Name: Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę konstrukcji i oczyszczania sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej z powtórzeniami elastynopodobnymi z Escherichia coli. Technika ta umożliwia tanie pozyskiwanie dużych ilości białek do inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za dofinansowanie z Ministerstwa Edukacji AcRF Tier 1 (RG41) oraz grant na rozpoczęcie działalności od Uniwersytetu Technologicznego Nanyang. Low i Tjin są finansowani przez Research Student Scholarship (RSS) z Nanyang Technological University w Singapurze.

1. Klonowanie rekombinowanych plazmidów kodujących białka aECM
<ol>
	<li>Zaprojektuj sekwencję aminokwasową domeny funkcjonalnej (np. domena wiążąca komórki i powtórzenia podobne do elastyny). Zaprojektuj strony z ograniczeniami po bokach domen funkcjonalnych, aby ułatwić subklonowanie przy użyciu wolnego oprogramowania zgodnie z instrukcjami oprogramowania (np. http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). W tym miejscu wybierz unikatowe miejsca ograniczenia, które nie są obecne w domenie funkcjonalnej, aby ograniczyć trawienie do zamierzonych miejsc. Wybierz miejsca ograniczeń, które pojawiają się w wielu miejscach klonowania (MCS) wektora gospodarza (np. pET22b(+)) do podklonowania.</li>
	<li>Odwrotna translacja sekwencji aminokwasów na sekwencję nukleotydów za pomocą bezpłatnych stron internetowych zgodnie z instrukcjami oprogramowania. (np. http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Upewnij się, że kodony są zoptymalizowane pod kątem gospodarzy E. coli.</li>
	<li>Gen będący przedmiotem zainteresowania można kupić komercyjnie jako jednoniciowe oligonukleotydy (tj. jeśli oligonukleotydy < 100 par zasad (bp)) i przeprowadzić wyżarzanie DNA (patrz krok 1.4) w celu obniżenia kosztów. W przeciwnym razie, w przypadku genów większych niż 100 pz, można je nabyć za pośrednictwem firm komercyjnych.</li>
	<li>Wyżarzanie DNA oligonukleotydów
	<ol>
		<li>Wyżarzać oligomery DNA, aby uzyskać pożądaną sekwencję genów. Rozpuścić oligonukleotydy DNA w buforze oligomerów DNA (10 mM tris: 2-amino-2-(hydroksymetylo)-propan-1,3-diol, pH 8,0, przefiltrowany) do końcowego stężenia 1 μg/μl.</li>
		<li>Dodać 4 μl każdego oligomeru do 32 μl buforu do wyżarzania DNA (10 mM Tris, 100 mM NaCl i 100 nM MgCl2), aby uzyskać całkowitą mieszaninę 40 μl.</li>
		<li>Zagotuj zlewkę z wodą na płycie grzejnej i zanurz mieszaninę na 5 minut, 95 °C. Wyjąć zlewkę i stopniowo schłodzić cały zestaw w styropianowym pudełku O/N. Oligomery zostały wyżarzone i są gotowe do trawienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać odpowiednie enzymy restrykcyjne w celu oddzielnego trawienia wyżarzonych oligomerów (tj. określanych jako insert) i wektora gospodarza (tj. pET22b(+)) oddzielnie. Stosować według następującego przepisu (1-2 μg DNA, 2 μl każdego enzymu restrykcyjnego, 5 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego i woda do całkowitej ilości 50 μl mieszaniny) przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Wektor plazmidowy pET22b(+) jest oporny na antybiotyki ampicyliny i zawiera 6x-His znacznik na C-końcu. Znacznik 6x-His obecny w pET22b (+) pozwala nam użyć przeciwciał znakowanych przez Hisa do identyfikacji docelowego białka za pomocą western blotting w kroku 7.</li>
	<li>Dodaj 6x barwnik ładujący do każdej mieszanki mineralnej. Uruchom mieszaniny wytrawiające oddzielnie, w tym drabinkę DNA, na 1,2% żelach z agarozy DNA zawierających fluorescencyjne promieniowanie UV DNA przez 1 godzinę przy napięciu 100 V. Wizualizuj 1,2% żel agarozowy DNA za pomocą oświetlacza światła UV.</li>
	<li>Pokrój żel, aby wyekstrahować strawione produkty DNA za pomocą komercyjnych zestawów do oczyszczania żelu. Elutować przy użyciu minimalnej objętości kolumny, aby osiągnąć minimalne stężenie DNA 50-100 ng/μl.</li>
	<li>Połączyć interesujący gen sekwencyjnie, ligując strawioną wstawkę DNA (tj. powtórzenia elastyny lub domeny wiążące komórki uzyskane przez wyżarzanie DNA) do wektora plazmidowego za pomocą ligazy T4 przy użyciu następującej receptury: (2 μl wektora, 1 μl ligazy T4, 1,5 μl buforu ligacyjnego T4, x μl insertu, 10,5 x μl wody, co daje łącznie 15 μl mieszaniny). Mieszaninę do ligacji inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godz. 
