temperaturze RT do czasu czytania. Ze względu na wysoką stabilność substratu reakcyjnego, jakość jest zachowana przez kilka lat. 
	UWAGA: Stężenia komórek i antygenów zostały zoptymalizowane tak, aby uniknąć studzienek z niezliczonymi plamami 23,24,27,37. Możliwe jest, że niepoliczalne plamy powstają w różnych warunkach lub z powodu zmienności biologicznej. W takim przypadku należy zoptymalizować stężenie komórek, aby uzyskać czytelną odpowiedź na zliczanie punktowe.</li>
</ol>
7. Odczyt tablic rejestracyjnych i analiza danych
<ol>
	<li>Wykonaj analizę zgodnie z przewodnikiem czytnika płytek ELISPOT firmy Cellular Technology Limited (CTL) (Tabela 1). Po uzyskaniu liczby plam dla każdej ze studni oblicz średnią między duplikatami. Specyficzną odpowiedź immunologiczną na każdy bodziec antygenowy oblicza się, odejmując średnią liczbę plamek w studzienkach niestymulowanych od liczby dołków stymulowanych antygenem.</li>
</ol>

<ol><li>Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transcription+factor%2C+T-bet%2C+directs+Th1+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment.</a> Cell. 100 (6), 655-669 (2000).</li>
<li>Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T-bet+in+commitment+of+Th1+cells+before+IL-12-dependent+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection.</a> Science Signaling. 292 (5523), 1907(2001).</li>
<li>Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+murine+helper+T+cell+clone.+I.+Definition+according+to+profiles+of+lymphokine+activities+and+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins.</a> Journal of immunology. 136 (7), 2348-2357 (1986).</li>
<li>Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-bet+is+rapidly+induced+by+interferon-gamma+in+lymphoid+and+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15137-15142 (2001).</li>
<li>Masopust, D., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+memories%3A+frontline+memory+T+cells+and+early+pathogen+interception%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception.</a> Journal of immunology. 188 (12), 5811-5817 (2012).</li>
<li>Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+subsets+of+memory+T+lymphocytes+with+distinct+homing+potentials+and+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions.</a> Nature. 401 (6754), 708-712 (1999).</li>
<li>Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+immunity%3A+Opportunities+from+studies+with+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Developmental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2011 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+antibody+to+bovine+IL-2+reveals+multifunctional+CD4+T%28EM%29+cells+in+cattle+naturally+infected+with+bovine+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis.</a> PLoS ONE. 6 (12), e29194(2011).</li>
<li>Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+receptor+on+tuberculin-reactive+T-cells+marks+active+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis.</a> PLoS ONE. 2 (8), e735(2007).</li>
<li>Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+Calmette-Gu%C3%A9rin+vaccination+of+human+newborns+induces+T+cells+with+complex+cytokine+and+phenotypic+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles.</a> Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).</li>
<li>Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+tuberculosis+vaccine+research%3A+historical+perspectives+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances.</a> Vaccine. 30 (16), 2611-2622 (2012).</li>
<li>Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+CD4%2B+central+memory+T+cells+and+survival+in+vaccinated+SIV-challenged+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys.</a> Science. 312 (5779), 1530-1533 (2006).</li>
<li>Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+preserves+CD4+memory+T+cells+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge.</a> The Journal of experimental medicine. 203 (6), 1533-1541 (2006).</li>
<li>Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Chronic+Mycobacterium+tuberculosis+.infection+by+CD4+KLRG1-+IL-2-secreting+central+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells.</a> The Journal of Immunology. 190 (12), 6311-6319 (2013).</li>
<li>Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+memory+T+cell+responses+against+TRAP+with+protection+from+clinical+malaria%2C+and+CD4+CD25+high+T+cells+with+susceptibility+in+Kenyans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans.</a> PLoS ONE. 3 (4), e2027(2008).</li>
<li>Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+T+cell-mediated+protection+against+malaria+in+human+challenges+by+using+the+recombinant+poxviruses+FP9+and+modified+vaccinia+virus+Ankara%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (13), 4836-4841 (2005).</li>
<li>Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+reinfection+as+a+cause+of+recurrent+tuberculosis+after+curative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment.</a> New England Journal of Medicine. 341 (16), 1174-1179 (1999).</li>
<li>Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+reinfection+with+tuberculosis+on+a+European+Island+with+a+moderate+incidence+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (3), 717-720 (2001).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+vaccines+to+memory+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">From vaccines to memory and back.</a> Immunity. 33 (4), 451-463 (2010).</li>
<li>Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis.-specific+cellular+immune+profiles+suggest+bacillary+persistence+decades+after+spontaneous+cure+in+untreated+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis.</a> The Journal of infectious diseases. 202 (11), 1685-1689 (2010).</li>
<li>Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+CD4%28%2B%29+memory-phenotype+T+cells+are+abundant+in+unexposed+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults.</a> Immunity. 38 (2), 373-383 (2013).</li>
<li>Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region+of+difference+1+antigen-specific+CD4%2B+memory+T+cells+correlate+with+a+favorable+outcome+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis.</a> The Journal of infectious diseases. 194 (7), 984-992 (2006).</li>
<li>Waters, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+immunogenicity+of+Mycobacterium+bovis.+DeltaRD1+against+aerosol+M.+bovis.+infection+in+neonatal+calves%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves.</a> Vaccine. 27 (8), 1201-1209 (2009).</li>
<li>Hope, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+surrogates+and+correlates+of+protection+in+protective+immunity+against+Mycobacterium+bovis.+infection+induced+in+neonatal+calves+by+vaccination+with+M.+bovis.+BCG+Pasteur+and+M.+bovis.+BCG+Danish%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 18 (3), 373-379 (2011).</li>
