Wyciszanie BRCA2 w celu identyfikacji nowych funkcji biologicznych regulowanych przez BRCA2 w hodowanych komórkach ludzkich

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyciszenie ekspresji B RCA two poprzez transfekcję SIR A. Jest to realizowane poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności kompleksów odczynnika do transfekcji z SIR a. Następnie przeprowadza się pierwszą rundę transfekcji, dodając kompleksy kroplowo do monowarstwy komórek o 80% konfluencji. Następnie wykonuje się drugą rundę transfekcji SIR a, stosując wyższy stosunek SIR A do odczynnika do transfekcji.

Na koniec monowarstwy komórek przemywa się lodowatym PBS, a następnie komórki poddaje się lizie w temperaturze 4°C z użyciem buforu lizującego na bazie detergentu. Ostatecznie, do wykazania wyciszenia B RCA A dwa na poziomie białka wykorzystuje się analizę Western blotting. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona efektywne wyciszanie genów, a także optymalną detekcję białek o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak supresor nowotworowy B RCA two. Aby rozpocząć, po wyhodowaniu monowarstw ludzkich komórek nabłonkowych w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide w komorze wilgotnościowej, należy usunąć pożywkę wzrostową i przemyć komórki roztworem PBS o temperaturze pokojowej.

Aby odlepić komórki od płytki, należy dodać dwa mililitry roztworu 0,25% trypsyny i 0,53 millimolar EDTA, a następnie inkubować przez od trzech do pięciu minut, w zależności od typu komórek. Trypsynę należy zneutralizować, dodając dwa mililitry pełnej pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS, przed przeniesieniem komórek do probówki o pojemności 15 mililitrów. Probówki należy umieścić w rotorze z koszyczkami i wirować przy 320 do 330 Gs i czterech stopniach Celsius w temperaturze 4 °C przez trzy minuty.

Użyj 5 mL medium bez antybiotyków, aby resuspender osady przed policzeniem komórek przy użyciu komory Bürkera lub automatycznego systemu zliczania. Następnie nanieś około 0,5 do 1 × 10⁶ komórek w 2 mL medium bez antybiotyków do każdego dołka płytek 6-dołkowych i inkubuj przez 24 godziny do osiągnięcia 80% konfluencji. Po inkubacji przystąp do pierwszej rundy transfekcji, rozcieńczając 6 µL odczynnika do transfekcji specyficznego dla siRNA na bazie lipidów w 130 µL medium z obniżoną zawartością surowicy.

Rozcieńczyć 3 µL siRNA S o stężeniu 10 µM w 130 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Połączyć rozcieńczone siRNA z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i inkubować przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. W czasie inkubacji usunąć pożywkę z komórek i dodać 2 mL świeżej pożywki bez antybiotyków.

Podgrzać wstępnie do 37 °C. Następnie do każdej studni z komórkami na płytce 6-dołkowej dodać 250 µL kompleksów odczynnika do transfekcji siRNA. Następnie inkubować komórki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

Po 24 godzinach należy rozcieńczyć 5 µL 10 µM siRNA w 130 µL medium z redukowaną zawartością surowicy, a następnie przeprowadzić drugą rundę transfekcji, zgodnie z przedstawioną procedurą. Wysokie stężenie siRNA w drugiej rundzie jest niezbędne do uzyskania wysokiej wydajności wyciszenia Brca2.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez jeden do dwóch dni przed analizą, aby przygotować lizat komórkowy do analizy immunoblottingowej. Przygotuj świeży bufor do lizy zgodnie z podanym tutaj przepisem. Usuń medium z komórek i dodaj 2 mL lodowatego PBS na każdą studzienkę, aby wyprać komórki.

Następnie całkowicie usunąć PBS z płytki i dodać 200 µL lodowatego buforu do lizy do każdego dołka. Delikatnie obrócić płytkę, aby równomiernie rozprowadzić bufor do lizy, a następnie inkubować na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Następnie, używając skrobaczki do komórek.

Lizat komórkowy zebrać do probówki do mikrocentryfugi i inkubować w lodzie, a następnie odwirować przy 17 900 Gs i temperaturze 4 °C przez 25 minut. Zebrać supernatant w celu przeprowadzenia analizy immunoblottingu. Przygotować bufor do elektroforezy, rozcieńczając 50 ml 20-krotnego buforu do elektroforezy Tris-octan SDS w 950 ml wody destylowanej. Próbkę przygotować w następujący sposób.

Dodaj 15 µg całkowitego lizatu komórkowego. Dodaj 5 µL czterokrotnego buforu do próbek zawierającego dodecylosiarczan sodu w pH 8,4, 2 µL 0,5 M DTT oraz bufor do lizy do uzyskania całkowitej objętości 20 µL. Denaturuj próbki w temperaturze 55 °C przez 10 minut.

