Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich

Ogólnym celem tej procedury jest wyciszenie ekspresji B RCA dwa przez transfekcję SIR A. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie kompleksów odczynników do transfekcji SIR. Następnie przeprowadza się pierwszą rundę transfekcji, dodając kompleksy kroplami do monowarstwy komórek, które mają płynność 80% CO. Następnie przeprowadza się drugą rundę transfekcji SIR a przy użyciu wyższego stosunku odczynnika SIR, A do transfekcji.

Na koniec monowarstwy komórek przemywa się lodowatym PBS, a komórki poddaje się lizie w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą buforu do lizy na bazie detergentu. Ostatecznie, analiza Western blot jest stosowana w celu wykazania wyciszenia B RCA A dwa na poziomie białka. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia skuteczne wyciszanie genów, a także optymalne wykrywanie białek o dużej masie cząsteczkowej, takich jak supresor guza B RCA dwa Aby rozpocząć po wyhodowaniu monowarstw ludzkich komórek nabłonka w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej komorze, usuń pożywkę wzrostową i użyj PBS o temperaturze pokojowej do umycia komórek.

Aby odłączyć komórki od płytki, dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny 0,53 milimolowego roztworu EDTA i inkubuj przez trzy do pięciu minut, w zależności od typu komórki. Zneutralizuj trypsynę, dodając dwa mililitry kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS przed przeniesieniem komórek do 15-mililitrowej probówki. Umieść probówki w obracającym się wirniku kubełkowym i odwiruj w temperaturze od 320 do 330 G i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty.

Użyj pięciu mililitrów pożywki wolnej od antybiotyków, aby ponownie zawiesić granulki przed użyciem komory burkera lub automatycznego systemu liczenia do policzenia komórek. Następnie umieść około 0,5 do jednego razy 10 do sześciu komórek w dwóch mililitrach pożywki wolnej od antybiotyków w każdym dołku z sześcioma płytkami dołkowymi i inkubuj przez 24 godziny do 80% płynności. Po inkubacji przystąp do pierwszej rundy transfekcji, rozcieńczając sześć mikrolitrów odczynnika do transfekcji specyficznego dla irna na bazie lipidów w 130 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy.

Rozcieńczyć trzy mikrolitry 10 mikromolowych S irna w 130 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy. Połączyć rozcieńczony irna z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i inkubować przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji usuń pożywkę z komórek i dodaj dwa mililitry świeżej pożywki bez antybiotyków.

Podgrzej w 37 stopniach Celsjusza. Następnie w 250 mikrolitrach kompleksów odczynników do transfekcji siRNA do każdej studzienki komórek na płytce sześciodołkowej. Następnie inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po 24 godzinach rozcieńczyć pięć mikrolitrów 10 mikromolowego irna w 130 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy i przystąpić do drugiej rundy transfekcji, którą właśnie pokazano. Wysokie stężenie sarny w drugiej rundzie jest niezbędne do uzyskania wysokiej skuteczności B rca. Dwa uciszanie.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni przed analizą, aby przygotować lizat komórkowy do analizy immunologicznej. Przygotuj świeży bufor do lizy zgodnie z przepisem pokazanym tutaj. Usuń pożywkę z komórek i dodaj dwa mililitry na studzienkę lodowatego PBS, aby umyć komórki.

Raz całkowicie usuń PBS z płytki i dodaj do każdego 200 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy. Dobrze delikatnie obróć płytkę, aby równomiernie rozprowadzić bufor do lizy i inkubować na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie za pomocą skrobaka do komórek.

Zebrać lizat komórkowy w mikroprobówce wirówkowej na wirówce lodowej w temperaturze 17, 900 G i czterech stopniach Celsjusza przez 25 minut i zebrać supernat w celu przeprowadzenia analizy immunoblottingu. Przygotować bufor do biegania, rozcieńczając 50 mililitrów 20 x octan tris SDS bufor do biegania z 950 mililitrami wody destylowanej. Przygotuj próbkę w następujący sposób.

