Name: Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę zwiększania czułości analizy HRM do wykrywania mutacji SNP w niskich stężeniach w próbkach malarii. Technika ta umożliwia skuteczniejsze genotypowanie i monitorowanie oporności na leki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Fundacji Billa i Melindy Gatesów za wsparcie rozwoju technologii i szkoleń.

Uwaga: Protokół ten obejmuje objętości i stężenia dla 96-dołkowych płytek, 8-probówek i systemów kapilarnych (objętość reakcji 10 μl); jednak HRM można również przeprowadzić w 384-dołkowych systemach opartych na płytkach z objętością reakcyjną 5 μl poprzez odpowiednie skalowanie wszystkich objętości. Zakres detekcji dla większości systemów wynosi od 10 pg do 10 ng matrycy DNA. 
1. Przygotuj szablony
<ol>
	<li>Próbki Plasmodium falciparum należy pobrać bezpośrednio z krwi pobranej od pacjentów biorących udział w badaniach terenowych i przechowywanej w postaci krwi pełnej, granulowanych krwinek czerwonych lub na bibule filtracyjnej><.
	Uwaga: Próbki mogą być również przystosowane do hodowli in vitro; niektóre standardowe szczepy laboratoryjne do analizy można zamówić w Centrum Badań nad Malarią i Referencyjnymi Odczynnikami (MR4, Próbki mogą być używane bezpośrednio z granulowanych czerwonych krwinek lub hodowli lub ekstrahowane z krwi pełnej, czerwonych krwinek lub bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>DNA wyekstrahowane z bibuły filtracyjnej lub szczepów dostosowanych do hodowli 
	Uwaga: HRM jest wrażliwy na stężenie soli; Różnice stężeń wynikające ze zmiennych metod ekstrakcji mogą znacząco wpływać na temperatury topnienia. Chociaż specyficzne końcowe nie są istotnym czynnikiem sukcesu, należy użyć standardowego wspólnego buforu do elucji lub reprodukcji (tj. wody, 1x Te ['low Te' lub 'DNA suspension buffer': 10 mM Tris-Cl, 0,10 mM EDTA] lub 1x TE [10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA]) dla wszystkich próbek, aby uniknąć anomalnych lub niespójnych krzywych topnienia.
	<ol>
		<li>Przygotować rozcieńczenia matrycy 10 pg –10 ng na μl w wzorcowym Te, TE lub wodzie na każde 10 μl reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezpośrednia amplifikacja z granulowanych krwinek czerwonych
	<ol>
		<li>Określ pasożyt czerwonych krwinek za pomocą mikroskopii cienkorozmazowej 
		Uwaga: Metody określania parazytemii zakażonych czerwonych krwinek są dostępne w Centrach Kontroli i Prewencji Chorób (CDC): http://www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html</li>
		<li>Rozcieńczyć pasożyty powyżej 0,5% w stosunku 1:400 w wodzie klasy PCR, TE lub Te. Stosować 3 μl na każde 5–10 μl reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterowanie 
	Uwaga: HRM może być używany do skanowania genów w celu wykrycia wariantów sekwencji w populacji12; jednak dokładne genotypowanie wymaga standardowej weryfikacji sekwencji, aby zawierała badany SNP. Można stosować konstrukty plazmidowe lub izolaty malarii o znanych genotypach. W większości zastosowań 3D7 (MR4 MRA-151) jest używany jako kontrolka typu dzikiego. Ze względu na zmienność między seriami, zawsze uwzględniaj kontrole pozytywne i negatywne.
	<ol>
		<li>Kontrole pozytywne: Przygotować 10 pg – 10 ng na 1 μl rozcieńczeń plazmidu lub wzorców o zweryfikowanych sekwencyjnie genotypach SNP.</li>
		<li>Kontrola ujemna: Użyj wody klasy PCR jako kontroli bez matrycy (NTC) w reakcjach amplifikacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. Amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) Nakładka na olej mineralny. Uwaga: Niektóre systemy HRM są samodzielnymi platformami do topienia i nie mają podgrzewanej pokrywy, aby zapobiec kondensacji i parowaniu produktu podczas amplifikacji.
		<ol>
			<li>Dodać 20 μl lekkiego oleju mineralnego do każdej płytki dołka przed załadowaniem mieszaniny reakcyjnej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj 10 zapasów roboczych dla wszystkich testów
		<ol>
			<li>Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z zalecanymi 10-krotnymi stężeniami zapasu roboczego, a także stężeniami końcowymi dla genotypowania HRM opartego na zablokowanej sondzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie mieszanin reakcyjnych
		<ol>
			<li>Do każdej studzienki w płytce lub probówce dodaj 1 μl 10x starterów i sond do przodu i do tyłu materiału roboczego, 4,0 – 5,0 μl 2,5x lub 2,0x HRM master mix, 1 μl matrycy i wody klasy PCR, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 μl.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pokrywy lub rury
		<ol>
			<li>Używaj uszczelek płytki optycznej do amplifikacji na płytce, nasadek optycznych do systemów opartych na rurkach paskowych i plastikowych nasadek do systemów opartych na kapilarach. Upewnij się, że pokrycie jest pełne, a płytki i nasadki są całkowicie uszczelnione i zabezpieczone, aby zapobiec parowaniu podczas amplifikacja.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wirowanie próbek
		<ol>
			<li>Obracać płytki przez 3 minuty przy 1 800 x g w celu usunięcia pęcherzyków powietrza i oddzielenia fazy olejowej i wodnej, jeśli używany jest olej mineralny.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół amplifikacji
	<ol>
		<li>Umieść płytki lub probówki reakcyjne w termocyklerze. Uruchom standardowe protokoły amplifikacji sondy blokowanej lub MAAB (odpowiednio tabele 2 i 3). Zwróć uwagę na różnicę w temperaturze wyżarzania między tymi metodami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza HRM
<ol>
	<li>topnieć
	<ol>
		<li>Po amplifikacji PCR przystąp do analizy topnienia. W przypadku samodzielnych systemów topienia, które nie mają wbudowanego amplifikacji (np. systemy BioFire Defense LightScanner), wyjmij amplifikowaną płytkę z termocyklera i umieść w przyrządzie HRM. Z poziomu interfejsu oprogramowania systemowego stopić płytkę w temperaturze od 40 do 80 °C, aby uzyskać piki topnienia zarówno sondy, jak i amplikonu. 
		Uwaga: Aby zaoszczędzić czas topnienia i analizy, okno topnienia można skrócić, aby objąć zakresy temperatur tylko dla obszarów topnienia sondy lub amplikonu. Po stopieniu płytki i rurki można w razie potrzeby ponownie stopić i przechowywać w temperaturze -20 °C lub 4 °C. Szklane probówki należy przechowywać tylko w temperaturze 4 °C, aby zapobiec pękaniu probówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza stopu
	<ol>
		<li>Usuwanie próbek ujemnych
		<ol>
			<li>W oprogramowaniu do analizy należy usunąć z dalszej analizy próbki, które nie uległy amplifikacji lub które mają postrzępione piki topnienia. Uwaga: Po wybraniu metody analizy dla pojedynczego pliku przebiegu, urządzenie automatycznie grupuje próbki dodatnie i ujemne. Przed genotypowaniem każdego podzbioru użytkownik może ręcznie zmienić wywołania.
			<ol>
				<li>W widoku krzywej topnienia lub piku topnienia kliknij prawym przyciskiem myszy krzywe do usunięcia, aby je wybrać. Po wybraniu błędnie sklasyfikowanych próbek, przejdź do "Nowe połączenie", wybierz odpowiednią grupę i kliknij "Zastosuj zmianę".</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>normalizować
		<ol>
			<li>Z ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji w odniesieniu do temperatury (–dF/dT) ("Krzywe różnicowe") przesunąć paski normalizacyjne tak, aby otaczały obszar stopienia sondy. 
			Uwaga: Obszar stopienia sondy to niższa temperatura dwóch obszarów topnienia. Paski normalizacji powinny znajdować się u podstawy szczytów topnienia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obliczanie grup
		<ol>
			<li>Po normalizacji wybierz opcję "Oblicz grupy", aby automatycznie przypisać próbki do grup. 
			W razie potrzeby ręcznie ponownie przypisz próbki do określonych grup. 
