Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie etapów związanych z budową i produkcją sztucznych białek ECM lub powtórzeń podobnych do elastyny ECM zawierających elastynę. Osiąga się to poprzez najpierw skonstruowanie rekombinowanych genów, które kodują białka A ECM. Następnie rekombinowane geny są wprowadzane do gospodarzy bakteryjnych.

W tym momencie rekombinowane białka ulegają ekspresji w gospodarzach bakteryjnych, a następnie są zbierane po ekstrakcji białek w procesie lizy komórek. Ostatnim krokiem jest oczyszczenie białek za pomocą odwrotnego cyklu przejścia lub ITC, który wykorzystuje unikalne zachowanie elastyny w zakresie przemian fazowych. Jak polipeptydy.

Cykle wirowania odbywają się w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 37 stopni Celsjusza. Ostatecznie elektroforeza żelowa i techniki western blot są stosowane do identyfikacji rekombinowanych białek i określenia ich czystości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kolumny powinowactwa, jest to, że możemy stosunkowo tanio wyekstrahować dużą ilość białek.

Rozpocznij tę procedurę od całego projektu więzadła zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po uzyskaniu oligomerów należy anil oligomery DNA, aby uzyskać pożądaną sekwencję genu. Najpierw rozpuszcza oligonukleotydy DNA w buforze oligonukleotydów DNA do końcowego stężenia jednego mikrograma na mikrolitr.

Dodaj cztery mikrolitry każdego więzadła do 32 mikrolitrów DNA i bufora klęczącego, aby uzyskać łączną mieszaninę 40 mikrolitrów. Następnie zagotuj zlewkę z wodą na gorącej płycie i zanurz mieszaninę na pięć minut. W temperaturze 95 stopni Celsjusza wyjmij zlewkę i stopniowo schładzaj cały zestaw w styropianowym pudełku przez noc, oligomery są teraz w stanie klęczącym i są gotowe do strawienia.

Dodaj odpowiednie enzymy restrykcyjne, aby oddzielnie trawić oligomery al i wektory gospodarza, jak opisano w tekście Protocol Digest przez trzy do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po umieszczeniu produktów trawienia w żelu agarozowym i oczyszczeniu DNA, połącz kolejno interesujący nas gen poprzez ligowanie strawionego DNA do wektora plazmidowego z ligazą T cztery. Korzystając z przepisu znajdującego się w protokole tekstowym, inkubuj mieszaninę ligacji w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Następnie przekształć ogniwa za pomocą szoku cieplnego przez Ali. Podawanie 50 mikrolitrów kompetentnych komórek do czystych, wstępnie schłodzonych mikroprobówek wirówkowych. Odpipetować pięć mikrolitrów mieszaniny ligacji do komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby wymieszać.

Pozostaw mieszaninę na lodzie na 20 minut. Następnie zanurz probówkę mikrowirówki zawierającą mieszaninę komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza na dwie minuty i wróć do lodu na dwie minuty. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki SOC do probówki mikrowirówki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez godzinę.

Po inkubacji rozprowadzić od 50 do 500 mikrolitrów mieszaniny ligacji komórek na dwukrotnie większej płytce ślimakowej YT zawierającej ampicylinę, która została wstępnie podgrzana do temperatury pokojowej. Inkubuj płytki do góry nogami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia pobierz kolonie DNA z płytki ślimaka za pomocą czystych końcówek pipet.

Hoduj kolonie w pięciu mililitrach dwa razy. Pożywki YT zawierające ampicylinę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc z wstrząsaniem następnego dnia. Użyj zestawu do izolacji plazmidu zgodnie z protokołem producenta, aby wyekstrahować plazmidy DNA dla każdej kolonii.

Wybrane elucję DNA z 50 mikrolitrami wody po przekształceniu rekombinowanego plazmidu w bakteryjnego gospodarza ekspresyjnego, jak opisano w protokole tekstowym. Wybierz kolonię z przekształconej płytki ślimakowej za pomocą zaszczepiania końcówką pipety. 10 mililitrów sterylnego, wspaniałego bulionu lub pożywki gruźliczej zawierającej zarówno antybiotyki ampicylinę, jak i chloramfenikol w probówce.

Inkubuj tę kulturę starterową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wstrząsając z prędkością 225 obr./min. Następnie przenieś 10 mililitrów kultury starterowej do jednego litra świeżej i sterylnej pożywki przeciw gruźlicy. Uzupełniony tymi samymi antybiotykami w trzylitrowej kolbie Erlina Meyera.

