Name: Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę wyciszania genu BRCA2 przy użyciu transfekcji siRNA w hodowanych komórkach ludzkich. Technika ta umożliwia skuteczną analizę ekspresji białka metodą Western blotting w badaniach nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty FIRB-Merit RBNE08YFN3_005 i RBNE08HWLZ_012, oraz przez włoskie Ministerstwo Gospodarki i Finansów dla CNR na projekt "FaReBio di Qualità".

1. Przygotuj roztwory siRNA
<ol>
	<li>Zawiesić 5 nmol zaszyfrowanych (Ctrl) i 5 nmol wysuszonych granulek BRCA2 siRNA w 100 μl wody wolnej od RNaz (końcowe stężenie siRNA: 50 μM). Jest to podstawowy siRNA i musi być przechowywany w temperaturze -20 °C w 10 μl podwielokrotności.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność 10 μl z podstawowego siRNA i dodać 40 μl wody wolnej od RNaz, aby uzyskać 10 μM roztworu roboczego siRNA. Rozcieńczenie to należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia. 
	UWAGA: Roztwór roboczy siRNA nie powinien być zamrażany/rozmrażany więcej niż 3 razy.</li>
</ol>
2. Zasiewanie ludzkich linii komórkowych nabłonka
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę wzrostową z linii komórkowych ludzkiego nabłonka rosnących jako monowarstwy komórek na płytkach do hodowli tkankowych w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Umyć komórki w płytce raz za pomocą RT PBS (10 ml PBS na płytkę 100 mm).</li>
	<li>Aby oderwać komórki od płytki, dodaj 2 ml 0,25% roztworu trypsyny/0,53 mM EDTA i inkubuj 3-5 minut w zależności od typu komórki.</li>
	<li>Przed pobraniem oderwanych komórek należy zneutralizować trypsynę, dodając 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 320-330 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym.</li>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w 5 ml pożywki wolnej od antybiotyków.</li>
	<li>Policz komórki pod mikroskopem w komorze Burkera lub za pomocą automatycznego systemu liczenia zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wysiewaj komórki na płytkach 6-dołkowych, aby po 24 godzinach były zlewające się w około 80% (0,5-1 x106 komórek w 2 ml pożywki na każdą studzienkę). Optymalna liczba komórek do wysiewu może się różnić w zależności od konkretnych linii komórkowych i tempa wzrostu. 
	UWAGA: W tym momencie nie dodawaj antybiotyków do pożywki, ponieważ antybiotyki negatywnie zakłócą skuteczność transfekcji. Bardzo ważne jest, aby komórki znajdowały się w niskich pasażach hodowlanych (< 10), aby osiągnąć wysoką skuteczność transfekcji siRNA BRCA2.</li>
</ol>
3. Komórki transfekcyjne z siRNA
<ol>
	<li>Dwadzieścia cztery godziny po posianiu komórek przystąp do pierwszej rundy transfekcji.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 6 μl odczynnika do transfekcji swoistego dla 10 siRNA na bazie lipidów w 130 μl zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Rozcieńczyć 3 μl 10 μM siRNA (30 pmol) w 130 μl zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Połączyć rozcieńczone siRNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Podczas inkubacji usunąć pożywkę z komórek i dodać 2 ml świeżej pożywki wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C (bez antybiotyków).</li>
		<li>Dodać 250 μl kompleksów odczynników do transfekcji siRNA do komórek (ilość ta dotyczy pojedynczego dołka płytki 6-dołkowej).</li>
		<li>Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 24 godzinach przystąpić do drugiej rundy transfekcji, powtarzając kroki 3.1.1-3.1.5 z następującą modyfikacją dla kroku 3.1.2: rozcieńczyć 5 μl 10 μM siRNA (50 pmol) w 130 μl zredukowanej pożywki surowicy.
	<ol>
		<li>Inkubować komórki przez 1-2 dni w temperaturze 37 °C przed analizą. 
		UWAGA: Dwie rundy transfekcji i użycie wysokiego stosunku siRNA do odczynnika do transfekcji w drugiej rundzie są niezbędne do uzyskania wysokiej skuteczności wyciszania BRCA2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Liza komórek do analizy immunoblottingu
<ol>
	<li> Przygotować świeży bufor do lizy z PBS (pH 7,4) zawierający 1% niejonowego, niedenaturującego detergentu oktylofenoksypolietylenu, 5 mM pirofosforanu sodu, 1 mM ortowananianu sodu, 10 mM fluorku sodu, 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 10 μg/ml leupeptyny, 10 μg/ml aprotyniny. Trzymaj go na lodzie.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek i przemyć je raz zimnym PBS (2 ml/studzienkę) w płytce. Aby zapobiec przeniesieniu PBS, należy całkowicie usunąć go z płytki.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu do lizy do każdego dołka. 
	UWAGA: Jeśli komórki muszą być użyte również do innych testów, trypsynizuj komórki zgodnie z opisem w kroku 2.1-2.6 i ponownie zawieś komórki w odpowiednim buforze/pożywce zgodnie z zastosowaniem, które ma być użyte.</li>
	<li>Delikatnie obrócić płytkę, aby równomiernie rozprowadzić bufor do lizy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze.</li>