			Uwaga: Niektóre programy analityczne mają wysokie progi czułości, których nie można zmienić; W takich przypadkach oprogramowanie może przypisywać próbki do różnych grup, które wizualnie należą do innej grupy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przypisywanie genotypów
		<ol>
			<li>Przypisz genotypy do każdej grupy w oparciu o normy (kontrole pozytywne).
			<ol>
				<li>Po potwierdzeniu przez użytkownika, że obliczone grupy są poprawne (jeśli nie, to czy zostały wprowadzone poprawne zmiany w zakładce Grupowanie, wybierając błędnie sklasyfikowane próbki i wybierając odpowiednią grupę z listy rozwijanej obok "Nowe połączenie"), wybierz opcję "Edytuj nazwy grup" w zakładce "Grupowanie".</li>
				<li>Wprowadź genotypy wzorców w odpowiednim kolorowym polu (na przykład, jeśli norma 3d7 ma znany genotyp A i znajduje się w grupie czerwonej, grupa czerwona ma genotyp A). Naciśnij "OK" i zapisz wyniki.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Eksport wyników
		<ol>
			<li>Eksportuj wywołania genotypów jako arkusz kalkulacyjny w celu dalszej analizy populacji próbki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization+report+2013%22">World Health Organization report 2013</a>. , 1-286 (2013).</li>
<li>Hayton, K., Su, X. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+and+genetic+mapping+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Current+genetics%22%5BJournal%5D)">Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum.</a> Current genetics. 54 (5), (2008).</li>
<li>Neafsey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+SNP+genotyping+highlights+the+role+of+natural+selection+in+Plasmodium+falciparum+population+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence.</a> Genome biology. 9 (12), R171(2008).</li>
<li>Volkman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+diversity+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum.</a> Nature. 39 (1), 113-119 (2007).</li>
<li>Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+genomics+and+genome+biology+to+understand+malaria+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).</li>
<li>Manske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Plasmodium+falciparum+diversity+in+natural+infections+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing.</a> Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).</li>
<li>Auburn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+within-host+Plasmodium+falciparum+diversity+using+next-generation+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data.</a> PLoS ONE. 7 (2), e32891(2012).</li>
<li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+SNP-based+molecular+barcode+for+Plasmodium+falciparum+identification+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking.</a> Malaria Journal. 7, 223(2008).</li>
<li>Daniels, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+surveillance+detects+both+clonal+and+epidemic+transmission+of+malaria+following+enhanced+intervention+in+Senegal%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal.</a> PLoS ONE. 8 (4), e60780(2013).</li>
<li>Daniels, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((field-deployable+method+for+genotyping+and+discovery+of+single-nucleotide+polymorphisms+associated+with+drug+resistance+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+and+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).</li>
<li>Olbadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+outbreak+of+Plasmodium+falciparum+in+eastern+Panama%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama.</a> The Journal of infectious diseases. , (2014).</li>
<li>Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mutation+scanning+and+genotyping+by+high-resolution+DNA+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis.</a> Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).</li>
<li>Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-amplification+methods+for+tracking+low-grade+Plasmodium+falciparum+populations+during+scaled-up+interventions+in+Southern+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia.</a> Malaria Journal. 13, 89(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ciągły HRM jest etapem analizy po PCR; w związku z tym konfiguracja próbki i testu jest podobna do standardowych protokołów PCR, z dodatkowym włączeniem fluorescencyjnego barwnika interkalacyjnego używanego do śledzenia przejścia od dwuniciowego do jednoniciowego DNA podczas etapu topnienia o wysokiej rozdzielczości. Najważniejszym czynnikiem wpływającym na udaną analizę HRM jest solidny produkt PCR. Projektowanie testów ma kluczowe znaczenie, a kilka narzędzi zoptymalizowanych pod kątem projektowania testów HRM jest dostępnych na rynku i w Internecie13. Długości amplikonów wynoszące 80-150 par zasad z towarzyszącymi ~ 20 zablokowanymi parami zasad sondami wyśrodkowanymi nad SNP lub SNP będącymi przedmiotem zainteresowania najlepiej sprawdzają się w różnicowaniu SNP, a także haplotypów wielu SNP w regionie sondy. Sondy mogą być blokowane za pomocą dystansu 3' C3 lub niedopasowania 2 par zasad na końcu 3', co zapobiega wysuwaniu się podczas amplifikacji. Sondy mogą być zaprojektowane tak, aby pasowały do pasma szablonu Watsona lub Cricka; Wybór zależy od testów empirycznych mających na celu określenie, która konstrukcja sondy wytwarza dopuszczalne piki topnienia. Nadmiar starterów do przodu lub do tyłu jest używany do wytwarzania jednoniciowego produktu amplifikacji, który wyżarza się do zablokowanych sond. Jeśli sonda zawiera sekwencję nici do przodu, wówczas w nadmiarze stosuje się starter odwrotny, zwykle w stosunku 1:5 i odwrotnie w przypadku sond pasujących do nici odwrotnej.
Podobnie, HRM działa najlepiej z wystarczającą ilością i solidnym produktem PCR. Optymalizacja reakcji PCR wymaga gradientowego PCR i żeli agarozowych lub analizy bioanalizatorem w celu określenia optymalnych temperatur wyżarzania. Stężenie matrycy można zwiększyć za pomocą metod takich jak amplifikacja wstępna, stronnicze multipleksowane amplifikacja wszystkich celów przy użyciu niskiego stężenia startera i liczby cykli w celu zwiększenia stężenia matrycy13.
Tylko kilka instrumentów jest kompatybilnych z MAAB. Właściwości termiczne szklanych kapilar stosowanych w tych systemach ułatwiają tę metodę. Mała średnica wewnętrzna kapilar oraz szybki transfer ciepła przez szkło zapewniają bardziej rygorystyczną kontrolę temperatury niż standardowe wyroby z tworzyw sztucznych PCR, które mają wolniejsze tempo przejścia między cyklami wyżarzania i denaturacji ze względu na właściwości termoizolacyjne tworzyw sztucznych. Dzięki tej metodzie czułość wykrywania może zostać zmniejszona z 2-5% do mniej niż 1% zmutowanego allelu w mieszaninie alleli typu dzikiego i zmutowanego10.
HRM jest łatwym, wydajnym i ekonomicznym narzędziem do genotypowania SNP w różnych ustawieniach i licznych zastosowaniach, od nadzoru nad chorobami zakaźnymi po skanowanie w poszukiwaniu wariantów genów raka. Kilka innych urządzeń, takich jak systemy Roche Nano i LightCycler (480 i 96), a także system Eco Real-time PCR, oferuje HRM oprócz standardowej funkcji wzmacniania, czasu rzeczywistego i kopiowania numerów. Korzystając z maszyn o wyższej przepustowości, kodowanie kreskowe HRM kosztuje mniej niż 0,50 USD za test w naszych rękach, w tym wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne.
W opisanym tu kontekście, aplikacje terenowe umożliwiają monitorowanie populacji w czasie rzeczywistym pod kątem zmian związanych z wysiłkami na rzecz zwalczania malarii, w tym zmniejszonej różnorodności populacji, wykrywania importowanych typów pasożytów oraz pojawiania się i rozprzestrzeniania SNP związanych ze zmniejszoną wrażliwością na leki. Udoskonalenia metody zapewniają dodatkową czułość przydatną w informowaniu o postępach na drodze do eliminacji i zwalczania malarii.