Kluczowe jest zastosowanie tej temperatury, ponieważ białko RCA two jest wrażliwe na działanie wysokich temperatur. Następnie należy przygotować komorę elektroforetyczną zgodnie z instrukcjami producenta. Potem nanieś próbki w 10 µL standardu białkowego o wysokiej masie cząsteczkowej na gotowy żel i prowadź elektroforezę przy napięciu 120 V przez około dwie godziny.

W międzyczasie przygotuj bufor do transferu, mieszając 50 mililitrów 20 x buforu do transferu, 100 mililitrów 100% metanolu oraz 850 mililitrów wody. Aktywuj membranę PVDF, mocząc ją w 100% metanolu przez pięć minut. Przepłucz wodą destylowaną i inkubuj w buforze do transferu przez co najmniej pięć minut w celu wyrównania warunków.

Namaczaj gąbki urządzenia do transferu w buforze do transferu w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu użycia. Przerwij elektroforezę przed tym, jak niebieski marker 55 kilodalton opuści żel prekastowany, a następnie złóż „kanapkę”, zaczynając od trzech gąbek namoczonych w buforze do transferu. Następnie połóż jeden arkusz papieru 3 mm nasycony buforem do transferu.

Następnie dodaj żel, potem aktywowaną membranę PVDF, a w dalszej kolejności jeden arkusz papieru jakościowej 3M nasączony buforem i na koniec trzy nasączone gąbki. Umieść tak przygotowany zestaw w aparacie i przeprowadź transfer białek przy natężeniu 350 mA przez cztery godziny w temperaturze 4 °C lub przy 180 mA w temperaturze 4 °C przez noc. Po transferze przemyj membranę buforem TBS, a następnie inkubuj przez jedną godzinę w celu blokowania w buforze TBST z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka w proszku.

Następnie należy zastąpić bufor dziewięcioma mililitrami buforu TBST z mlekiem zawierającego 30 µL przeciwciała króliczego poliklonalnego przeciwko BCA2 i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Po trzykrotnym przemyciu membrany buforem TBST przez 10 minut za każdym razem, inkubować filtr przez jedną godzinę z 1 µL przeciwciała wtórnego anty-króliczego sprzężonego z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonego w 10 mililitrach buforu TBST z mlekiem. Po trzykrotnym przemyciu membrany przeprowadzić detekcję immunoluminescencyjną KEMMA zgodnie z instrukcjami producenta.

Wizualizuj prążki na filmach ECL o wysokiej rozdzielczości, aby potwierdzić swoistość wyciszania B rca. A. Obok irna B RCA dwa użyto irna scrambled, jak pokazano tutaj; jak wspomniano wcześniej, ważne jest przeprowadzenie drugiej rundy transfekcji irna z wysokim stosunkiem irna do transfekcji, aby uzyskać wysoką wydajność wyciszania B RCA A dwa.

Przedstawione tutaj wyniki obrazują różnicę w wydajności wyciszania genów w zależności od zastosowania niskiego lub wysokiego stosunku siRNA do czynnika transfekcyjnego, zależnie od typu komórek. Optymalny minimalny czas potrzebny do uzyskania najwyższego poziomu wyciszenia genu może się różnić po drugiej rundzie transfekcji siRNA; na przykład, jak pokazano na tej rycinie, 24 godziny są wystarczające dla komórek tarczycy NTHY, natomiast w przypadku wydajnego wyciszenia B RCA A two w komórkach prostaty PNT one A wymagane jest do 48 godzin. Wyciszenie b RCA two jest dość stabilne aż do siódmego dnia po drugiej rundzie transfekcji. Jak wspomniano wcześniej, denaturacja lizatów komórkowych w temperaturze powyżej 55 °C skutkuje utratą do 50% białka B RCA A two.

W tym eksperymencie zbadano wrażliwość komórek PNT1A z wyciszonym genem BRCA2 na inhibitor PARP, rukaparib, po 24-godzinnej inkubacji z lekiem. Obserwowano zależny od czasu spadek proliferacji komórek PNT1A pozbawionych BRCA2 w porównaniu z grupą kontrolną. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze rozumieć, jak wyciszać długie geny kodujące białka za pomocą CRISPR/Cas9 oraz jak efektywnie wykrywać ich produkt białkowy za pomocą zoptymalizowanej procedury blokowania immunologicznego, na przykładzie białka BRCA2.

Metodę tę można zastosować do wielu innych problematycznych dużych białek, szczególnie gdy są one ekspresjonowane w komórkach na bardzo niskim poziomie.