	UWAGA: Stężenie molowe wektora do wstawienia powinno być zróżnicowane, aby zoptymalizować wydajność ligacji. Objętość insertu opisana w recepturze jako x zależy od stężenia eluowanego DNA z kroku 1.7.</li>
	<li>Rozmrozić chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α (lub dowolny szczep klonujący) na lodzie. Ogrzać 2xYT płytki agarowe (Tabela 1) zawierające ampicylinę (25 μg/ml) do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przekształć ogniwa za pomocą szoku cieplnego:
	<ol>
		<li>Porcjować 50 μl kompetentnych komórek do czystych, wstępnie schłodzonych mikroprobówek wirówkowych. Odpipetować 5 μl (między 100 pg a 100 ng) mieszaniny ligacyjnej do komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół w celu wymieszania. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 20 minut.</li>
		<li>Zanurzyć probówkę mikrowirówki zawierającą mieszaninę komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 2 minuty i ponownie umieścić na lodzie na 2 minuty. Skróć czas zanurzenia, aby zminimalizować uszkodzenia ogniw spowodowane przez ciepło.</li>
		<li>Dodać 500 μl pożywki SOC (tabela 1) do probówki do mikrowirówki i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozprowadzić 50 500 μl mieszaniny komórek/ligacji na płytce agarowej 2xYT, która została wstępnie podgrzana do temperatury słonecznej, zawierającej ampicylinę (25 μg/ml) i inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 37 °C O/N (12-16 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia pobierz kolonie DNA z płytki agarowej za pomocą czystych końcówek pipet. Hodować kolonie w 5 ml pożywki 2YT (Tabela 1) zawierającej ampicylinę (25 μg/ml) O/N w temperaturze 37 °C O/N (12-16 godzin) z wytrząsaniem (225 obr./min).</li>
	<li>Następnego dnia użyj zestawu do izolacji plazmidu, aby wyekstrahować plazmidy DNA dla każdej kolonii pobranej zgodnie z protokołem producenta. Odeluuj DNA za pomocą 50 μl wody.</li>
	<li>Przeprowadzić testowe trawienie enzymami restrykcyjnymi, stosując następującą recepturę: (5 μl DNA, 0,2 μl każdego enzymu restrykcyjnego, 1 μl 10x bufor enzymu restrykcyjnego i uzupełnić wodą, aby uzyskać łącznie 10 μl mieszaniny), inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w celu przesiewu kolonii, które prawdopodobnie zawierają wstawkę, i uruchomić na 1,2% żelu agarozowym DNA, jak w kroku 1.6. 
UWAGA: Po trawieniu, udana ligacja powinna skutkować powstaniem dwóch prążków, po jednym dla wektora i insertu, które odpowiadają ich odpowiedniej masie cząsteczkowej (ryc. 1).</li>
	<li>Wyślij prawdopodobne kolonie do sekwencjonowania DNA za pomocą starterów promotora T7 do przodu i do tyłu do komercyjnych sekwenatorów.</li>
</ol>
2. Przemiana rekombinowanego plazmidu w bakteryjnego gospodarza ekspresyjnego
<ol>
	<li>Z wyniku sekwencjonowania wybierz kolonię, która została pomyślnie zligowana i użyj plazmidu DNA do transformacji w gospodarza ekspresji E. coli.</li>
	<li>Rozmrozić szczep ekspresyjny E. coli (BL21(DE3)pLysS) na lodzie. W międzyczasie ciepłe płytki agarowe zawierające ampicylinę (25 μg/ml) i chloramfenikol (34 μg/ml) do RT. 
	UWAGA: Plazmid pLysS obecny w szczepie bakteryjnym BL21(DE3)pLysS zawiera gen oporności na chloramfenikol. Plazmid pLysS zawiera gen represorowy T7, który ulega konstytutywnej ekspresji w celu ograniczenia nieszczelnej ekspresji białka aECM. Chloramfenikol jest niezbędny do selekcji komórek bakteryjnych, które zawierają pLysS podczas hodowli.</li>
	<li>Powtórz krok 1.10, aby uzyskać przekształcone komórki E. coli, które są gotowe do ekspresji sztucznych białek. Owinąć płytki agarowe w Parafilm i przechowywać do góry nogami w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
</ol>
3. Bakteryjna ekspresja białek aECM
<ol>
	<li>Patrz Rysunek 2, wybierz kolonię z przekształconej płytki agarowej za pomocą końcówki pipety i zaszczepij w 10 ml sterylnego podłoża Terrific Broth (TB) (Tabela 1) zawierającego zarówno ampicylinę, jak i antybiotyki chloramfenikolowe w probówce. Inkubować tę kulturę starterową w temperaturze 37 °C o/N (12-16 godzin) z wytrząsaniem przy 225 obr./min.</li>
	<li>Przenieść 10 ml kultury starterowej do 1 l świeżej i sterylnej pożywki przeciw gruźlicy uzupełnionej tymi samymi antybiotykami w 3-litrowej kolbie Erlenmeyera. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min przez 2-3 godziny i obserwować, jak gęstość optyczna kultury (OD600) osiągnęła 0,6-0,8, pipetując 1 ml kultury do pustej kuwety w celu odczytu. Zaoszczędź 1 ml kultury przed indukcją w celu scharakteryzowania SDS-PAGE.