Pomimo ponownego zainteresowania kontrolą i zwalczaniem malarii, malaria pozostaje światowym obciążeniem, z prawie połową światowej populacji zagrożonej infekcją i ponad 550 000 zgonów rocznie, szczególnie dzieci w Afryce Subsaharyjskiej1.
Te nowe programy kontroli i eliminacji były wspierane przez renesans genomu, z dużą liczbą pasożytów malarii zsekwencjonowanych i przeanalizowanych pod kątem mutacji związanych ze zmniejszoną wrażliwością na leki, zwiększoną zjadliwością i cechami populacji2,3. Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) należą do najczęściej identyfikowanych wariantów genetycznych 4-7.
Przenośne metody genotypowania SNP oferują nadzór i śledzenie populacji na miejscu i w czasie rzeczywistym8. Oprócz pobierania odcisków palców od poszczególnych pasożytów, "molekularny kod kreskowy" jest również wykorzystywany do wykrywania dramatycznych zmian czasowych w częstości występowania alleli, a także wariancji, efektywnej wielkości populacji i złożoności infekcji9.
Chociaż ten zestaw informacyjnych SNP można łatwo dostosować do wielu platform genotypowania, analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) jest szczególnie dobrze dopasowana do badań terenowych, gdzie czuła i prosta obsługa oraz wykrywanie nowych mutacji przy niskich kosztach w porównaniu do sekwencjonowania i innych podejść jest atrakcyjna w warunkach ubogich w zasoby.
HRM zaczyna się od standardowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która zawiera barwnik fluorescencyjny. Analiza topnienia po PCR określa szczytową temperaturę topnienia amplikonu; pojedyncza różnica SNP w krótkim amplikonie może skutkować znacznymi różnicami szczytowej temperatury topnienia (Tm).
Kilka udoskonaleń tej metody oferuje lepszą rozdzielczość genotypowania, aby rozróżnić SNP, w tym SNP klasy IV (A-T), i wykryć mniejsze zmutowane allele w próbkach z obecnymi wieloma allelami (infekcje poligenomiczne). Po pierwsze, testy obejmują krótkie sondy wyśrodkowane w regionie SNP, a także startery do przodu i do tyłu, które są obecne w różnych stężeniach. Te zablokowane sondy nie są amplifikowane podczas PCR, ale wiążą się z nicią wytwarzaną w nadmiarze z powodu asymetrycznych stężeń starterów, które zwiększają produkcję produktu matrycy sondy. Te oddzielne dwuniciowe amplikony składające się z sondy związanej z nadmiarem nici matrycowej mają ~ 20-30 pz; ich znacznie zmniejszona długość w porównaniu z całym amplikonem (80-150 pz) prowadzi do znacznie większych różnic Tm związanych z niedopasowaniem pojedynczej lub wielokrotnej sondy bazowej do matrycy10.
Po drugie, błąd amplifikacji zmutowanego allelu (MAAB) obniża temperaturę wyżarzania reakcji, aby odchylić reakcję w kierunku zmutowanych alleli obecnych w niskich proporcjach w infekcjach poligenomicznych. Temperatura wyżarzania jest ustawiana między Tms idealnie dopasowanych (typu dzikiego) i niedopasowanych (zmutowanych) sond. W tej temperaturze wiązanie allelu typu dzikiego jest na tyle stabilne, że amplifikacja jest utrudniona w porównaniu z jego odpowiednikiem niedopasowania, co powoduje odchylenie amplifikacji w kierunku zmutowanego allelu, gdy oba są obecne w jednej próbce10.
Dzięki tym udoskonaleniom HRM, technologia ta umożliwiła śledzenie pochodzenia i tożsamości pasożytów związanych z infekcjami epidemicznymi w Ameryce Południowej11 oraz wykrywanie nowych mutacji, różnicowanie wielu SNP znajdujących się bezpośrednio obok siebie w sekwencji, oraz mutacje obecne w mniej niż 1% alleli w próbkach poligenomicznych10.
Zwiększona czułość jest szczególnie ważna w regionach zbliżających się do stanu pre-eliminacji oraz w regionach zagrożonych pojawiającą się opornością na leki. Możliwość szybkiej i łatwej identyfikacji importowanych pasożytów i SNP związanych ze zmniejszoną czułością na miejscu informuje o wysiłkach nadzorczych i programach kontroli o skuteczności ich wdrożenia oraz identyfikuje punkty zapalne dla zwiększonych wysiłków na rzecz eradykacji i eliminacji malarii. Protokół ten opisuje metody oparte na sondach blokowanych i MAAB w celu zwiększenia czułości genotypowania HRM.

