Metody zwiększania czułości genotypowania polimorfizmu pojedynczego nukleotydu topniejącego w wysokiej rozdzielczości w malarii

Ogólnym celem poniższego eksperymentu ze stopionym stopem w wysokiej rozdzielczości jest zwiększenie czułości wykrywania zmutowanych alleli obecnych w niskich stężeniach w pojedynczych próbkach. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie wyekstrahowanego DNA poprzez rozcieńczenie matrycy do niezbędnych objętości i stężeń. Drugim krokiem jest przygotowanie testów z asymetrycznymi proporcjami startera do przodu i do tyłu w celu zwiększenia produktu sondy matrycowej.

Po przygotowaniu reakcji temperaturę wyżarzania ustawia się między temperaturami topnienia sondy po związaniu z matrycą typu dzikiego lub zmutowanego. Ostatnim krokiem jest analiza amplifikowanych produktów na odpowiedniej platformie HRM. Ostatecznie błąd amplifikacji zmutowanego allelu i asymetryczny PCR oparty na sondzie pozwalają na bardziej czułe wykrywanie trudnej mutacji SNP przy niskich stężeniach obecnych w próbkach.

Ta zwiększona czułość jest przydatna w nadzorze mutacji w populacjach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak standardowe topnienie w wysokiej rozdzielczości lub genotypowanie takt-man, jest to, że pozwala na zwiększoną czułość alleli obecnych w niskich stężeniach, a także umożliwia genotypowanie SNP położonych proksymalnie względem siebie w genomie. Chociaż ta metoda może dostarczyć informacji na temat rozprzestrzeniania się oporności na leki u pasożyta malarii.

Może być również stosowany w innych systemach, takich jak nadzór nad innymi typami chorób zakaźnych, takimi jak HIV, lub wykrywanie rzadkich wariantów raka w populacji komórek. Procedurę zademonstruje Caitlin Durphy. Technik z naszego laboratorium.

Szablony do topienia w wysokiej rozdzielczości lub HRM przygotowuje się z próbek plasmodium falciparum uzyskanych bezpośrednio z krwi pacjentów biorących udział w badaniach terenowych. Próbki mogą być przechowywane na bibule filtracyjnej, w szybkich testach wykrywających lub jako granulowane próbki czerwonych krwinek, które mogą być również hodowane w kulturze przystosowanej do hodowli in vitro. Niektóre standardowe szczepy laboratoryjne do analizy można zamówić w centrum badań nad malarią, a próbki odczynników referencyjnych mogą być ekstrahowane z krwi pełnej, czerwonych krwinek lub bibuły filtracyjnej lub używane bezpośrednio z granulowanych czerwonych krwinek lub hodowli w celu bezpośredniej amplifikacji z granulowanych czerwonych krwinek.

Najpierw określ para czerwonych krwinek za pomocą mikroskopii cienkiego rozmazu zgodnie z procedurą Centers for Disease Control and Prevention. Czerwone krwinki o parach powyżej 0,5% są następnie rozcieńczane od jednego do 400. W TE trzy mikrolitry rozcieńczonych czerwonych krwinek zostaną użyte na każde pięć do 10 mikrolitrów reakcji ze względu na między jedną zmiennością, kontrole dodatnie i ujemne muszą być zawsze uwzględnione w analizach HRM.

Przygotuj od 10 pikogramów do 10 nanogramów na jeden mikrolitr rozcieńczeń plazmidu lub wzorców ze zweryfikowanymi sekwencyjnie genotypami snipów jako dodatnie trolle. Użyj wody klasy PCR jako kontroli negatywnej bez matrycy dla reakcji amplifikacji. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 10 x zapasów roboczych starterów i sond.

Ten sam protokół ma zastosowanie do testów z użyciem płytek 96-dołkowych, płytek 384-dołkowych, ośmiu pasków probówek lub szklanych kapilarn. Jednak do celów tej demonstracji zostanie użytych tylko 96 płytek dołkowych i szklanych kapilarni. Poniższa tabela przedstawia zalecane 10-krotne stężenia zapasu roboczego, a także stężenia końcowe dla genotypowania HRM opartego na zablokowanej sondzie.

Do każdego z nich należy przygotować mieszaniny reakcyjne. Dobrze dodaj po jednym mikrolitrze każdego z 10 x roboczych starterów i sond do przodu i do tyłu. Cztery do pięciu mikrolitrów wzorca HRM wymieszać jeden mikrolitr matrycy i wody klasy PCR, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 mikrolitrów.

Zrób to samo dla każdej szklanej kapilary. Przykryj płytki i szklane kapilary. Używaj uszczelek płytki optycznej do amplifikacji na bazie płytek i plastikowych nasadek do systemów opartych na kapilarach.

