In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA

Ogólnym celem tej procedury jest zlokalizowanie bakterii w tkankach osadzonych w parafinie za pomocą znakowanego DIG 16 s rybosomalnego RNA, ukierunkowanego na sondy DNA. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie sondy ze amplifikacją PCR i znakowaniem DIG. Drugim krokiem jest przygotowanie skrawków tkanek tak, aby miały bardziej dostępne miejsca docelowe i mniej wiązały się w tle.

Następnie przygotowane skrawki tkanek są hybrydyzowane z sondą oznaczoną kopią. Na koniec zhybrydyzowana sonda jest wykrywana za pomocą fosfatazy alkalicznej, znakowanej przeciwciałami anty-D dig. Ostatecznie ta metoda hybrydyzacji C two może wykazać obecność bakterii z tkankami zatopionymi w parafinie.

Domenową przewagą tej metody wykrywania nad istniejącą metodą, taką jak ING, jest to, że metoda ta może wykrywać bakterie SHS w kontekście niektórych struktur histologicznych. Ta metoda może zapewnić wgląd w patogenezę, ale będzie miała różne stany zapalne, takie jak zapalenie przyzębia i planeta R. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania tkanek i trawienia hybrydowego są trudne do przeprowadzenia, ponieważ skrawki tkanki łatwo ulegają uszkodzeniu.

Aby wykonać sondę bakterii U, użyj 70 par zasad, fragmentu DNA jako matrycy i dwóch starterów 15 par zasad, aby amplifikować sondę przez PCR. Zebrać amplikon w buforze o znanym stężeniu. Następnie oznacz sondę zestawem do znakowania i wykrywania DNA dig.

Najpierw wymieszaj trzy mikrogramy sondy z 15 mikrolitrami wody. Denaturuj sondę w bloku grzewczym przez 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Następnie umieść zdenaturowaną sondę na lodzie.

Następnie dodaj dwa mikrolitry 10 nukleotydów XH, dwa mikrolitry DN NTP i jeden mikrolitr enzymu kanałowego. Po wymieszaniu pozwól sondzie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin później. Zatrzymaj reakcję, podgrzewając mieszaninę do 65 stopni Celsjusza.

Następnie zmierz stężenie DNA znakowanej sondy na 260 nanometrach i dostosuj stężenie do 100 nanogramów na mikrolitr. Korzystając z zestawu, najpierw sprawdź czułość sond na nylonowej membranie, załaduj jeden mikrolitr seryjnie rozcieńczonej kontroli pozytywnej. Sonda i kop oznaczone sondą.

Pozostaw membranę do wyschnięcia na pięć minut. Po wysuszeniu zanurz na krótko membranę w dwóch XSSC, a następnie przenieś ją do inkubatora o temperaturze 80 stopni Celsjusza na godzinę. Aby unieruchomić DNA po inkubacji, należy na krótko namoczyć błonę w buforze kwasu maleinowego, a następnie przenieść ją do buforu blokującego skoncentrowanego z przeciwciałami sprzężonymi z AP w rozcieńczeniu od jednego do 5 000 po pół godzinie.

Umyj membranę w MABT. Następnie wymieszaj 40 mikrolitrów N-B-T-B-C-I-P z dwoma mililitrami buforu detekcyjnego. A po kąpieli dodaj tę mieszaninę do membrany na jedną minutę.

Po usunięciu parafiny i ponownym nawodnieniu skrawków tkanek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przygotuj je do hybrydyzacji C 2, najpierw zanurz szkiełka w 0,1 normalnym kwasie solnym na 20 minut. Po kąpieli kwasowej zmyj szkiełka wodą uzdatnioną DEPC przez 30 sekund. Następnie za pomocą pisaka woskowego obrysuj próbki na każdym szkiełku.

Następnie dodaj od 50 do 400 mikrolitrów roztworu proteinazy K do próbek, w zależności od ich wielkości. Pozwól enzymowi działać przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umyj szkiełka w jednym XPBS poddanym działaniu DEPC przez jedną minutę. Teraz przenieś szkiełka do 4% aldehydu paraform w PBS poddanym działaniu DEPC przez 10 minut.

Zmyć utrwalacz PBS jak poprzednio. Następnie wykąpać szkiełka w 0,1-molowym chlorowodorku trietanoloaminy o pH ósmym z 0,5% octu i wodorkiem po 20 minutach, zmyć szkiełka czystą wodą jak poprzednio. Teraz rozpocznij w C dwa, najpierw zanurzając szkiełka w dwóch XSSC na 20 minut.

