Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Ogólnym celem tej procedury jest ocena odpowiedzi limfocytów T zarówno efektorowych, jak i pamięciowych przy użyciu odpowiednio krótko- i długoterminowych testów plamki interferonu gamma L. Ocena odpowiedzi pamięci centralnej odbywa się poprzez hodowlę komórek jednojądrzastych bydlęcej krwi obwodowej pod stymulacją antygenową przez 13 dni. Długotrwała hodowla umożliwia wystąpienie i zanik odpowiedzi efektorowych limfocytów T.

Interleukina druga jest dodawana do kultur w celu utrzymania limfocytów T pamięci. W dniu 13 komórki długoterminowe są przenoszone na płytki punktowe L pokryte przeciwciałem wychwytującym promienie gamma IFN. Odpowiedź komórek długotrwałych na poszczególne antygeny prątkowe ocenia się w obecności lub braku komórek prezentujących autologiczny antygen

APC Transportery opancerzone są izolowane od świeżych b BMC przez przyleganie do zaleceń lekarskich w 13 dniu. Dodatkowo, odpowiedź świeżo wyizolowanego pbmc w warunkach ex vivo jest oceniana jako korelat odpowiedzi efektorowych. W kilku badaniach wykazano, że długoterminowa odpowiedź bydła na antygeny prątkowe po szczepieniu jest dodatnio skorelowana ze skutecznością szczepionki.

Ponadto długoterminowe hodowle limfocytów T zawierają głównie limfocyty T pamięci centralnej zarówno u ludzi, jak i bydła w celu przeprowadzenia długoterminowego testu plamki L. Od zwierząt zakażonych lub zaszczepionych przez nakłucie szyjne, dożylne pobiera się 60 ml krwi za pomocą nakłucia szyi, nakłucia żyły i P BMC są izolowane według gęstości. Wirowanie gradientowe.

Koncentracja komórek powinna być dostosowana do 4 milionów komórek na ml. W kompletnych pożywkach RPMI należy rozpocząć od posiewu 500 mikrolitrów antygenów mikrobakteryjnych, w tym przypadku TB 10.4 i antygenu 85 A oraz oczyszczonej pochodnej białkowej kultury em bovis zwanej PPDB. Następnie dodać 500 mikrolitrów pbmc wyizolowanych z każdego zwierzęcia po cztery powtórzenia na zwierzę.

Należy pamiętać, że wszystkie studnie muszą być stymulowane. Kontrole, takie jak brak stymulacji lub mitogeny, nie są potrzebne na tym etapie, inkubuj płytkę w temperaturze 39 stopni Celsjusza, normalnej temperaturze bydła przez 13 dni. W trzecim i siódmym dniu należy ostrożnie wyrzucić 500 mikrolitrów z każdej studzienki, pipetując, aby nie naruszyć warstwy komórek na dnie studzienek.

Uzupełnij wolumin o kompletny wskaźnik PMI zawierający IL Two. Umieścić płytkę w inkubatorze W dniu 10 wyrzucić 750 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki, uzupełnić pełnym RPMI bez IL dwa w dniu 12, odpipetować i wyrzucić jeden ml supernatantu z każdej studzienki uzupełnionej pełnym RPMI bez IL dwa. Przygotuj również płytkę punktową L, która ma być pokryta przeciwciałem wychwytującym IFM Gamma, najpierw odpipetuj 15 mikrolitrów 35% alkoholu do każdej studzienki za pomocą pipetera wielokanałowego, ten krok zwiększa definicję plamki.

Umyj dobrze sześć razy 300 mikrolitrami PBS. Dodać 100 mikrolitrów przeciwciała wychwytującego w stężeniu ośmiu mikrogramów na ml w PBS. Pipetowanie należy wykonywać ostrożnie podczas wszystkich procedur, nie dopuszczając do kontaktu końcówek pipet ani do uszkodzenia membrany na dnie studzienki. Umieść płytkę w plastikowej torbie i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

W dniu 13 należy pobrać 60 ml krwi przez nakłucie żyły szyjnej od tych samych zwierząt, od których pobrano próbki pierwszego dnia. Wyizolować pbmc i dostosować stężenie do 2 milionów komórek na ml. Oznacz płytkę punktową L prawidłowo dla każdego zestawu próbek.

