Name: Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę śledzenia komórek w fazie S za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU) w połączeniu z barwnikami DNA i przeciwciałami. Ta technika umożliwia szczegółową analizę dynamiki cyklu komórkowego bez synchronizacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została sfinansowana przez Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), grant Cancer Council NSW (13-02), NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) oraz grant projektowy (1041614).

Opisany tutaj protokół wykorzystuje linię komórkową ostrej białaczkowczości limfoblastycznej NALM6, ale może być zastosowany również do innych typów komórek.
1. Roztwory i odczynniki
<ol>
	<li>Pełna pożywka RPMI
	<ol>
		<li>Do 500 ml butelki pożywki RPMI-1640 dodać 56 ml płodowej surowicy bydlęcej (FCS) oraz 5,5 ml L-glutaminy o stężeniu 200 mM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór zapasowy BrdU
	<ol>
		<li>Przygotować 32,5 mM BrdU (10 mg/ml) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pełna pożywka RPMI z BrdU
	<ol>
		<li>Do 10 ml pełnej pożywki RPMI dodać 6,2 µl roztworu zapasowego BrdU.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór DNazy
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór DNazy o stężeniu 1 mg/ml w DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor barwiący
	<ol>
		<li>Przygotować 3% inaktywowanego ciepłem FCS oraz 0,09% azotku sodu w DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definicje buforu do fiksacji, buforu do permeabilizacji oraz buforu do przemywania znajdują się w liście materiałów.</li>
</ol>
2. Komórki
Uwaga: Komórki nie były hodowane przez okres dłuższy niż 6 miesięcy. Metoda ta jest bezpośrednio możliwa do zaadaptowania dla każdej linii komórek nieadherentnych, po wprowadzeniu korekt w gęstości komórek i pożywkach hodowlanych. Należy użyć komórek znajdujących się w fazie wzrostu wykładniczego w momencie rozpoczynania eksperymentu.
<ol>
	<li>Hodować komórki NALM6 w kolbach hodowlanych T-75 w pełnym medium RPMI. Wszystkie etapy przeprowadzać w warunkach sterylnych, korzystając z komory z laminarnym przepływem powietrza klasy II.
	<ol>
		<li>Utrzymywać gęstość komórek NALM6 na poziomie 1-2 x 106 komórek na ml poprzez pasażowanie hodowli trzy razy w tygodniu.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Markowanie impulsowe komórek przy użyciu BrdU
OSTRZEŻENIE: BrdU należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest potencjalnym mutagenem i teratogenem.
<ol>
	<li>Wirować komórki z przyspieszeniem 150 x g przez 5 min. Uwaga: Przeniesienie komórek do świeżej pożywki poprawia powtarzalność wyników.</li>
	<li>Wykonać obliczanie liczby komórek i resuspendować je w pełnym medium RPMI w stężeniu 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:2 w pożywce BrdU Complete RPMI, aby uzyskać końcową koncentrację komórek wynoszącą 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 45 min, następnie rozcieńczyć komórki 1:10 w pełnej pożywce RPMI. Odwiruj komórki przy 150 x g przez 5 min i ostrożnie odlej cały supernatant.</li>
	<li>Resuspender komórki w niewielkiej objętości (~100 µl) pełnej pożywki RPMI, należy przeprowadzić zliczenie komórek i dostosować ich liczbę do 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Pipetować 1 ml zawiesiny komórek do dołków płytki 48-dołkowej. Do wszystkich nieobsadzonych dołków pipetować 1 ml DPBS, aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki.</li>
	<li>Inkubować w 37 °C w 5% CO2 na powietrzu przez wybrany czas, w tym przypadku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24 h. Uwaga: długość czasu zależy od tego, co ma zostać zmierzone w ramach projektu eksperymentalnego.</li>
	<li>Przenieś wszystkie komórki do probówek do FACS za pomocą pipety. Przepłucz dołek sekwencyjnie objętościami 1 ml PBS, aż do uzyskania całkowitej objętości 5 ml.</li>
	<li>Wiruj przy 150 x g przez 5 min i ostrożnie usuń cały nadsącz. Komórki są gotowe do barwienia; przeprowadź tę procedurę (sekcja 4) niezwłocznie.</li>
</ol>
4. Barwienie komórek
