Name: Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę iniekcji domięśniowych wzdłuż płytek końcowych silnika w celu zwiększenia efektywności retrogradnego transportu znaczników do neuronów ruchowych rdzenia kręgowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant projektu National Health & Medical Research Centre (NHMRC) dla R.M.

Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne były zgodne z Komisją ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki UNSW Australia i zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach. Wszystkie procedury przewidziane w niniejszym protokole powinny być wykonywane zgodnie z wymogami odpowiedniej Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki.
1. Barwienie histochemiczne acetylocholinoesterazy
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej acetylocholinoesterazy
	<ol>
		<li>Dodać 290 mg jodku acetylotiocholiny do 200 ml 0,1 M buforu fosforanowego (PB). Wymieszać mieszadłem magnetycznym przy 900 obr./min.</li>
		<li>Dodać 600 mg glicyny przy ciągłym mieszaniu.</li>
		<li>Powoli dodawać 420 mg siarczanu miedzi do mieszaniny reakcyjnej, ciągle mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia produktu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć skórę z tuszy zwierzęcej (uzyskaną poprzez dzielenie się tkankami), wykonując nacięcia w skórze perfundowanego szczura lub myszy, chwytając skórę od okolicy szyi i przeciągając ją obok stóp. Upewnij się, że powięź pokrywająca każdy mięsień jest usunięta lub znacznie perforowana, aby zapewnić wystarczającą ekspozycję włókien mięśniowych na roztwór reakcyjny.</li>
	<li>Zanurzyć całe ciało lub kończynę będącą przedmiotem zainteresowania w mieszaninie reakcyjnej i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Tuszę myć przez 2 minuty w wodzie destylowanej. Uwaga: Na tym etapie mięśnie wykazują niebieskie zabarwienie, a płytki końcowe silnika (MEP) mogą być widoczne jako białe kropki.</li>
	<li>Wystawić tuszę na działanie 10% roztworu siarczku amonu przez 3-5 sek. 
	Uwaga: Włókna mięśniowe szybko zmienią kolor na brązowy, a posłowie do PE będą widoczni jako czarne nakrapiane kropki. Jeśli reakcja zachodzi zbyt szybko, a włókna mięśniowe są zabarwione zbyt ciemno, aby można było odróżnić MEP od włókien mięśniowych, spróbuj użyć roztworu siarczku amonu o niższych stężeniach (np. 5%). Czas reakcji w celu uzyskania optymalnego kontrastu między MEP a włóknami mięśniowymi różni się w zależności od próbki. Dlatego trudno jest określić dokładny czas ekspozycji na odczynnik. Reakcję należy ściśle monitorować i przerwać, gdy kontrast zostanie uznany za odpowiedni.</li>
	<li>Umyj tuszę dwa razy, mieszając w wodzie destylowanej i delikatnie osusz tuszę.</li>
	<li>Sfotografuj zarówno boczną, jak i przyśrodkową stronę kończyny, upewniając się, że uchwycone są posłowie do PE dla wszystkich mięśni będących przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>
2. Iniekcje domięśniowe na płytkach końcowych silnika
<ol>
	<li>Mikropipety szklane należy wyciągać za pomocą ściągacza do mikropipet (zaleca się stosowanie mikropipet stopniowanych z tłokami). Za pomocą mikroskopu preparacyjnego rozbij końcówki mikropipet parą kleszczyków tak, aby wewnętrzna średnica światła mikropipety wynosiła około 0,5 mm.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie używane narzędzia chirurgiczne są świeżo autoklawowane, a obszar operacyjny jest sterylny.</li>
	<li>Napełnij mikropipety fluoro-złotem (5% w wodzie destylowanej).</li>