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć OD600 w hodowli komórkowej, przygotuj 1 fiolkę z pożywką TB w kuwecie do ślepego pomiaru. Oddzielnie przenieść 1 ml kultury z kolby hodowlanej do nowej pustej kuwety. Zmierzyć gęstość optyczną kultury za pomocą spektrofotometru w stosunku do ślepej próby kontrolnej przy absorbancji 600 nm.</li>
		<li>Zachować próbkę (do późniejszej analizy SDS-PAGE), przenosząc 1 ml próbki hodowlanej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty i zdekantować supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukować kulturę za pomocą izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min przez kolejne 4 godziny. Zachować 1 ml kultury na koniec indukcji po 4 godzinach w celu charakterystyki SDS-PAGE.</li>
	<li>Zebrać komórki, przenosząc kulturę do 1 litrowych butelek wirówkowych i odwirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, zważyć granulki komórek i ponownie zawiesić w buforze TEN (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) przy 0,5 g/ml.</li>
</ol>
4. Liza kultur bakteryjnych
<ol>
	<li>Zamrozić ponownie zawieszoną hodowlę komórkową w temperaturze -80 °C O/N. Zamrożoną kulturę komórkową rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej lub na lodzie w celu lizy komórek. Dodać 10 μg/ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy I), 10 μg/ml rybonukleazy A (RNazy I) i 50 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) podczas rozmrażania i homogenizować roztwór, powoli mieszając.</li>
	<li>Po rozmrożeniu wszystkich zawieszonych komórek dostosuj roztwór do pH 9,0, aby zwiększyć rozpuszczalność białek w wodzie12. Dodać kroplami 6 N NaOH, mieszając na lodzie, aby uzyskać jednorodną konsystencję. Liza przez rozdrobnienie ultradźwiękowe przez 20 minut na lodzie za pomocą płaskiej końcówki o średnicy 2 mm, impuls 5 sekund.</li>
	<li>Odwirować roztwór komórkowy o stężeniu 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej, pustej butelki i przechowywać w temperaturze 4 °C w celu późniejszego oczyszczenia.</li>
	<li>W międzyczasie ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą buforu TEN i ponownie zamrozić w temperaturze -80 °C. Aby zakończyć lizę komórek, powtórz proces zamrażania/rozmrażania i sonikacji do trzech razy. Zaoszczędź 20 μl lizatu komórkowego do charakterystyki SDS-PAGE.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie białek aECM za pomocą odwrotnego cyklu przejścia
<ol>
	<li>Zsortuj lizat komórkowy z kroku 4.3 i przystąp do oczyszczania białek aECM za pomocą ITC, podobnie jak w przypadku oczyszczania białek na bazie elastyny21. Cykle będą wykonywane w różnych temperaturach, które wynoszą odpowiednio 4 °C (określane jako "zimne") i 37 °C (określane jako "ciepłe").</li>
	<li>Podzielić lizat komórkowy na 50 ml butelki wirówkowe i odwirować przy 40 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Wygląd osadu komórkowego powinien być ciemnobrązowy i wyglądać na rzadki.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez pipetowanie, aby uzyskać czyste oddzielenie od osadu. Zebrać supernatant do czystych butelek wirówkowych i dodać NaCl do końcowego stężenia 1 M (maksymalnie do 3 M). Podgrzewać roztwór do temperatury 37 °C przez 2 godziny, wstrząsając z prędkością 225 obr./min. 
	UWAGA: Dodanie NaCl spowoduje przejście składnika elastyny aECM, powodując agregację. Supernatant zmieni kolor na mętny. Jeśli stężenie białka jest wystarczająco wysokie, po bokach butelki wirówki można zobaczyć białe, pieniste białko</li>.
	<li>Odwirować supernatant z kroku 5.3 przy 40 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Zdekantować supernatant. Rozdrobnić granulki za pomocą metalowej szpatułki i ponownie zawiesić kawałki osadów w lodowatej autoklalawowanej wodzie destylowanej (50 mg/ml), energicznie mieszając O/N w temperaturze 4 °C za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki. Osad powinien być całkowicie rozpuszczony.</li>
	<li>Powtórz kroki od 5.2 do 5.4 przez kolejne trzy do pięciu razy, aby uzyskać wyższą czystość białka.</li>
	<li>Po ostatnim cyklu oczyszczania odsolić roztwór białkowy, dializując go w wodzie destylowanej o temperaturze 4 °C. Roztwór białka należy dializować z wodą przez 2-3 dni ze zmianami w wodzie co 4 godziny lub 8 godzin w przypadku O/N. Zachowaj 20 μl oczyszczonego białka dla SDS-PAGE i liofilizuj resztę oczyszczonego białka i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.</li>
</ol>
6. Charakterystyka białek aECM za pomocą elektroforezy SDS-PAGE
<ol>
	<li>Przygotuj 12% żel SDS-PAGE (jeśli masa cząsteczkowa jest duża, użyj 8% żeli SDS-PAGE dla lepszej separacji). Dodać 2x bufor ładujący SDS do każdej próbki, podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C i badać próbki w żelu przez 1 godzinę przy napięciu 100 V lub do momentu, gdy drabinka białkowa odpowiadająca masie cząsteczkowej białka aECM osiągnie środek żelu.</li>
	<li>Pobierz żel z zestawu SDS-PAGE i dodaj barwnik Coomassie Brilliant Blue (Tabela 2) z objętością, aby zanurzyć żel na 1 godzinę na szalce Petriego. Płucz żel w roztworze odbarwiającym (Tabela 2) przez 5 minut na bujaku. Zmień roztwór odbarwiający i kontynuuj odbarwianie żelu z kołysaniem, aż tło żelu stanie się czyste. Pasma białkowe powinny być wyraźnie widoczne.</li>
	<li>Porównaj położenie białka docelowego z drabinką białkową, aby określić masę cząsteczkową białka docelowego.</li>
	<li>Aby dodatkowo potwierdzić obecność białka docelowego, wykonaj western blotting, jak w kroku 7.</li>
</ol>
7. Charakterystyka białek aECM za pomocą Western Blotting
<ol>
	<li>Próbki należy umieścić w 12% żelu SDS-PAGE, jak w rozdziale 6, bez barwienia.</li>
	<li>Przytnij membranę nitrocelulozową do rozmiaru nieco większego niż żel SDS-PAGE. Wytnij 4 kawałki bibuły filtracyjnej do tego samego rozmiaru.</li>
	<li>Zwilż jeden kawałek bibuły filtracyjnej buforem Western Transfer Buffer (20% v/v metanolu, 25 mM Tris, 190 mM glicyny, pH 8,3), umieść żel SDS-PAGE na bibule filtracyjnej, a następnie kolejny kawałek bibuły filtracyjnej, następnie membranę nitrocelulozową i ostatnie dwa pozostałe kawałki bibuły filtracyjnej. Upewnij się, że cała konfiguracja jest zanurzona w wystarczającym zachodnim buforze transferowym. 