<table><tbody><tr><td>LightScanner Master Mix</td><td>BioFire Defense</td><td>HRLS-ASY-0003</td><td></td></tr><tr><td>Lekki olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td>do płytowych systemów HRM BioFire Defense</td></tr><tr><td>TE</td><td>Teknova</td><td>T0226</td><td></td></tr><tr><td></td> Te <td>Teknova</td><td>T0221</td><td>Bufor TE ze zredukowaną wodą o jakości EDTA</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Teknova</td><td>W3330</td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium Wzorce falciparum</td><td>MR4</td><td>MRA-151, 156, 205, 330 MR4.org</td><td>oferuje bezpłatne oprogramowanie do projektowania podkładów genomowego skanera światła DNA</td></tr><tr><td></td><td>Komercyjne oprogramowanie BioFire Defense</td><td></td><td>do projektowania testów HRM</td></tr><tr><td>LightCycler 480 o wysokiej rozdzielczości Melting Master Mix</td><td>Roche</td><td>4909631001</td><td>Do stosowania w LightCycler-480, -96 i nano. 2x</td></tr><tr><td>stężenie Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2938A</td><td>Bioanalizator Agilent 2100</td></tr><tr><td>LightCycler 2.0</td><td>Roche</td><td>3531414001</td><td>System kapilarny do MAAB</td></tr><tr><td>LightCycler Nano</td><td>Roche</td><td>6407773001</td><td>Rurka paskowa HRM i amplifikacja</td></tr><tr><td>LightCycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>Rurka paskowa i płytka HRM i amplifikacja</td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>HRM na płytce (96 i 384- płytki studzienne) i amplifikacja</td></tr><tr><td>LightScanner-96</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0011</td><td>HRM na bazie płytki (96-dołkowej)&nbsp;</td></tr><tr><td>LightScanner-384</td><td>BioFire Defense</td><td>LSCN-ASY-0001</td><td>płytki HRM (96-dołkowe)</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Roche</td><td>4729692001</td> płytki <td>96-dołkowe do HRM (płytki</td></tr><tr><td>384-dołkowe</td><td>LightCycler Roche</td><td>4729749001</td><td>Płytki 384-dołkowe do HRM (LightCycler)</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-9665&nbsp;</td><td>Płytki 96-dołkowe do HRM (LightScanner)</td></tr><tr><td>Płytki 384-dołkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP-3865&nbsp;</td><td>Płytki 384-dołkowe do HRM (LightScanner)</td></tr><tr><td>Paski LightCycler 8 tubek (przezroczyste)</td><td>Probówki paskowe 6327672001 Roche</td><td></td><td>do HRM (Light Cycler 96 i Light Cycler Nano)</td></tr><tr><td>Kapilary LightCycler (20 &mu; l)</td> <td>Kapilary 4929292001</td><td></td><td>Roche do HRM</td></tr><tr><td>Uszczelki optyczne płytek Roche</td><td></td><td>4729757001</td><td>innych marek również działają</td></tr></tbody></table>

metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Methods to Increase the Sensitivity of High Resolution Melting Single Nucleotide Polymorphism Genotyping in Malaria

Pomimo dziesięcioleci wysiłków na rzecz wyeliminowania, malaria pozostaje globalnym obciążeniem. Niedawnemu wznowieniu zainteresowania regionalną eliminacją i globalną eradykacją towarzyszy zwiększona ilość informacji genomicznych na temat gatunków pasożytów Plasmodium odpowiedzialnych za malarię, w tym charakterystyka populacji geograficznych, a także różnice związane ze zmniejszoną podatnością na leki przeciwmalaryczne.
Jedna powszechna odmiana genetyczna, polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), oferuje atrakcyjne cele dla genotypowania pasożytów. Markery te są przydatne nie tylko do śledzenia markerów oporności na leki, ale także do śledzenia populacji pasożytów przy użyciu markerów, które nie są pod presją leków lub innych selektywnych nacisków.
Metody genotypowania SNP oferują możliwość śledzenia oporności na leki, jak również odcisków palców poszczególnych pasożytów w celu nadzoru populacji, szczególnie w odpowiedzi na wysiłki mające na celu kontrolę malarii w regionach zbliżających się do stanu eliminacji.
Chociaż zidentyfikowano informacyjne SNP, które są niezależne od konkretnych technologii genotypowania, analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) jest szczególnie przydatna do badań terenowych. W porównaniu ze standardowymi metodami opartymi na sondzie fluorescencyjnej, które wymagają pojedynczych SNP w jednej znakowanej sondzie i oferują co najwyżej 10% czułość wykrywania SNP w próbkach zawierających wiele genomów (poligenomicznych), HRM oferuje czułość 2-5%. Modyfikacje HRM, takie jak zablokowane sondy i asymetryczne stężenia starterów, a także optymalizacja temperatur wyżarzania amplifikacji w celu odchylenia PCR w kierunku amplifikacji mniejszego allelu, dodatkowo zwiększają czułość HRM. Chociaż poprawa czułości zależy od konkretnego testu, zwiększyliśmy czułość wykrywania do mniej niż 1% allelu mniejszego.
W regionach zbliżających się do eliminacji malarii, wczesne wykrycie pojawiającej się lub importowanej oporności na leki jest niezbędne do szybkiej reakcji. Podobnie, zdolność do wykrywania infekcji poligenomicznych i odróżniania importowanych typów pasożytów od tajemniczych lokalnych rezerwuarów może informować programy kontrolne.
Ten manuskrypt opisuje modyfikacje technologii topnienia o wysokiej rozdzielczości, które jeszcze bardziej zwiększają jej czułość do identyfikacji infekcji poligenomicznych w próbkach pobranych od pacjentów.