	<li>Wywołać znieczulenie zwierzęcia w komorze indukcyjnej izofluoranem (4% wO2). Sprawdź, czy nie ma odruchu prostującego i upewnij się, że go nie ma przed wyjęciem go z komory indukcyjnej. Zabezpiecz stożek nosowy nad pyskiem szczura i podaj izofluoran (2% wO2) w celu podtrzymania znieczulenia. Ściśnij palce u nóg zwierzęcia i delikatnie dotknij oka zwierzęcia, aby upewnić się, że zarówno wycofanie pedału, jak i odruchy rogówkowe są nieobecne. Uwaga: Można również zastosować mieszaninę ketaminy i ksylazilu (odpowiednio 80 i 10 mg/kg, podawana dootrzewnowo). Ketamina jest lekiem z grupy 8 ("kontrolowanym") i konieczne będzie przestrzeganie niezbędnych protokołów związanych z zakupem, stosowaniem, przechowywaniem i utylizacją leku.</li>
	<li>Nałóż smar do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu w trakcie zabiegu.</li>
	<li>Ogol docelową kończynę i użyj gazy, aby przetrzeć ogolony obszar trzema naprzemiennymi peelingami chlorheksydyny i 70% alkoholu. Przenieś zwierzę na obszar operacyjny.</li>
	<li>Umieść zwierzę na czystym podkładzie i ustaw je odpowiednio, aby zapewnić dobry dostęp do docelowego mięśnia (mięśni).</li>
	<li>Użyj kleszczy z uchwytami do zębów, aby unieść skórę nad docelowym mięśniem z dala od leżącego poniżej mięśnia i wykonaj nacięcie w skórze nożyczkami chirurgicznymi. Upewnij się, że nacięcie jest wystarczająco duże, aby całkowicie odsłonić interesujący mięsień (mięśnie). Upewnij się, że przerwa w pracy deski rozdzielczej jest minimalna.</li>
	<li>Wykorzystaj zdjęcia MEP, aby mentalnie przetransponować położenie i kształt obszaru MEP na mięsień(y). 
	Uwaga: Drobny marker filcowy może pomóc w odtworzeniu obszaru MEP ze zdjęcia na interesujący mięsień (mięśniach).</li>
	<li>Wykonaj wielokrotne wstrzyknięcia na całej długości obszaru MEP (w przypadku Fluoro-Gold powinny wystarczyć 3 do 4 wstrzyknięć po 1-2 μl każdy). Delikatnie przetrzyj mięsień (mięśnie), aby usunąć wszelkie przesiąkanie.</li>
	<li>Zbliż do siebie dwa końce naciętej skóry kleszczami i zamknij ranę klipsami chirurgicznymi. Naciekać 0,1 ml bupiwakainy (0,5% w wodzie) (lub innych środków znieczulających miejscowo) na całej długości rany.</li>
	<li>Wyłącz urządzenie do znieczulania i monitoruj zwierzę, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone ze znieczulenia.</li>
	<li>Należy odczekać 14 dni między podaniem wstrzyknięć domięśniowych a perfuzją zwierząt.</li>
</ol>
3. Perfuzje
<ol>
	<li>Śmiertelne dawki roztworu pentobarbitonu sodowego (np. Lethabarb; 150 mg/kg) należy podać zwierzęciu we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
	<ol>
		<li>Uważnie obserwuj zwierzę, aż do osiągnięcia głębokiego poziomu znieczulenia, co potwierdza brak wycofania pedału i odruchów rogówkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ułóż zwierzę na plecach na desce sekcyjnej umieszczonej nad zlewem perfuzyjnym.</li>
	<li>Użyj kleszczy z uchwytami do zębów, aby podnieść skórę pokrywającą podstawę mostka. Wykonaj małe nacięcie skóry za pomocą silnych nożyczek chirurgicznych bezpośrednio pod mostkiem, a następnie użyj kleszczy, aby chwycić chrząstkę mieczykowatą mostka. Trzymając chrząstkę mieczykowatą, powiększ nacięcie po obu stronach jamy klatki piersiowej, od mostka do pach.</li>
	<li>Przetnij membranę, aby odsłonić serce.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 0.ml heparyny bezpośrednio w wierzchołek serca, aby zapobiec krzepnięciu krwi.</li>
		<li>Przeciąć wierzchołek, aby umożliwić wprowadzenie kaniuli do lewej komory, a następnie szybko zacisnąć kaniulę na miejscu za pomocą hemostatu.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku za pomocą cienkich nożyczek i natychmiast uruchom pompę perystaltyczną. Perfuzję z 0,1 M PB do momentu, gdy płyn wypływający z przedsionka będzie prawie wolny od krwi, a kolor wątroby stanie się jasnobrązowy. Następnie perfuzję z roztworem paraformaldehydu (4% w 0,1 M PB), aż całe ciało zwierzęcia stanie się sztywne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym i przygotowanie do badania histologicznego
<ol>
	<li>Połóż tuszę zwierzęcia na jego brzuchu.</li>
	<li>Przetnij skórę na linii środkowej ciała skalpelem i odbij ją od podstawy czaszki do poziomu kości biodrowej.</li>
