Name: In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj metodę in situ wykrywania bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA. Technika ta umożliwia badanie roli bakterii w chorobach takich jak periodontitis, nowotwory i choroby zapalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant (2013R1A1A3005669) z Narodowej Fundacji Badawczej Korei oraz grant (HI13C0016) Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych, Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej.

1. Przygotowanie sondy
<ol>
	<li>Amplifikacja PCR sondy
	<ol>
		<li>W przypadku sondy specyficznej dla P. gingivalis amplifikować fragment DNA 343-pz 16S rRNA P. gingivalis metodą PCR, używając genomowego DNA P. gingivalis i następujących starterów: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' i 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'10. Wykonać amplifikacje w następujących warunkach cyklu: 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 1 minutę 20 sekund, a następnie przedłużenie o 5 minut w temperaturze72 °C 10,11.</li>
		<li>Amplifikować sondę eubakteryjną za pomocą fragmentu DNA o długości 70 pz (5'-CAGGTGCTGCATGGCTCTCGTCAGCTCGTGTGTGAAATGTTGGGTTAAG 
		TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3') syntetyzowany jako oligonukleotyd i następujące startery: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' i 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'11. Wykonaj amplifikacje w następujących warunkach cyklu: 40 cykli w temperaturze 9 4 °C przez 30 sekund, 60 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 1 minutę 20 s, a następnie przedłużenie o 5 minut w temperaturze72 °C 11,12.</li>
		<li>Produkty PCR należy wytrącić (≥500 μl), dodając 3 M octan sodu (pH 5,2) i 100% etanolu (w stosunku 10:1:2) i inkubując w temperaturze -20 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 14 000 x g przez 15 minut, ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu TE i zmierzyć stężenie DNA za pomocą gęstości optycznej przy 260 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie DIG za pomocą zestawu do znakowania i wykrywania DNA DIG
	<ol>
		<li>Zmieszać 3 μg sondy z wodą do końcowej objętości 15 μl.</li>
		<li>Denaturować DNA w temperaturze 95 °C przez 10 minut i szybko schłodzić na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 2 μl 10x mieszanki heksanukleotydów, 2 μl mieszanki znakującej dNTP i 1 μl enzymu Klenowa do 15 μl zdenaturowanego DNA.</li>
		<li>Mieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny do 48 godzin, a następnie zatrzymać reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź czułość sondy znakowanej DIG za pomocą zestawu do znakowania i wykrywania DNA DIG
	<ol>
		<li>Ręcznie załadować 1 μl seryjnych rozcieńczeń sondy kontroli dodatniej dostarczonej w zestawie i 1 ng sondy z oznaczeniem DIG na membranę nylonową i suszyć przez 5 minut w temperaturze suchej.</li>
		<li>Krótko zanurzyć błonę w 2x buforze SSC (0,3 M NaCl, 30 mM cytrynian sodu, pH 7,0) i inkubować błonę w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w celu unieruchomienia DNA.</li>
		<li>Krótko zanurzyć błonę w buforze kwasu maleinowego (MAB, 0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl, pH 7,5) i inkubować z przeciwciałem sprzężonym z fosfatazą alkaliczną anty-DIG (AP) rozcieńczonym (1:5 000) w 6 ml roztworu blokującego dostarczonego w zestawie w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Przemyć membranę MABT (MAB zawierający 1% Tween 20) i nałożyć 40 μl roztworu NBT/BCIP zmieszanego z 2 ml buforu detekcyjnego (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, pH 9,5) na membranę przez 1 min. Jeśli czułość znakowanej sondy nie jest zadowalająca, powtórz kroki od 1.1.3 do 1.3.4.</li>
		<li>Zmierz stężenie DNA znakowanej sondy (OD260) i dostosuj stężenie do 100 ng μl-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź specyfikę sondy z oznaczeniem DIG
	<ol>
		<li>Denaturacja próbek genomowego DNA (25 ng 3 μl-1 na każdą próbkę) różnych gatunków bakterii, w tym bakterii, której celem jest specjalna sonda, w temperaturze 95 °C przez 10 minut i szybko schładzać na lodzie.</li>
		<li>Ręcznie załaduj zdenaturowane DNA na nylonową membranę i susz przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Krótko zanurzyć błonę w buforze 2x SSC i inkubować błonę w temperaturze 80 °C przez 2 godziny w celu unieruchomienia DNA.</li>
		<li>Zablokuj membranę roztworem blokującym w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
		<li>Rozcieńczyć sondę przy 1 ng μl-1 w buforze hybrydyzacyjnym, zdenaturować rozcieńczone sondy i nałożyć na membranę.</li>
		<li>Inkubować błonę w temperaturze 45 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyć membranę trzykrotnie buforem 2x SSC.</li>
		<li>Krótko namocz membranę w MAB.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem sprzężonym z anty-DIG AP rozcieńczonym (1:2 000) w 6 ml roztworu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przemyć membranę MABT i nałożyć 40 μl roztworu NBT/BCIP zmieszanego z 2 ml buforu detekcyjnego.</li>
		<li>Gdy sonda nie osiąga oczekiwanej swoistości, należy zwiększać temperaturę hybrydyzacji, aż do zaobserwowania swoistości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hybrydyzacja in situ 
Uwaga: Aby uniknąć wysuszenia próbek i odczynników, wszystkie inkubacje wykonuj w wilgotnej komorze wyłożonej mokrymi ręcznikami papierowymi.
<ol>
	<li>Deparafinizacja i rehydratacja skrawków tkanek
	<ol>
		<li>Przygotować skrawki tkanek o grubości 4 μm z bloków zatopionych w parafinie. Formalina, paraformaldehyd i utrwalacz na bazie są zgodne z tym protokołem.</li>
		<li>Przygotuj wszystkie odczynniki, używając wody uzdatnionej przez DEPC.</li>
		<li>Podgrzewać szkiełka w suchym piecu w temperaturze 60 °C przez 30 minut i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w 100% ksylenie na 5 minut trzy razy; za każdym razem używaj świeżego ksylenu. 
		Uwaga: Wykonaj tę procedurę usuwania wosku w dygestoriach chemicznych.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w 100% etanolu na 5 minut dwukrotnie, za każdym razem używając świeżego etanolu, a następnie ponownie uwodnij próbki w seryjnych roztworach etanolu 90%, 80% i 70% na 5 minut każdy.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w wodzie uzdatnionej DEPC na 1 minutę i umyj szkiełka w PBS poddanym DEPC (pH 7,4) przez 6 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne zabiegi skrawków tkanek
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełka w 0,1 N kwasie solnym na 20 minut i umyj szkiełka w wodzie uzdatnionej przez DEPC przez 30 sekund.</li>
		<li>Narysuj hydrofobową barierę otaczającą próbki za pomocą pisaka woskowego. 