	UWAGA: Żel i membrana nie powinny się stykać w tym momencie, ponieważ białka mogą związać się z błoną w kontakcie.</li>
	<li>Przenieś białka na membranę nitrocelulozową, umieszczając dwie bibuły filtracyjne w zachodniej półsuchej jednostce transferowej, a następnie membranę nitrocelulozową i ostrożnie umieść żel SDS-PAGE wewnątrz i na membranie, na koniec umieść dwie ostatnie mokre bibuły filtracyjne na żelu SDS-PAGE. Uruchom zachodni transfer na 45 mA, 30 min. Dodaj bufor, jeśli napięcie jest wyższe niż 30 V. 
	UWAGA: Najlepiej umieścić żel SDS-PAGE na membranie za jednym razem i unikać niepotrzebnego przesuwania żelu po membranie, ponieważ białka mogą związać się z membraną w kontakcie.</li>
	<li>Pobrać i zablokować membranę nitrocelulozową roztworem blokującym (5% beztłuszczowe mleko o PBS pH 7,4, przefiltrowane bibułą filtracyjną) na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący i dodać PBS do płukania. 
	UWAGA: Zmień rękawice na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia błony niepożądanymi białkami.</li>
	<li>Inkubować pierwszorzędowe przeciwciało anty-He z rozcieńczeniem w PBS w stosunku 1:1,000 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z kołysaniem. Przygotować mieszaninę w objętości, która mogłaby zanurzyć całą membranę, na przykład w stosunku rozcieńczenia 1:1000, dodać 1 μl przeciwciała (stężenie podstawowe: 1 mg/ml) do 999 μl PBS na 1 ml mieszaniny całkowitej.</li>
	<li>Przepłukać membranę 5 ml PBST (PBS z 0,1% Tween20).</li>
	<li>Inkubować z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) z rozcieńczeniem w PBS w stosunku 1:5 000 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z kołysaniem. Przygotować mieszaninę w objętości, która mogłaby zanurzyć całą membranę, na przykład w stosunku rozcieńczenia 1:5 000, dodać 1 μl przeciwciała (stężenie podstawowe: 1 mg/ml) do 4,999 μl PBS na 5 ml całkowitej mieszaniny.</li>
	<li>Umyć membranę 5 ml PBST i powtórzyć dwukrotnie.</li>
	<li>Nałóż substrat chemiluminescencyjny na membranę z objętością pokrywającą membranę i inkubuj, postępując zgodnie z instrukcjami dla użytego substratu. 