	<li>Zebrać lizat komórkowy w probówce mikrowirówkowej na lodzie za pomocą skrobaka do komórek.</li>
	<li>Odwirować przy 17 900 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka za pomocą dostępnego na rynku testu białkowego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Analiza immunoblottingu BRCA2
<ol>
	<li>Przygotować bufor do biegania, rozcieńczając 50 ml 20x Tris-Acetate SDS bufor do biegania (50 mM trycyny, 50 mM zasady Tris, 0,1% SDS, pH 8,24) 950 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Przygotować próbkę w następujący sposób: dodać 15 μg całkowitego lizatu komórkowego, 5 μl 4 μl buforu próbki zawierającego dodecylosiarcan litu o pH 8,4, 2 μl 10 x środka redukującego próbkę (0,5 M DTT) i bufor do lizy do końcowej objętości 20 μl. 
	UWAGA: Protokół ten umożliwia wykrycie BRCA2 w normalnych liniach komórkowych również przy użyciu mniejszej ilości białek ogółem (do 5 μg).</li>
	<li>Denaturyzacja próbek w temperaturze 55 °C przez 10 min. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać 55 °C. Ponieważ białko BRCA2 jest termoczułe11, wyższe temperatury denaturacji powodują stałą utratę nienaruszonego białka BRCA2 o pełnej długości (390 kDa).</li>
	<li>Ustawić komorę elektroforetyczną zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Załadować próbki i 10 μl wstępnie wybarwionego wzorca białka o wysokiej masie cząsteczkowej na prefabrykowany żel (octan trisu 3-8%) i pracować pod napięciem 120 V przez około 2 godziny 12. Zatrzymaj przebieg elektroforetyczny, zanim niebieski znacznik o wartości 55 kDa opuści prefabrykowany żel.</li>
	<li>Przygotować bufor transferowy z 50 ml 20-krotnego buforu transferowego, 100 ml 100% metanolu i 850 ml wody.</li>
	<li>Aktywować membranę PVDF (wielkość porów 0,45 μm) przez moczenie w 100% metanolu przez 5 minut, płukanie wodą destylowaną i równowaga w buforze transferowym przez co najmniej 5 minut. Namoczyć gąbki aparatu transferowego w buforze transferowym w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegu elektroforetycznego złóż kanapkę w stosie transferowym w następującej kolejności (od dołu do góry): trzy gąbki nasycone buforem transferowym, jeden arkusz papieru klasy 3MM nasycony buforem transferowym, żel, aktywowana membrana PVDF, jeden arkusz papieru klasy 3MM nasycony buforem transferowym, trzy gąbki nasycone buforem transferowym 13,14. Umieścić stos w aparacie i przenieść białka o natężeniu 350 mA przez 4 godziny w temperaturze 4 °C lub w temperaturze 180 mA przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ponieważ BRCA2 jest białkiem bardzo dużym, ważne jest, aby wydłużyć czas transferu z 1 godziny (zgodnie z sugestiami producenta i większości protokołów transferu) do 4 godzin lub z dnia na dzień, aby zapewnić całkowity transfer białek o dużej masie cząsteczkowej. Ponadto, ze względu na długi czas przenoszenia, konieczne jest wykonanie blottingu w chłodni w temperaturze 4 °C, aby zminimalizować przegrzanie i ułatwić demontaż kanapek. Półsuche systemy transferowe nie są dobre do przenoszenia dużych białek.</li>
	<li>Po przeniesieniu przemyć membranę TBS, zablokować ją na 1 godzinę w temperaturze pokojowej w TBS-Tween 0,25% (TBS-T) zawierającej 5% odtłuszczonego mleka w proszku i sondować przez noc w temperaturze 4 °C 30 μl króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-BRCA2 (200 μg/ml), rozcieńczonego w 9 ml TBS-T + 5% odtłuszczonego mleka w proszku [rozcieńczenie 1:300 (v/v)].</li>
	<li>Przemyć membranę trzykrotnie (po 10 minut) TBS-T, a następnie inkubować filtr przez 1 godzinę z 1 μl wtórnego przeciwciała przeciw królikowi sprzężonego z peroksydazą chrzanową rozcieńczonego w 10 ml TBS-T + 5% odtłuszczonego mleka w proszku. Następnie przemyj membranę trzy razy (po 10 minut) TBS-T.</li>
	<li>Przeprowadzić immunodetekcję za pomocą ECL w celu ujawnienia białka BRCA2 przy użyciu odczynnika Western Blotting Detection o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wizualizacja pasm immunochemiluminescencyjnych na foliach ECL o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Przeprowadzić immunodetekcję za pomocą przeciwciała dla genu porządkowego, takiego jak β-tubulina (55 kDa), na tym samym filtrze, co kontrola obciążenia, używając przeciwciała monoklonalnego przeciwko β-tubulinie rozcieńczonego w stosunku 1:1000 (10 μl przeciwciała antytubulinowego w 10 ml TBS-T + 5% odtłuszczonego mleka w proszku) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć i inkubować przeciwciało drugorzędowe zgodnie z opisem dla BRCA2 (5.10-5.11), z wyjątkiem stosowania przeciwciała anty-mysiego sprzężonego z peroksydazą chrzanową zamiast przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi.</li>
	<li>Uzyskaj cyfrowy obraz filmów odciśniętych za pomocą pasm immunochemiluminescencyjnych i przeanalizuj intensywność pasma za pomocą dedykowanego oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ).</li>
</ol>