	<li>Przetnij i odbij mięśnie przykręgosłupowe, aby odsłonić grzbietowy aspekt kręgosłupa.</li>
	<li>Zidentyfikuj kostny wyrostek kolczysty Atlasa, drugiego segmentu szyjki macicy (tj. C2) i usuń go za pomocą pary chirurgicznych rongeurów lub kleszczy, aby zlokalizować odpowiedni leżący poniżej korzeń grzbietowy.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj właściwy korzeń C2, barwiąc go trwałym markerem filcowym.</li>
		<li>Usuń kolejne kręgi jeden po drugim i zaznacz prawe korzenie grzbietowe naprzemiennymi kolorami (tj. C2, C4, C6 i C8 mogą być pokolorowane na zielono, a C3, C5, C7, T1 mogą być pokolorowane na niebiesko).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj małej igły chirurgicznej (np. igły o rozmiarze 30 G), aby delikatnie przebić oponę twardą pokrywającą dolny koniec rdzenia kręgowego. Ze skosem igły skierowanym do góry, podnieś oponę twardą z dala od sznurka, jednocześnie przesuwając igłę w ruch obrotowy, aby zrobić podłużną szczelinę.
	<ol>
		<li>Odbicie opony twardej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetnij rdzeń kręgowy poprzecznie na jedno- lub dwusegmentowe bloki za pomocą nowego ostrza skalpela.
	<ol>
		<li>Pozostaw segmenty rdzenia kręgowego na miejscu i dla każdego bloku ostrożnie wykonaj mały znak odniesienia po lewej stronie każdego bloku za pomocą ostrza skalpela w połowie odległości między dwoma sąsiednimi korzeniami. Upewnij się, że znak odniesienia jest wystarczająco głęboki w tkance, aby był widoczny od strony brzusznej bloków. Wykonać znak odniesienia pod kątem około 45°, skierowany do przodu lub do tyłu w stosunku do anatomii zwierzęcia, aby pomóc w orientacji segmentu tkanki po rozwarstwieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać poszczególne bloki do małych, wyraźnie oznakowanych butelek zawierających roztwór paraformaldehydu (4% w 0,1 M PB) i pozostawić w temperaturze RT O/N.</li>
	<li>Przenieść bloki do czystych, wyraźnie oznakowanych butelek zawierających roztwór sacharozy (30% w 0,1 M PB) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa dni.</li>
	<li>Umieść segmenty w krioformach i przykryj je pożywką do zamrażania tkanek. W celu podłużnego przygotowania histologicznego należy ustawić bloki stroną grzbietową skierowaną do góry i użyć znaku odniesienia, aby zorientować blok w krioformach.</li>
	<li>Formy kriogeniczne zamrozić w temperaturze -20 °C i pociąć kriostatem na odcinki o grubości 50 μm. Uwaga: Skrawki można zamontować bezpośrednio na szkiełkach mikroskopu adhezyjnego i pozostawić do wyschnięcia O/N. Alternatywnie, skrawki można umieścić na 48-dołkowych płytkach wypełnionych 0,1 M PB, a następnie zamontować za pomocą znaku odniesienia w celu orientacji skrawków tkanki na szkiełkach.</li>
</ol>
5. Rozwarstwienie rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym i przygotowanie do badania histologicznego
<ol>
	<li>Połóż tuszę zwierzęcia na plecach.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż brzucha zwierzęcia i usuń wnętrzności. Wypreparuj mięśnie tylnej ściany brzucha, aby odsłonić brzuszny aspekt kręgosłupa.</li>
	<li>Zlokalizuj krótkie, najbardziej ogonowe żebro i przylegający do niego kręg T13 w miejscu, w którym korzeń brzuszny T13 wychodzi z kości.
	<ol>
		<li>Kolejno usuń jeden po drugim dwa lub trzy kręgi rostralne do T13 (tj. T12, T11 i, jeśli to konieczne, T10) za pomocą drobnych rongeurów chirurgicznych, aby podążać za korzeniem brzusznym T13 aż do punktu jego wejścia w brzuszną część rdzenia brzusznego i oznaczyć go trwałym markerem filcowym.</li>
		<li>Od tego momentu powtórz tę samą procedurę, aby zidentyfikować lokalizację brzusznych punktów wejścia korzenia dla L1, L2, L3, L4, L5, L6 i S1, kolorując je naprzemiennymi kolorami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w sekcji 4.5-4.10 w przypadku rozwarstwienia rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym.</li>
</ol>