<li>Thom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+immunity+against+Mycobacterium+bovis.+following+neonatal+vaccination+with+bacillus+Calmette-Gu%C3%A9rin+Danish%3A+significant+protection+against+infection+at+12%2C+but+not+24%2C+months%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (8), 1254-1260 (2012).</li>
<li>Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubation+of+whole+blood+at+39%C2%B0C+augments+gamma+interferon+%28IFN-%CE%B3%29-induced+protein+10+and+IFN-%CE%B3+responses+to+Mycobacterium+tuberculosis+.antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+vaccine+immunology+%3A+CVI%22%5BJournal%5D)">Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens.</a> Clinical and vaccine immunology : CVI. 18 (7), 1150-1156 (2011).</li>
<li>Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+immune+responses+directed+toward+a+recombinant+early+secretory+antigenic+target+six-kilodalton+protein-culture+filtrate+protein+10+fusion+protein+in+Mycobacterium+bovis.-infected+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle.</a> Infection and Immunity. 73 (10), 6659-6667 (2005).</li>
<li>Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+epitope-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+after+clearance+of+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus.</a> Journal of immunology. 169 (4), 2210-2214 (2002).</li>
<li>Todryk, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+human+effector+and+memory+T+cells+measured+by+ex+vivo+and+cultured+ELISPOT+following+recent+and+distal+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming.</a> Immunology. 128 (1), 83-91 (2009).</li>
<li>Vordermeier, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+booster+vaccines+improve+Mycobacterium+bovis.+BCG-induced+protection+against+bovine+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis.</a> Infection and Immunity. 77 (8), 3364-3373 (2009).</li>
<li>Orme, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+nonspecific+acquired+resistance+and+delayed-type+hypersensitivity%2C+but+not+specific+acquired+resistance+in+mice+inoculated+with+killed+mycobacterial+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines.</a> Infect. Immun. 56 (12), 3310-3312 (1988).</li>
<li>Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+protocols+to+optimise+the+protective+efficacy+of+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+and+lung+disease+%3A+the+official+journal+of+the+International+Union+against+Tuberculosis+and+Lung+Disease%22%5BJournal%5D)">Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG.</a> Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79 (3), 135-143 (1999).</li>
<li>Buddle, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+cattle+from+bovine+tuberculosis+by+vaccination+with+BCG+by+the+respiratory+or+subcutaneous+route%2C+but+not+by+vaccination+with+killed+Mycobacterium+vaccae.%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+veterinary+science%22%5BJournal%5D)">Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae.</a> Research in veterinary science. 59 (1), 10-16 (1995).</li>
<li>Lehmann, P. V., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+strengths+of+ELISPOT+for+T+cell+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics.</a> Methods in Molecular Biology. 792 (Chapter 1), 3-23 (2011).</li>
<li>Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+latent+from+active+Mycobacterium+tuberculosis.+infection+using+Elispot+assays%3A+looking+beyond+interferon-gamma%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma).</a> Cells. 1 (2), 99-99 (2012).</li>
<li>Lash, G. E., Pinto, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+cytokine+analysis+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+vaccines%22%5BJournal%5D)">Multiplex cytokine analysis technologies.</a> Expert review of vaccines. 9 (10), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Vordermeier, M., Whelan, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assays+to+enumerate+bovine+IFN-%CE%B3-secreting+cells+for+the+development+of+novel+vaccines+against+bovine+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis.</a> Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).</li>
<li>Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+deletion+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cells+following+infection+represents+a+strategy+of+immune+evasion+and+persistence+for+Anaplasma+marginale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale.</a> Journal of immunology. 181 (11), 7759a-7769a (2008).</li>
<li>Helden, M. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+virus-specific+CD8%28%2B%29+T-cells+provide+protection+against+pneumovirus-induced+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice.</a> Vaccine. 30 (45), 6382-6388 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Produkcja IFN-γ w długoterminowych testach ELISPOT jest na ogół spowodowana Tcm u ludzi, ale sposób, w jaki ta reakcja rozwija się w hodowli, jest słabo poznany. Nie wiadomo, czy Tcm są obecne w krążeniu i rozszerzają się in vitro, czy też odpowiedzi Tcm wynikają z różnicowania komórek efektorowych i Tem do Tcm podczas hodowli. Jednak badania z próbkami od ludzi wykazały, że limfocyty T CD4 + z testów ELISPOT ex vivo i długotrwale hodowanych IFN-γ mają niepowiązaną specyficzność epitopową, co oznacza, że odpowiedzi Tcm nie rozwijają się z komórek efektorowych28. Oczywiście czas trwania odpowiedzi może się różnić, ale jeśli zostanie osiągnięty klirens patogenu, ostatecznie zarówno odpowiedź ex vivo , jak i Tcm spadają. Wykazano również, że reakcje długoterminowych hodowli mierzonych wcześnie i długo po torowaniu antygenowym (gdy odpowiedź efektorowa jest niższa) korelują, co wskazuje, że krążące populacje Tcm wcześnie i długo po torowaniu antygenowym pozostają powiązane in vivo. Z drugiej strony, wielkość odpowiedzi ex vivo nie wydaje się być związana z wielkością reakcji pamięciowej29. Wyniki te sugerują, że długoterminowe hodowlane odpowiedzi IFN-γ ELISPOT wynikają z ekspansji Tcm in vitro i związanego z tym zaniku odpowiedzi efektorowych w próbce, a nie różnicowania komórek efektorowych do fenotypu TCM.
W przypadku bydła względny udział podzbiorów efektorowych i pamięciowych w odpowiedziach wykrywanych w długoterminowych testach IFN-γ ELISPOT nie jest znany. Ostatnie badania wskazują na korelację między długotrwałą odpowiedzią γELISPOT wywołaną szczepionką a ochroną przed późniejszym eksperymentalnym zakażeniem M. bovis23-24. Doniesiono, że słaba długoterminowa odpowiedź IFN-γ ELISPOT na szczepienie jest związana z brakiem ochrony30. Zarówno żywe, jak i zabite szczepionki wywołują podobne odpowiedzi ex vivo IFN-γ ELISPOT, ale szczepienie żywym BCG wywołuje silniejszą długotrwałą odpowiedź ELISPOT w hodowli IFN-γ niż w przypadku zabitych preparatów szczepionkowych. Co ciekawe, żywe szczepionki mają działanie ochronne, podczas gdy zabite preparaty nie zapewniają ochrony przed prowokacją zjadliwymi prątkami gruźlicy 31-32, 33.