<ol><li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2%3A+a+universal+recombinase+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li>
<li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair%2C+transcription%2C+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li>
<li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li>
<li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li>
<li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li>
<li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li>
<li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82(2013).</li>
<li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li>
<li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li>
<li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems%3A+pharmaceutical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA2%3A+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. ' <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Western+blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li>
<li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li>
<li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+the+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li>
<li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ mutacje germinalne genu BRCA2 prowadzą do zwiększonego ryzyka kilku typów nowotworów, w tym raka piersi u kobiet i mężczyzn, raka jajnika, raka prostaty, raka trzustki i czerniaka 3,4, podjęto szereg badań w celu zrozumienia biologicznej funkcji białka BRCA2. Większość z tych badań ma podłoże genetyczne, głównie ze względu na trudności techniczne w analizie tak gigantycznego białka jak BRCA2. Opisana tutaj metoda wyciszania i analizy ekspresji białka BRCA2 stanowi skuteczne narzędzie do badan...

Gen BRCA2 (BReast CAncer susceptibility gene-2) koduje białko supresorowe nowotworu, które odgrywa kluczową rolę w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA poprzez regulację funkcji enzymu rekombinazy Rad51 1. BRCA2 jest również zaangażowany w modulację transkrypcji i kontrolę cyklu komórkowego 2. Mutacje germinalne w genie BRCA2 wywołują autosomalną dominującą podatność na raka piersi i jajnika u kobiet oraz raka prostaty u mężczyzn, a także predyspozycje do innych typów nowotworów 3,4. Jednak pomimo zwiększonego ryzyka zachorowania na raka, mutacje BRCA2, które hamują lub zmniejszają funkcję BRCA2, mogą sprawić, że komórki rakowe będą bardziej podatne na chemioterapeutyki, które powodują uszkodzenie DNA 5-7. Sporadyczne nowotwory wykazują niski odsetek mutacji BRCA2 (< 3%), chociaż w niektórych typach nowotworów wykryto obniżony poziom białka BRCA2, co sugeruje, że białko BRCA2 może zostać utracone podczas nowotworzenia w sporadycznych nowotworach poprzez mechanizmy niezależne od mutacji 7,8. Dlatego ważne jest, aby w pełni zrozumieć funkcje BRCA2 w kontekście biologii nowotworów, a także w innych warunkach biologicznych.
Potężnym narzędziem używanym do identyfikacji nowych funkcji genu w komórkach ssaków jest wyciszenie jego ekspresji. Na przykład, wyciszenie ekspresji BRCA2 w różnych normalnych komórkach nabłonka doprowadziło ostatnio do zidentyfikowania nowej funkcji BRCA2 jako regulatora oporności na anoikis, co jest ważnym krokiem w nabywaniu zdolności inwazyjnej i przerzutowej komórek nowotworowych 9. Wyciszanie genów można osiągnąć poprzez wprowadzenie do komórek małych cząsteczek RNA interferujących (si) lub krótkich cząsteczek RNA typu spinka do włosów (sh) ukierunkowanych na określony gen. Wysoka siła działania siRNA i łatwość użycia sprawiają, że jest to preferencyjne narzędzie do wyciszania eksperymentów mających na celu uzyskanie nowego wglądu w krytyczne procesy biologiczne i identyfikację nowych celów terapeutycznych. Jednak skuteczne obniżenie ekspresji genów może nie być łatwe do osiągnięcia dla wszystkich genów i może być bardzo zmienne w zależności od typu komórki. Ponieważ spadek poziomu białek wewnątrzkomórkowych jest najistotniejszym badanym fenotypem, kluczowe znaczenie ma ilościowe określenie wyciszania genów za pomocą analizy immunoblottingu produktu genu. W związku z tym białko BRCA2 stanowi kolejne wyzwanie: ze względu na to, że białko jest duże (około 390 kDa), istnieją trudności techniczne w przypadku konwencjonalnej analizy biochemicznej, w tym immunoblottingu.
Przedstawiamy tutaj protokół zoptymalizowany pod kątem skutecznego wyciszania BRCA2 w ludzkich liniach komórkowych nabłonka oraz szybkiego i skutecznego wykrywania knockdownu białka BRCA2 za pomocą analizy immunoblottingu.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp; D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Odczynnik</td></tr><tr><td>RNAiMAX do puli lipofekctaminy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Medium o zredukowanej surowicy</td> Life <td>Technologies</td><td>31985-070</td><td>Pożywka do zabiegu transfekcji</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Prefabrykat</td><td>żelowy Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Żel do elektroforezy białek</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor próbki&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Odczynnik do elektroforezy białek</td></tr><tr><td>NuPAGE Środek redukujący próbki (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Odczynnik do elektroforezy białek</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Odczynnik do elektroforezy białek</td></tr><tr><td>HiMark Wstępnie barwiony standard białka</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Wstępnie zabarwiony marker do żelu elektroforeza</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Sprzęt do elektroforezy/transferu białek</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Odczynnik do Western blotting</td></tr><tr><td>membrany PVDF</td><td>Millipore</td><td></td><td>IPVH00010 Odczynnik do Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Odczynnik do Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 królicze przeciwciało poliklonalne</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne beta-tubuliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Odczynnik do Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Odczynnik do Western blotting</td></tr><tr><td>Podłoże chemiluminescencyjne SuperSignal West Pico/Femto</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>System chemiluminescencyjny</td></tr><tr><td>Komórki PNT1A</td><td>SIGMA Aldrich (dla ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A ludzki, normalny nabłonek prostaty unieśmiertelniony komórkami SV40</td></tr><tr><td>Nthy</td><td>SIGMA Aldrich (dla ECACC)</td><td>90011609</td><td>Linia komórkowa Nthy-ori 3-1 ludzkie, komórki nabłonka pęcherzyków tarczycy</td></tr><tr><td>Proliferacja komórek Zestaw I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Zestaw do oznaczania proliferacji komórek</td></tr></tbody></table>

wyciszanie brca2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez brca2 w hodowanych komórkach ludzkich

