Name: Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania mutantów transposonowych Coxiella burnetii i ich wielofenotypowego badania przesiewowego. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla cyklu zakaźnego tego patogena.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Avenir/ATIP dla Matteo Bonazziego i CIG Marie Curie (nr 293731) dla Erica Martineza. Autorzy chcieliby podziękować dr Robertowi Heinzenowi za podzielenie się szczepami, przeciwciałami i narzędziami C. burnetii, Virginie Georget i Sylvainowi DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) za ich pomoc techniczną i analizę danych.

<ol><li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li>
<li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li>
<li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li>
<li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%3A+a+biological+weapon+in+your+backyard%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li>
<li>Der Hoek, W. V. an, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li>
<li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.%3A+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).</li>
<li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+OmpA%2C+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion%2C+by+multi-phenotypic+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013(2014).</li>
<li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li>
<li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot%2FIcm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566(2013).</li>
<li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+tiger+into+a+house+cat%3A+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii.%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii.</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li>
<li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li>
<li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot%2FIcm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li>
<li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li>
<li>Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97(2011).</li>
<li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+screening+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Badanie interakcji gospodarz/patogen okazało się niezwykłą metodą zrozumienia infekcji bakteryjnych i opracowania alternatywnych strategii przeciwdziałania chorobom zakaźnym. Jednak ze względu na różnorodność strategii opracowanych przez różne patogeny bakteryjne, identyfikacja i charakterystyka czynników wirulencji bakterii oraz szlaków sygnałowych gospodarza, które są celem podczas infekcji, stanowi prawdziwe wyzwanie. Wymaga to opracowania nowych podejść do identyfikacji na dużą skalę kluczowych węzłów interakcji gospodarz/patogen. Niedawny rozwój innowacyjnych, wysokowydajnych i bogatych technik badań przesiewowych stanowi nieocenione źródło informacji, które można zaadaptować do badania wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych15. W tym przypadku wykorzystaliśmy odzwierzęcy patogen bakteryjny Coxiella burnetii jako model do opracowania podejść przesiewowych, które łączą mutagenezę transpozonów i testy oparte na fluorescencji. Co ważne, ta metoda przesiewowa umożliwia jednoczesne monitorowanie wielu etapów cyklu wewnątrzkomórkowego Coxiella , zapewniając globalny przegląd strategii opracowanych przez tę bakterię w celu inwazji, replikacji i utrzymywania się w zakażonych komórkach.
Opisane tutaj podejście opiera się na dwóch dobrze znanych technikach, mutagenezie transpozonów i testach opartych na fluorescencji, które zostały z powodzeniem zastosowane do badania patogenów bakteryjnych. Połączenie tych technik w kontekście badań przesiewowych o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości pozwala nam ocenić skutki dużej liczby mutacji bakteryjnych poprzez analizę bardzo dużej liczby zdarzeń (zazwyczaj obrazuje się i analizuje 15 000 zakażonych komórek na mutację bakteryjną). Zapewnia to ważną analizę statystyczną zdarzeń, takich jak inwazja bakterii na komórki gospodarza i replikacja wewnątrzkomórkowa, które z natury podlegają dużej zmienności. Ważne jest, aby pamiętać, że linie komórkowe inne niż nabłonkowe mogą być wykorzystywane do tego typu badań przesiewowych. Jednak płaskie i duże komórki nabłonkowe są optymalne do analizy obrazu, ponieważ organelle komórek gospodarza są łatwiejsze do wykrycia. Ponieważ większość mikroskopów automatycznych może automatycznie obsługiwać dużą liczbę płytek, nie ma praktycznie żadnych ograniczeń co do liczby mutantów, które mogą być jednocześnie badane. W zależności od patogenu użytkownik może zdecydować się na użycie mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Czas akwizycji obrazu będzie zależał głównie od czułości kamery mikroskopowej, od liczby pól pozyskanych na studzienkę oraz od liczby kanałów pozyskanych w polu widzenia. Użytkownik może zdecydować, w jaki sposób dostosować te czynniki, aby zoptymalizować protokół przesiewowy. Dla przykładu, zobrazowaliśmy jedną 96-dołkową płytkę/godz., używając warunków wskazanych w punkcie 5.1. Analiza obrazu w dużej mierze zależy od używanej maszyny (lub grupy maszyn). Korzystamy ze stacji roboczej 12-rdzeniowej (2 x 3,06 GHz 6-rdzeniowej), 48 GB RAM. To urządzenie potrzebuje około 40 minut na analizę obrazów uzyskanych z jednej płyty.
Ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu tych testów, jest ustanowienie nowych (lub optymalizacja istniejących) protokołów, aby umożliwić manipulację i przetwarzanie dużej liczby próbek. Typowym przykładem jest opracowanie metody PCR z pojedynczą kolonią starterów, która pozwoliła nam szybko amplifikować i sekwencjonować fragmenty DNA Coxiella zawierające miejsce insercji każdego transpozonu, z bardzo małych próbek. Opierając się na naszym doświadczeniu, polimeraza o wysokiej wierności musi być starannie dobrana i przetestowana w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Jedynym ograniczeniem tego podejścia może być obserwacja, że w większości przypadków około 30% przetworzonych próbek nie nadaje się do wykorzystania, ani ze względu na PCR, ani etapy sekwencjonowania. Biorąc jednak pod uwagę, że izolacja nowych mutantów transpozonu Coxiella nie jest krokiem ograniczającym szybkość, nie stanowi to poważnego problemu. Kluczowe znaczenie dla tego podejścia miało również opracowanie wiarygodnego testu do ilościowego określania stężenia bakterii w stadach mutantów. Ze względu na tendencję Coxiella do agregacji w zawiesinie, zastosowanie odczytów gęstości optycznej nie ma zastosowania do obliczania stężenia kultur Coxiella , a jedyną istniejącą alternatywą był ilościowy PCR (qPCR). W tym przypadku zastosowanie fluorescencyjnie znakowanego środka interkalującego DNA znacznie przyspieszyło ocenę ilościową bakterii.
Podejście to może również wykorzystać wykorzystanie stabilnych linii komórkowych wykazujących ekspresję markerów fluorescencyjnych dla kilku przedziałów wewnątrzkomórkowych w zależności od zastosowanego patogenu. Kolejnym ważnym aspektem jest stosowanie pożywek do hodowli komórkowych pozbawionych czerwieni fenolowej. Zaobserwowaliśmy, że ten wskaźnik pH ma naturalną fluorescencję obejmującą widmo czerwone i zielone, które nasyca sygnał zarejestrowany na automatycznym czytniku fluorescencji.
Przedstawiona tutaj strategia opiera się na losowej mutagenezie transpozonów. W przypadku interesujących mutantów zalecamy walidację unikalnych transpozycji (i klonalności) przy użyciu amplifikacji Southern blot i PCR miejsca insercji transpozonu.
Oprócz sprzętu opisanego w sekcji dotyczącej protokołu, zespoły zainteresowane zastosowaniem przedstawionego tu podejścia przesiewowego będą miały duże korzyści w tworzeniu relacyjnej bazy danych do gromadzenia danych, serwera do przechowywania danych oraz stacji roboczej do szybkiej analizy obrazu.
Co ważne, opisana tutaj metoda nadaje się do badania innych wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych, pod warunkiem, że istnieje metoda mutagenezy losowej dla patogenu, linie komórkowe mogą być zakażone patogenem, a ten wykazuje określony fenotyp podczas infekcji.

Pojawiająca się, endemiczna bakteria Coxiella burnetii jest odpowiedzialna za duże wybuchy gorączki Q, wyniszczającej grypopodobnej choroby odzwierzęcej o poważnych skutkach zdrowotnych i ekonomicznych1. Głównymi rezerwuarami Coxielli są zwierzęta domowe i gospodarskie, a szacuje się, że ponad 90% bydła mlecznego w USA jest nosicielami C. burnetii2. Ludzie są przypadkowymi żywicielami, którzy zarażają się poprzez wdychanie skażonych aerozoli. Ludzka gorączka Q objawia się jako ostra lub przewlekła choroba, która może mieć śmiertelne powikłania, a śmiertelność sięga 65%1,3. Z zakaźną dawką 1 - 10 organizmów, Coxiella jest najbardziej zakaźnym znanym patogenem i została przebadana jako potencjalna broń biologiczna4. Niedawny wybuchowy wybuch gorączki Q w Holandii (2007 - 2010), w którym liczba przypadków wzrosła ze 182 do ponad 2000 rocznie, jest przykładem ciężkiej zjadliwości tego patogenu5.