Inkubować kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając w temperaturze 225 RRP M przez dwie do trzech godzin. Obserwuj gęstość optyczną kultury przy 600 nanometrach lub OD 600, aby potwierdzić, że osiągnęła 0,6 do 0,8, pipetując jeden mililitr kultury do pustego Q vet w celu odczytu. Następnie indukować kulturę za pomocą IPTG do końcowego stężenia jednego milimola i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 225 obr./min przez kolejne cztery godziny.

Zbierz komórki, przenosząc kulturę do litrowej wirówki, butelek i odwirowując w temperaturze 12 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu zważyć osadki komórek i ponownie zawiesić w buforze 10 w stężeniu 0,5 grama na mililitr. Zamrozić zawieszoną hodowlę komórkową w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia rozmrozić zamrożoną kulturę komórkową w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej lub na lodzie. Do L komórki dodają deoksyrybonukleazę, jedną rybonukleazę A i fluorek fenylometylosuenu. Podczas rozmrażania roztworu homogenizuj roztwór, powoli mieszając.

Po rozmrożeniu wszystkich zawieszonych komórek bardzo ostrożnie dostosuj roztwór do pH 9,0, aby zwiększyć rozpuszczalność białek w wodzie. Dodawanie sześciu N wodorotlenku sodu kroplami, mieszając na lodzie, aby uzyskać jednorodną konsystencję. Następnie przez 20 minut na lodzie należy rozdrabniać komórki za pomocą ultradźwięków, używając płaskiej końcówki o średnicy dwóch milimetrów i pięciosekundowego impulsu.

Odwirować roztwór komórek o sile 12 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś supernat do czystej, pustej butelki i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu późniejszego oczyszczenia. W międzyczasie ponownie zawieś osad komórkowy za pomocą buforu 10 i zaoszczędź 20 mikrolitrów lizatu komórkowego.

W celu scharakteryzowania strony SDS ponownie zamrozić zawieszony osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby zakończyć lizę komórek. Powtórz proces zamrażania, rozmrażania i sonikacji do trzech razy. Zsortuj lizat komórkowy z wcześniejszego i przystąp do oczyszczania białek A ECM za pomocą ITC, w którym cykle wirowania są przeprowadzane w różnych temperaturach w warunkach wysokiej soli.

Podziel lizat komórkowy na 50-mililitrową wirówkę, butelki i odwiruj w temperaturze 40 000 G przez dwie godziny w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant przez pipetowanie, aby uzyskać czyste oddzielenie od osadu. Zebrać sklarowany nad osadem do czystych butelek wirówkowych i dodać chlorek sodu do końcowego stężenia jednego molowca.

Podgrzej roztwór do 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, wstrząsając przy 225 obr./min. Następna wirówka. Supernatant w temperaturze 40 000 G przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po dekantacji supernatant kruszy osad za pomocą metalowej szpatułki i ponownie zawiesza kawałki osadu w lodzie. Zimną wodę destylowaną w autoklawie energicznie mieszając przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki, aż do całkowitego rozpuszczenia granulki. Powtarzaj te cykle, aż osadek w temperaturze 37 stopni Celsjusza stanie się biały, po czym można go rozpuścić w wodzie przez noc i odwirować.

Aby uzyskać roztwór białka, odsolić roztwór białka, dializując go w wodzie destylowanej o temperaturze czterech stopni Celsjusza, zmieniając wodę co cztery godziny lub osiem godzin przez noc przez dwa do trzech dni po zaoszczędzeniu 20 mikrolitrów oczyszczonego białka na stronie SDS Liofilizuj resztę oczyszczonego białka, jak pokazano tutaj. Intensywne pasmo białkowe znajduje się na przewidywanej masie cząsteczkowej w indukowanej próbce. Pokazano również żel na stronie SDS zawierający oczyszczoną próbkę białka o masie cząsteczkowej 22 kilodaltonów odpowiadającej lamininie pięciu A ECM.

Szacowana czystość białek A ECM wynosi około 90 do 95%Wartość tę uzyskano przez porównanie stosunków intensywności pasma białka docelowego i innych prążków białkowych obecnych w żelu SDS. Wreszcie, aby ustalić, czy oczyszczone białko było rzeczywiście białkiem A ECM, przeprowadzono tutaj Western blot. Czystość białek trzech białek A ECM jest pokazana za pomocą żelu strony SDS i porównana z obrazem błony nitrocelulozowej dla western blotting.

Analiza ujawnia obecność docelowych białek kolagenu czterech A ECM i laminatu pięciu A ECM znakowanych za pomocą przeciwciał znacznika anty hexa histydyny sprzężonych z peroksydazą chrzanu. Ostateczna wydajność białek A ECM wahała się od 60 miligramów na litr do 120 miligramów na litr. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kurczyć i oczyszczać białka zawierające domeny światła elastyny do konkretnego zastosowania.