W międzyczasie rozcieńczyć znakowaną sondę do jednego nanograma na mikrolitr w buforze hybrydyzacyjnym w celu uzyskania kontroli ujemnej. Użyj 10-krotności stężenia nieoznakowanej sondy sondy. Następnie denaturuj sondy, podgrzewając je w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie szybko schładzając je na lodzie.

Następnie nałóż tę samą objętość rozcieńczenia sondy na każde szkiełko, co wcześniej zastosowana proteinaza K. Następnie ostrożnie zakryj szkiełko i uszczelnij sekcje lakierem do paznokci. Teraz podgrzej szkiełka na bloku maszyny do PCR w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut i przenieś je do nawilżanego inkubatora o temperaturze 45 stopni Celsjusza na noc następnego dnia.

Schłodzić szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pół godziny, a następnie ostrożnie zdjąć szkiełka nakrywkowe. Tkanki są delikatne. Na koniec przepuść szkiełka przez szereg SSC w temperaturze pokojowej.

Najpierw umyj dwa hybrydowe szkiełka NC przez pięć minut w MABT. Następnie nałóż od 50 do 400 mikrolitrów roztworu blokującego w 1%tween 20 przez 20 minut. Po inkubacji blokowej zastosować od 50 do 400 mikrolitrów przeciwciała fosfatazy alkalicznej anty-D do 1000 i roztworu blokującego.

Pozwól mu związać się przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza po nałożeniu podstawowego. Myj szkiełka w MABT przez 10 minut. Następnie na pięć minut umieść slajdy w buforze wykrywania z 1% tween 20.

Teraz nałóż od 50 do 400 mikrolitrów jednego milimolowego ole w roztworze buforowym do wykrywania na każde szkiełko i inkubuj je przez pięć minut, aby dezaktywować endogenną fosfatazę alkaliczną. Następnie dodaj od 50 do 400 mikrolitrów N-B-T-B-C-I-P rozcieńczonego podczas wykrywania. Buforuj od jednego do 100 do każdego szkiełka i pozwól szkiełkom inkubować przez dwie do trzech godzin w wilgotnej komorze w oparciu o doświadczenie.

Opłucz szkiełka wodą demineralizowaną, a następnie nałóż zieleń metylową w ilości 0,05% objętości i pozwól barwieniu z licznika działać na tkance przez 10 minut. W 37 stopniach Celsjusza. Ponownie umyj szkiełka wodą DI, a następnie odwodnij je 100% etanolem, a następnie zanurz w ksylenie.

Na koniec nałóż 80 mikrolitrów środka montażowego i szkiełka nakrywkowego. Slajdy po sondach zostały oznaczone jako wykopane. Ich czułość porównano z rozcieńczeniem sondy kontroli dodatniej.

Sonda specyficzna dla 3 43 par zasad p dziąseł była 25 razy bardziej czuła niż zaprojektowana sonda bakteryjna z 70 parami zasad. Obie sondy zostały następnie zastosowane do tkanek dziąseł od pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia w dużym powiększeniu. Różne kształty bakterii można było dostrzec za pomocą sondy bakteryjnej.

Podczas gdy sonda specyficzna dla dziąseł p gingivalis wykrywała tylko bakterie w kształcie pręcików, ścisłe połączenie zakłócające działanie substancji chemicznej DSS nałożono na błonę śluzową dziąseł myszy. Próbki tkanek od tych myszy wykorzystano do porównania sond w innym kontekście. W tym przypadku sonda bakteryjna U była w stanie wykryć bakterie, których druga nie mogła wykryć.

Sonda bakterii U została następnie przetestowana pod kątem jej zdolności do wykrywania innych bakterii w skrawkach tkanki płucnej zawierających guzy. Bakterie wykryto zarówno na zewnątrz guza, jak i w obrębie guza. Badając tkanki pacjentów z liszajem płaskim jamy ustnej, chorobą o nieznanej etiologii, sonda bakteryjna wykryła sygnały bakteryjne w komórkach nabłonka i blaszki właściwej, w których zaobserwowano naciek zapalny.

Od czasu jej opracowania, technika ta pomogła naukowcom w dziedzinie chorób zakaźnych zbadać inwazję bakterii do tkanek zarówno u ludzi, jak i zwierząt Po tej procedurze. Inne metody, takie jak wykrywanie immunochemiczne, wzrost do markera komórkowego, mogą być ED, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie komórki zawierają bakterie w tkankach.