Niezwykła skuteczność infekcji Coxiella jest prawdopodobnie związana z jej odpornością na stres środowiskowy, w połączeniu z unikalną adaptacją do komórek gospodarza. Rzeczywiście, Coxiella jest obecna w środowisku w postaci metabolicznie nieaktywnych wariantów małych komórek (SCV), które są niezwykle odporne na kilka trudnych warunków (wysuszenie, temperatura itp.). SCV są wychwytywane przez komórki fagocytarne za pośrednictwem integryn αVβ3 6, podczas gdy inwazja komórek niefagocytarnych odbywa się za pośrednictwem adhezji/inwazji Coxiella OmpA7 i jeszcze niezidentyfikowanego receptora. Po wychwycie Coxiella znajduje się w ciasno przylegających wakuolach, dodatnich dla wczesnych markerów endosomalnych Rab5 i EEA18. Bakterie reagują na zakwaszenie endosomalne, przekształcając się w metabolicznie aktywne warianty dużych komórek (LCV) i aktywując system wydzielania Dot/Icm typu 4 (T4SS)9, wysoce homologiczny do Legionella pneumophila10. Wydzielanie efektorów Dot / Icm pozwala Coxiella na wytworzenie dużego, dodatniego LAMP1 kwaśnego kompartmentu zawierającego aktywne enzymy lizosomalne, w którym bakterie mogą się rozwijać i aktywnie chronić zakażone komórki przed apoptozą11. W związku z tym cykl wewnątrzkomórkowy Coxiella jest kontrolowany przez translokację efektorów bakteryjnych za pośrednictwem Dot / ICM12, jednak czynniki mikrobiologiczne zaangażowane w inwazję komórek gospodarza, replikację bakterii i rozprzestrzenianie się infekcji pozostają w dużej mierze nieznane.
Łącząc mutagenezę transpozonów i testy oparte na fluorescencji, rozwijamy bezstronne podejścia do jednoczesnej identyfikacji czynników bakteryjnych zaangażowanych w główne etapy infekcji Coxiella: 1) internalizacja w komórkach gospodarza, 2) replikacja wewnątrzkomórkowa, 3) rozprzestrzenianie się z komórki na komórkę i 4) trwałość. Do tej pory przeprowadziliśmy badania przesiewowe ponad 1000 mutacji w 500 sekwencjach kodujących Coxiella, co dostarczyło nam bezprecedensowego wglądu w interakcje gospodarz-patogen, które regulują patogenezę Coxiella 7. Warto zauważyć, że podejście to można zastosować do badania innych patogenów wewnątrzkomórkowych, które mają wspólne cechy biologii komórki z Coxiella.