		Uwaga: Wielkość bariery hydrofobowej zależy od wielkości próbek. W związku z tym objętości odczynników stosowanych w kolejnych etapach różnią się w zależności od wielkości próbek, ale muszą wypełniać barierę hydrofobową (50 μl dla małych próbek i 400 μl dla dużych próbek).</li>
		<li>Próbki należy traktować 50 do 400 μl proteinazy K (1 do 10 μg ml-1 w PBS poddanym działaniu DEPC) w suchym piecu w temperaturze 37 °C przez 30 minut i myć szkiełka w 1x PBS poddanych działaniu DEPC przez 1 min.</li>
		<li>Namocz szkiełka w 4% paraformaldehydzie w PBS poddanym działaniu DEPC przez 10 minut, a następnie umyj szkiełka w PBS poddanym działaniu DEPC przez 1 minutę.</li>
		<li>Moczyć szkiełka w 0,1 M trietanoloamino-HCl (pH 8,0) zawierającym 0,5% bezwodnika octowego przez 20 minut i myć szkiełka w wodzie uzdatnionej przez DEPC przez 30 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja z sondą i myciem
	<ol>
		<li>Zanurz slajdy w buforze 2x SSC na 20 minut.</li>
		<li>Rozcieńczyć sondę przy 1 ng μl-1 w buforze hybrydyzacyjnym (4x SSC, 50% [vol/vol] formamid, 1x roztwór Denhardta, 10% [wt/vol] siarczan dekstranu, 0,1% [wt/vol] dodecylosiarczan, 0,4 mg ml-1 DNA plemników łososia). W przypadku kontroli ujemnych należy zmieszać oznakowaną sondę z 10-krotnym nadmiarem nieznakowanej sondy.</li>
		<li>Rozcieńczone sondy poddać denaturacji i nałożyć od 50 do 400 μl na skrawki tkanki. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
		<li>Podgrzewać szkiełka w maszynie do PCR w temperaturze 90 °C przez 10 minut i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze O/N w temperaturze 45 °C lub optymalnej temperaturze określonej w kroku 1.4.11.</li>
		<li>Schłodzić szkiełka w temperaturze 4 °C przez 30 minut, usunąć szkiełka nakrywkowe i zanurzyć je w szeregowym buforze SSC w następujący sposób: 4x SSC przez 10 min, wstępnie podgrzane (45 °C) 2x SSC przez 20 min, 2x SSC przez 10 min i 0,2x SSC przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie za pomocą przeciwciała sprzężonego z anty-DIG AP
	<ol>
		<li>Myj szkiełka w MABT przez 5 minut.</li>
		<li>Blokuj od 50 do 400 μl roztworu blokującego z 1% Tween 20 przez 20 minut.</li>
		<li>Dodać 50 do 400 μl przeciwciała anty-DIG-AP rozcieńczonego w roztworze blokującym (1:1 000) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut.</li>
		<li>Myć szkiełka w MABT przez 10 min.</li>
		<li>Zanurz slajdy w buforze detekcji zawierającym 1% Tween 20 na 5 minut.</li>
		<li>Traktować od 50 do 400 μ 1 mM lewamizolu (w buforze wykrywającym zawierającym 1% Tween 20) przez 5 minut, aby dezaktywować endogenną fosfatazę alkaliczną.</li>
		<li>Rozprowadzić 50 do 400 μl wstępnie zmieszanego roztworu NBT/BCIP (rozcieńczonego w buforze detencyjnym w stosunku 1:100) na każdą próbkę i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2 do 3 godzin, aż do uzyskania uzyskanego sygnału.</li>
		<li>Spłucz szkiełka wodą dejonizowaną, aby zatrzymać wizualizację i nałóż od 50 do 400 μl 0,05% [wt/vol] zieleni metylowej jako przeciwbarwnika w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Opłucz szkiełka wodą dejonizowaną, odwodnij w 100% etanolu i zanurz w ksylenie.</li>
		<li>Nałożyć 80 μl roztworu montażowego na każde szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+human+gingiva.+II.+The+lower+part+of+the+pocket+epithelium+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis.</a> J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).</li>
<li>Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+of+the+periodontium%3B+an+important+factor+in+the+pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).</li>
<li>Saglie, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+bacteria+in+the+oral+epithelium+in+periodontal+disease.+II.+Immunohistochemical+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria.</a> J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).</li>
<li>Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+localization+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.+in+human+periodontitis.+I.+Light%2C+immunofluorescence+and+electron+microscopic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies.</a> J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).</li>
<li>Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+correlative+immuno-identification+of+mononuclear+infiltrates+and+invasive+bacteria+in+diseased+gingiva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva.</a> J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).</li>
<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis.+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
<li>Marttila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Treponema+denticola.+chymotrypsin-like+proteinase+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis.</a> J. Oral Microbiol. 6, (2014).</li>
<li>Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+oral+species+within+human+crevicular+epithelial+cells+from+subjects+with+chronic+periodontitis+by+fluorescence+in+situ.+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization.</a> J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).</li>
<li>Abrams, K., Caton, J., Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+comparisons+of+interproximal+gingival+tissues+related+to+the+presence+or+absence+of+bleeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding.</a> J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Porphyromonas+gingivalis.+and+plasma+cell+dominance+in+gingival+tissues+with+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis.</a> Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis.+and+dextran+sodium+sulfate+induce+periodontitis+through+the+disruption+of+physical+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers.</a> Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bacterial+invasion+and+differential+expression+of+tight+junction+proteins%2C+growth+factors%2C+and+growth+factor+receptors+in+periodontal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions.</a> J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).</li>
<li>Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).</li>
<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano protokół lokalizacji bakterii w tkankach osadzonych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej DIG. Sonda celuje w cząsteczki DNA lub RNA bakteryjnego genu 16S rRNA, a sondy ukierunkowane na 16S rRNA mogą być zaprojektowane jako specyficzne dla gatunku lub uniwersalne. Specyficzna hybrydyzacja sondy specyficznej dla P. gingivalis z P. gingivalis, ale nie z innymi bakteriami jamy ustnej, została wcześniej wykazana10. W przeciwieństwie do tego, sonda eubakteryjna zhybrydy...