Ocena odpowiedzi Tcm jest również możliwa poprzez sortowanie tych komórek z PBMC. Bezpośrednie wzbogacenie Tcm z PBMC wymaga jednak drogich urządzeń, wysoko wykwalifikowanego personelu i jest trudne, ponieważ komórki te nie są liczne w krwiobiegu. Długotrwała hodowla PBMC zapewnia wzbogacenie Tcm nad Tem i komórkami efektorowymi bez kosztownych urządzeń; jednak ponieważ te populacje limfocytów T są rozszerzane in vitro , mogą być mniej reprezentatywne dla odpowiedzi pamięciowych in vivo . Możliwe jest uzyskanie dostępu do odpowiedzi pamięci IFN-γ (przy użyciu długoterminowej hodowli lub strategii sortowania TCM) za pomocą testów innych niż ELISPOT, takich jak: ELISAcytokin 34, macierze kulek cytokin (CBA), barwienie wewnątrzkomórkowe (ICS) lub macierze białek cytokin (CPA). Te metody; są jednak na ogół mniej czułe niż testy ELISPOT35.
Zaletą ELISPOT jest jego zdolność do wykrywania natychmiastowego wychwytywania cytokiny wkrótce po jej uwolnieniu, zapobiegając rozcieńczeniu w supernatancie i degradacji przez rozszczepienie enzymatyczne lub wychwyt cytokin przez inne komórki. Testy ELISPOT wykrywają pojedyncze komórki wytwarzające cytokiny, zapewniając precyzyjne wyniki nawet w scenariuszach niskiego stosunku sygnału do szumu (tj. niskich odpowiedzi swoistych)35. Ponadto, w przypadku ICS, wykrycie cytokin przed uwolnieniem może skutkować fałszywą identyfikacją komórek wytwarzających cytokin (np. z powodu modulacji potranslacyjnej przed lub w trakcie procesu wydzielniczego)34. Inhibitory transportu stosowane w testach ICS w celu zminimalizowania wydzielania cytokin podczas stymulacji antygenowej (znane jako białka zatrzymania Golgiego) ograniczają czas stymulacji komórek ze względu na toksyczność komórek tych białek, co ostatecznie wpływa na produkcję cytokin35.
Mając to na uwadze - CBA, CPA i ICS są przydatnymi technikami do jednoczesnego pomiaru wielu cytokin i / lub do określania ekspresji markerów powierzchniowych komórek (tj. za pomocą ICS). W związku z tym metody te mogą być stosowane w połączeniu z testem IFN-γ ELISPOT36. Podczas gdy poprzednie badania skuteczności szczepionki przeciwko gruźlicy bydła mierzyły odpowiedź Tcm za pomocą testu ELISPOT, wykrycie odpowiedzi Tcm za pomocą innych technik prawdopodobnie przyniesie porównywalne wyniki. Co ważne, test ELISPOT jest tańszy i prostszy do wykonania niż techniki analizy CBA, CPA i ICS34. Ręczne liczenie SFC jest alternatywą dla automatycznego liczenia, a płytki ELISPOT mogą być przechowywane w RT przez długi czas przy minimalnej utracie jakości, przed lub po zliczaniu punktowym37.
Długoterminowa hodowlana odpowiedź IFN-γ ELISPOT została zastosowana do oceny odpowiedzi pamięciowych u ludzi i bydła podczas oceny odpowiedzi na szczepionkę przeciw gruźlicy14-16,31-32,33. Zakłada się również, że odpowiedzi Tcm odgrywają znaczącą rolę w odpowiedziach gospodarza na kilka innych czynników zakaźnych bydła, takich jak: Mycoplasma mycoides subsp. mycoides42, Anaplasma marginale38 i syncytialny wirus oddechowybydła 39. Potencjalnie, długoterminowy test ELISPOT może zostać dostosowany do innych gatunków zwierząt, cytokin i infekcji. Te szersze zastosowania będą szczególnie przydatne w zastosowaniach immunologii weterynaryjnej ze względu na obecną ograniczoną dostępność określonych odczynników.
Odpowiedzi TCM mają kluczowe znaczenie dla ochrony przed wieloma infekcjami, ale ich pomiar na wczesnym etapie po zakażeniu / szczepieniu (w celu przewidywania wyników choroby lub skuteczności szczepionki) może być kłopotliwy. Analiza odpowiedzi immunologicznej w warunkach ex vivo i krótkiej stymulacji antygenowej będzie częściej reprezentować odpowiedzi efektorowe, ze względu na nakładanie się odpowiedzi pamięciowych i efektorowych, zwłaszcza na początku tworzenia pamięci immunologicznej. W kontekście chorób przewlekłych, w których ładunek antygenu jest ciągły, odpowiedzi ex vivo będą oceniać odpowiedzi komórek efektorowych lub kombinację odpowiedzi komórek efektorowych i efektorowych. Opisany tutaj test ELISPOT z długoterminową hodowlą IFN-γ prawdopodobnie umożliwia pomiar odpowiedzi Tcm, a nie efektorowych limfocytów T lub połączonych odpowiedzi limfocytów T CD4 + . Podsumowując, test ELISPOT z długoterminową hodowlą IFN-γ stanowi cenne podejście do szacowania odpowiedzi pamięciowych limfocytów T i został z powodzeniem zastosowany do oceny odpowiedzi pamięciowych kilku gatunków na różne czynniki infekcji12-16, 20-25,29,31,33,34,38,39.

Limfocyty T efektorowe i pamięciowe są generowane przez programowanie rozwojowe naiwnych limfocytów T CD4+ po rozpoznaniu antygenu. Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + w komórki wytwarzające cytokiny wymaga rozpoznania patogenu przez wrodzone komórki odpornościowe, prezentacji antygenu limfocytom T, kostymulacji i zmian transkrypcyjnych skutkujących spolaryzowaną produkcją cytokin. Na przykład: komórki prezentujące antygen wytwarzają interleukinę (IL)-12 w odpowiedzi na patogeny wewnątrzkomórkowe, co wraz z rozpoznawaniem antygenu sprzyja różnicowaniu się limfocytów T w komórki pomocnicze T 1 (Th1)1,2 poprzez sygnalizację przez przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 4 (STAT4) oraz T-box ulegający ekspresji w komórkach T (T-bet), co prowadzi do aktywacji komórek, produkcji IL-2, ekspansji klonalnej i produkcji interferonu (IFN)-γ3,4. Jeśli zakażenie jest kontrolowane, do 95% limfocytów T wytworzonych w fazie ekspansji (tj. fazy skurczu) zostaje wyeliminowanych, a limfocyty T pamięci pozostają, czasami na całe życie5. Sallusto i wsp. 6, ujawnił dwa funkcjonalnie odrębne podzbiory limfocytów T pamięci u ludzi w oparciu o ekspresję receptorów naprowadzających węzły chłonne. Limfocyty T pamięci centralnej (Tcm) wyrażają receptor chemokiny C-C (CCR)-7 i CD45RO i są zlokalizowane głównie w obszarach komórek T wtórnych narządów limfatycznych. Tcm mają ograniczoną funkcję efektorową, niski próg aktywacji i zachowują wysoką produkcję i zdolność proliferacyjną IL-2. Limfocyty T pamięci efektorowej (Tem) wyrażają CD45RO, brakuje CCR7 i wyświetlają receptory do naprowadzania na tkanki obwodowe lub objęte stanem zapalnym. Komórki efektorowe nie wyrażają ani CCR7, ani CD45RO, ale szybko wytwarzają cytokiny efektorowe, takie jak IFN-γ, po rozpoznaniu antygenu.