<table><tbody><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Siarczan żelaza</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Casamino acids</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>Metylo-B-cyklodekstryna</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>RPMI z glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 średni składnik</td></tr><tr><td>RPMI z glutamaxem, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>Do hodowli komórkowej i infekcji</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GE SH30071 opieki zdrowotnej</td><td></td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji 0,1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Do transformacji Coxiella</td></tr><tr><td>Trackmates przykręcane górne rurki z zaślepkami</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D zakrętka z kodem kreskowym</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka z czarnymi ściankami i dnem</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Płaskie ciemne dno, do oznaczania ilościowego dsDNA</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka PCR</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>Płytka 96-dołkowa wolna od DNAzy/RNAzy</td></tr><tr><td>, głębokostudzienkowa</td><td>949481</td><td>Labcon Do infekcji mutantami Coxiella</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>Do oznaczania ilościowego dsDNA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>Do oznaczania ilościowego dsDNA</td></tr><tr><td>Phusion polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Dla pojedynczego kolonia starterów PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Czerwony CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-LAMP1</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>Do obrazowania</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescencyjny mikroskop automatyczny Cellomika</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów coxiella burnetii

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Inwazja i kolonizacja komórek gospodarza przez patogeny bakteryjne zależy od aktywności dużej liczby białek prokariotycznych, zdefiniowanych jako czynniki wirulencji, które mogą podważać i manipulować kluczowymi funkcjami gospodarza. Badanie interakcji gospodarz/patogen jest zatem niezwykle ważne dla zrozumienia infekcji bakteryjnych i opracowania alternatywnych strategii przeciwdziałania chorobom zakaźnym. Podejście to wymaga jednak opracowania nowych, wysokoprzepustowych testów do bezstronnej, zautomatyzowanej identyfikacji i charakterystyki determinantów wirulencji bakterii. W tym miejscu opisujemy metodę generowania biblioteki mutantów znakowanych GFP przez mutagenezę transpozonów oraz rozwój podejść przesiewowych o wysokiej zawartości do jednoczesnej identyfikacji wielu fenotypów związanych z transpozonami. Naszym modelem roboczym jest wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny Coxiellaburnetii, czynnik etiologiczny gorączki Q choroby odzwierzęcej, która wiąże się z poważnymi wybuchami epidemii, a w konsekwencji obciążeniem zdrowotnym i ekonomicznym. Obligatoryjny wewnątrzkomórkowy charakter tego patogenu do niedawna poważnie utrudniał identyfikację czynników bakteryjnych zaangażowanych w interakcje patogenów gospodarza, co czyni Coxiella idealnym modelem do wdrażania podejść o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości.

Po wyizolowaniu mutantów transpozonycznych, PCR kolonii z użyciem pojedynczego primera stanowi niezawodną, wysokoprzepustową metodę identyfikacji miejsca insercji transpozonu dla każdego mutanta. Podejście to wywodzi się z typowego protokołu nested PCR, jednak w tym przypadku pojedynczy primer hybrydyzuje specyficznie i/lub niespecyficznie z matrycowym DNA, w zależności od rygorystyczności temperatury przyłączania (Rysunek 1A). Typowe produkty PCR składają się z wielu fragmentów DNA, z których większość jest specyficzna (Rysunek 1B). Zastosowanie innego primera sekwencyjnego, który przyłącza się bezpośrednio powyżej ITR transpozonu i poniżej sekwencji rozpoznawanej przez primer amplifikacyjny, zapewnia specyficzność etapu sekwencjonowania (Rysunek 1C). Zautomatyzowane oprogramowanie do analizy sekwencji dopasowuje uzyskane sekwencje do genomu Coxiella, wskazując dokładne miejsce insercji transpozonów (Rysunek 1C). Wszystkie insercje transpozonów mogą być następnie naniesione na mapę genomu Coxiella (Rysunek 1D).
Każdy mutant Coxiella jest izolowany i namnażany aksenicznie w pożywce ACCM-2 przed przechowywaniem lub przesiewaniem. Rycina 2 przedstawia przykład 38 mutantów transpozonowych w 16 genach dot/icm Coxiella (Rycina 2A). Aby ocenić żywotność mutantów Coxiella, krzywe wzrostu aksenicznego uzyskuje się poprzez pobieranie próbek kultur bakteryjnych przez 7 dni po inokulacji i zastosowanie testu stężenia bakterii opisanego w sekcji 1.5 (Rycina 2B). Namnożone mutanty są następnie inkubowane z komórkami nabłonkowymi w trzech powtórzeniach na płytkach 96-dołkowych przez 7 dni. Ponieważ wszystkie wygenerowane mutanty Coxiella są znakowane GFP, krzywe wzrostu wewnątrzkomórkowego uzyskuje się poprzez pomiar intensywności fluorescencji GFP w każdym dołku co 24 h i wykreślenie zmierzonych wartości w funkcji czasu (Rycina 2C).