Uwaga: Jeśli wymagane jest barwienie powierzchniowe komórek, należy je przeprowadzić przed fiksacją, dbając o to, aby komórki przez cały czas znajdowały się w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Resuspender komórki w 100 µl buforu do barwienia (w przypadku opcjonalnego barwienia powierzchniowego dodać zalecaną objętość przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i inkubować przez 30 min w 4 °C).</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do barwienia, odwirować przez 5 min przy 150 x g i usunąć supernatant. 
	Uwaga: Konkretne przeciwciało, stężenie, czas inkubacji itp. będą różnić się w zależności od konkretnych celów eksperymentalnych.</li>
	<li>Fixacja i permeabilizacja
	<ol>
		<li>Resuspender komórki w 100 µl buforu do fixacji i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania, odwirować przez 5 min przy 150 x g i usunąć supernatant.</li>
		<li>Resuspender komórki w 100 µl buforu do permeabilizacji i inkubować komórki przez 10 min na lodzie.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania, odwirować przez 5 min przy 150 x g i usunąć supernatant.</li>
		<li>Resuspender komórki w 100 µl buforu do fixacji na probówkę i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania, odwirować przez 5 min przy 150 x g i usunąć supernatant. 
		Uwaga: W tym miejscu można w razie potrzeby przerwać protokół. Ufixowane komórki są stabilne przez kilka dni w 4 °C, jeśli zostaną resuspenderowane w buforze do barwienia. Przed kontynuacją należy usunąć bufor do barwienia po odwirowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka DNazą
	<ol>
		<li>Resuspender komórki w 100 µl roztworu DNazy (30 µg DNazy/106 komórek) i inkubować komórki przez 1 h w 37 °C.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania, odwirować przy 150 x g przez 5 min i usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwciałami 
	Uwaga: Barwienie markerów wewnątrzkomórkowych innych niż BrdU można przeprowadzić jednocześnie z barwieniem BrdU.
	<ol>
		<li>WAŻNE: Przygotować kontrole kompensacyjne składające się z niebarwionych komórek oraz komórek znakowanych pojedynczymi fluorochromami. Idealnie należy użyć do kontroli kompensacyjnych tych samych przeciwciał, których użyto w probówkach eksperymentalnych. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy zastosować przeciwciała do silnie ekspresyjnych antygenów sprzężonych z tym samym fluorochromem.</li>
		<li>Resuspender komórki w 50 µl buforu do przemywania i dodać 1 µl/106 komórek przeciwciał przeciwko BrdU. Uwaga: Można również dodać przeciwciała bezpośrednio sprzężone z innymi specyficznymi antygenami wewnątrzkomórkowymi.   
		UWAGA: Przeciwciała przeciwko histonie H3 fosforylowanej w Ser10 mogą być użyte do rozróżnienia komórek w fazach G2 i M; histona H3 jest fosforylowana w Ser10 podczas mitozy.10 Przeciwciała przeciwko cdc2 fosforylowanemu w Tyr15 mogą być użyte do wykrycia komórek, które weszły w fazę mitozy.11</li>
		<li>Inkubować komórki przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania, odwirować komórki przy 150 x g przez 5 min i usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="6">
	<li>Barwienie DNA do analizy cyklu komórkowego
	<ol>
		<li>Rozluźnić osad i dodać 20 µl roztworu 7-AAD (0,25 µg). Uwaga: Krytyczne jest zastosowanie stałej ilości 7-AAD na komórkę.</li>
		<li>Resuspendować komórki w 1 ml buforu do barwienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Gromadzenie danych z cytometrii przepływowej
Uwaga: Wymagana maszyna zależy od liczby i rodzaju zastosowanych fluorochromów.
<ol>
	<li>Zbierz następujące parametry: FSC-A, SSC-A, FSC-H (zamiast FSC-H można użyć FSC-W) oraz fluorescencję 7-AAD w skali liniowej. Zbierz sygnał z kanału APC w skali logarytmicznej. Zbierz wszelkie dodatkowe kanały wymagane do oceny znaczników powierzchniowych lub wewnętrznych w skali logarytmicznej.</li>
	<li>Przed analizą próbek przeprowadź kompensację nakładających się sygnałów w widmach emisji obserwowanych pomiędzy różnymi fluorochromami. Uwaga: większość cytometrów przepływowych wykonuje tę czynność automatycznie.</li>
	<li>Zbierz co najmniej 10 000 zdarzeń dla każdej próbki.</li>