	UWAGA: Czułość substratu na wykrywanie białek może się różnić, zalecamy substrat o maksymalnej czułości dla bardzo niskich sygnałów w przypadku, gdy wzrost stężenia przeciwciał nie zwiększa sygnałów.</li>
	<li>Uchwyć sygnały chemiluminescencyjne za pomocą imagera opartego na kamerze CCD. Dostosuj stosunek rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, jeśli sygnały są słabe i nieswoiste. Inkubować dłużej w roztworze blokującym, jeśli sygnał tła jest wysoki.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastomeric+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastomeric biomaterials for tissue engineering.</a> Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).</li>
<li>Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+tissue+engineering+-+In+vivo+and+in+vitro+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).</li>
<li>Kushner, A. M., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+Design+in+Natural+and+Biomimetic+Soft+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).</li>
<li>Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+protein-based+biomaterials+for+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Designing protein-based biomaterials for medical applications.</a> Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).</li>
<li>Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+genetically+engineered+proteins+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering.</a> Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).</li>
<li>Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein scaffolds for tissue engineering.</a> Biomedical Materials. 7 (1), 012002(2012).</li>
<li>MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+tissue+engineering+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for tissue engineering of skin.</a> Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).</li>
<li>Fong, E., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+Cell+Migration+on+Artificial+Extracellular+Matrix+Proteins+Containing+Full-Length+Fibronectin+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains.</a> Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).</li>
<li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIOMATERIALS%3A+Where+We+Have+Been+and+Where+We+are+Going%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).</li>
<li>Cai, L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+ECM-mimetic+materials+using+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Designing ECM-mimetic materials using protein engineering.</a> Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).</li>
<li>Annabi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastomeric+recombinant+protein-based+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Elastomeric recombinant protein-based biomaterials.</a> Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).</li>
<li>Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+adhesion+to+the+fibronectin+CS5+domain+in+artificial+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins.</a> Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).</li>
<li>Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+and+Biotechnological+Applications+of+Elastin-Like+Polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides.</a> Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).</li>
<li>Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Epidermal+Keratinocyte+Cell+Response+on+Integrin-Specific+Artificial+Extracellular+Matrix+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).</li>
<li>MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+opportunities+for+tissue-engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and opportunities for tissue-engineered skin.</a> Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).</li>
<li>Kariya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+cellular+adhesion+and+migration+by+recombinant+laminin-5+forms+with+partial+deletion+or+mutation+within+the+G3+domain+of+%CE%B13+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain.</a> J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).</li>
<li>Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+LG3+module+of+laminin-5+harbors+a+binding+site+for+integrin+%CE%B13%CE%921+that+promotes+cell+adhesion%2C+spreading%2C+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration.</a> J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).</li>
<li>Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+polypeptides+as+a+purification+tag+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).</li>
<li>Keeley, F. Ch. 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeeley%2C+F+%22Evolution+of+Extracellular+Matrix.Biology+of+Extracellular+Matrix%22">Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).</li>
<li>Le, D. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+of+Elastin-Mimetic+Double+Hydrophobic+Polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides.</a> Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).</li>
<li>MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-chromatographic+Purification+of+Recombinant+Elastin-like+Polypeptides+and+their+Fusions+with+Peptides+and+Proteins+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583(2014).</li>
<li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation%3A+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Inżynieria białek rekombinowanych to wszechstronna technika tworzenia nowych materiałów białkowych przy użyciu podejścia oddolnego. Materiały na bazie białek mogą być zaprojektowane tak, aby miały wiele funkcji, dostosowanych do danego zastosowania. Ze względu na rosnący postęp w technologiach klonowania i ekspresji białek, tworzenie różnorodnych sztucznych białek w powtarzalny i skalowalny sposób stało się stosunkowo proste (i opłacalne). Domena podobna do elastyny została włączona do wielu sztucznych białek, aby służyć...

Przez kilka dziesięcioleci zarówno syntetyczne, jak i naturalne materiały były badane pod kątem wykorzystania jako rusztowania w inżynierii tkankowej1,2. Podczas gdy materiały syntetyczne, takie jak polimery, oferują doskonałą integralność strukturalną i regulowane właściwości mechaniczne, często mają niewystarczającą bioaktywność, aby sprzyjać wzrostowi i infiltracji tkanek. Z drugiej strony, naturalne materiały, takie jak białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), mają doskonałą aktywność biologiczną, ale mają ograniczenia, takie jak zmienność między partiami, szybka degradacja i problemy z immunogennością. W związku z tym pożądane są białka rekombinowane, ponieważ można je zaprojektować tak, aby naśladowały tylko pożądane właściwości białek natywnych3,4.
Inżynieria białek rekombinowanych wzbudziła szerokie zainteresowanie jako wszechstronna platforma do projektowania i produkcji nowych biopolimerów białek sztucznych. Kontrolując sekwencję genetyczną, funkcje sztucznych białek można dostosować do szerokiej gamy zastosowań5,6. W szczególności białka sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) można dostosować tak, aby miały wiele funkcji do zastosowań w inżynierii tkankowej, regeneracji i gojeniu ran2,7. Co ważniejsze, postępy w technologiach klonowania i oczyszczania znacznie zwiększyły skalowalność i znacznie obniżyły koszty produkcji białek rekombinowanych. Możliwe jest wytwarzanie dużych ilości białek rekombinowanych przy niskich kosztach produkcji, które są ekonomiczne do stosowania w klinice5. 
Sztuczne białka macierzy zewnątrzkomórkowej zostały opracowane do zastosowań w inżynierii tkankowej8-11. Na przykład Tirrell i wsp. zaprojektowali przeszczep naczyniowy o małej średnicy, wykorzystując sztuczne białka zawierające sekwencję CS5 fibronektyny i powtórzenia podobne do elastyny (ELP-CS5). Wykazali, że ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są w stanie przylegać i rosnąć na tych materiałach12. Inni włączyli również krótkie sekwencje bioaktywne pobrane z fibronektyny, kolagenu, lamininy, fibrynogenu i witronektyny, a także domen strukturalnych, które naśladują elastynę, pajęczą nić i kolageny, aby stworzyć różnorodne białka fuzyjne10. Usieciowane folie wykonane z białek aECM na bazie elastyny wykazywały również właściwości mechaniczne podobne do natywnej elastyny (moduły sprężystości wahają się w zakresie 0,3-0,6 MPa)13. Następnie stwierdzono również, że białka aECM zawierające dłuższe fragmenty fibronektyny przyspieszają gojenie się ran in vitro ze względu na zwiększone powinowactwo wiązania integryn8. 