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Wyciszenie białka supresorowego BRCA2 i jego wykrycie za pomocą konwencjonalnych analiz biochemicznych stanowi wielkie wyzwanie techniczne ze względu na duży rozmiar ludzkiego białka BRCA2 (około 390 kDa). Informujemy o modyfikacjach standardowych protokołów transfekcji siRNA i immunoblottingu w celu wyciszenia ludzkiego BRCA2 i wykrycia endogennego białka BRCA2 w ludzkich liniach komórkowych nabłonka. Kluczowe kroki obejmują wysoki stosunek odczynnika siRNA do transfekcji i dwie kolejne rundy transfekcji siRNA w tym samym eksperymencie. Korzystając z tych i innych modyfikacji standardowego protokołu, konsekwentnie osiągamy ponad 70% wyciszenie ludzkiego genu BRCA2, co oceniono na podstawie analizy immunoblottingu z przeciwciałami anty-BRCA2. Ponadto denaturacja lizatów komórkowych w temperaturze 55 °C zamiast konwencjonalnej 70-100 °C oraz inne techniczne optymalizacje procedury immunoblottingu umożliwiają wykrycie nienaruszonego białka BRCA2 nawet wtedy, gdy dostępne są bardzo małe ilości materiału wyjściowego lub gdy poziomy ekspresji białka BRCA2 są bardzo niskie. Skuteczne wyciszanie BRCA2 w komórkach ludzkich stanowi cenną strategię zakłócania funkcji BRCA2 w komórkach z nienaruszonym BRCA2, w tym w komórkach nowotworowych, w celu zbadania nowych szlaków molekularnych i funkcji komórkowych, na które mogą mieć wpływ patogenne mutacje BRCA2 w nowotworach. Adaptacja tego protokołu do skutecznego wyciszania i analizy innych "dużych" białek, takich jak BRCA2, powinna być łatwo osiągalna.

Przed przystąpieniem do analizy biologicznej/biochemicznej w celu zbadania wpływu wyciszenia genu BRCA2 na funkcje komórkowe, pierwszym krokiem jest potwierdzenie swoistości wyciszenia poprzez równoległe zastosowanie kontrolowanego siRNA (siRNA niecelującego) oraz BRCA2 siRNA (małe interferujące RNARysunek 1A). Ważne jest przeprowadzenie drugiej rundy transfekcji siRNA przy zastosowaniu wysokiego stosunku siRNA do czynnika transfekcyjnego, aby uzyskać wysoką wydajność BRCA2 wyciszanie. ...

Wyciszanie genów przez siRNA stanowi wygodną strategię eksperymentalną do analizy funkcji biologicznych zależnych od BRCA2 z natychmiastowymi implikacjami dla lepszego zrozumienia biologii raka. Przedstawiono metodę skutecznego wyciszania BRCA2 wraz z eksperymentalną procedurą wykrywania i ilościowego określania zmian w ekspresji białka BRCA2 poprzez immunoblotting w ludzkich liniach komórkowych.

Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyciszenie ekspresji B RCA two poprzez transfekcję SIR A. Jest to realizowane poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności kompleksów odczynnika do transfekcji z SIR a. Następnie przeprowadza się pierwszą rundę transfekcji, dodając kompleksy kroplowo do monowarstwy komórek o 80% konfluencji. Następnie wykonuje się drugą rundę transfekcji SIR a, stosując wyższy stosunek SIR A do odczynnika do transfekcji.Na koniec monowarstwy komórek przemywa się lodowatym PBS, a następnie komórki poddaje się lizie w temperaturze 4°C z użyciem buforu lizującego na bazie detergentu. Ostatecznie, do wykazania wyciszenia B RCA A dwa na poziomie białka wykorzystuje się analizę Western blotting. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona efektywne wyciszanie genów, a także optymalną detekcję białek o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak supresor nowotworowy B RCA two. Aby rozpocząć, po wyhodowaniu monowarstw ludzkich komórek nabłonkowych w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide w komorze wilgotnościowej, należy usunąć pożywkę wzrostową i przemyć komórki roztworem PBS o temperaturze pokojowej.Aby odlepić komórki od płytki, należy dodać dwa mililitry roztworu 0,25% trypsyny i 0,53 millimolar EDTA, a następnie inkubować przez od trzech do pięciu minut, w zależności od typu komórek. Trypsynę należy zneutralizować, dodając dwa mililitry pełnej pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS, przed przeniesieniem komórek do probówki o pojemności 15 mililitrów. Probówki należy umieścić w rotorze z koszyczkami i wirować przy 320 do 330 Gs i czterech stopniach Celsius w temperaturze 4 °C przez trzy minuty.Użyj 5 mL medium bez antybiotyków, aby resuspender osady przed policzeniem komórek przy użyciu komory Bürkera lub automatycznego systemu zliczania. Następnie nanieś około 0,5 do 1 × 10⁶ komórek w 2 mL medium bez antybiotyków do każdego dołka płytek 6-dołkowych i inkubuj przez 24 godziny do osiągnięcia 80% konfluencji. Po inkubacji przystąp do pierwszej rundy transfekcji, rozcieńczając 6 µL odczynnika do transfekcji specyficznego dla siRNA na bazie lipidów w 130 µL medium z obniżoną zawartością surowicy.Rozcieńczyć 3 µL siRNA S o stężeniu 10 µM w 130 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Połączyć rozcieńczone siRNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i inkubować przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. W czasie inkubacji usunąć pożywkę z komórek i dodać 2 mL świeżej pożywki bez antybiotyków.Podgrzać wstępnie do 37 °C. Następnie do każdej studni z komórkami na płytce 6-dołkowej dodać 250 µL kompleksów odczynnika do transfekcji siRNA. Następnie inkubować komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.Po 24 godzinach należy rozcieńczyć 5 µL 10 µM siRNA w 130 µL medium z redukowaną zawartością surowicy, a następnie przeprowadzić drugą rundę transfekcji, zgodnie z przedstawioną procedurą. Wysokie stężenie siRNA w drugiej rundzie jest niezbędne do uzyskania wysokiej wydajności wyciszenia Brca2.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez jeden do dwóch dni przed analizą, aby przygotować lizat komórkowy do analizy immunoblottingowej. Przygotuj świeży bufor do lizy zgodnie z podanym tutaj przepisem. Usuń medium z komórek i dodaj 2 mL lodowatego PBS na każdą studzienkę, aby wyprać komórki.Następnie całkowicie usunąć PBS z płytki i dodać 200 µL lodowatego buforu do lizy do każdego dołka. Delikatnie obrócić płytkę, aby równomiernie rozprowadzić bufor do lizy, a następnie inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Następnie, używając skrobaczki do komórek.Lizat komórkowy zebrać do probówki do mikrocentryfugi i inkubować w lodzie, a następnie odwirować przy 17 900 Gs i temperaturze 4 °C przez 25 minut. Zebrać supernatant w celu przeprowadzenia analizy immunoblottingu. Przygotować bufor do elektroforezy, rozcieńczając 50 ml 20-krotnego buforu do elektroforezy Tris-octan SDS w 950 ml wody destylowanej. Próbkę przygotować w następujący sposób.Dodaj 15 µg całkowitego lizatu komórkowego. Dodaj 5 µL czterokrotnego buforu do próbek zawierającego