</ol>
6. Analiza danych z cytometrii przepływowej
Uwaga: W niniejszym badaniu do analizy danych z cytometrii przepływowej wykorzystano program FlowJo, jednak można zastosować również inne pakiety oprogramowania. Strategia bramkowania została przedstawiona na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj populację żywych komórek, wykorzystując parametry FSC-A i SSC-A.</li>
	<li>W obrębie tej populacji wyklucz dublety i agregaty, stosując FSC-A i FSC-H (można tutaj również użyć FSC-W).</li>
	<li>W obrębie tej populacji ustaw wykres punktowy, przyjmując 7-AAD na osi x oraz BrdU-APC na osi y.</li>
</ol>
<img alt="Analiza cytometryczna, diagramy danych populacji komórek, SSC-A vs FSC-A, FSC-H, BrdU-APC 7-AAD." src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Strategia bramkowania. Panel lewy: niebramkowane komórki przedstawione na wykresie kropkowym FSC-A vs. SSC-A. Populacja żywych komórek została zidentyfikowana za pomocą zaznaczonej bramki. Panel środkowy: komórki wyselekcjonowane z panelu lewego przedstawione na wykresie kropkowym FSC-A vs. FSC-H (zamiast wysokości można zastosować szerokość FSC-W). Dublety i agregaty zostały zidentyfikowane i wykluczone za pomocą zaznaczonej bramki. Panel prawy: komórki wyselekcjonowane z danych wykluczenia dubletów w panelu środkowym przedstawione na wykresie kropkowym 7-AAD vs. APC-A. Przeciwciało BrdU jest znakowane APC, co umożliwia identyfikację komórek, które włączyły BrdU podczas pulsowego znakowania. 7-AAD dostarcza informacji o zawartości DNA. Górna bramka definiuje komórki pozytywne pod kątem BrdU, a zatem znajdujące się w fazie S w czasie pulsu BrdU; dolna lewa bramka – komórki w fazie G0/1 , a dolna prawa – komórki w fazie G2/M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="4">
	<li>Analiza cyklu komórkowego
	<ol>
		<li>Otwórz pierwszy plik danych i wyznacz bramkę dla komórek w bramce wykluczania dubletów.</li>
		<li>Przeanalizuj tę populację pod kątem rozkładu cyklu komórkowego (opcja znajduje się w sekcji platforms w oprogramowaniu FloJo), stosując model Dean-Jett-Fox.</li>
		<li>Wyznacz pozycje pików G0/1 oraz G2/M, korzystając z funkcji tworzenia bramek (create gates).</li>
		<li>Wyznacz bramkę dla komórek BrdU-dodatnich i poddaj tę populację tej samej analizie cyklu komórkowego.</li>
		<li>Określ pozycje pików G0/1 oraz G2/M, stosując te same bramki z funkcji create gates i ustawiając ograniczenia (wykorzystując utworzone bramki) dla pozycji pików G0/1 oraz G2/M. Jest to przedstawione na dwóch pierwszych panelach Ryciny 2. 
		Uwaga: Do analizy danych można użyć innego oprogramowania, w takim przypadku instrukcje będą odpowiednio różnić się od powyższych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Analiza faz cyklu komórkowego; histogramy cytometrii przepływowej dla etapów G0/1, S, G2/M, barwienie 7-AAD." src="/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Progresja cyklu komórkowego. Pierwszy panel (All Cells) jest ograniczony do populacji komórek zdefiniowanej przez bramkę wykluczającą dublety. Populacja ta została przedstawiona na histogramie z 7-AAD na osi X. Szczyt fazy G0/1 jest wskazany strzałką poniżej osi. W kolejnych panelach wyselekcjonowano komórki BrdU-dodatnie, zgodnie z przedstawionym na Rycina 1. Wartość dla pozycji G0/1 uzyskana po zastosowaniu bramki wykluczającej dublety została przypisana do bramki komórek BrdU-dodatnich w oprogramowaniu do analizy cyklu komórkowego FlowJo. Każdy kolejny panel został ograniczony do populacji BrdU-dodatniej, jak pokazano na Rycina 1, a pozycja szczytu G0/1 została ustalona na podstawie wartości uzyskanej podczas analizy całej populacji, co pokazano na dwóch pierwszych panelach. Wykorzystanie frakcji BrdU-ujemnej do zidentyfikowania lokalizacji populacji G0/1 dla komórek BrdU-dodatnich w tej samej próbce pozwala kontrolować wszelkie niewielkie różnice w intensywności barwienia DNA pomiędzy próbkami. Liczba pokazana na każdym panelu reprezentuje czas od zakończenia impulsu BrdU. Obliczone fazy cyklu komórkowego zaznaczono kolorem zielonym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