Ostatnio, Tjin i jegowspółpracownicy opracowali sztuczne białka ECM specyficzne dla integryny. Każde białko aECM zawiera bioaktywną domenę wiążącą komórki pobraną ze składników ECM rodzimej ludzkiej skóry2,7,15, takich jak laminina-5, kolagen-IV i fibronektyna. Na przykład wykazano, że integryna α3Β1 wiąże sekwencję PPFLMLLKGSTR znajdującą się w domenie kulistej 3 łańcucha lamininy-5 alfa-3 (LG3)16,17. W swoim raporcie wykazali, że pierwotne keratynocyty naskórkowe ludzkiej skóry preferencyjnie angażują różne integryny do wiązania się z każdym z białek aECM, w zależności od rodzaju obecnej domeny wiążącej komórki.
Białka aECM omówione w pracy Tjin et al. zawierają flankujące domeny podobne do elastyny {(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8, które nadają elastyczność naśladującą mechaniczne właściwości ludzkiej skóry. Ponadto włączenie reszt lizyny do powtórzeń podobnych do elastyny zwiększa również ogólną rozpuszczalność białek w rozpuszczalnikach wodnych. Ponadto reszty lizyny służą również jako miejsca sieciowania, ułatwiając tworzenie usieciowanych warstw aECM12. Włączenie powtórzeń podobnych do elastyny do sekwencji białka aECM umożliwia łatwe oczyszczanie białek za pomocą odwrotnego cyklu przejścia (ITC)14. Elastyny ulegają ostrej i odwracalnej przemianie fazowej w określonej temperaturze znanej jako dolna krytyczna temperatura roztworu (LCST) lub odwrotna temperatura przejścia (TT)18-20. Elastyny i powtórzenia podobne do elastyny przyjmują hydrofilowe losowe konformacje cewki poniżej ich LCST i stają się rozpuszczalne w wodzie, podczas gdy powyżej ich LCST elastyny szybko agregują się w cząstki wielkości mikronów. Takie przemiany fazowe są odwracalne, a zatem można je wykorzystać, aby umożliwić łatwe oczyszczanie białek aECM na bazie elastyny za pomocą techniki ITC21.
W tej pracy opisujemy uogólnioną procedurę projektowania, konstruowania i oczyszczania sztucznych białek ECM zawierających bioaktywne domeny wiążące komórki, połączone z powtórzeniami podobnymi do elastyny. Opisano proces projektowania i klonowania plazmidów, które kodują sekwencje aminokwasowe dla białek aECM. Przedstawiono etapy oczyszczania białek aECM za pomocą ITC. Na koniec omówiono metody oznaczania czystości białek aECM otrzymanych za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i Western Blotting.

<table><tbody><tr><td>Wektory ekspresyjne pET22b (+)</td><td>Novagen</td><td>69744</td><td>T7 z opornością na ampicylinę&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C6060-03</td><td>dodatkowe antybiotyki - chloramfenikol</td></tr><tr><td>Izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>1 M roztwór podstawowy z autoklawowaną wodą, świeży przed indukcją.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td> zestaw <td>do izolacji plazmidu</td></tr><tr><td>Ligaza T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Affymetrix</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Affymetrix</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean&trade; żelowy zestaw do odzyskiwania DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>XL10-złoty szczep</td><td>Agilent Technologies</td><td>200315</td><td></td></tr></tbody></table>

projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aecm) z escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Technologia rekombinowana to wszechstronna platforma do tworzenia nowatorskich sztucznych białek o regulowanych właściwościach. W ciągu ostatniej dekady opisano wiele sztucznych białek, które zawierały funkcjonalne domeny pochodzące z natury (lub stworzone de novo). W szczególności opracowano białka sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM); te białka aECM składają się z domen biologicznych pobranych z fibronektyny, lamininy i kolagenu i są połączone z domenami strukturalnymi, w tym powtórzeniami podobnymi do elastyny, powtórzeniami jedwabiu i kolagenu. Do tej pory białka aECM były szeroko badane pod kątem zastosowań w inżynierii tkankowej i gojeniu ran. Niedawno Tjin i jego współpracownicy opracowali specyficzne dla integryny białka aECM, przeznaczone do promowania przyłączania i propagacji keratynocytów ludzkiej skóry. W swojej pracy białka aECM zawierają domeny wiążące komórki pobrane z fibronektyny, lamininy-5 i kolagenu IV, a także flankujące powtórzenia podobne do elastyny. Wykazali, że białka aECM opracowane w ramach ich prac są obiecującymi kandydatami do zastosowania jako substraty w sztucznej skórze. W tym miejscu przedstawiamy projekt i budowę takich białek aECM, a także proces ich oczyszczania z wykorzystaniem termoczułych właściwości elastyny.

Projektując białka fuzyjne zawierające powtórzenia elastynopodobne, ważne jest zachowanie całkowitej zawartości elastyny w odpowiednio dużym ułamku białka fuzyjnego18. Ma to na celu zapewnienie, aby konstrukt białka fuzyjnego zachował swoje właściwości elastynopodobne, co umożliwia zastosowanie ITC do jego oczyszczania. Projekt i sekwencje białek aECM opisane w tej sekcji zostały zaczerpnięte bezpośrednio z pracy Tjin et al.14. W tej pracy trzy białka aECM zostały pomyślnie sklonow...