Dodać 15 mikrogramów całkowitego lizatu komórkowego. Pięć mikrolitrów czterokrotnego buforu do próbek zawierających siarczan litu ESAL o pH 8,42 mikrolitra 0,5 molowego DTT i bufor do lizy o łącznej objętości 20 mikrolitrów. Denaturować próbki w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Bardzo ważne jest, aby używać tej temperatury, ponieważ białko b RCA dwa jest wrażliwe termicznie. Następnie należy ustawić komorę elektroforetyczną zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie załaduj próbki do 10 mikrolitrów wzorca białka restain o wysokiej masie cząsteczkowej na prefabrykowany żel i pracuj pod napięciem 120 woltów przez około dwie godziny.

W międzyczasie przygotuj bufor transferowy z 50 mililitrami 20 x buforem transferowym, 100 mililitrami 100% metanolu i 850 mililitrami wody. Aktywuj membranę PVDF, mocząc ją w 100% metanolu przez pięć minut. Przepłukać wodą destylowaną i zachować równowagę w buforze transferowym przez co najmniej pięć minut.

Namocz gąbki aparatu transferowego w buforze transferowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Przerwij bieg, zanim niebieski znacznik o mocy 55 kilodaltonów opuści prefabrykowany żel i złóż kanapkę, zaczynając od trzech gąbek nasączonych buforem transferowym. Następnie jeden papier o średnicy trzech mm nasączony buforem transferowym.

Następnie dodaj żel, następnie aktywowaną membranę PVDF, a następnie jeden bufor nasączony papierem klasy 3M, a na końcu trzy nasączone gąbki. Umieść stos w aparacie i przenieś białka w temperaturze 350 miliamperów przez cztery godziny i cztery stopnie Celsjusza lub w temperaturze 180 miliamperów i czterech stopni Celsjusza przez noc. Po przeniesieniu użyj TBS do przemycia membrany i bloku przez godzinę TBST i 5% odtłuszczonego mleka w proszku.

Następnie zastąp bufor dziewięcioma mililitrami buforu mlecznego TBST zawierającego 30 mikrolitrów przeciwciała poliklonalnego anty BCA dwóch królików i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po użyciu TBST do trzykrotnego przemycia membrany przez 10 minut, należy inkubować filtr przez godzinę z jednym mikrolitrem sprzężonego z peroksydazą chrzanową przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi, rozcieńczonego w 10 mililitrach buforu mlecznego TBST. Po trzykrotnym umyciu membrany należy wykonać immunodetekcję luminescencji KEMMA zgodnie z zaleceniami producenta.

Wizualizacja pasm na foliach ECL o wysokiej rozdzielczości, aby potwierdzić specyficzność B rca. Dwa uciszanie. Zaszyfrowany irna został użyty obok B RCA dwa irna, jak pokazano tutaj, jak wspomniano wcześniej, ważne jest, aby wykonać drugą rundę transfekcji irna z wysokim stosunkiem irna do transfekcji, aby uzyskać wysoką wydajność B RCA A dwa wyciszenia.

Wyniki pokazują różnicę w skuteczności knockdown między użyciem niskiego i wysokiego stosunku siRNA do transfekcji w zależności od typu komórki. Optymalny minimalny czas uzyskania najwyższego poziomu wyciszenia genów może się różnić po drugiej rundzie transfekcji siRNA, na przykład, jak pokazano na tym rysunku, 24 godziny są wystarczające dla komórek tarczycy NTHY, ale do 48 godzin potrzeba do skutecznego B RCA A dwa knockdown w PNT jeden A komórki prostaty b RCA dwa wyciszenie jest dość stabilne do siódmego dnia po drugiej rundzie transfekcji. Jak wspomniano wcześniej, denaturacja lizatów komórkowych w temperaturze powyżej 55 stopni Celsjusza powoduje do 50% utraty białka B RCA A dwa.

W tym eksperymencie zbadano wrażliwość B RCA A dwóch wyciszonych komórek PNT jeden A na inhibitor PARP rukaparib po 24-godzinnym leczeniu lekiem. Zależny od czasu spadek proliferacji komórek zaobserwowano w B RCA dwóch zubożonych komórkach PNT i jednej A w porównaniu z kontrolą. Po obejrzeniu tego filmu powinien dobrze zrozumieć, jak wyciszyć długie geny kodujące białka przez CRNA i jak skutecznie wykryć ich produkt białkowy za pomocą zoptymalizowanej procedury immunoblokiny oprócz BRC 2.

Materia ta może być zastosowana do wielu innych trudnych dużych białek, szczególnie gdy są one wyrażane na bardzo niskich poziomach w komórkach.