Dane można wizualizować na kilka różnych sposobów, w zależności od oprogramowania analitycznego i urządzenia. Zazwyczaj wykres ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji względem temperatury (–dF/dT) w funkcji temperatury jest najprostszym sposobem wizualizacji pików topnienia i określania genotypów.
Pełne okno topnienia (40°C–80°C) wykaże regiony topnienia zarówno dla amplikonu, jak i sondy. Rysunek 1 przedstawia przykład znormalizowanych pików topnienia dla obu regionów. Ustawienie okna analizy wyłącznie na region sondy pozwala na wyraźne rozróżnienie pików odpowiadających konkretnym SNP (Rysunek 2).
Analiza z wykorzystaniem sond wyraźnie wykazuje obecność obu alleli jako pojedyncze piki z temperaturami topnienia odpowiadającymi pikom homozygotycznych SNP (Rysunek 3).
Rysunek 4 pokazuje, że stopniowe obniżanie temperatury anelowania podczas amplifikacji (MAAB) prowadzi do preferencji w kierunku allelu zmutowanego (pik po lewej stronie) (Rysunek 4A), co skutkuje zwiększoną czułością wykrywania allelu zmutowanego w populacji alleli mieszanych (Rysunek 4B).
<img alt="Wykres szczytów topnienia; fluorescencja w funkcji temperatury; analiza DNA; badanie stabilności termicznej." src="/files/ftp_upload/52839/52839fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rysunek 1. Regiony topnienia sondy i amplikonu. Wykreślenie ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji względem temperatury w szerokim oknie topnienia pozwala na analizę pików topnienia zarówno dla sondy (niższa temperatura), jak i dla amplikonu. (Adaptowano z Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Znormalizowane piki topnienia; wykres analizy termicznej; denaturacja DNA; sygnał względny w funkcji temperatury." src="/files/ftp_upload/52839/52839fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Piki topnienia sond. Idealne dopasowanie (zazwyczaj allele typu dzikiego) skutkuje wyższymi pikami topnienia (kolor czerwony), podczas gdy niedopasowania SNP wykazują niższe temperatury topnienia (kolor szary). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres znormalizowanych pików topnienia, analiza topnienia DNA, temperatura względem fluorescencji, dane naukowe." src="/files/ftp_upload/52839/52839fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3. Piki topnienia poligenomowego. W przypadku obecności obu alleli w próbce, analiza HRM oparta na sondach przedstawia oba allele jako krzywe dwupikowe (pomarańczowe), których piki odpowiadają próbkom z pojedynczym allelem (czerwone i szare). (Adaptowano z Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres PCR w czasie rzeczywistym; analiza krzywej topnienia DNA; wydajność amplifikacji; detekcja allelu mutantowego." src="/files/ftp_upload/52839/52839fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Błąd amplifikacji allelu mutantowego (MAAB). A. Stopniowe obniżanie temperatury przyłączania podczas amplifikacji przesuwa szczyt topnienia w stronę szczytu odpowiadającego allelowi mutantowemu (niższa temperatura) w próbce poligenomowej lub polialelicznej. B. MAAB pozwala na uzyskanie czułości HRM umożliwiającej wykrycie mniejszościowych alleli obecnych w stężeniu poniżej 1% w próbkach poligenomowych lub polialelicznych. (Część B zaadaptowana z Daniels et al. DOI: 10.1128/AAC.05737-11) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52839/52839fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1. Konfiguracja reakcji amplifikacji wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem sond (HRM).
<table>
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Objętość na reakcję (płyta 96-dołkowa i kapilara)</td>
			<td >Objętość na reakcję (płyta 384-dołkowa)</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >HRM Master Mix</td>
			<td >4–5 µl</td>
			<td >2-2.5 µl</td>
			<td >1 x</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10 x nadmiarowy starter</td>
			<td >1 µl</td>
			<td >0.5 µl</td>
			<td >0.50 µM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10 x drugi starter</td>
			<td >1 µl</td>
			<td >0.5µl</td>
			<td >0.1 µM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >10x sonda</td>
			<td >1 µl</td>
			<td >0.5 µl</td>
			<td >0.40 µM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Woda klasy PCR</td>
			<td >1–2 µl</td>
			<td >0.5-1 µl</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Matryca DNA</td>
			<td >1 µl</td>
			<td >0.5 µl</td>
			<td >0.01-10 ng/µl</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >10 µl</td>
			<td >5 µl</td>
			<td ></td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Standardowe warunki amplifikacji dla wysokorozdzielczego topnienia (HRM).
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podtrzymanie</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>120 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">45 cykli</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68 °C*</td>
			<td>30 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1 cykl</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 °C</td>
			<td>30 sec</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
* temperatura ta zależy od amplikonu
Tabela 3. Warunki amplifikacji dla błędu amplifikacji allelu zmutowanego.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Czas</td>
			<td>Cykle</td>
			<td>Szybkość narastania</td>
			<td>Tryb akwizycji</td>
			<td>Tryb analizy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denaturacja</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
			<td>20</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cykl</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>2 s</td>
			<td rowspan="2">55</td>
			<td>20</td>
			<td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego, nie mam czego tłumaczyć. Proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.</td>
			<td rowspan="2">Ilościowe oznaczenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>56 °C*</td>
			<td>15 s</td>
			<td>20</td>
			<td>Pojedynczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Topienie</td>
			<td>40 °C</td>
			<td>0 s</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">0.3</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 °C*</td>
			<td>0 s</td>
			<td rowspan="2">Ciągły</td>
			<td rowspan="2">Topienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 °C*</td>
			<td>0 s</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
* temperatura ta zależy od amplikonu i zostanie obniżona podczas przeprowadzania MAAB

