Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Ogólnym celem następnego eksperymentu wysokorozdzielczego topnienia (high resolution melt) jest zwiększenie czułości wykrywania alleli mutantów występujących w niskich stężeniach w poszczególnych próbkach. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie wyekstrahowanego DNA poprzez rozcieńczenie matrycy do niezbędnych objętości i stężeń. Drugim krokiem jest przygotowanie analiz z asymetrycznymi proporcjami prawego i lewego primera w celu zwiększenia ilości produktu sondy matrycowej.

Po przygotowaniu reakcji temperaturę przyłączania ustawia się pomiędzy temperaturami topnienia sondy związanej z matrycą typu dzikiego a tej związanej z matrycą zmutowaną. Ostatnim krokiem jest analiza produktów amplifikacji na odpowiedniej platformie HRM. W rezultacie stronniczość amplifikacji allelu zmutowanego oraz asymetryczna PCR oparta na sondach umożliwiają czulszą detekcję trudnych do wykrycia mutacji SNP przy niskich stężeniach obecnych w próbkach.

Ta zwiększona czułość jest przydatna w nadzorze nad mutacjami w populacjach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowy topnienie o wysokiej rozdzielczości (HRM) czy genotypowanie z użyciem sond TaqMan, jest to, że pozwala ona na zwiększenie czułości w wykrywaniu alleli występujących w niskich stężeniach, a także umożliwia genotypowanie SNP położonych blisko siebie w genomie. Metoda ta może zatem dostarczyć cennych informacji na temat rozprzestrzeniania się lekooporności u pasożyta malarii.

Metodę tę można zastosować również w innych systemach, takich jak nadzór nad innymi typami chorób zakaźnych, np. HIV, czy wykrywanie rzadkich wariantów nowotworowych w populacji komórek. Procedurę zaprezentuje Caitlin Durphy, technik z naszego laboratorium.

Matryce do wysokorozdzielczego topnienia (HRM) przygotowuje się z próbek Plasmodium falciparum pobranych bezpośrednio z krwi pacjentów uczestniczących w badaniach terenowych. Próbki mogą być przechowywane na papierze filtracyjnym, na testach szybkiego wykrywania lub w formie osadu erytrocytów; próbki mogą być również adaptowane do hodowli in vitro. Niektóre standardowe szczepy laboratoryjne do analiz można zamówić z centrum zasobów odczynników referencyjnych i badawczych nad malarią. Próbki mogą być ekstrahowane z krwi pełnej, erytrocytów lub papieru filtracyjnego, bądź wykorzystywane bezpośrednio z osadu erytrocytów lub hodowli w celu bezpośredniej amplifikacji z osadu erytrocytów.

W pierwszej kolejności należy określić poziom pasożytnictwa erytrocytów za pomocą mikroskopii cienkiego rozmazu, zgodnie z procedurą Centers for Disease Control and Prevention. Erytrocyty z poziomem pasożytnictwa powyżej 0,5% rozcieńcza się w stosunku 1:400. W TE do każdej reakcji o objętości od 5 do 10 µL należy użyć 3 µL rozcieńczonych erytrocytów; ze względu na zmienność między próbkami, w analizach HRM zawsze należy uwzględnić kontrole pozytywne i negatywne.

Przygotować rozcieńczenia plazmidu lub wzorców z weryfikowaną sekwencją genotypów SNP w zakresie od 10 pg do 10 ng na 1 µL jako kontrole pozytywne. W reakcjach amplifikacji jako negatywną kontrolę bez matrycy należy zastosować wodę klasy PCR. Procedurę rozpocząć od przygotowania 10-krotnych roztworów roboczych starterów i sond.

Ten sam protokół ma zastosowanie do analiz z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych, płytek 384-dołkowych, pasków ośmiu probówek lub kapilar szklanych. Jednak w celu przeprowadzenia niniejszej demonstracji zostaną użyte wyłącznie płytki 96-dołkowe oraz kapilary szklane. W poniższej tabeli przedstawiono zalecane 10-krotne stężenia zapasów roboczych oraz stężenia końcowe dla genotypowania HRM w oparciu o sondy blokowane.

Przygotować mieszaniny reakcyjne w każdej studzience. Dodać 1 µL każdego z 10x roztworów roboczych starterów i sond bezpośrednich i odwrotnych. Dodać od 4 do 5 µL HRM master mix, 1 µL matrycy oraz wodę jakości PCR do uzyskania całkowitej objętości reakcji wynoszącej 10 µL.

Powtórz tę procedurę dla każdej kapilary szklanej. Przykryj płytki oraz kapilary szklane. W przypadku amplifikacji na płytkach zastosuj optyczne uszczelki do płytek, a w systemach kapilarnych użyj plastikowych nakrętek.