Bakterie odgrywają rolę w etiologii różnych chorób jamy ustnej, takich jak zapalenie przyzębia, zapalenie miazgi miazgowej, zapalenie okołokoronowe, zapalenie tkanki łącznej i zapalenie kości i szpiku. Aby zrozumieć rolę bakterii w patogenezie choroby i monitorować efekt leczenia, ważna jest lokalizacja bakterii w tkance. Obecność bakterii w tkance dziąsła od pacjentów z zapaleniem przyzębia wykazano przy użyciu różnych metod, w tym mikroskopii elektronowej1,2, immunohistochemii i immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał specyficznych dla bakterii3-7 oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)8 przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowej ukierunkowanej na 16S rRNA. Niemniej jednak metody te nie są powszechnie stosowane ze względu na ograniczenia techniczne lub trudności. W porównaniu z przeciwciałami, sondy ukierunkowane na 16S rRNA są łatwe do wyprodukowania i osiągają swoistość gatunkową. FISH okazał się doskonałym narzędziem do wizualizacji bakterii w ich naturalnym środowisku, takim jak biofilm płytki nazębnej. Jednak zastosowanie FISH do próbek tkanek jest ograniczone ze względu na autofluorescencję różnych składników tkankowych. Na przykład silna autofluorescencja czerwonych krwinek często utrudnia zastosowanie technologii fluorescencji do tkanek objętych stanem zapalnym, gdy wiąże się to z krwawieniem9.
W celu zlokalizowania bakterii w tkankach dziąseł objętych stanem zapalnym, opracowano metodę hybrydyzacji in situ z użyciem sondy DNA znakowanej digoksygeniną (DIG) i z powodzeniem zastosowano10,11. W tym artykule opisano szczegółowy protokół lokalizacji bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą specyficznych dla P. gingivalis i uniwersalnych sond eubakteryjnych. Szczególny nacisk kładziony jest na standaryzację metody, tak aby podobne wyniki można było odtworzyć w innych laboratoriach. Protokół ten pozwala na lokalizację bakterii w ich kontekście histologicznym, a wyniki są wysoce powtarzalne. Opisany protokół może być stosowany do lokalizacji bakterii w sposób specyficzny dla gatunku lub uniwersalny w różnych tkankach. Uniwersalna sonda jest szczególnie przydatna do wykrywania bakterii w chorobach wielodrobnoustrojowych oraz do badania potencjalnej roli bakterii w chorobach, w których rola konkretnych bakterii nie jest znana.