Komórki długoterminowe plus APC: komórki długoterminowe bez APC i komórki ex vivo. Wyrzuć przeciwciało wychwytujące z dołków do płukania płytki punktowej Ellisa za pomocą 300 mikrolitrów PBS zawierających tween. Powtórz sześć razy, wyrzuć, umyj płyn i pipetę.

50 mikrolitrów świeżo wyizolowanych b BMC do studzienek przeznaczonych dla komórek długoterminowych. Do tego transportery opancerzone. Zablokuj inne studzienki płytki punktu L za pomocą 200 mikrolitrów na studzienkę pełnego RPMI Aby ocenić fenotyp komórek za pomocą cytometrii przepływowej równolegle z płytką do oznaczania plamki L.

50 mikrolitrów świeżo wyizolowanych komórek w odpowiednio oznakowanej 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem. Jest to test pomocniczy, który należy wykonać w połączeniu z testem żółtej plamki w celu określenia fenotypu reagujących komórek. Inkubuj płytki przez 90 minut w temperaturze 39 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2, pozwalając komórkom prezentującym antygen przylegać.

Inkubuj również 200 ml pełnego RPMI, aby rozgrzać go podczas tego 90-minutowego etapu inkubacji. Zbierz długotrwale hodowane komórki z płytki 24-dołkowej. Łączenie poczwórnych duplikatów z każdego zwierzęcia w pojedynczą stożkową rurkę o grubości 15 mil.

Wirować probówki przez pięć minut w temperaturze 400 Gs. Wyrzucić supernatant przez odwrócenie probówki, usunąć osad komórkowy i dodać pięć ml PBS, delikatnie zawiesić osad, jeśli to konieczne. Umyj komórki dwukrotnie, a następnie dostosuj stężenie komórek do 200 000 komórek na ml. Po 90-minutowej inkubacji należy pobrać płytkę LPO i cały RPMI z inkubatora.

Umieść płytkę LPO na wytrząsarce płyt na 30 sekund. Następnie usuń nieprzylegające komórki za pomocą pipety inwersyjnej do inwersji płytki 150 mikrolitrów na studzienkę ciepłego, pełnego RPMI. Potrząśnij płytką i wylej płyn do mycia.

Powtórz trzy razy, wylej jak najwięcej płynu i dodaj sto mikrolitrów na stu mikrolitrów każdego antygenu na studzienkę do odpowiednich studzienek zawierających przylegające APC. Następnie pipetować 100 mikrolitrów na studzienkę długotrwałej zawiesiny komórek hodowlanych. 200 000 komórek na ML do studzienek oznaczonych jako komórki długoterminowe plus APC.

Upewnij się, że długoterminowe komórki dodane na tym etapie pochodzą od tego samego zwierzęcia, co APC już znajdujące się w studni. Nie mieszaj APC z komórkami hodowanymi długoterminowo od różnych zwierząt. Ponadto pipetować 100 mikrolitrów na studzienkę długotrwałej zawiesiny komórek hodowlanych w stężeniu 200 000 komórek na ml do studzienek bez APC w celu oceny długoterminowych odpowiedzi.

W przypadku braku prezentacji antygenu dodać 100 mikrolitrów na studzienkę komórek krótkotrwałych, a także świeżo wyizolowane i dostosowane do 2 milionów komórek na ML w celu oceny odpowiedzi ex vivo. W przypadku wykonywania analizy cytometrii przepływowej należy umyć płytkę z okrągłym dnem 96 dołka i dodać do studzienek długotrwale świeżo wyizolowane komórki i antygeny, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami. Stosowany do inkubacji płytek IFN Gamma LPO przez noc w temperaturze 39 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2.

Upewnij się, że talerze leżą płasko i nie układaj talerzy w stos 14 dnia. Wylać płyny z dołków i płytek myjących sześć razy po 300 mikrolitrów na studzienkę PBS zawierającą twee, umieszczając je na wytrząsarce płytek za każdym razem na 10 sekund przed i pomiędzy myciami. Następnie przemyj jeden raz tą samą objętością wody destylowanej i dodatkowe sześć razy PBS zawierającym tween.

Na koniec umyj komórki dwukrotnie 300 mikrolitrami na studzienkę PBS. Usuń płyn do mycia, stukając płytką o ręczniki papierowe lub wkładki chłonne. Dodać 100 mikrolitrów na studzienkę przeciwciała wykrywającego w dawce pięciu mikrogramów na ml rozcieńczonego w PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej.