Upewnij się, że pokrycie jest kompletne, a płytki i zakrętki są całkowicie szczelne i zabezpieczone, aby zapobiec odparowywaniu. Przed amplifikacją odwiruj próbki w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.

Wiruj płytki w wirówce stołowej przez trzy minuty przy 1 800 ×g. Wiruj kapilary szklane w mikrowirówce przez 10 do 15 sekund. Umieść płytkę reakcyjną i kapilary szklane w termocyklerze i przeprowadź standardowe protokoły amplifikacji zablokowanej sondy lub MAAB. Po amplifikacji PCR przejdź do analizy krzywych topnienia za pomocą interfejsu oprogramowania systemowego.

Podgrzewaj płytkę od 40 °C do 80 °C, aby uzyskać piki topnienia zarówno dla sondy, jak i amplikonu. Pierwszym krokiem analizy topnienia w systemie LightCycler 480 jest normalizacja ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji względem temperatury. Przesuń paski normalizacji tak, aby obejmowały obszar topnienia sondy.

Obszar topnienia sondy to niższa temperatura spośród dwóch obszarów topnienia. Paski normalizacji powinny znajdować się u podstawy pików topnienia. Po normalizacji wybierz opcję obliczania grup, aby automatycznie przypisać próbki do grup, jeśli jest to konieczne, lub ręcznie przypisz próbki do konkretnych grup.

Wybierz próbki, które nie uległy amplifikacji lub wykazują poszarpane piki topnienia. Następnie przejdź do opcji „new call” i wybierz „negative”. Po wybraniu wszystkich pozostałych błędnie sklasyfikowanych próbek, przejdź do „new call”, wybierz odpowiednią grupę i kliknij „apply change”. Przypisz genotypy dla każdej grupy na podstawie standardów.

Po potwierdzeniu poprawności obliczonych grup, w zakładce grupowania (grouping) wybierz opcję edycji nazw grup (edit group names). W odpowiednim kolorowym polu wprowadź genotypy standardów. Na przykład, jeśli standard 3D seven posiada znany genotyp C i znajduje się w grupie pierwszej, to wszystkie próbki w grupie pierwszej mają genotyp C; po wybraniu opcji wyniki (results) genotypy zostaną wyświetlone obok próbek.

Na koniec wyeksportuj wyniki do pliku TXT w celu przeprowadzenia dalszej analizy populacji próbek. Po zakończeniu pracy urządzenia light cycler 2.0 zapisz nazwy i pozycje próbek w sekcji danych próbkowych. Przed rozpoczęciem analizy oznacz kontrole negatywne oraz genotypy standardów topnienia. Rozpocznij analizę topnienia, wybierając opcję analizy, następnie wybierz genotypowanie w sekcji analizy krzywej topnienia i zatwierdź przyciskiem OK.

Aby zwiększyć czułość automatycznego grupowania, zaznacz wszystkie próbki, aby pojawiły się na wykresie krzywych topnienia. Przesuń pasek normalizacji do górnej granicy pików topnienia sond. Potwierdź, czy próbki zostały poprawnie pogrupowane, wybierając pojedynczo każdą grupę pod nazwą grupy.

Wyeksportuj genotypy dla każdej próbki, zaznaczając wszystkie próbki, kopiując dane i wklejając je do arkusza kalkulacyjnego. Wykres ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji względem temperatury jest zazwyczaj najprostszym sposobem wizualizacji pików topnienia i określania genotypów. Ustawienie okna analizy wyłącznie na region sondy pozwala na wyraźne rozróżnienie pików odpowiadających konkretnym SNP.

Idealne dopasowania skutkują wyższymi pikami topnienia zaznaczonymi na czerwono. W przypadku niedopasowań SNP temperatury topnienia są niższe i zaznaczone na szaro, gdy w próbce obecne są oba allele. Analiza HRM oparta na prawdopodobieństwie przedstawia oba allele jako dwie krzywe piku w kolorze pomarańczowym, przy czym piki odpowiadające próbkom z pojedynczym allelem zaznaczone są na czerwono i szaro; stopniowe obniżanie temperatury topnienia podczas amplifikacji prowadzi do przesunięcia w stronę allelu zmutowanego, reprezentowanego przez lewy pik w próbce poligenomicznej lub poliallelicznej.

To obciążenie amplifikacją allelu zmutowanego sprawia, że HRM wykazuje czułość pozwalającą na wykrycie alleli mniejszościowych występujących w stężeniu poniżej 1% w próbkach poligenomowych lub polialelelicznych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie, że kluczowa jest jakość próbki. Nawet niewielkie różnice w stężeniach buforów mogą przesunąć krzywe HRM.

Stosowanie kontroli jest użytecznym sposobem na standaryzację wyników. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać asymetryczną PCR opartą na sondach oraz błąd amplifikacji alleli mutantowych do dokładnego i czułego genotypowania SNP malarii w różnych typach próbek.