Testy uwalniania IFN-γ (IGRA) są używane do diagnozowania gruźlicy bydła i ludzi7. Mycobacterium bovis jest głównym czynnikiem wywołującym gruźlicę bydła (bTB), podczas gdy przypadki gruźlicy u ludzi są wywoływane głównie przez Mycobacterium tuberculosis. W tych testach krew pełna lub komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) są stymulowane antygenami prątków przez 16 do 24 godzin, a produkcja IFN-γ w supernatancie jest mierzona za pomocą testu ELISA lub poprzez wykrywanie komórek wytwarzających IFN-γ przy użyciu technik ELISPOT. W wyniku krótkiego okresu stymulacji (tj. od 16 do 24 godzin) i szybkiej produkcji cytokin, testy ex vivo wykrywają przede wszystkim odpowiedzi efektorowe i tem. Zostało to potwierdzone przez analizę populacji komórek w tych hodowlach metodą cytometrii przepływowej 8-10.
Odpowiedzi ex vivo IFN-γ są rutynowo włączane do oceny panelu odpowiedzi immunologicznej szczepionek przeciw gruźlicy, w tym tych używanych do oceny odpowiedzi bydła. Większość skutecznych szczepionek przeciwko gruźlicy bydła wywołuje specyficzną odpowiedź IFN-γ, ale nie wszystkie szczepionki wywołujące odpowiedź IFN-γ są ochronne. Ponadto poziomy IFN-γ wywołane przez szczepienie, mierzone przed zakażeniem, niekoniecznie korelują z ochroną. Na przykład różne szczepy BCG mogą mieć różną zdolność do wywoływania odpowiedzi ex vivo na IFN-γ, pomimo podobnych poziomów ochrony11. W związku z tym IGRA ex vivo są cenne w diagnostyce gruźlicy i w dostępie do immunogenności szczepionki; Jednak ich zastosowanie jako predyktorów skuteczności szczepionki jest ograniczone. Z drugiej strony, odpowiedzi Tcm na szczepienie mogą być wykorzystywane do przewidywania skuteczności szczepionki, jak wykazano w przypadku zakażenia małpim wirusem niedoboru odporności (SIV) u naczelnych12,13, gruźlicy u myszy14 i malarii u ludzi15,16.
Po skutecznej odpowiedzi immunologicznej skutkującej usunięciem patogenu, Tcm są utrzymywane i zapewniają ochronę przed ewentualnym drugim zakażeniem tym samym czynnikiem. Godnym uwagi wyjątkiem od tego scenariusza jest zakażenie ludzi M. tuberculosis, w którym pacjenci otrzymujący leczniczą terapię przeciwprątkową są podatni na ponowne zakażenie17,18. Dodatkowo, zdarzenia rządzące pamięcią immunologiczną podczas przewlekłych infekcji, w których stymulacja antygenowa utrzymuje się, nie są dobrze poznane19. Podczas przewlekłych zakażeń, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) i gruźlica, znacząca odpowiedź Tcm wiąże się z korzystnym wynikiem (np. latencja z gruźlicą i subkliniczna choroba z HIV)20,21. Kilka badań na myszach i ludziach wykazało, że długoterminowe testy ELISPOT z hodowlą IFN-γ mierzą odpowiedzi Tcm16,20-22. W tym teście PBMC są hodowane w zmniejszającym się stężeniu antygenu przez 10 do 14 dni, co pozwala na szczyt i zanik odpowiedzi efektorowych; ułatwiając Tcm wyróżnienie się i ekspansję w kulturze.
Długoterminowe testy ELISPOT z hodowlą IFN-γ były również wykorzystywane w badaniach weterynaryjnych, jednak fenotyp komórek reagujących był trudny do oceny z powodu braku krytycznych odczynników, zwłaszcza przeciwciała przeciwko CCR7. Skuteczne szczepionki przeciwko gruźlicy bydła [np. z zastosowaniem pojedynczej dawki szczepionki przeciwko M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG, a następnie podszczepionki przeciw antygenowi 85A z wektorem wirusowym lub atenuowanej szczepionki M. bovisΔRD1] wywołują długotrwałą hodowlę IFN-γ odpowiedzi ELISPOT po szczepieniu, które korelują z ochroną (tj. Niższym obciążeniem prątkami i zmniejszoną patologią związaną z gruźlicą) przeciwko późniejszemu prowokacji zjadliwym M. bovis23,24. Ponadto liczba komórek wydzielających IFN-γ specyficznych dla antygenu w długoterminowych hodowlach PBMC jest wyższa po 12 miesiącach, ale zmniejsza się po 24 miesiącach od szczepienia BCG noworodków cieląt, co koreluje ze stopniem ochrony wykrywalnym po prowokacji M. bovis 25. W tym scenariuszu wyhodowany IFN-γ ELISPOT jest ważnym narzędziem do przewidywania skuteczności szczepionki, zapewniając środki do priorytetyzacji kandydatów na szczepionki do kosztownych badań skuteczności. Ponadto techniki hodowli ELISPOT można dostosować do różnych gospodarzy, patogenów i cytokin poprzez zmianę antygenów lub przeciwciał do różnych celów w różnych dziedzinach badań.