Technologie rekombinowane umożliwiły projektantom materiałów tworzenie nowatorskich sztucznych białek z dostosowanymi funkcjami do zastosowań inżynierii tkankowej. Na przykład sztuczne białka macierzy zewnątrzkomórkowej można zaprojektować tak, aby zawierały domeny strukturalne i biologiczne pochodzące z natywnych ECM. W tym miejscu opisujemy budowę i oczyszczanie białek aECM zawierających powtórzenia podobne do elastyny.

Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie etapów związanych z konstrukcją i produkcją sztucznych białek ECM lub A ECM zawierających powtórzenia elastynopodobne. Jest to realizowane poprzez wstępne skonstruowanie genów rekombinowanych kodujących białka A ECM, a następnie wprowadzenie tych genów rekombinowanych do gospodarzy bakteryjnych.Na tym etapie białka rekombinowane są ekspresowane w gospodarzach bakteryjnych, a następnie odzyskiwane po ekstrakcji białek poprzez lizę komórek. Ostatnim krokiem jest oczyszczenie białek za pomocą cyklicznego odwrócenia przejścia fazowego (inverse transition cycling, ITC), co wykorzystuje unikalne zachowanie przejścia fazowego polipeptydów elastyny.Cykle wirowania przeprowadzane są w temperaturze 4°C oraz 37°C. Ostatecznie, w celu identyfikacji białek rekombinowanych i określenia ich czystości, stosuje się techniki elektroforezy w żelu oraz western blot. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami, takimi jak kolumny powinowactwa, jest możliwość stosunkowo taniego wyizolowania dużej ilości białek.Rozpocznij tę procedurę, projektując wszystkie liganty zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po otrzymaniu oligomerów, przeprowadź anilowanie oligomerów DNA w celu uzyskania pożądanej sekwencji genu. Najpierw rozpuść oligonukleotydy DNA w buforze do oligonukleotydów DNA do końcowego stężenia 1 µg/µL.Dodaj 4 µL każdego oligonukleotydu do 32 µL DNA i buforu do wyżarzania, aby uzyskać mieszaninę o całkowitej objętości 40 µL. Następnie zagotuj zlewkę z wodą na płytce grzejnej i zanurz w niej mieszaninę na pięć minut. Po osiągnięciu 95 °C wyjmij zlewkę i stopniowo schładzaj cały układ w pudełku styropianowym przez noc; oligomery zostały w ten sposób wyżarzone i są gotowe do trawienia.Dodaj odpowiednie enzymy restrykcyjne, aby osobno przeprowadzić trawienie oligomerów al oraz wektorów gospodarza, zgodnie z opisem w sekcji Protocol. Inkubuj przez trzy do czterech godzin w temperaturze 37°C. Po rozdziale produktów trawienia w żelu agarozowym i oczyszczeniu DNA, połącz gen zainteresowania, ligując trawiony insert DNA do wektora plazmidowego za pomocą ligazy T4. Stosując recepturę zawartą w sekcji Protocol, inkubuj mieszaninę ligacyjną w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Następnie przeprowadź transformację komórek metodą szoku termicznego. Odmierz 50 µL kompetentnych komórek do czystych, uprzednio schłodzonych probówek do mikrocentryfugi. Pipetą przenieś 5 µL mieszaniny ligacyjnej do komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół w celu wymieszania.Pozostaw mieszaninę na lodzie przez 20 minut. Następnie zanurz probówkę do mikrocentryfugi zawierającą mieszaninę komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na dwie minuty i ponownie umieść na lodzie na dwie minuty. Dodaj 500 µL pożywki SOC do probówki do mikrocentryfugi i inkubuj w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez jedną godzinę.Po inkubacji nanieś od 50 do 500 µL mieszaniny ligacji komórek na płytkę agarową 2×YT z ampicyliną, uprzednio ogrzaną do temperatury pokojowej. Inkubuj płytki odwrócone dnem do góry w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia wybierz kolonie DNA z płytki agarowej, używając czystych końcówek do pipet.Hodować kolonie przez noc w 37 °C z wytrząsaniem w 5 ml podłoża 2× YT zawierającego ampicylinę. Następnego dnia, zgodnie z protokołem producenta, użyć zestawu do izolacji plazmidów w celu wyekstrahowania plazmidów DNA z każdej kolonii.Odwirowano eluat, czyli DNA z 50 µL wody, po transformacji rekombinowanego plazmidu do bakteryjnego gospodarza ekspresyjnego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą końcówki pipety pobrano kolonię z przekształconej płytki agarowej i zaszczepiono ją do probówki zawierającej 10 mL sterylnego bulionu Terrific Broth lub pożywki TB z dodatkiem antybiotyków ampicyliny i chlorampenikolu.Inkubować tę kulturę startową w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem przy 225 RPM. Następnie przenieść 10 ml kultury startowej do jednego litra świeżego i sterylnego medium TB, uzupełnionego o te same antybiotyki, do kolby Erlenmeyera o pojemności trzech litrów.Inkubować hodowlę w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 RPM przez dwie do trzech godzin. Pomiar gęstości optycznej hodowli przy 600 nm (OD 600) w celu potwierdzenia osiągnięcia wartości od 0,6 do 0,8 należy przeprowadzić, pipetując 1 mL hodowli do pustej kuwety. Następnie indukowanie hodowlę IPTG do stężenia końcowego 1 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 225 RPM przez kolejne cztery godziny.Zmieć komórki, przenosząc kulturę do butelek do wirówki o