<ol><li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanfalvi%2C+G+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132, 487-498 (2008).</li>
<li>Harper, J. W., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+ten+years+after%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: ten years after.</a> Molecular Cell. 28, 739-745 (2007).</li>
<li>Latt, S. A., George, Y. S., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+bromodeoxyuridine-substituted+cells+stained+with+33258+Hoechst%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine-substituted cells stained with 33258 Hoechst.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 25, 927-934 (1977).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218, 474-475 (1982).</li>
<li>Carayon, P., Bord, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-replicating+lymphocyte+subsets+using+a+new+method+to+label+the+bromo-deoxyuridine+incorporated+into+the+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets using a new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA.</a> Journal of Immunological Methods. 147, 225-230 (1992).</li>
<li>Gonchoroff, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase+detection+with+an+antibody+to+bromodeoxyuridine.+Role+of+DNase+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">S-phase detection with an antibody to bromodeoxyuridine. Role of DNase pretreatment.</a> Journal of Immunological Methods. 93, 97-101 (1986).</li>
<li>Rabinovitch, P. S., Torres, R. M., Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+cell+cycle+analysis+and+two-color+surface+immunofluorescence+using+7-amino-actinomycin+D+and+single+laser+excitation%3A+applications+to+study+of+cell+activation+and+the+cell+cycle+of+murine+Ly-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous cell cycle analysis and two-color surface immunofluorescence using 7-amino-actinomycin D and single laser excitation: applications to study of cell activation and the cell cycle of murine Ly-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 136, 2769-2775 (1986).</li>
<li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD001+%28everolimus%29+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. 32, 4789-4797 (2013).</li>
<li>Hendzel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106, 348-360 (1997).</li>
<li>Draetta, G., Beach, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+cdc2+protein+kinase+during+mitosis+in+human+cells%3A+cell+cycle-dependent+phosphorylation+and+subunit+rearrangement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of cdc2 protein kinase during mitosis in human cells: cell cycle-dependent phosphorylation and subunit rearrangement.</a> Cell. 54, 17-26 (1988).</li>
<li>Saunders, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD001+%28everolimus%29+induces+dose-dependent+changes+to+cell+cycle+regulation+and+modifies+the+cell+cycle+response+to+vincristine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RAD001 (everolimus) induces dose-dependent changes to cell cycle regulation and modifies the cell cycle response to vincristine.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Knudsen, R. C., Ahmed, A. A., Sell, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microassay+for+lymphotoxin+using+microculture+plates+and+the+multiple+automated+sample+harvester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microassay for lymphotoxin using microculture plates and the multiple automated sample harvester.</a> Journal of Immunological Methods. 5, 55-63 (1974).</li>
<li>Beck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+kinetics+of+perturbed+cell+populations+determined+by+the+bromodeoxyuridine-33258+technique%3A+radiotoxic+effects+of+incorporated+%5B3H%5Dthymidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Proliferation kinetics of perturbed cell populations determined by the bromodeoxyuridine-33258 technique: radiotoxic effects of incorporated [3H]thymidine.</a> Cytometry. 2, 170-174 (1981).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Collins, J. M., Berry, D. E., Bagwell, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+rates+of+DNA+synthesis+during+the+S+phase+of+log+phase+HeLa+S3%2C+WI-38%2C+and+2RA+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Different rates of DNA synthesis during the S phase of log phase HeLa S3, WI-38, and 2RA cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 255, 3585-3590 (1980).</li>
<li>Schwarting, R., Gerdes, J., Niehus, J., Jaeschke, L., Stein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+growth+fraction+in+cell+suspensions+by+flow+cytometry+using+the+monoclonal+antibody+Ki-67%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67.</a> Journal of Immunological Methods. 90, 65-70 (1986).</li>
<li>Danova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-related+proteins%3A+a+flow+cytofluorometric+study+in+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-related proteins: a flow cytofluorometric study in human tumors.</a> Biology of the Cell. 64, 23-28 (1988).</li>
<li>Juan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+phosphorylation+and+expression+of+cyclins+A+and+B1+measured+in+individual+cells+during+their+progression+through+G2+and+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Histone H3 phosphorylation and expression of cyclins A and B1 measured in individual cells during their progression through G2 and mitosis.</a> Cytometry. 32, 71-77 (1998).</li>
<li>Langan, T. J., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+mammalian+cell+cultures+by+serum+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation.</a> Methods in Molecular Biology. 761, 75-83 (2011).</li>
<li>Kues, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+porcine+fetal+fibroblasts%3A+effects+of+serum+deprivation+and+reversible+cell+cycle+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors.</a> Biology of Reproduction. 62, 412-419 (2000).</li>
<li>Urbani, L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+nuclear+and+cytoplasmic+cell+cycle+progression+by+drugs+employed+in+cell+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Dissociation of nuclear and cytoplasmic cell cycle progression by drugs employed in cell synchronization.</a> Experimental Cell Research. 219, 159-168 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Możliwość analizy cyklu komórkowego jest ważna dla zrozumienia biologii nowotworów i mechanizmu działania zarówno leków, jak i genów, które wpływają na proliferację i wzrost komórek. Chociaż istnieje wiele testów, które podobno mierzą proliferację komórek, większość z nich zapewnia tylko miarę, która wskazuje liczbę obecnych komórek. Należą do nich testy, które mierzą liczbę komórek poprzez bezpośrednią wizualizację i zliczanie, aktywność metaboliczną lub stężenie ATP. Główną zaletą wielu z tych metod jest to, że są one ...