<table><tbody><tr><td>Cytrynian sodu (dihydrat)</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy (monohydrat)</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki ELISPOT PVDF</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC &ndash; AP KIT Standard</td><td>Vector Laboratories</td><td>AK-5000</td><td></td></tr><tr><td>Vector Zestaw substratów fosfatazy alkalicznej</td><td>niebieskiej Vector Laboratories</td><td>SK-5300</td><td></td></tr><tr><td>Ag85A</td><td>Lionex</td><td>LRP-0004.3</td><td>23, 24, 25, 37</td></tr><tr><td>TB 10.4</td><td>Lionex</td><td>LRP-0061.6</td><td>23, 24, 25, 37</td></tr><tr><td>PPDb</td><td>Prionics AG</td><td>7600055</td><td></td></tr><tr><td>rESAT-6:CFP10</td><td>Miły prezent Dr. Minion, Iastate</td><td></td><td>23, 24, 25, 27,&nbsp; 37</td></tr><tr><td>Mysz anty-bydlęca IFN-&gamma; Klon CC302</td><td>Serotec</td><td>MCA1783B</td><td>23, 24, 25, 27,&nbsp; 37</td></tr><tr><td>Mysz anty-bydlęca IFN-&gamma; Biotynylowany klon CC330</td><td>Serotec</td><td>MCA2112</td><td>23, 24, 25, 27,&nbsp; 37</td></tr><tr><td>Mysz anty-bydlęcy klon CD4 CC8</td><td>Serotec</td><td>MCA1653GA</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-bydlęca CD45RO Klon IL116A</td><td>Serotec</td><td>MCA2434GA</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-ludzki Klon CCR7 3D12</td><td>Abcam</td><td>ab95665</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-bydlęca IFN-&gamma;-Pe Klon CC302</td><td>Serotec</td><td>MCA1783PE</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG2a- Alexa Fluor 350</td><td>Invitrogen</td><td>A-21130</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG3 APC-CY7</td><td>SouthernBiotechnology</td><td>1080-193</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-szczura IgG-APC</td><td>Invitrogen</td><td>A10540</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm&trade;</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>BrefeldinA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed Mitogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8777</td><td></td></tr><tr><td>Recombinat ludzka interleukina 2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7908</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów t u bydła

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Limfocyty T efektorowe i pamięciowe są generowane przez programowanie rozwojowe naiwnych komórek po rozpoznaniu antygenu. Jeśli zakażenie jest kontrolowane, do 95% limfocytów T wytworzonych w fazie ekspansji (tj. fazy skurczu) zostaje wyeliminowanych, a limfocyty T pamięci pozostają, czasami na całe życie. U ludzi opisano dwa funkcjonalnie odrębne podzbiory limfocytów T pamięci na podstawie ekspresji receptorów naprowadzających węzły chłonne. Limfocyty T pamięci centralnej wyrażają receptor chemokiny C-C 7 i CD45RO i są zlokalizowane głównie w obszarach komórek T wtórnych narządów limfatycznych. Limfocyty T pamięci efektorowej wyrażają CD45RO, brakuje CCR7 i wyświetlają receptory związane z naprowadzaniem limfocytów do tkanek obwodowych lub objętych stanem zapalnym. Limfocyty T efektorowe nie wykazują ekspresji ani CCR7, ani CD45RO, ale po zetknięciu z antygenem wytwarzają cytokiny efektorowe, takie jak interferon-γ. Testy uwalniania interferonu γ są stosowane w diagnostyce gruźlicy bydła i ludzi i wykrywają przede wszystkim odpowiedzi komórek T pamięci efektorowej i efektorowej. Z drugiej strony, odpowiedzi limfocytów T pamięci centralnej limfocytów T CD4 + na szczepienie mogą być wykorzystywane do przewidywania skuteczności szczepionki, jak wykazano w przypadku zakażenia małpim wirusem niedoboru odporności u naczelnych innych niż ludzie, gruźlicy u myszy i malarii u ludzi. Kilka badań na myszach i ludziach, a także niepublikowane dane dotyczące bydła wykazały, że testy ELISPOT γ interferonu mierzą odpowiedzi limfocytów T pamięci centralnej. W tym teście komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są hodowane w zmniejszającym się stężeniu antygenu przez 10 do 14 dni (hodowla długoterminowa), co pozwala na osiągnięcie szczytu i zaniku odpowiedzi efektorowej; ułatwiając limfocytom T pamięci centralnej różnicowanie się i rozszerzanie w hodowli.

Około miesiąc po zakażeniu aerozolowym M. bovis (104 jednostek tworzących kolonie), PBMC od zwierząt zakażonych (n=8) i kontrolnych (n=8) hodowano w obecności antygenów i IL-2 przez 13 dni. Rozwój odpowiedzi Tcm po zakażeniu określono za pomocą testu IFN-γ ELISPOT. Reprezentatywne odpowiedzi Tcm (w obecności lub w nieobecności APC) oraz odpowiedzi ex vivo IFN-γ ELISPOT od zwierząt zakażonych (trzy zwierzęta) i zwierzęcia niezakażonego (jedno zwierzę) przedstawiono na Ryc. 1. Pomyślny długoterminowy test IFN-γ ELISPOT skutkuje produkcją IFN-γ przez komórki (komórki tworzące plamki, SFC) w warunkach stymulowanych oraz niemal całkowitym brakiem odpowiedzi u zwierząt niezakażonych i w warunkach niestymulowanych. Ponadto w odpowiedzi na PWM powinna wystąpić silna odpowiedź limfocytów T. Specyficzne odpowiedzi na M. bovis oceniano poprzez stymulację antygenową PPD-B lub rESAT-6:CFP10. Jak pokazano na Ryc. 1, u wszystkich trzech zwierząt zakażonych M. bovis wykryto silne odpowiedzi Tcm i ex vivo na PPD-B oraz rESAT-6:CFP10. U zwierzęcia kontrolnego wykryto minimalne lub żadne odpowiedzi Tcm i ex vivo. Ponadto do uzyskania optymalnych odpowiedzi Tcm u zwierząt zakażonych wymagana była obecność APC, co udowodniono poprzez znacznie zredukowane odpowiedzi komórek długoterminowych hodowanych w nieobecności autologicznych APC. Odpowiedź IFN-γ PBMC od zwierząt zakażonych M. bovis i niezakażonych przedstawiono na Ryc. 2. Liczbę SFC dla każdego zwierzęcia obliczono jako średnią liczbę SFC w próbkach powtórzonych w odpowiedzi na PPD-B pomniejszoną o odpowiednią odpowiedź na samą pożywkę. Odpowiedzi oszacowano dla 106 komórek. Odpowiedzi różniły się (P &lt; 0.05) w zależności od statusu zakażenia, obecności lub braku APC oraz czasu trwania hodowli (t.j. hodowla długoterminowa w porównaniu z hodowlą ex vivo).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Pozyskiwanie obrazów płytek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>Włączyć urządzenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>Uruchomić oprogramowanie „Immuno Capture” w wersji 6.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>Krok 1: wybrać typ płytki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>Krok 2: załadować płytkę.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>Krok 3: wybrać opcje skanowania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.</td>
			<td>Krok 4: rozpocząć skanowanie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.</td>
			<td>Uzyskać obraz ogólny płytki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.</td>
			<td>Wysunąć płytkę.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9.</td>
			<td>Zamknąć oprogramowanie „Immuno Capture”.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Zliczanie jednostek tworzących plamki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>Uruchomić oprogramowanie „Immuno Spot Capture” w wersji 5.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>Wybrać typ obiektu: normal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>Wybrać moduł zliczania: smart count.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>Krok 1: załadować płytkę.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>Krok 2: zdefiniować parametry zliczania: sprawdzić dokładność rozpoznawania plamek w dołkach z różnymi plamkami.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.</td>
			<td>Rozpocząć automatyczne zliczanie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Kontrola jakości</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.</td>
			<td>Uruchomić oprogramowanie „Immunospot Capture” w wersji 5.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.</td>
			<td>Wybrać moduł zliczania: quality control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.</td>
			<td>Krok 1: załadować płytkę.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.</td>
			<td>Krok 2: przeanalizować poszczególne zaznaczone dołki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.</td>
			<td>Zakończyć kontrolę jakości.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1 - Procedura pozyskiwania obrazów i zliczania komórek za pomocą czytnika ELISPOT firmy AutoImmun Diagnostika.