dodecylosiarczan sodu w pH 8,4, 2 µL 0,5 M DTT oraz bufor do lizy do uzyskania całkowitej objętości 20 µL. Denaturuj próbki w temperaturze 55 °C przez 10 minut.Kluczowe jest zastosowanie tej temperatury, ponieważ białko RCA two jest wrażliwe na działanie wysokich temperatur. Następnie należy przygotować komorę elektroforetyczną zgodnie z instrukcjami producenta. Potem nanieś próbki w 10 µL standardu białkowego o wysokiej masie cząsteczkowej na gotowy żel i prowadź elektroforezę przy napięciu 120 V przez około dwie godziny.W międzyczasie przygotuj bufor do transferu, mieszając 50 mililitrów 20 x buforu do transferu, 100 mililitrów 100% metanolu oraz 850 mililitrów wody. Aktywuj membranę PVDF, mocząc ją w 100% metanolu przez pięć minut. Przepłucz wodą destylowaną i inkubuj w buforze do transferu przez co najmniej pięć minut w celu wyrównania warunków.Namaczaj gąbki urządzenia do transferu w buforze do transferu w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu użycia. Przerwij elektroforezę przed tym, jak niebieski marker 55 kilodalton opuści żel prekastowany, a następnie złóż „kanapkę”, zaczynając od trzech gąbek namoczonych w buforze do transferu. Następnie połóż jeden arkusz papieru 3 mm nasycony buforem do transferu.Następnie dodaj żel, potem aktywowaną membranę PVDF, a w dalszej kolejności jeden arkusz papieru jakościowej 3M nasączony buforem i na koniec trzy nasączone gąbki. Umieść tak przygotowany zestaw w aparacie i przeprowadź transfer białek przy natężeniu 350 mA przez cztery godziny w temperaturze 4 °C lub przy 180 mA w temperaturze 4 °C przez noc. Po transferze przemyj membranę buforem TBS, a następnie inkubuj przez jedną godzinę w celu blokowania w buforze TBST z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka w proszku.Następnie należy zastąpić bufor dziewięcioma mililitrami buforu TBST z mlekiem zawierającego 30 µL przeciwciała króliczego poliklonalnego przeciwko BCA2 i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Po trzykrotnym przemyciu membrany buforem TBST przez 10 minut za każdym razem, inkubować filtr przez jedną godzinę z 1 µL przeciwciała wtórnego anty-króliczego sprzężonego z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonego w 10 mililitrach buforu TBST z mlekiem. Po trzykrotnym przemyciu membrany przeprowadzić detekcję immunoluminescencyjną KEMMA zgodnie z instrukcjami producenta.Wizualizuj prążki na filmach ECL o wysokiej rozdzielczości, aby potwierdzić swoistość wyciszania B rca. A. Obok irna B RCA dwa użyto irna scrambled, jak pokazano tutaj; jak wspomniano wcześniej, ważne jest przeprowadzenie drugiej rundy transfekcji irna z wysokim stosunkiem irna do transfekcji, aby uzyskać wysoką wydajność wyciszania B RCA A dwa.Przedstawione tutaj wyniki obrazują różnicę w wydajności wyciszania genów w zależności od zastosowania niskiego lub wysokiego stosunku siRNA do czynnika transfekcyjnego, zależnie od typu komórek. Optymalny minimalny czas potrzebny do uzyskania najwyższego poziomu wyciszenia genu może się różnić po drugiej rundzie transfekcji siRNA; na przykład, jak pokazano na tej rycinie, 24 godziny są wystarczające dla komórek tarczycy NTHY, natomiast w przypadku wydajnego wyciszenia B RCA A two w komórkach prostaty PNT one A wymagane jest do 48 godzin. Wyciszenie b RCA two jest dość stabilne aż do siódmego dnia po drugiej rundzie transfekcji. Jak wspomniano wcześniej, denaturacja lizatów komórkowych w temperaturze powyżej 55 °C skutkuje utratą do 50% białka B RCA A two.W tym eksperymencie zbadano wrażliwość komórek PNT1A z wyciszonym genem BRCA2 na inhibitor PARP, rukaparib, po 24-godzinnej inkubacji z lekiem. Obserwowano zależny od czasu spadek proliferacji komórek PNT1A pozbawionych BRCA2 w porównaniu z grupą kontrolną. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze rozumieć, jak wyciszać długie geny kodujące białka za pomocą CRISPR/Cas9 oraz jak efektywnie wykrywać ich produkt białkowy za pomocą zoptymalizowanej procedury blokowania immunologicznego, na przykładzie białka BRCA2.Metodę tę można zastosować do wielu innych problematycznych dużych białek, szczególnie gdy są one ekspresjonowane w komórkach na bardzo niskim poziomie.