Podczas gdy analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości oferuje możliwość różnicowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu w heterogenicznej populacji, stronniczość amplifikacji zmutowanego allelu może zwiększyć jego zdolność do wykrywania alleli obecnych w stosunkowo niskich procentach w próbce. W tym protokole opisano ulepszenia, które poprawiają czułość analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Despite decades of eradication efforts, malaria remains a global burden. Recent renewed interest in regional elimination and global eradication has been ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu wysokorozdzielczego topnienia (high resolution melt) jest zwiększenie czułości wykrywania alleli mutantów występujących w niskich stężeniach w poszczególnych próbkach. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie wyekstrahowanego DNA poprzez rozcieńczenie matrycy do niezbędnych objętości i stężeń. Drugim krokiem jest przygotowanie analiz z asymetrycznymi proporcjami prawego i lewego primera w celu zwiększenia ilości produktu sondy matrycowej.Po przygotowaniu reakcji temperaturę przyłączania ustawia się pomiędzy temperaturami topnienia sondy związanej z matrycą typu dzikiego a tej związanej z matrycą zmutowaną. Ostatnim krokiem jest analiza produktów amplifikacji na odpowiedniej platformie HRM. W rezultacie stronniczość amplifikacji allelu zmutowanego oraz asymetryczna PCR oparta na sondach umożliwiają czulszą detekcję trudnych do wykrycia mutacji SNP przy niskich stężeniach obecnych w próbkach.Ta zwiększona czułość jest przydatna w nadzorze nad mutacjami w populacjach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowy topnienie o wysokiej rozdzielczości (HRM) czy genotypowanie z użyciem sond TaqMan, jest to, że pozwala ona na zwiększenie czułości w wykrywaniu alleli występujących w niskich stężeniach, a także umożliwia genotypowanie SNP położonych blisko siebie w genomie. Metoda ta może zatem dostarczyć cennych informacji na temat rozprzestrzeniania się lekooporności u pasożyta malarii.Metodę tę można zastosować również w innych systemach, takich jak nadzór nad innymi typami chorób zakaźnych, np. HIV, czy wykrywanie rzadkich wariantów nowotworowych w populacji komórek. Procedurę zaprezentuje Caitlin Durphy, technik z naszego laboratorium.Matryce do wysokorozdzielczego topnienia (HRM) przygotowuje się z próbek Plasmodium falciparum pobranych bezpośrednio z krwi pacjentów uczestniczących w badaniach terenowych. Próbki mogą być przechowywane na papierze filtracyjnym, na testach szybkiego wykrywania lub w formie osadu erytrocytów; próbki mogą być również adaptowane do hodowli in vitro. Niektóre standardowe szczepy laboratoryjne do analiz można zamówić z centrum zasobów odczynników referencyjnych i badawczych nad malarią. Próbki mogą być ekstrahowane z krwi pełnej, erytrocytów lub papieru filtracyjnego, bądź wykorzystywane bezpośrednio z osadu erytrocytów lub hodowli w celu bezpośredniej amplifikacji z osadu erytrocytów.W pierwszej kolejności należy określić poziom pasożytnictwa erytrocytów za pomocą mikroskopii cienkiego rozmazu, zgodnie z procedurą Centers for Disease Control and Prevention. Erytrocyty z poziomem pasożytnictwa powyżej 0,5% rozcieńcza się w stosunku 1:400. W TE do każdej reakcji o objętości od 5 do 10 µL należy użyć 3 µL rozcieńczonych erytrocytów; ze względu na zmienność między próbkami, w analizach HRM zawsze należy uwzględnić kontrole pozytywne i negatywne.Przygotować rozcieńczenia plazmidu lub wzorców z weryfikowaną sekwencją genotypów SNP w zakresie od 10 pg do 10 ng na 1 µL jako kontrole pozytywne. W reakcjach amplifikacji jako negatywną kontrolę bez matrycy należy zastosować wodę klasy PCR. Procedurę rozpocząć od przygotowania 10-krotnych roztworów roboczych starterów i sond.Ten sam protokół ma zastosowanie do analiz z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych, płytek 384-dołkowych, pasków ośmiu probówek lub kapilar szklanych. Jednak w celu przeprowadzenia niniejszej demonstracji zostaną użyte wyłącznie płytki 96-dołkowe oraz kapilary szklane. W poniższej tabeli przedstawiono zalecane 10-krotne stężenia zapasów roboczych oraz stężenia końcowe dla genotypowania HRM w oparciu o sondy blokowane.Przygotować mieszaniny reakcyjne w każdej studzience. Dodać 1 µL każdego z 10x roztworów roboczych starterów i sond bezpośrednich i odwrotnych. Dodać od 4 do 5 µL HRM master mix, 1 µL matrycy oraz wodę jakości PCR do uzyskania całkowitej objętości reakcji wynoszącej 10 µL.Powtórz tę procedurę dla każdej kapilary szklanej. Przykryj płytki oraz kapilary szklane. W przypadku amplifikacji na płytkach zastosuj optyczne uszczelki do płytek, a w systemach kapilarnych użyj plastikowych nakrętek.Upewnij się, że pokrycie jest kompletne, a płytki i zakrętki są całkowicie szczelne i zabezpieczone, aby zapobiec odparowywaniu. Przed amplifikacją odwiruj próbki w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.Wiruj płytki w wirówce stołowej przez trzy minuty przy 1 800 ×g. Wiruj kapilary szklane w mikrowirówce przez 10 do 15 sekund. Umieść płytkę reakcyjną i kapilary szklane w termocyklerze i przeprowadź standardowe protokoły amplifikacji zablokowanej sondy lub MAAB. Po amplifikacji PCR przejdź do analizy krzywych topnienia za pomocą interfejsu oprogramowania systemowego.Podgrzewaj płytkę od 40 °C do 80 °C, aby uzyskać piki topnienia zarówno dla sondy, jak i amplikonu. Pierwszym krokiem analizy topnienia w systemie LightCycler 480 jest normalizacja ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji względem temperatury. Przesuń paski normalizacji tak, aby obejmowały obszar topnienia sondy.Obszar topnienia sondy to niższa temperatura spośród dwóch obszarów topnienia. Paski normalizacji powinny znajdować się u podstawy pików topnienia. Po normalizacji wybierz opcję obliczania grup, aby automatycznie przypisać próbki do grup, jeśli jest to konieczne, lub ręcznie przypisz próbki do konkretnych grup.Wybierz próbki, które nie uległy amplifikacji lub wykazują poszarpane piki topnienia. Następnie przejdź do opcji „new call” i wybierz „negative”. Po wybraniu wszystkich pozostałych błędnie sklasyfikowanych próbek, przejdź do „new call”, wybierz odpowiednią grupę i kliknij „apply change”. Przypisz genotypy dla każdej grupy na podstawie standardów.Po potwierdzeniu poprawności obliczonych grup, w zakładce grupowania (grouping) wybierz opcję edycji nazw grup (edit group names). W odpowiednim kolorowym polu wprowadź genotypy standardów. Na przykład, jeśli standard 3D seven posiada znany genotyp C i znajduje się w grupie pierwszej, to wszystkie próbki w grupie pierwszej mają genotyp C; po wybraniu opcji wyniki (results) genotypy zostaną wyświetlone obok próbek.Na koniec wyeksportuj wyniki do pliku TXT w celu przeprowadzenia dalszej analizy populacji próbek. Po zakończeniu pracy urządzenia light cycler 2.0 zapisz nazwy i pozycje próbek w sekcji danych próbkowych. Przed rozpoczęciem analizy oznacz kontrole negatywne oraz genotypy standardów topnienia. Rozpocznij analizę topnienia, wybierając opcję analizy, następnie wybierz genotypowanie w sekcji analizy krzywej topnienia i zatwierdź przyciskiem OK.Aby zwiększyć czułość automatycznego grupowania, zaznacz wszystkie próbki, aby pojawiły się na wykresie krzywych topnienia. Przesuń pasek normalizacji do górnej granicy pików topnienia sond. Potwierdź, czy próbki zostały poprawnie pogrupowane, wybierając pojedynczo każdą grupę pod nazwą grupy.Wyeksportuj genotypy dla każdej próbki, zaznaczając wszystkie próbki, kopiując dane i wklejając je do arkusza kalkulacyjnego. Wykres ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji względem temperatury jest zazwyczaj najprostszym sposobem wizualizacji pików topnienia i określania genotypów. Ustawienie okna analizy wyłącznie na region sondy pozwala na wyraźne rozróżnienie pików odpowiadających konkretnym SNP.Idealne dopasowania skutkują wyższymi pikami topnienia zaznaczonymi na czerwono. W przypadku niedopasowań SNP temperatury topnienia są niższe i zaznaczone na szaro, gdy w próbce obecne są oba allele. Analiza HRM oparta na prawdopodobieństwie przedstawia oba allele jako dwie krzywe piku w kolorze pomarańczowym, przy czym piki odpowiadające próbkom z pojedynczym allelem zaznaczone są na czerwono i szaro; stopniowe obniżanie temperatury topnienia podczas amplifikacji prowadzi do przesunięcia w stronę allelu zmutowanego, reprezentowanego przez lewy pik w próbce poligenomicznej lub poliallelicznej.To obciążenie amplifikacją allelu zmutowanego sprawia, że HRM wykazuje czułość pozwalającą na wykrycie alleli mniejszościowych występujących w stężeniu poniżej 1% w próbkach poligenomowych lub polialelelicznych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie, że kluczowa jest jakość próbki. Nawet niewielkie różnice w stężeniach buforów mogą przesunąć krzywe HRM.Stosowanie kontroli jest użytecznym sposobem na standaryzację wyników. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać asymetryczną PCR opartą na sondach oraz błąd amplifikacji alleli mutantowych do dokładnego i czułego genotypowania SNP malarii w różnych typach próbek.