Upewnij się, że pokrycie jest całkowite, a płytki i nasadki są całkowicie uszczelnione i zabezpieczone, aby zapobiec parowaniu. Podczas wzmacniania. Odwirować próbki, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Wiruj płytki w wirówce stołowej przez trzy minuty po 1,800 razy G. Obracaj szklane kapilary w pico fuge przez 10 do 15 sekund. Umieść płytkę reakcyjną i szklane kapilary w termocyklerze, uruchamiaj standardowe protokoły amplifikacji sondy zablokowanej lub MAAB. Po amplifikacji PCR przejdź do analizy topnienia z interfejsu oprogramowania systemowego.

Stopić płytkę od 40 stopni Celsjusza do 80 stopni Celsjusza, aby uzyskać piki topnienia zarówno sondy, jak i amplikonu. Pierwszym krokiem analizy topnienia na światłocyklerze four 80 jest normalizacja z ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji w odniesieniu do temperatury view. Przesuń paski normalizacji, aby otoczyć obszar stopienia sondy.

Obszar topnienia sondy to niższa temperatura dwóch obszarów topnienia. Paski normalizacji powinny znajdować się u podstawy szczytów topnienia. Po normalizacji wybierz opcję Oblicz grupy, aby w razie potrzeby automatycznie przypisać próbki do grup, ręcznie ponownie przypisz próbki do określonych grup.

Wybierz próbki, które nie uległy amplifikacji lub które mają postrzępione piki topnienia. Następnie przejdź do nowego połączenia i wybierz opcję negatywna. Po wybraniu pozostałych błędnie sklasyfikowanych próbek, przejdź do nowego naboru, wybierz odpowiednie grupowanie i kliknij przycisk Zastosuj zmianę Przypisz genotypy do każdej grupy na podstawie standardów.

Po potwierdzeniu, że obliczone grupy są poprawne, wybierz opcję edytuj nazwy grup na karcie grupowania. Wprowadź genotypy standardów w odpowiednim kolorowym polu. Na przykład, jeśli standardowa siódemka 3D ma znany genotyp C i znajduje się w grupie pierwszej, to wszystkie próbki w grupie pierwszej mają wyniki tłoczenia genotypu C, a genotypy są wyświetlane obok próbek.

Na koniec wyeksportuj wyniki jako plik TXT w celu dalszej analizy populacji próbki. Po zakończeniu pracy na Light Cycler 2.0 należy zapisać nazwy i pozycje próbek pod danymi próbki Przed rozpoczęciem analizy należy oznaczyć kontrole ujemne i genotypy wzorców topnienia. Rozpocznij analizę stopu od wybrania analizy, wyboru genotypowania w ramach analizy krzywej topnienia i prasowania. Porządku.

Aby zwiększyć czułość automatycznego grupowania, należy wybrać wszystkie próbki, tak aby były wyświetlane na wykresie krzywych topnienia. Przesuń pasek normalizacji do górnej granicy pików topnienia sondy. Upewnij się, że próbki zostały poprawnie pogrupowane, wybierając indywidualnie każdą grupę poniżej nazwy grupy.

Wyeksportuj genotypy dla każdej próbki, zaznaczając wszystkie próbki, kopiując dane i wklejając je do arkusza. Wykres ujemnej pochodnej znormalizowanej fluorescencji w odniesieniu do temperatury jest zazwyczaj najprostszym sposobem wizualizacji pików topnienia i określenia genotypów. Ustawienie okna analizy tylko na obszar sondy skutkuje wyraźnym rozróżnieniem pików odpowiadających konkretnym SNP.

Idealne dopasowania skutkują wyższymi pikami topnienia zaznaczonymi na czerwono. Podczas gdy niedopasowania SNP mają niższe temperatury topnienia oznaczone na szaro, gdy oba allele są obecne w próbce. Analiza HRM oparta na prob przedstawia oba allele jako dwie krzywe pików pokazane na pomarańczowo z pikami, które pasują do próbek pojedynczego allelu pokazanych na czerwono i szaro, stopniowo obniżając temperaturę ealingu podczas amplifikacji, co powoduje odchylenie w kierunku zmutowanego allelu reprezentowanego przez pik po lewej stronie w próbce poligenomowej lub poliallelicznej.

To odchylenie amplifikacji zmutowanego alleli powoduje czułość HRM na wykrywanie mniejszych alleli obecnych na poziomie mniejszym niż 1% w próbkach poligenomicznych lub poliallelicznych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jakość próbki jest kluczowa. Niewielkie różnice w stężeniach mogą spowodować przesunięcie krzywych HRM.

Korzystanie z kontrolek jest użytecznym sposobem standaryzacji wyników. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać asymetrycznego PCR opartego na prob i odchylenia amplifikacji zmutowanych alleli do dokładnego i czułego genotypowania SNP malarii z różnych typów próbek.