<img alt="Schemat eksperymentu odpowiedzi komórkowej; analiza wpływu APC na infekcję; przedstawia próbki kontrolne i zainfekowane." src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Obraz studni z testu ELISPOT na IFN-γ po długoterminowej hodowli. Test ELISPOT na IFN-γ z hodowlą komórek przeprowadzono około miesiąca po zakażeniu zjadliwym szczepem M. bovis (trzy zwierzęta). Jako kontrolę uwzględniono zwierzęta niezainfekowane (jedno zwierzę). Długoterminowe linie komórkowe generowano poprzez stymulację PBMC koktajlem rekombinowanego Ag85A (1 µg / ml), TB10.4 (1 µg / ml), rESAT-6:CFP10 (1 µg / ml) i PPD-B (5 µg / ml) przez 13 dni, a następnie przeniesiono je na płytki ELISPOT w obecności lub przy braku autologicznych APC. Komórki krótkoterminowe stanowiły PBMC wyizolowane w 13. dniu i wysiane bezpośrednio na płytki ELISPOT. Komórki długoterminowe i krótkoterminowe stymulowano PPD-B (10 µg / ml), rESAT-6:CFP10 (1 µg / ml), samym medium lub mitogenem z pokrzywnika (5 μg / ml) przez 24 h.
<img alt="Wykres kropkowy liczby komórek w badaniu zakażenia M. bovis, przedstawiający wyniki analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne wyniki odpowiedzi IFN-γ ELISPOT w długotrwałej kulturze na oczyszczoną pochodną białkową M. bovis (PPD-B). Analizę IFN-γELISPOT w kulturze przeprowadzono około miesiąca po zakażeniu wirulentnym szczepem M. bovis (osiem zwierząt). Jako kontrolę uwzględniono zwierzęta niezakażone (osiem zwierząt). Komórki długotrwałe uzyskano poprzez stymulację PBMC koktajlem rekombinowanych białek Ag85A (1 µg / ml), TB10.4 (1 µg / ml), rESAT-6:CFP10 (1 µg / ml) oraz PPD-B (5 µg / ml) przez 13 dni, a następnie przeniesiono je na płytki ELISPOT w obecności lub w przypadku braku autologicznych APC. Komórki krótkotrwałe stanowiły PBMC wyizolowane w 13. dniu i wysiane bezpośrednio na płytkę ELISPOT. Komórki długotrwałe i krótkotrwałe stymulowano PPD-B (10 μg / ml) lub samym medium przez 24 h. Specyficzne odpowiedzi dla każdego zwierzęcia (SFC / 106 komórek) przedstawiono jako odpowiedź na PPD-B (średnia z próbek powtórzonych) pomniejszoną o odpowiedź na samo medium.

Długoterminowy test immunologiczny związany z interferonem γ enzymem jest używany jako miara odpowiedzi pamięci centralnej i koreluje z ochronnymi odpowiedziami na szczepionkę przeciw prątkom. Dzięki temu testowi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są stymulowane antygenami prątkami i interleukiną-2 przez 14 dni, umożliwiając różnicowanie i ekspansję limfocytów T pamięci centralnej.