Krzywe wzrostu wewnątrzkomórkowego zapewniają ilościową analizę fenotypów związanych z każdą insercją transpozonu w genomie Coxiella. Aby dodać informacje jakościowe na temat tych samych mutantów transpozonowych, zdecydowaliśmy się na zautomatyzowaną akwizycję i analizę obrazów. Siedem dni po infekcji płytki są utrwalane, poddawane procedurze immunofluorescencji zgodnie z opisem w 4 i analizowane przy użyciu zautomatyzowanego mikroskopu epifluorescencyjnego zgodnie z opisem w 5. Oprogramowanie do zautomatyzowanej analizy obrazów, takie jak CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a>), przetwarza pozyskane kanały niezależnie i segmentuje zidentyfikowane obiekty w celu przeprowadzenia analizy porównawczej (Rysunek 3). Pozwala to na identyfikację i charakterystykę morfologiczną jąder komórek gospodarza, konturów komórek, lizosomów oraz kolonii Coxiella (Rysunek 3, górne panele). Korelacja kolonii Coxiella z komórkami i lizosomami umożliwia identyfikację i szczegółową analizę morfologiczną wakuol zawierających Coxiella (które są LAMP1-dodatnie, Rysunek 3, dolny lewy panel). Korelacja kolonii Coxiella z konturami komórek gospodarza pozwala na identyfikację i szczegółową analizę morfologiczną zakażonych komórek (Rysunek 3, dolny środkowy panel). Na koniec 4 kanały są łączone w celu ilustracji i kontroli jakości (Rysunek 3, dolny prawy panel).
Dane uzyskane z automatycznej analizy obrazu można przedstawić w formie wykresów korelacji, aby otrzymać „wielofenotypowe wykresy rozrzutu”. Na przykład w Rysunek 4A średnia powierzchnia (w μm2) z Coxiella liczbę kolonii w funkcji liczby kolonii na komórkę (Rycina 4A), aby zidentyfikować mutacje wpływające na replikację wewnątrzkomórkową Coxiella (fenotyp replikacyjny) i/lub zdolność bakterii do naciekania komórek gospodarza (fenotyp internalizacji). Analizę statystyczną wykorzystano do zdefiniowania obszarów na otrzymanym wykresie rozrzutu odpowiadających łagodnym (-4 &lt; fenotypy umiarkowane (wynik Z ≤ -2) i ciężkie (wynik Z ≤ -4). Mutanty zaobserwowano w 3 głównych skupiskach: mutacje skutkujące zaburzonym wzrostem wewnątrzkomórkowym Coxiella zgrupowano w najbardziej lewej części wykresu (Rycina 4A, różowe i czerwone kropki); mutacje, które wpłynęły na Coxiella internalizacja w komórkach została zgrupowana w dolnej części wykresu (Rycina 4A, jasnoniebieskie i ciemnoniebieskie kropki) i wreszcie zielone kropki w najbardziej prawym obszarze wykresu odpowiadają mutacjom skutkującym nieistotnymi fenotypami (Z-score &gt; -2). Co istotne, mutanty, które nie namnażają się, lecz nadal są zdolne do inwazji komórek gospodarza, są wykrywane po 7 dniach infekcji jako pojedyncze bakterie lub małe kolonie sąsiadujące z jądrami komórek gospodarza (Rysunek 4C, drugi panel). Zatem wielkość Coxiella liczba „kolonii” ulegnie znacznemu zmniejszeniu, natomiast liczba zainfekowanych komórek nie będzie różnić się w porównaniu z WT Coxiellakomórek zainfekowanych. Z drugiej strony, mutacje wpływające na zdolność do Coxiella do naciekania komórek gospodarza skutkuje zmniejszeniem liczby kolonii/komórkę. Gdy liczba ta jest znacznie niższa niż 1, wskazuje to na średni spadek całkowitej liczby zainfekowanych komórek. Alternatywnie, średnia powierzchnia (w μm2) z Coxiella liczbę kolonii można nanieść na wykres w zależności od liczby komórek gospodarza, które przeżyły infekcję (Rycina 4B), aby zidentyfikować mutacje nadające cytotoksyczność Coxiella (fenotyp cytotoksyczny). Jak wyżej, analizę statystyczną wykorzystano do zdefiniowania na otrzymanym wykresie rozproszenia obszarów odpowiadających łagodnemu (-4 &lt; fenotypy umiarkowane (Z-score ≤ -2) i ciężkie (Z-score ≤ -4). Większość przesiewowych mutacji nie wpłynęła znacząco na przeżywalność komórek, niezależnie od replikacji bakterii w komórkach gospodarza (Rysunek 3B zielone kropki). 37 mutacji w niewielkim stopniu wpłynęło na przeżywalność komórek gospodarza (Rycina 3B, jasnoczerwone kropki), a 7 mutacji było szczególnie niekorzystnych dla przeżywalności komórek gospodarza (Rycina 3B, ciemnoczerwone kropki). Należy pamiętać, że dodatkowe parametry uzyskane w procedurze zautomatyzowanej analizy obrazu mogą zostać wykorzystane do stworzenia innych wykresów, w zależności od potrzeb eksperymentalnych.