Inkubować płytki przez 120 minut w temperaturze 39 stopni Celsjusza. Podczas tego etapu inkubacji należy przygotować roztwór fosfatazy alkalicznej ze wzorca zestawu VTA stain A BC AP zgodnie z instrukcjami producenta 30 minut przed użyciem lub 90 minut po dodaniu przeciwciała wykrywającego do studzienek. Rozcieńczyć odczynnik w PBS zawierającym dwanaście po 120 minutach inkubacji, odrzucić przeciwciało wykrywające za pomocą płytki do przemycia inwersji płytki sześć razy w ilości 300 mikrolitrów na studzienkę PBS zawierającej tween.

Usuń płyn do mycia, stukając talerzem o ręczniki papierowe. Następnie dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę alkalicznego roztworu fosfatazy. Inkubować płytki przez 45 minut w temperaturze pokojowej.

Wyrzuć płyn i umyj każdą płytkę sześć razy za pomocą tween zawierającego PBS. Przygotuj roztwór podłoża z zestawu wektorowego niebieskiego podłoża AP trzy zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć odczynniki w 0,1 molowym buforze tris HCL o pH 8,2.

Odpipetować 50 mikrolitrów substratu D. Każdą studzienkę inkubować w temperaturze pokojowej, aż niebieski kolor zacznie się rozwijać około 30 minut. Wylej płyn i umyj talerze dużą ilością wody destylowanej. Zdejmij dolną płytę, aby odsłonić membranę, wypłukać z powrotem studzienki i pozostaw płytę do wyschnięcia na powietrzu.

Zmierz odpowiedź za pomocą analizatora obrazu plamki immunologicznej lub trzymaj płytki w ciemności w temperaturze pokojowej, aż odpowiedź zostanie zmierzona. Ze względu na wysoką stabilność substratu reakcyjnego jakość jest zachowana przez kilka lat. W przypadku oceny fenotypu i odpowiedzi na cytokiny za pomocą cytometrii przepływowej, należy przeprowadzić standardowe procedury barwienia komórek posianych na okrągłym dnie 96, reprezentatywnej płytki studziennej TCM w obecności lub bez APC, pokazano załogowe odpowiedzi na plamkę gamma L IFN ex vivo od zwierząt zakażonych i niezakażonych.

Specyficzne odpowiedzi na m bovis są oceniane za pomocą stymulacji antygenowej PBDB lub ESAT six, CFP 10. Plamki na spodzie płytek są kolorowym produktem testu żółtej plamki. Każda plamka zazwyczaj reprezentuje pojedynczą komórkę produkującą cytokiny, zapewniając ilościową miarę IFN gamma wytwarzającą komórki T z komórkami zakażonych zwierząt.

Długoterminowe odpowiedzi plamki gamma L IFN prezentowane jako komórki tworzące plamki lub SFC są wyraźnie wizualizowane: niewielką lub żadną produkcję gamma IFN w odpowiedzi na stymulację antygenu obserwuje się w komórkach niezakażonego bydła i w niestymulowanych komórkach bydła zakażonego lub niezakażonego. Silna odpowiedź limfocytów T powinna wystąpić w odpowiedzi na mitogen chwastów typu poke, jak wykazano, TCM i odpowiedzi ex vivo na PPDB i ESAT six. CCFP 10 wykryto u wszystkich zwierząt zakażonych 3M bovis, a od zwierzęcia kontrolnego wykryto minimalne lub żadne odpowiedzi TCM i ex vivo.

Obecność APC była wymagana dla optymalnej odpowiedzi TCM przez zakażone zwierzęta, o czym świadczy znacznie zmniejszona odpowiedź przez długoterminowe hodowle komórek. Wobec braku autologicznych APC przedstawiono komórki plamotwórcze od zwierząt em, zakażonych i niezakażonych. Liczbę SFC z każdego zwierzęcia obliczono na podstawie średniej liczby SFC w 10 do szóstych komórkach w zduplikowanych próbkach w odpowiedzi na PPDB pomniejszonej o odpowiednią odpowiedź na samą pożywkę, odpowiedzi różniły się w zależności od statusu infekcji, obecności lub braku APC i długości hodowli, tj. hodowli długoterminowej w porównaniu z hodowlą ex vivo.