<table><tbody><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50% roztwór siarczanu dekstranu</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt' s solution</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG Zestaw do znakowania i wykrywania DNA</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&trade; Długopis</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Vector</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Zieleń metylowa</td><td>Sigma</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DNA plemników łososia</td><td>Invitrogen</td><td>#15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Duksan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina-HCl</td><td>Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Badania organiczne</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy dna znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16s rrna

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Obecność bakterii w nabłonku kieszonkowym i leżącej pod nim tkance łącznej w biopsjach dziąseł od pacjentów z zapaleniem przyzębia została zgłoszona przy użyciu różnych metod, w tym mikroskopii elektronowej, immunohistochemii lub immunofluorescencji przy użyciu przeciwciał specyficznych dla bakterii oraz fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) przy użyciu znakowanej fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowej. Niemniej jednak metody te nie są powszechnie stosowane ze względu na ograniczenia techniczne lub trudności. W tym miejscu wprowadzono metodę lokalizacji bakterii w tkankach osadzonych w parafinie za pomocą sond DNA znakowanych DIG. Tkanki zatopione w parafinie są najczęstszą formą tkanek biopsyjnych dostępnych w bankach patologii. Bakterie można wykrywać zarówno w sposób specyficzny dla gatunku, jak i uniwersalny. Sygnały bakteryjne są wykrywane jako dyskretne formy (ziarniak, pręcik, wrzecionowaty i owłosiony) bakterii lub formy rozproszone. Technika ta pozwala na uzyskanie innych informacji histologicznych: dobrze wyróżnia się nabłonek, tkankę łączną, nacieki zapalne i naczynia krwionośne. Metoda ta może być wykorzystana do badania roli bakterii w różnych chorobach, takich jak zapalenie przyzębia, nowotwory i zapalne choroby immunologiczne.