<ol><li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li>
<li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li>
<li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li>
<li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li>
<li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li>
<li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11(2011).</li>
<li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li>
<li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1%2F2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li>
<li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li>
<li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li>
<li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li>
<li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li>
<li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li>
<li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li>
<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Alternative+energy+for+neuronal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li>
<li>Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li>
<li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb%3A+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li>
<li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li>
<li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58(2013).</li>
<li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons%3A+an+approach+to+maximize+retrograde+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li>
<li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li>
<li>Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Celowanie domięśniowe, a następnie wsteczny transfer terapeutycznych transgenów do odpowiednich α neuronów ruchowych w celu eksperymentalnego leczenia stanu nerwowo-mięśniowego nie jest nową strategią. Na przykład ta metoda dostarczania została wykorzystana do opóźnienia zwyrodnienia nerwowo-mięśniowego na różnych etapach progresji ALS u myszy SOD1 i szczurów 1,9-12 , a także u myszy z SMA 13. Chociaż są obiecujące, skuteczność tych scenariuszy terapii genowej jest ograniczona. W związku z tym propo...

Utrata kontroli nad dobrowolnymi ruchami, która wynika z chorób neurologicznych, takich jak choroba neuronu ruchowego i rdzeniowego, a także zanik mięśni Duchenne'a, jest wyniszczającym stanem, który ma duży i długotrwały wpływ na codzienne życie dotkniętych osób. W ciągu ostatniej dekady wysiłki badawcze mające na celu powstrzymanie lub przynajmniej opóźnienie szkodliwych skutków tych chorób nerwowo-mięśniowych były priorytetem dla wielu klinicystów i naukowców na całym świecie. W związku z tym najnowsza generacja modeli zwierzęcych, które naśladują te choroby nerwowo-mięśniowe, odegrała zasadniczą rolę w uzyskaniu fundamentalnych informacji na temat mechanizmów fizjologicznych leżących u podstaw rozwoju i progresji tych schorzeń 1-13. Leczenie tych chorób nerwowo-mięśniowych wymaga bezpośredniego dostępu do rdzenia kręgowego i może być osiągnięte poprzez iniekcje do rdzenia kręgowego 14,15. Ostatnie postępy w terapii genowej są również ukierunkowane na mięśnie poprzecznie prążkowane kończyn górnych i dolnych w celu transportu genów terapeutycznych do odpowiednich α neuronów ruchowych, które znajdują się w rogu brzusznym rdzenia kręgowego 1,9-13. Jednak ta niegdyś obiecująca strategia nie poprawiła wyników leczenia tych schorzeń neurologicznych. Chociaż można stwierdzić, że te słabe wyniki można przynajmniej częściowo przypisać niskiej skuteczności tych ochronnych genów, nie można wykluczyć niskiej skuteczności tych metod dostarczania genów.
Płytki końcowe silnika (MEP) to wyspecjalizowane obszary szkieletowych włókien mięśniowych, które są wcięte przez zakończenia aksonów dużych obwodowych włókien ruchowych pochodzących z α neuronów ruchowych. Zakończenia włókien nerwów obwodowych i MEP tworzą razem połączenie nerwowo-mięśniowe, czyli miejsce, w którym impulsy synaptyczne są wyzwalane przez następcze uwalnianie neuroprzekaźnika, acetylocholiny. Co ważne, związek między obwodowymi włóknami nerwowymi a MEP jest dwukierunkowy, chociaż różne silniki są odpowiedzialne za transport cząsteczek i organelli w kierunku i od somaty neuronu 16-18. W świetle tych uwarunkowań anatomicznych, MEP wydają się być celami z wyboru w zakresie dostarczania, a następnie wstecznego transportu materiału genetycznego do odpowiednich neuronów ruchowych. W tym kontekście nie jest zaskakujące, że powodzenie transdukcji neuronów ruchowych w dużej mierze zależy od odległości między domięśniowym wstrzyknięciem wektorów wirusowych a MEP mięśni 19-20. Co zaskakujące, dokładna lokalizacja stref MEP na włóknach mięśniowych laboratoryjnego szczura i myszy, dwóch gatunków z wyboru do modelowania chorób nerwowo-mięśniowych, nie była dostępna do niedawna.
Stworzyliśmy kompleksowe mapy regionu MEP dla kilku mięśni kończyn przednich u szczura i myszy 21-22. Niedawno pokazaliśmy szczegóły organizacji regionu MEP dla kilku mięśni kończyny tylnej myszy 23, a obecnie analizujemy cechy MEP na tylnej kończynie szczura. W naszych rękach domięśniowe wstrzyknięcia znaczników wstecznych skierowane do całych stref MEP w tych mięśniach spowodowały powstanie większej liczby znakowanych neuronów ruchowych, które obejmują więcej segmentów rdzenia kręgowego niż wcześniej zgłaszano. Poniżej przedstawiamy protokół, który został opracowany w ciągu ostatnich kilku lat w celu ujawnienia lokalizacji MEP na powierzchni zewnętrznej, a także na całej głębokości mięśni kończyn tylnych i przednich zarówno u myszy, jak i szczura.