<img alt="Schemat insercji transpozonu z cyklami PCR, wynikami sekwencjonowania DNA i analizą mapy genetycznej." src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Sekwencjonowanie i adnotacja mutantów transpozunowych Coxiella. (A) PCR kolonii z użyciem pojedynczego primera jest wykorzystywany do amplifikacji fragmentów DNA zawierających miejsce insercji transpozonu. Primer amplifikacyjny (Amp) służy jako starter specyficzny i niespecyficzny w zależności od rygorystyczności temperatury przyłączania. (B) Typowy wynik PCR kolonii z użyciem pojedynczego primera. Każda reakcja generuje szereg fragmentów o zmiennej wielkości, z których niektóre zawierają miejsce insercji transpozonu; inne są amplifikowane losowo jako produkty uboczne cyklu PCR o niskiej rygorystyczności. (C) Zastosowanie primera sekwencyjnego (Seq), który hybrydyzuje z sekwencją transpozonu, umożliwia sekwencjonowanie interesujących fragmentów. (D) Oprogramowanie do analizy sekwencji pozwala na automatyczną adnotację insercji transpozonów w genomie bakteryjnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat klastra genów bakteryjnych; wykresy wzrostu i fluorescencji dla analizy mutantów." src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wzrost akseniczny i wewnątrzkomórkowy mutantów transpozonowych Coxiella. (A) W badaniu pilotażowym wyizolowano, zsekwencjonowano i przesiewano 38 mutantów transpozonowych w 16 kluczowych genach systemu sekrecji dot/icm Coxiella (oznaczonych na czerwono). (B) Aby ocenić żywotność każdego mutanta transpozonowego, monitorowano wzrost każdego izolatu w aksenicznym medium hodowlanym przez 8 dni przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego środka interkalującego DNA. (C) Następnie każdy mutant został użyty do zakażenia komórek nabłonkowych. Ponieważ transpozon posiada kasetę GFP, wewnątrzkomórkowy wzrost bakterii monitorowano przez 7 dni infekcji, śledząc zmiany fluorescencji GFP związane z replikacją Coxiella za pomocą czytnika mikropłytek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat segmentacji komórek z analizą morfologiczną; jądra, komórki, lizosomy, zakażenie Coxiella." src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zautomatyzowana analiza obrazu zakażeń Coxiella. Zautomatyzowany mikroskop epifluorescencyjny jest wykorzystywany do obrazowania 21 pozycji na studzienkę w trzech powtórzeniach na płytkach 96-dołkowych. Oprogramowanie do analizy obrazu segmentuje obiekty w każdym z nabytych kanałów w celu ich kwantyfikacji i analizy. We wszystkich przypadkach obiekty dotykające krawędzi obrazów są wykluczane. (A) Kanał Hoechst jest używany do identyfikacji jąder komórek gospodarza (zakreślone na zielono). (B) Służą one jako punkty wyjścia do identyfikacji konturów komórek gospodarza w kanale Cy3 (pozycje jąder są zakreślone na niebiesko, kontury komórek na zielono). (C) Kanał Cy5 jest używany do identyfikacji przedziałów pozytywnych pod względem LAMP1 (zakreślone na zielono); do analizy obrazu zachowywane są tylko te obiekty, które znajdują się wewnątrz wcześniej zidentyfikowanych konturów komórkowych (na czerwono). (D) Kanał GFP jest używany do identyfikacji kolonii Coxiella (zakreślone na