Rycina 1 przedstawia dot blotting sond znakowanych DIG w porównaniu z sondą kontrolną dodatnią dostarczoną w zestawie w celu określenia ich czułości. Sonda specyficzna dla P. gingivalis o długości 343 bp jest 25 razy bardziej czuła niż sonda eubakteryjna o długości 70 bp. Rycina 2 pokazuje hybrydyzację in situ tkanek dziąsłowych pobranych od pacjentów z przewlekłym przyzębiem w celu wykrycia P. gingivalis oraz eubakterii. Sygnały bakteryjne, przedstawione w kol...

Tutaj opisano metodę lokalizacji bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą znakowanych DIG sond DNA 16S ukierunkowanych na rRNA. Protokół ten można zastosować do badania roli bakterii w różnych chorobach, takich jak zapalenie przyzębia, nowotwory i zapalne choroby immunologiczne.

In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest lokalizacja bakterii w tkankach zatopionych w parafinie przy użyciu sond DNA celujących w 16 s rybosomalny RNA znakowanych DIG. Jest to realizowane poprzez przygotowanie sondy za pomocą amplifikacji PCR i znakowania DIG. W drugim kroku przygotowuje się skrawki tkanek w celu zwiększenia dostępności miejsc docelowych oraz zmniejszenia wiązania niespecyficznego w tle.Następnie przygotowane skrawki tkanek poddaje się hybrydyzacji z sondą znakowaną digoksyminą. Na koniec zhybrydyzowaną sondę wykrywa się za pomocą przeciwciał anty-dig znakowanych fosfatazą alkaliczną. Ostatecznie ta metoda hybrydyzacji in situ pozwala wykazać obecność bakterii w tkankach zatopionych w parafinie.Przewagą tej metody detekcji nad istniejącymi metodami, takimi jak ING, jest możliwość wykrywania bakterii SHS w obrębie struktur histologicznych. Metoda ta może dostarczyć wglądu w patogenezę różnych stanów zapalnych, takich jak przyperiodontitis i R planet. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy przygotowania tkanek i trawienia hybryd są trudne do przeprowadzenia ze względu na łatwe uszkodzenie skrawków tkanek.Aby przygotować sondę bakteryjną U, należy użyć 70-parowego fragmentu DNA jako matrycy oraz dwóch 15-parowych starterów w celu amplifikacji sondy metodą PCR. Amplikon należy zebrać w buforze o znanym stężeniu. Następnie sondę znakuje się, używając zestawu do znakowania i detekcji DNA dig.Najpierw wymieszaj 3 µg sondy w 15 µL wody. Denaturuj sondę w bloku grzejnym przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Następnie umieść zdenaturowaną sondę na lodzie.Następnie dodaj 2 µL nukleotydów 10 XH, 2 µL DN NTP oraz 1 µL enzymu kanałowego. Po wymieszaniu inkubuj sondę w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 do 48 godzin. Reakcję przerwij, podgrzewając mieszaninę do 65 °C.Następnie należy zmierzyć stężenie DNA znakowanej sondy przy 260 nanometrach i dostosować stężenie do 100 nanogramów na mikrolitr. Używając zestawu, należy najpierw sprawdzić czułość sondy na membranie nylonowej, nanosząc jeden mikrolitr seryjnie rozcieńczonej kontroli pozytywnej. Sonda i sonda znakowana DIG.Pozostaw membranę do wyschnięcia na pięć minut. Po wyschnięciu krótko zanurz membranę w roztworze two XSSC, a następnie przenieś ją do inkubatora ustawionego na 80 °C na jedną godzinę. Aby unieruchomić DNA po inkubacji, krótko namocz membranę w buforze z kwasem maleinowym, a po pół godzinie przenieś ją do buforu blokującego zawierającego przeciwciała sprzężone z AP w rozcieńczeniu 1:5 000.Przemyj membranę w roztworze MABT. Następnie wymieszaj 40 µL N-B-T-B-C-I-P z dwoma mililitrami buforu detekcyjnego. Po kąpieli nanieś tę mieszaninę na membranę na jedną minutę.Po usunięciu parafiny i rehydratacji skrawków tkankowych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować je do hybrydyzacji in situ. Najpierw zanurz płytki w 0,1 N kwasie solnym na 20 minut. Po kąpieli w kwasie opłucz płytki wodą traktowaną DEPC przez 30 sekund. Następnie, używając woskowego pisaka, obrysuj preparaty na każdej płytce.Następnie, w zależności od wielkości preparatów, dodać od 50 do 400 µL roztworu proteinazy K. Pozostawić enzym do działania na 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przemyć preparaty w 1×PBS traktowanym DEPC przez jedną minutę. Teraz przenieść preparaty do 4% paraformaldehydu w PBS traktowanym DEPC na 10 minut.Zmyć utrwalacz za pomocą PBS, analogicznie jak poprzednio. Następnie