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena odpowiedzi limfocytów T efektorowych oraz pamięciowych przy użyciu testów ELISpot dla interferonu gamma w krótkoterminowych i długoterminowych hodowlach, odpowiednio. Ocena odpowiedzi pamięci centralnej jest realizowana poprzez hodowlę mononuklearnych komórek krwi obwodowej bydła pod wpływem stymulacji antygenowej przez 13 dni. Długoterminowa hodowla pozwala na wystąpienie, a następnie wygaśnięcie odpowiedzi limfocytów T efektorowych.Do kultur dodaje się interleukinę 2 w celu podtrzymania komórek T pamięci. W 13. dniu komórki długożyjące przenosi się na płytki L spot pokryte przeciwciałem wychwytującym IFN gamma. Odpowiedź komórek długożyjących na poszczególne antygeny prątkowe ocenia się w obecności lub w nieobecności autologicznych komórek prezentujących antygen.Komórki APC są izolowane ze świeżych p BMC poprzez adhezję w 13. dniu. Dodatkowo, odpowiedź świeżo izolowanych pbmc w warunkach ex vivo jest oceniana jako korelat odpowiedzi efektorowych. W kilku badaniach wykazano, że odpowiedź sbot bydlęcych hodowanych długoterminowo na antygeny mykobakteryjne po szczepieniu pozytywnie koreluje z efektywnością szczepionki.Ponadto długoterminowe hodowle limfocytów T zawierają głównie komórki T pamięci centralnej zarówno u ludzi, jak i u bydła. W celu przeprowadzenia testu ELISpot z wykorzystaniem długoterminowych hodowli, od zwierząt zakażonych M. bovis lub szczepionych pobiera się 60 ml krwi poprzez nakłucie żyły szyjnej, a następnie izoluje PBMC za pomocą wirowania w gradiencie gęstości.Stężenie komórek należy dostosować do 4 milionów komórek na ml. W kompletnej pożywce RPMI należy rozpocząć od naniesienia 500 mikrolitrów antygenów mikrobakteryjnych, w tym przypadku TB 10.4 oraz antygenu 85 A i oczyszczonej pochodnej białkowej kultury em bovis zwanej PPDB. Następnie należy dodać 500 mikrolitrów PBMC wyizolowanych od każdego zwierzęcia, wykonując cztery powtórzenia dla każdego zwierzęcia.Należy pamiętać, że wszystkie studzienki muszą zostać stymulowane. Kontrole, takie jak brak stymulacji lub mitogeny, nie są w tym kroku wymagane. Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C, będącej normalną temperaturą bydła, przez 13 dni. Trzeciego i siódmego dnia odpipetować 500 µL z każdej studzienki, robiąc to ostrożnie, aby nie naruszyć warstwy komórek na dnie studzienek.Uzupełnij objętość pełną pożywką RPMI zawierającą IL-2. Umieść płytkę w inkubatorze. W dniu 10. usuń 750 µL supernatantu z każdej studni i uzupełnij go pełną pożywką RPMI bez IL-2. W dniu 12. odpipetuj i usuń 1 ml supernatantu z każdej studni, uzupełniając go pełną pożywką RPMI bez IL-2. Przygotuj również płytkę ELISPOT do powlekania przeciwciałem wychwytującym IFN-gamma: najpierw pipetuj 15 µL 35% alkoholu do każdej studni za pomocą pipety wielokanałowej; ten krok poprawia rozdzielczość plamek.Przemyć dokładnie sześć razy 300 µL PBS. Dodać 100 µL przeciwciała wychwytującego w stężeniu 8 µg/ml w PBS. Podczas wszystkich procedur należy pipetować ostrożnie, nie dopuszczając do dotykania lub uszkodzenia membrany na dnie dołka; umieścić płytkę w plastikowej torebce i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.W 13. dniu pobierz 60 ml krwi poprzez nakłucie żyły szyjnej od tych samych zwierząt, od których pobrano próbki w pierwszym dniu. Wyizoluj PBMC i dostosuj stężenie do 2 milionów komórek na ml. Odpowiednio opisz płytkę do testu ELISpot dla każdego zestawu próbek.Komórki długoterminowe z APC, komórki długoterminowe bez APC oraz komórki ex vivo. Odpiąp przeciwciało wychwytujące z dołków płuczących płytki Ellis spot, używając 300 µL PBS z tweenem. Powtórz czynność sześć razy, odlej płyn płuczący i pipetuj.50 µL świeżo wyizolowanych p BMCs do studzienek przeznaczonych dla komórek długoterminowych. Dodatkowo APCs. Pozostałe studzienki płytki L spot należy zablokować, dodając 200 µL kompletnego RPMI na studzienkę. W celu oceny fenotypu komórek metodą cytometrii przepływowej równolegle z płytką testową L spot.50 µL świeżo wyizolowanych komórek w odpowiednio oznakowanej 96-dołkowej płytce o okrągłych dołkach. Jest to test pomocniczy, który należy przeprowadzić równolegle z testem żółtych plamek (yellow spot assay) w celu określenia fenotypu komórek reagujących. Inkubować płytki przez 90 minut w temperaturze 39 °C w inkubatorze z 5% CO2, aby umożliwić przyleganie komórek prezentujących antygen.Należy również inkubować 200 ml kompletnego medium RPMI, aby je ogrzać podczas tego 90-minutowego etapu inkubacji. Zebrać komórki z długotrwałej hodowli z płytki 24-dołkowej. Połączyć cztery powtórzenia od każdego zwierzęcia w jednej 15 ml probówce stożkowej.Wiruj probówki przez pięć minut przy 400 Gs. Usuń nadsącz poprzez odwrócenie probówki, rozbij pellet komórkowy i dodaj 5 ml PBS; w razie potrzeby delikatnie resuspenduj pellet. Przemyj komórki dwukrotnie, a następnie dostosuj stężenie komórek do 200 000 komórek na ml. Po 90 minutach inkubacji wyjmij z inkubatora płytkę LPO oraz kompletne podłoże RPMI.Umieść płytkę LPO na potrząsarku do płytek na 30 sekund. Następnie usuń nieprzytwierdzone komórki poprzez odwrócenie płytki i pipetowanie 150 µL podgrzanego, pełnego medium RPMI do każdego dołka. Potrząśnij płytką i odlej płyn przemywający.Powtórz czynność trzy razy, odlej jak najwięcej cieczy, a następnie dodaj do odpowiednich studzienek zawierających przylegające APC 100 µL każdego antygenu na studzienkę. Następnie pipetuj 100 µL na studzienkę zawiesiny komórek hodowanych długoterminowo (200 000 komórek/mL) do studzienek oznaczonych jako komórki długoterminowe plus APC.Należy upewnić się, że komórki hodowane długoterminowo dodawane w tym kroku pochodzą od tego samego zwierzęcia, co APC znajdujące się już w dołku. Nie należy mieszać APC i komórek hodowanych długoterminowo pochodzących od różnych zwierząt. Ponadto, do dołków bez APC, służących do oceny odpowiedzi długoterminowych, należy pipetować 100 µL zawiesiny komórek hodowanych długoterminowo o stężeniu 200 000 komórek/ml na dołek.W przypadku braku prezentacji antygenu, do każdej studzienki należy