methods-to-increase-sensitivity-high-resolution-melting-single

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano szybką i niedrogą metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA pasożytów malarii oraz wektorów z okazów komarów. Wykorzystując właściwości chelatujące żywicy Chelex, ta prosta metoda umożliwia genotypowanie pasożytów malarii w fazach jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów, a także identyfikację molekularną gatunków bliźniaczych Anopheles za pomocą PCR.

Prosty protokół Chelex dla ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Ten film demonstruje gradientową reakcję łańcuchową polimerazy w celu optymalizacji temperatury wyżarzania podkładów, która ustawia gradientową temperaturę wyżarzania wzdłuż studni. Wpływ różnych temperatur wyżarzania zależy od wydajności amplifikowanych produktów, co pomaga zoptymalizować warunki reakcji.

Gradientowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania

W tym filmie opisujemy technikę topnienia PCR o wysokiej rozdzielczości, aby określić polimorfizm długości fragmentów DNA o różnych długościach sekwencji, na podstawie analizy temperatury topnienia.

PCR z topnieniem w wysokiej rozdzielczości w celu określenia zmian sekwencji w zmutowanych sekwencjach DNA

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Tutaj opisujemy innowacyjną metodę określania polimorfizmów długości receptora dopełniacza 1 (CR1) do wykorzystania w wielu zastosowaniach, szczególnie w ocenie podatności na choroby takie jak choroba Alzheimera (AD). Metoda ta może być przydatna do lepszego zrozumienia roli izoform CR1 w patogenezie choroby Alzheimera.

Genotypowanie polimorfizmu długości receptora dopełniacza 1 metodą topnienia w wysokiej rozdzielczości: innowacyjne narzędzie do oceny podatności genów choroby Alzheimera

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Testy pirosekwencjonowania umożliwiają solidne i szybkie genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu mitochondrialnego DNA w heteroplazmatycznych komórkach lub tkankach.

Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

Poznaj metodę zwiększania czułości analizy HRM do wykrywania mutacji SNP w niskich stężeniach w próbkach malarii. Technika ta umożliwia skuteczniejsze genotypowanie i monitorowanie oporności na leki.

Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Przeglądaj więcej filmów