zanurzyć preparaty w 0,1 M wodnym roztworze hydrochlorku trietanolaminy o pH 8 z dodatkiem 0,5% octanu i hydrydu; po 20 minutach opłukać preparaty czystą wodą, analogicznie jak poprzednio. Teraz rozpocząć etap C2, najpierw zanurzając preparaty w 2X SSC na 20 minut.W międzyczasie rozcieńcz znakowaną sondę do stężenia 1 ng/µL w buforze do hybrydyzacji w celu przygotowania kontroli negatywnej. Użyj 10-krotnego stężenia sondy nieznakowanej. Następnie zdenaturuj sondy, podgrzewając je w temperaturze 90 °C przez 10 minut, a następnie szybko schłodź na lodzie.Następnie na każdy preparat nanieś taką samą objętość rozcieńczenia sondy, jaka została wcześniej naniesiona w przypadku proteinazy K. Potem ostrożnie przykryj preparaty szkiełkami i zabezpiecz sekcje za pomocą laku do paznokci. Teraz podgrzewaj preparaty w bloku termocyklera w temperaturze 90 °C przez 10 minut, a następnie przenieś je do inkubatora z kontrolą wilgotności w temperaturze 45 °C na noc, aż do następnego dnia.Schładzaj preparaty w temperaturze 4 °C przez pół godziny, a następnie ostrożnie zdejmij szkiełka nakrywkowe. Tkanki są delikatne. Na koniec przepłucz preparaty w serii buforów SSC w temperaturze pokojowej.Najpierw przemyć dwa zhybrydyzowane preparaty NC przez pięć minut w roztworze MABT. Następnie nanieść od 50 do 400 µL roztworu blokującego zawierającego 1% tween 20 na 20 minut. Po inkubacji z roztworem blokującym nanieść od 50 do 400 µL przeciwciała anty-D znakowanego fosfatazą alkaliczną dig w rozcieńczeniu od 1:1 do 1:1000 w roztworze blokującym.Po zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego inkubować przez 90 minut w temperaturze 37°C. Płukać preparaty w buforze MABT przez 10 minut. Następnie przez pięć minut pozostawić preparaty w buforze detekcyjnym z dodatkiem 1% tween 20.Następnie nanieś od 50 do 400 µL 1 mM roztworu ole w buforze detekcyjnym na każdy preparat i inkubuj je przez pięć minut w celu inaktywacji endogennej fosfatazy alkalicznej. Następnie dodaj od 50 do 400 µL N-B-T-B-C-I-P rozcieńczonego w buforze detekcyjnym w stosunku 1:100 na każdy preparat i inkubuj je przez dwie do trzech godzin w komorze wilgotnościowej, zależnie od doświadczenia.Opłucz preparaty wodą zjonizowaną (DI), następnie nałóż metylową zieleń w stężeniu 0,05% m/v i pozostaw barwnik kontrastowy na tkance na 10 minut w temperaturze 37°C. Ponownie opłucz preparaty wodą DI, a następnie odwodnij je w 100% etanolu, po czym zanurz w ksylenie.Na koniec nanieś 80 µL medium montażowego i przykryj szkiełkiem nakrywką. Preparaty po zastosowaniu sond zostały oznakowane cyfrowo. Ich czułość porównano z rozcieńczeniem sondy kontrolnej dodatniej.Sonda specyficzna dla p. gingivalis o długości 43 par zasad była 25 razy bardziej czuła niż zaprojektowana sonda bakteryjna o długości 70 par zasad. Obie sondy zastosowano następnie w badaniu tkanek dziąseł pacjentów z przewlekłym przyzębiem przy dużym powiększeniu. Za pomocą sondy bakteryjnej można było rozróżnić różne kształty bakterii.Podczas gdy sonda specyficzna dla p. gingivalis wykrywała jedynie bakterie w kształcie pałeczek, na błonę śluzową dziąseł myszy naniesiono DSS – substancję chemiczną zaburzającą połączenia ścisłe. Próbki tkanek pobrane od tych myszy wykorzystano do porównania sond w innym kontekście. W tym przypadku sonda bakteryjna U była w stanie wykryć bakterie, których nie wykryła druga sonda.Następnie przetestowano sondę przeciwko bakteriom U pod kątem zdolności do wykrywania innych bakterii w przekrojach tkanki płucnej zawierających guzy. Bakterie wykryto zarówno poza guzem, jak i w jego obrębie. Podczas badania tkanek pobranych od pacjentów z porażeniem błony śluzowej jamy ustnej (płaskowicą), chorobą o nieznanej etiologii, sonda bakteryjna wykryła sygnały bakteryjne w obrębie komórek nabłonkowych oraz blaszki właściwej, w których zaobserwowano naciek zapalny.Od momentu opracowania technika ta pomaga badaczom w dziedzinie chorób zakaźnych badać inwazję bakterii do tkanek zarówno u ludzi, jak i u zwierząt po przeprowadzeniu tej procedury. Inne metody, takie jak detekcja immunochemiczna w celu identyfikacji markerów komórkowych, mogą zostać zastosowane, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, jakie rodzaje komórek w tkankach są siedliskiem bakterii.