Ocena cech cyklu komórkowego i zmian, które zachodzą w komórkach podczas progresji cyklu komórkowego, jest fundamentalna dla zrozumienia wielu aspektów biologii, szczególnie biologii raka. Wiele opracowywanych środków do leczenia nowotworów złośliwych ma głęboki wpływ na progresję cyklu komórkowego lub indukuje śmierć komórki poprzez mechanizmy zależne od cyklu komórkowego. Aby zbadać dynamikę cyklu komórkowego lub komórki w określonej fazie cyklu komórkowego, zwykle synchronizuje się komórki. Jednak metody synchronizacji mogą mieć szkodliwy wpływ na badane komórki, potencjalnie zakłócając uzyskane wyniki. 1 Ostatnio zastosowanie fluorescencyjnie znakowanych białek, które są obecne tylko w określonych fazach cyklu komórkowego, umożliwiło analizę progresji cyklu komórkowego w pojedynczych komórkach w czasie2, jednak komórki, które mają być badane, muszą być genetycznie manipulowane w celu ekspresji tych znakowanych białek, ograniczając ich użycie do systemów, w których można to łatwo osiągnąć.
Cykl komórkowy składa się z dwóch aktywnych faz: fazy syntezy (S), w której DNA jest replikowane i mitozy (M), w której następuje podział komórki. Fazy te są oddzielone trzema fazami przerwy: G0, G1 i G2. G0 lub spoczynek to faza spoczynku, w której komórka opuściła cykl, G1 to miejsce, w którym komórki zwiększają swój rozmiar przed replikacją DNA, a G2, w którym wzrost komórki trwa między zakończeniem replikacji DNA, ale przed podziałem komórki. Postęp w cyklu komórkowym jest kontrolowany przez szereg punktów kontrolnych. Punkt kontrolny G1 jest aktywowany, gdy warunki środowiskowe nie sprzyjają syntezie DNA i uniemożliwiają wejście w fazę S. Punkt kontrolny lub opóźnienie fazy intra-S może być wywołane przez uszkodzenie DNA, które może skutkować zatrzymaniem widełek replikacyjnych. PodczasG2 potwierdza się wierność zreplikowanego DNA, a jeśli zostanie wykryte uszkodzenie, aktywowany jest punkt kontrolnyG2, co umożliwia naprawę DNA przed podziałem komórki. Ostatni punkt kontrolny podczas mitozy zapewnia, że chromatydy zostały prawidłowo ustawione na płytce mitotycznej, aby podział komórek mógł zostać pomyślnie zakończony. 3 Aktywacja tych punktów kontrolnych jest powszechnie stosowana do synchronizacji populacji komórek. Punkty kontrolne cyklu komórkowego mogą być aktywowane przez wiele czynników, ale w biologii nowotworów najczęstszym jest wykrycie uszkodzenia DNA. Odpowiedź na uszkodzenie DNA jest inicjowana przez kinazy podobne do kinazy PI3, ataksja, teleangiektazja i związane z Rad3 (ATR) oraz zmutowane ataksje teleangiektazyjne (ATM), które aktywują odpowiednio kinazy efektorowe Chk1 i Chk2. 3 Szereg zdarzeń aktywuje Chk1, w tym zablokowane widełki replikacyjne, wiązania krzyżowe DNA i uszkodzenia spowodowane promieniowaniem ultrafioletowym, podczas gdy Chk2 jest aktywowany głównie przez pęknięcia podwójnej nici.
Zwykłą metodą badania wpływu zmienionych warunków na długość cyklu komórkowego jest synchronizacja komórek w określonej fazie cyklu komórkowego. 1 Można to osiągnąć na kilka sposobów. Komórki można fizycznie rozdzielić na podstawie rozmiaru, gęstości, rozrzutu bocznego (ziarnistości) i markerów ekspresji powierzchni komórki. Bardziej praktycznie, komórki mogą być synchronizowane za pomocą środków chemicznych. Kilka środków, takich jak tymidyna, hydroksymocznik i arabinozyd cytozyny, może być stosowanych do hamowania syntezy DNA w fazie S cyklu komórkowego, co powoduje akumulację komórek w fazie S, które kontynuują cykl po usunięciu środków. Komórki traktowane nokodazolem, który zapobiega tworzeniu się wrzeciona mitotycznego, zatrzymują się przy zawartości DNA w fazieG2 lub M. Eliminacja surowicy z pożywki hodowlanej powoduje akumulację komórek w fazie G0. Ponowne dodanie składników odżywczych w surowicy hodowlanej ponownie rozpoczyna normalny cykl komórek. Jednak wszystkie te metody synchronizacji zakłócają normalny cykl i wzrost komórek i mogą spowodować znaczną śmierć komórki.
Synchronizacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej jest szczególnie trudna, a komórki te nie są podatne na manipulacje genetyczne. Opisana tutaj metoda pozwala na ocenę dynamiki cyklu komórkowego i badanie komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego bez tradycyjnej synchronizacji lub modyfikacji genetycznej. Ta metoda może być również przydatna w przypadku innych typów komórek, w których modyfikacja genetyczna i tradycyjne procedury synchronizacji nie są łatwe do osiągnięcia. Metoda opiera się na ugruntowanym od dawna stosowaniu inkorporacji bromodeoksyurydyny (BrdU), która ma bardzo mały wpływ na krótkoterminowy wzrost i proliferację komórek. 4 Ustalone protokoły BrdU wykorzystują włączenie BrdU do nowo zsyntetyzowanego DNA podczas fazy S. To trwale oznacza, że komórki były w fazie S podczas ekspozycji na BrdU. Populacja ta może być zidentyfikowana w późniejszych punktach czasowych poprzez barwienie pod kątem inkorporacji BrdU, a tym samym działać jako zsynchronizowana populacja, którą można śledzić i oceniać w czasie, co pozwala na badanie wpływu leku na tranzyt cyklu komórkowego. BrdU musi być wystawiony na działanie przeciwciał przed barwieniem przeciwciał, zwykle uzyskuje się je po leczeniu DNazą lub kwasem. 6,7 Zastosowanie cytometrii przepływowej do wykrywania włączonego BrdU umożliwia włączenie dodatkowych markerów. Najważniejsze jest zastosowanie barwników do pomiaru zawartości DNA, umożliwiających ocenę rozkładu faz cyklu komórkowego komórek, które na początku badania znajdowały się w fazie S. 8 Ponadto można również badać dodatkowe antygeny powierzchniowe lub wewnątrzkomórkowe. 9 Mogą one odnosić się do zdarzeń cyklu komórkowego, takich jak Ki67 lub do pozornie niepowiązanych cech komórek, takich jak markery apoptozy, takie jak rozszczepiona kaspaza-3. Potencjalne zastosowania są ograniczone wyobraźnią badacza.