pojemności jednego litra, a następnie wiruj przy 12 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odlaniu supernatantu zważ osady komórkowe i zawieś je ponownie w buforze 10 w stężeniu 0,5 g/ml. Zamroź zawiesinę komórkową w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na noc.Następnego dnia rozmrozić zamrożoną kulturę komórek w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej lub na lodzie. Do komórek dodać deoxyribonuclease I, ribonuclease A oraz phenylmethylsulfonyl fluoride. Podczas rozmrażania homogenizować roztwór, powoli go mieszając.Po rozmrożeniu wszystkich resuspendowanych komórek, bardzo ostrożnie dostosuj pH roztworu do wartości 9,0, aby zwiększyć rozpuszczalność białek w wodzie. Dodawaj kroplami 6 N wodorotlenek sodu, mieszając na lodzie do uzyskania jednorodnej konsystencji. Następnie poddaj komórki lizie poprzez dezintegrację ultradźwiękową przez 20 minut na lodzie, używając płaskiej końcówki o średnicy 2 mm i impulsu trwającego 5 sekund.Wiruj zawiesinę komórkową z prędkością 12 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś nadsącz do czystej, pustej butelki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszej puryfikacji. W międzyczasie ponownie resuspenduj osad komórkowy w 10 buforze i odstaw 20 µl lizatu komórkowego.W celu charakterystyki metodą SDS-PAGE, ponownie zamroź zawiesinę granulatu komórkowego w temperaturze -80 °C, aby całkowicie przeprowadzić lizę komórek. Powtórz proces zamrażania, rozmrażania i sonikacji do trzech razy. Zbierz uzyskany lizat komórkowy i przystąp do oczyszczania białek A ECM przy użyciu ITC, w którym cykle wirowania są przeprowadzane w różnych temperaturach w warunkach wysokiego zasolenia.Rozdziel lizat komórkowy do butelek wirówkowych o pojemności 50 ml i wiruj przy 40 000 G przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Usuń nadsącz za pomocą pipety, aby uzyskać wyraźne oddzielenie od osadu. Zbierz nadsącz do czystych butelek wirówkowych i dodaj chlorek sodu do stężenia końcowego 1 M.Podgrzewaj roztwór do 37 °C przez dwie godziny, wytrząsając go z prędkością 225 RPM. Następnie odwiruj nadlew w temperaturze 37 °C przez dwie godziny przy 40 000 Gs.Po zlaniu nadsączu, zgniata się osad za pomocą metalnej szpatułki, a następnie zawiesza fragmenty osadu w lodowatej wodzie destylowanej z autoklawu, mieszając intensywnie przez noc w temperaturze 4°C przy użyciu mieszadła magnetycznego i płyty grzejno-mieszającej, aż osad całkowicie się rozpuści. Cykle te powtarza się do momentu, gdy osad w temperaturze 37°C stanie się biały; wtedy można go rozpuścić w wodzie przez noc i poddać wirowaniu.Aby otrzymać roztwór białka, należy odsolić roztwór białka poprzez dializę przeciwko wodzie destylowanejj w temperaturze 4 °C, wymieniając wodę co cztery godziny lub co osiem godzin w przypadku dializy nocnej, przez dwa do trzech dni; wcześniej należy odłożyć 20 µL oczyszczonego białka do analizy SDS-PAGE. Pozostałą część oczyszczonego białka liofilizuje się w sposób pokazany tutaj. W próbce indukowanej widoczny jest intensywny prążek białkowy o przewidywanej masie cząsteczkowej. Przedstawiono również żel SDS-PAGE zawierający próbkę oczyszczonego białka o masie cząsteczkowej 22 kDa, odpowiadającą ECM lamininy 5A.Szacowana czystość białek A ECM wynosi około 90 do 95%. Wartość ta została wyznaczona poprzez porównanie stosunków intensywności prążków białka docelowego oraz innych prążków białkowych obecnych na żelu SDS. W celu potwierdzenia, że oczyszczone białka są rzeczywiście białkami A ECM, przeprowadzono analizę Western blot. Czystość białkową trzech białek A ECM przedstawiono na żelu SDS-PAGE i porównano z obrazem membrany nitrocelulozowej po analizie Western blot.Analiza wykazuje obecność docelowych białek collagen four A ECM oraz laminate five A ECM, znakowanych przeciwciałami przeciwko znacznikowi heksa-histydynowemu sprzężonym z peroksydazą chrzanową. Końcowe wydajności białek A ECM wynosiły od 60 milligrams per liter do 120 milligrams per liter. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak konstruować i oczyszczać białka zawierające domeny lekkie elastyny w zależności od konkretnego zastosowania.

design-construction-artificial-extracellular-matrix-aecm-proteins

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje procedurę wytwarzania mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą elektrorozpylania. Te mikronośniki symulują natywne mikrośrodowisko specyficzne dla tkanek i są stabilne w długoterminowych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro.

Wytwarzanie rusztowań biologicznych przez elektronatryskiwanie: technika generowania rusztowań mikronośnikowych pochodzących z zewnątrzkomórkowej macierzy tkanki pozbawionej komórek

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Poznaj metodę konstrukcji i oczyszczania sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej z powtórzeniami elastynopodobnymi z Escherichia coli. Technika ta umożliwia tanie pozyskiwanie dużych ilości białek do inżynierii tkankowej.

Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Przeglądaj więcej filmów