in-situ-detection-bacteria-within-paraffin-embedded-tissues-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Źródło: Choi, Y. S. i in. Wykrywanie in situ bakterii w tkankach osadzonych w parafinę za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną, celującej w 16S rRNA. J. Vis. Exp. (2015).Ten film demonstruje in situ wykrywanie bakterii w przekrojach tkanki dziąseł myszy za pomocą sond DNA znakowanych digoksyną skierowanych do DNA bakterii. Sekcja jest inkubowana sondą. Dodaje się przeciwciała sprzężone z fosfatazą alkaliczną, specyficzne dla digoksyny. Endogenne fosfatazy są inaktywowane, a kolorowy wysad...

Wykrywanie bakterii in situ w przekrojach tkanki dziąseł myszy

Ten film pokazuje wizualizację bakterii w odparafinowanej tkance pęcherza moczowego od pacjenta zakażonego drogami moczowymi. Znakowana fluorescencyjnie sonda zhybrydyzowana z bakteryjnymi 16-sowymi rybosomalnymi RNA ujawnia bakterie związane z tkankami i ich rozmieszczenie, dostarczając cennych informacji przestrzennych na temat ich gęstości w próbce.

Wizualizacja bakterii w skrawkach biopsji pęcherza moczowego za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ na próbkach dorosłych koralowców, które zostały zatopione w parafinie i pocięte na szkiełka podstawowe. Jest to metoda jakościowa stosowana do wizualizacji ekspresji przestrzennej sondy antysensownej RNA w tkankach zanurzonych w parafinie.

In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

Ten protokół służy do bezstronnego wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach pacjentów za pomocą hybrydyzacji in situ 16S rRNA i mikroskopii konfokalnej.

Wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16S rRNA Hybrydyzacja in situ

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji amplifikacji genów w próbkach tkanek z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie.

Niezawodna detekcja amplifikacji genów w próbkach zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ

Poznaj metodę in situ wykrywania bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA. Technika ta umożliwia badanie roli bakterii w chorobach takich jak periodontitis, nowotwory i choroby zapalne.

In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA (Wideo) | JoVE Journal

In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA

Przeglądaj więcej filmów