<table><tbody><tr><td>Zestaw przepływowy APC BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>552598</td><td>Zawiera przeciwciało BrdU, 7-AAD i bufor BD Cytofix/Cytoperm (określany jako bufor utrwalający)</td></tr><tr><td>Bufor permeabilacyjny BD Cytoperm Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>561651</td><td>określany jako bufor permeabilizacji</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>określany jako bufor płuczący</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D-4513</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12 x 75&nbsp; mm Probówki FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Barin Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR FORTESSA cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>FORTESSA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>P2, P20, P100, P1000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1,640 bez L-Gln 500 ml</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>FisherBiotec</td><td>FBS-7100113</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoksyurydyna</td><td>Sigma</td><td>B5002-1G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC 150&nbsp; cm2 kolby wentylowane</td><td>BD Biosciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 25&nbsp; ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Aersol 200&nbsp; &mikro; l</td><td>Pipety Interpath</td><td>24700</td><td></td></tr><tr><td>Aersol 1&nbsp; ml</td><td>Interpath</td><td>24800</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Spintron</td><td>GT-175R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Binder</td><td>C 150</td><td></td></tr><tr><td>AF488 anty-histon H3 Fospho (Ser10) Sygnalizacja</td><td>komórkowa</td><td>przeciwciała 9708S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Sygnalizacja komórkowa mAb królika</td><td></td><td>2197S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3) Sygnalizacja komórkowa mAb królika</td><td></td><td>2348S</td><td></td></tr><tr><td>NALM6&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-128</td><td></td></tr></tbody></table>

czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Ten protokół opisuje metodę pozwalającą na śledzenie komórek przez cały cykl komórkowy bez konieczności synchronizacji komórek. Osiągnięcie synchronizacji komórek może być trudne dla wielu systemów komórkowych. Standardową praktyką jest blokowanie progresji cyklu komórkowego na określonym etapie, a następnie uwalnianie nagromadzonych komórek, wytwarzając falę komórek przechodzących przez cykl zgodnie z nimi. Jednak niektóre typy komórek uważają ten blok za toksyczny, co skutkuje nieprawidłowym cyklem komórkowym, a nawet masową śmiercią. Wychwyt bromodeoksyurydyny (BrdU) może być wykorzystany do śledzenia etapu cyklu komórkowego poszczególnych komórek. Komórki zawierają ten syntetyczny analog tymidyny, jednocześnie syntetyzując nowe DNA podczas fazy S. Dostarczając BrdU przez krótki czas, możliwe jest oznaczenie puli komórek, które były w fazie S, gdy BrdU był obecny. Komórki te mogą być następnie śledzone przez pozostałą część cyklu komórkowego i do następnej rundy replikacji, co pozwala na określenie czasu trwania faz cyklu komórkowego bez konieczności wywoływania potencjalnie toksycznego bloku cyklu komórkowego. Możliwe jest również określenie i skorelowanie ekspresji białek zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych podczas kolejnych etapów cyklu komórkowego. Można je wykorzystać do dalszego uściślenia przypisywania etapów cyklu komórkowego lub oceny wpływu na inne funkcje komórkowe, takie jak aktywacja punktu kontrolnego lub śmierć komórki.