<table><tbody><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>Bezbarwnie</td><td>rozcieńczony do 5%</td></tr> <tr><td>mikropipet Drummond PCR 1-10 i mikro; l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>w towarzystwie tłoków</td></tr><tr><td>Jodek acetylotiocholiny</td><td>Sigma Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II) Bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Związek</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, tetrametylodamina i biotyna</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Rozcieńczony w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Izofluran do inhalacji</td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Klipsy do ran</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td></td><td></td>LETHA450</tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane SuperFrost Plus</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Siarczek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>Rozcieńczony do 10%</td></tr><tr><td>Marcain Spinal 0,5% (chlorowodorek bupiwakainy)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>Rozcieńczony do 0,25%</td></tr></tbody></table>

iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Choroby wpływające na integralność neuronów ruchowych rdzenia kręgowego należą do najbardziej wyniszczających schorzeń neurologicznych. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowanie kilku zwierzęcych modeli tych zaburzeń nerwowo-mięśniowych dostarczyło społeczności naukowej różnych scenariuszy terapeutycznych mających na celu opóźnienie lub odwrócenie postępu tych schorzeń. Wykorzystując wsteczną maszynerię neuronów, jednym z tych podejść było celowanie w mięśnie szkieletowe w celu przetransportowania genów terapeutycznych do odpowiednich neuronów ruchowych rdzenia kręgowego. Chociaż kiedyś było obiecujące, sukces takiego podejścia do dostarczania genów został utrudniony przez nieoptymalną liczbę transdukowanych neuronów ruchowych, które do tej pory wykazano. Motoryczne płytki końcowe (MEP) to wysoce wyspecjalizowane obszary mięśni szkieletowych, które są w bezpośrednim kontakcie synaptycznym z rdzeniem kręgowym α neuronami ruchowymi. W związku z tym należy zauważyć, że do tej pory wysiłki mające na celu wsteczne przeniesienie genów do neuronów ruchowych były podejmowane bez odniesienia do lokalizacji regionu MEP w docelowych mięśniach. W tym miejscu opisujemy prosty protokół: 1) aby ujawnić dokładną lokalizację MEP na powierzchni mięśni szkieletowych i 2) aby wykorzystać te informacje do kierowania dostarczeniem domięśniowym i późniejszym optymalnym transportem wstecznym znaczników wstecznych do neuronów ruchowych. Mamy nadzieję, że uda nam się wykorzystać wyniki tych eksperymentów śledzących w dalszych badaniach nad badaniem wstecznego transportu genów terapeutycznych do neuronów ruchowych rdzenia kręgowego poprzez celowanie w MEP.

Histochemiczne barwienie acetylocholinesterazy ujawnia rozmieszczenie płyt końcowych motorowych w całej szerokości mięśni. Rysunek 1 przedstawia wyniki takiego barwienia wykonanego na całej kończynie przedniej szczura. Sugeruje się optymalizację stężenia roztworu siarczku amonu (np. 5-7% zamiast 10%) oraz czasu zanurzenia preparatu w roztworze, jeśli nieswoiste barwienie tła na włóknach mięśniowych jest zbyt intensywne. Rysunek 2 przedstawia kolumnę oznakowanych neuronów ruchowy...

Skuteczność domięśniowego wychwytu i wstecznego transportu cząsteczek do odpowiednich neuronów ruchowych zależy od lokalizacji miejsc wstrzyknięć w stosunku do płytek końcowych silnika (MEP). W tym miejscu opisujemy, jak zlokalizować MEP na mięśniach szkieletowych, aby zoptymalizować wsteczny transport znaczników do neuronów ruchowych.