dodać 100 µL komórek krótkoterminowych, świeżo wyizolowanych i dostosowanych do stężenia 2 milionów komórek na mL w celu oceny odpowiedzi ex vivo. W przypadku przeprowadzania analizy cytometrii przepływowej, należy wypłukać 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem, a następnie do studzienek dodać świeżo wyizolowane komórki długoterminowe oraz antygeny, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami. W przypadku zastosowania płytki LPO dla IFN Gamma, płytki należy inkubować przez noc w temperaturze 39 °C w inkubatorze z 5% CO2.Należy upewnić się, że płytki leżą płasko i nie wolno ich układać w stosy w 14. dniu. Należy odpiąć ciecze z dołków i przemyć płytki sześciokrotnie 300 µL PBS z dodatkiem Tween na dołek, za każdym razem umieszczając płytki na wytrząsarce na 10 sekund przed i pomiędzy płukaniem. Następnie należy przemyć płytki jednokrotnie taką samą objętością wody destylowanej i dodatkowo sześciokrotnie PBS z dodatkiem Tween.Na koniec komórki należy przemyć dwukrotnie, używając 300 µL PBS na dołek. Płyn do mycia usuwa się poprzez odstukanie płytki o ręczniki papierowe lub podkładki absorbujące. Następnie należy dodać 100 µL na dołek przeciwciała detekcyjnego o stężeniu 5 µg/ml rozcieńczonego w PBS z 1% bovine serum albumin.Inkubować płytki przez 120 minut w temperaturze 39 Celsius. Podczas tego etapu inkubacji, na 30 minut przed użyciem lub 90 minut po dodaniu przeciwciała detekcyjnego do dołków, przygotować roztwór fosfatazy alkalicznej z zestawu VTA stain A BC AP zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć odczynnik w PBS z dodatkiem tweeny. Po 120-minutowej inkubacji usunąć przeciwciało detekcyjne poprzez odwrócenie płytki, a następnie przemyć płytki sześciokrotnie, używając 300 microliters PBS z dodatkiem tweeny na każdy dołek.Usuń płyn piorący, osuszając płytkę na ręcznikach papierowych. Następnie dodaj 100 µL roztworu fosfatazy alkalicznej do każdego dołka. Inkubuj płytki przez 45 minut w temperaturze pokojowej.Odlać płyn i przemyć każdą płytkę sześciokrotnie roztworem PBS z dodatkiem Tween. Przygotować roztwór substratu z zestawu Vector Blue AP Substrate III zgodnie z instrukcjami producenta. Odczynniki rozcieńczyć w 0,1 M buforze Tris-HCl o pH 8,2.Pipetuj 50 µL substratu D. Każdy dołek inkubuj w temperaturze pokojowej do momentu pojawienia się niebieskiego zabarwienia, co trwa około 30 minut. Odlej ciecz i przemyj płytki obfitą ilością wody destylowanej. Zdejmij dolną płytkę, aby odsłonić membranę, przemyj tył dołków i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu.Zmierz odpowiedź za pomocą analizatora obrazu immuno spot lub przechowuj płytki w ciemności w temperaturze pokojowej do momentu pomiaru odpowiedzi. Dzięki wysokiej stabilności substratu reakcyjnego jakość zostaje zachowana przez kilka lat. W przypadku oceny fenotypu i odpowiedzi cytokinowej za pomocą cytometrii przepływowej, przeprowadź standardowe procedury barwienia komórek wysianych na 96-dołkową płytkę o okrągłym dnie reprezentującą TCM w obecności lub braku APC; przedstawiono odpowiedzi IFN gamma ELISPOT ex vivo z zainfekowanych i niezainfekowanych zwierząt.Specyficzne odpowiedzi na m bovis są oceniane za pomocą stymulacji antygenowej PBDB lub ESAT six, CFP 10. Plamki na dnie płytek stanowią zabarwiony produkt testu yellow spot. Każda plamka reprezentuje zazwyczaj pojedynczą komórkę produkującą cytokiny, co pozwala na ilościowy pomiar komórek T produkujących IFN gamma w próbkach pobranych od zakażonych zwierząt.Długoterminowe odpowiedzi IFN gamma L spot, przedstawione jako komórki tworzące plamki (SFC), są wyraźnie widoczne; w przypadku komórek pochodzących od bydła nieinfected oraz komórek niestymulowanych (zarówno od bydła zainfekowanego, jak i niezainfekowanego) stwierdzono znikomą lub żadną produkcję IFN gamma w odpowiedzi na stymulację antygenem. Silna odpowiedź limfocytów T powinna wystąpić w odpowiedzi na mitogen z rośliny pokrzywnika (poke weed mitogen), co obrazują odpowiedzi TCM oraz ex vivo na PPDB i ESAT 6. W przypadku wszystkich zwierząt zainfekowanych M. bovis wykryto CCFP 10, natomiast w zwierzęciu kontrolnym wykryto minimalne lub żadne odpowiedzi TCM i ex vivo.Obecność APC była niezbędna dla optymalnych odpowiedzi TCM u zakażonych zwierząt, co potwierdzono poprzez znaczny spadek odpowiedzi w przypadku komórek hodowanych długoterminowo. W przypadku braku autologicznych APC zaprezentowano komórki tworzące plamki (SFC) pochodzące od zwierząt zakażonych M. bovis oraz niezakażonych. Liczbę SFC dla każdego zwierzęcia obliczono jako średnią liczbę SFC na 10⁶ komórek w próbkach powtórzonych w odpowiedzi na PPDB, pomniejszoną o odpowiednią odpowiedź na samą pożywkę; odpowiedzi różniły się w zależności od statusu zakażenia, obecności lub braku APC oraz czasu trwania hodowli, tj. hodowli długoterminowej w porównaniu z hodowlą ex vivo.

application-long-term-cultured-interferon-enzyme-linked-immunospot

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Ten protokół opisuje, jak zaszczepić myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i zmierzyć odpowiedzi interferonu γ (IFN-γ) przez komórki NK (natural killer), limfocyty T (NKT) i adaptacyjne limfocyty T po zakażeniu. Protokół ten opisuje również, w jaki sposób przeprowadzać badania przeżycia u myszy po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu.

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.

Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Metodologia opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) i ich zastosowanie do oceny in vitro kandydatów na antygeny podczas opracowywania potencjalnych szczepionek weterynaryjnych u bydła.

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Poznaj metodę oceny odpowiedzi limfocytów T pamięciowych i efektorowych u bydła za pomocą długotrwale hodowanego testu ELISPOT związanego z interferonem γ. Technika ta pozwala badać korelację między odpowiedzią komórkową a skutecznością szczepionki przeciwko bakteriom prątkowym.

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Przeglądaj więcej filmów