Niniejszą metodologię można wykorzystać do uzyskania szeregu informacji. Poniżej opisano kilka zastosowań.
Ocena czasu trwania cyklu komórkowego
Aby określić czas potrzebny komórkom na przejście przez cykl komórkowy, komórki są zbierane w różnych punktach czasowych po impulsie BrdU. Przedziały między pomiarami można dostosować do analizowanych komórek. Linie komórkowe krwiotwórcze oceniano co godzinę przez okres 24 hr bez zastosowania jakichkolwiek leków, aby określ...

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

temporal-tracking-cell-cycle-progression-using-flow-cytometry-without

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reportery oparte na FRET są coraz częściej wykorzystywane do monitorowania aktywności kinaz i fosfataz w żywych komórkach. W niniejszej pracy opisujemy metodę wykorzystania reporterów opartych na FRET do oceny zmian w fosforylacji celu zależnych od cyklu komórkowego.

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Wyznaczanie pozycji w cyklu komórkowym populacji komórek lub zrozumienie wpływu sygnałów na proliferację można łatwo zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, stosując niniejszy protokół. Przedstawiamy proste podejście eksperymentalne do barwienia komórek i ilościowego określania ich pozycji w cyklu komórkowym.

Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków

Śledzenie subtelnych zmian w progresji i kinetyce etapów cyklu komórkowego można przeprowadzić, stosując połączenie metabolicznego znakowania kwasów nukleinowych BrdU oraz barwienia całkowitej genomowej DNA jodeczkiem propidyny. Metoda ta eliminuje konieczność chemicznej synchronizacji dzielących się komórek, zapobiegając tym samym wprowadzaniu nieswoistych uszkodzeń DNA, które z kolei wpływają na przebieg cyklu komórkowego.

Pomiar kinetyki progresji cyklu komórkowego z wykorzystaniem znakowania metabolicznego i cytometrii przepływowej

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Jednym z wyzwań związanych z analizą eksperymentów z synchronizowanymi szeregami czasowymi jest to, że eksperymenty często różnią się długością powrotu do zdrowia po synchronizacji i okresem cyklu komórkowego. W związku z tym pomiary z różnych eksperymentów nie mogą być analizowane zbiorczo ani łatwo porównywane. W tym miejscu opisujemy metodę dopasowywania eksperymentów, aby umożliwić porównania specyficzne dla fazy.

Wyrównanie zsynchronizowanych danych szeregów czasowych przy użyciu modelu charakteryzowania utraty synchronizacji cyklu komórkowego do porównań między eksperymentami

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę śledzenia komórek w fazie S za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU) w połączeniu z barwnikami DNA i przeciwciałami. Ta technika umożliwia szczegółową analizę dynamiki cyklu komórkowego bez synchronizacji.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Przeglądaj więcej filmów