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy metodę testowania wariantów BRCA1 w teście opartym na hodowli tkankowej dla homologicznej naprawy pęknięć DNA, polegającą na usunięciu endogennego białka BRCA1 z komórki za pomocą RNAi i zastąpieniu go mutantem punktowym BRCA1 zawierającym zmianę kodującą.

Identyfikacja wpływu mutacji BRCA1 na rekombinację homologiczną z wykorzystaniem komórek wykazujących endogenną ekspresję BRCA1 typu dzikiego

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Osoby z mutacjami BRCA1 mają wyższe ryzyko zachorowania na raka, co gwarantuje dokładną ocenę funkcji wariantów BRCA1. W tym artykule opisaliśmy protokół oceny funkcjonalnej wariantów BRCA1 przy użyciu edytorów zasad cytozyny za pośrednictwem CRISPR, które umożliwiają ukierunkowaną konwersję C:G do T:A w żywych komórkach.

Ocena funkcjonalna wariantów BRCA1 za pomocą edytorów bazowych za pośrednictwem CRISPR

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

To badanie przedstawia podwójny system CRISPRi ukierunkowany na długie, niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Umożliwia kombinatoryczne knockdown genów i syntetyczne badania przesiewowe ze skutkiem śmiertelnym, identyfikując interakcje lncRNA specyficzne dla raka dla potencjalnych strategii terapeutycznych.

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Poznaj metodę wyciszania genu BRCA2 przy użyciu transfekcji siRNA w hodowanych komórkach ludzkich. Technika ta umożliwia skuteczną analizę ekspresji białka metodą Western blotting w badaniach nad rakiem.

Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich

Przeglądaj więcej filmów