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zwiększenie skuteczności transportu retrogradnego znaczników neuroanatomicznych do neuronów ruchowych rdzenia kręgowego po wstrzyknięciu domięśniowym. Osiąga się to poprzez zainicjowanie histochemicznej reakcji acetylocholinoesterazy w symulowanej tkance docelowej w celu zidentyfikowania lokalizacji płyt końcowych motorycznych w muskulaturze zwierzęcia. W drugim kroku wykonuje się wstrzyknięcia domięśniowe znacznika retrogradnego wzdłuż całego obszaru płyt końcowych motorycznych.Następnie zwierzęta utrzymuje się przez 14 dni, aby umożliwić transport znacznika do rdzenia kręgowego z zainteresowanych mięśni. Neurony ruchowe, których zakończenia obejmują całą długość obszaru płytki motorycznej, dają więcej oznakowanych neuronów ruchowych rozciągających się przez wiele segmentów rdzenia kręgowego gryzonia w obrazowaniu z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Wnioski z niniejszego badania mają znaczenie dla rozwoju terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych, w tym urazów rdzenia kręgowego oraz stwardnienia zanikowego bocznego.Ponieważ jest to metoda małoinwazyjna, a tym samym klinicznie istotny sposób dostarczania genów terapeutycznych do r

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wykonywania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-μm. Technika ta znacząco ogranicza uszkodzenia mózgu, minimalizuje pasywną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózg gryzonia.

Celowanie w głębokie struktury mózgu za pomocą mikroiniekcji w celu dostarczania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Przedstawiamy praktyczny przewodnik po wprowadzaniu tracerów in vivo, wykorzystując drogę rdzeniowo-móżdżkową jako system modelowy do zaprezentowania kluczowych kroków niezbędnych do skutecznej analizy obwodów neuronalnych u myszy. Szczegółowo opisujemy nasz wszechstronny protokół śledzenia, który wykorzystuje aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA) sprzężoną z fluoroforami Alexa.

Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Źródło: Mohan, R., et al. Wstrzyknięcia domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje celowe dostarczanie fluorescencyjnego znacznika neuronalnego do neuronów ruchowych poprzez wstrzyknięcie domięśniowe na motoryczne płytki końcowe (MEP). Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem szczura, wstrzyknięciem znacznika i oceną znakowanych neuronów ruchowych pod...

Wstrzyknięcia domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika w celu transportu znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych szczura

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem do analizy centralnych eferentów regulujących cele obwodowe za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Tutaj przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transsynaptycznego wirusa wścieklizny rzekomej do identyfikacji i lokalizacji funkcjonalnego obwodu mózgu, a następnie klasyczne techniki śledzenia dróg w celu walidacji określonych połączeń w obwodzie między zidentyfikowanymi grupami neuronów.

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Aby zbadać reorganizację mózgu w warunkach patologicznych, użyliśmy pomp miniosmotycznych do bezpośredniego dostarczania białka do mózgu, omijając barierę krew-mózg. Następnie wstrzykuje się znaczniki dróg oddechowych w celu zbadania zmian w połączeniach mózgowych pod wpływem białka.

Implantacja pomp miniosmotycznych i dostarczanie znaczników dróg oddechowych w celu zbadania reorganizacji mózgu w stanach patofizjologicznych

Ten protokół demonstruje wstrzyknięcie wstecznie transportowalnego wektora wirusowego do tkanki rdzenia kręgowego szczura. Wektor jest wychwytywany w synapsie i transportowany do ciała komórkowego docelowych neuronów. Model ten nadaje się do wstecznego śledzenia ważnych ścieżek rdzeniowych lub celowania w komórki do zastosowań w terapii genowej.

Bezpośrednie wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego uwydatnia wiele ścieżek motorycznych w rdzeniu kręgowym szczura

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Niniejszy artykuł opisuje metody podawania wewnątrz OUN dla terapii ukierunkowanych na OUN u dorosłych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem precyzji protokołu i umożliwienia powtarzanych wstrzykiwań. Zawiera wyniki badania walidacyjnego, w którym oligonukleotydy antysensowne zmniejszały ekspresję mutantnego SOD1 u modelowych myszy SOD1-ALS, co potwierdza przydatność tego podejścia w przedklinicznych badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS

Poznaj metodę iniekcji domięśniowych wzdłuż płytek końcowych silnika w celu zwiększenia efektywności retrogradnego transportu znaczników do neuronów ruchowych rdzenia kręgowego.

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Przeglądaj więcej filmów