zielono). (E) Korelacja kolonii Coxiella z przedziałami pozytywnymi pod względem LAMP1 pozwala na identyfikację wakuol zawierających Coxiella (CCV); do analizy obrazu zachowywane są tylko te obiekty, które znajdują się wewnątrz wcześniej zidentyfikowanych konturów komórkowych (na zielono). (F) Korelacja kolonii Coxiella z konturami komórkowymi pozwala na identyfikację komórek zakażonych (pseudokolor). (G) Obrazy uzyskane w 4 kanałach fluorescencyjnych (odpowiednio dla kolonii Coxiella (zielony), jąder komórek gospodarza (niebieski), błony plazmatycznej komórek gospodarza (szary), przedziałów pozytywnych pod względem LAMP1 (czerwony)) są łączone i wykorzystywane do ilustracji oraz kontroli jakości. Paski skali 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy rozrzutu kolonii bakteryjnych i obrazy fluorescencyjne fenotypowe; analiza powierzchni kolonii względem liczby." src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wielkoskalowa identyfikacja czynników Coxiella zaangażowanych w interakcje gospodarz/patogen. (A) Średnia powierzchnia (w μm2) kolonii Coxiella przedstawiona w zależności od względnej liczby kolonii na komórkę, w celu zidentyfikowania interesujących fenotypów replikacji i internalizacji. Zielone kropki reprezentują fenotypy, które odbiegają od WT Coxiella o Z-score &gt; -2 (nieistotne). Różowe i jasnoniebieskie kropki reprezentują odpowiednio fenotypy replikacji i internalizacji, z Z-score między -2 a -4 (fenotypy łagodne). Czerwone i ciemnoniebieskie kropki reprezentują fenotypy z Z-score ≤ -4 (fenotypy silne). (B) Średnia powierzchnia (w μm2) kolonii Coxiella została przedstawiona w zależności od całkowitej liczby komórek (zainfekowanych i niezainfekowanych), które przeżyły 7 dni infekcji, aby oszacować efekt cytotoksyczny wynikający z insercji transpozonów. Zielone kropki reprezentują fenotypy, które odbiegają od WT Coxiella o Z-score &gt; -2 (nieistotne). Różowe kropki reprezentują fenotypy cytotoksyczne z Z-score między -2 a -4 (fenotypy łagodne). Czerwone kropki reprezentują fenotypy cytotoksyczne z Z-score ≤ -4 (fenotypy silne). Strzałki wskazują mutanty zilustrowane odpowiadającą im małą literą w części C. (C) Reprezentatywne obrazy fenotypów replikacji, internalizacji i cytotoksyczności. we wszystkich przypadkach jądra komórek gospodarza są zaznaczone na czerwono, a kolonie Coxiella na zielono. Paski skali 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja na dużą skalę czynników COE zaangażowanych w kluczowe etapy cyklu infekcyjnego, w tym w wnikanie do komórek gospodarza, tworzenie bakteryjnej niszy replikacyjnej oraz persystencję. Jest to realizowane poprzez wstępne wytworzenie biblioteki mutantów ko-GF PT za pomocą mutagenezy transpozonowej.Następnie komórki gospodarza są zakażane każdym z wyizolowanych mutantów. Potem w czasie rzeczywistym, przy użyciu czytnika mikropłytek, monitorowana jest replikacja wewnątrzkomórkowa każdego mutanta, aby zidentyfikować mutacje najbardziej szkodliwe dla infekcji coxiella. Na koniec komórki zakażone coxiella są analizowane za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii.W ostatecznym rozrachunku zautomatyzowana analiza obrazów umożliwia charakterystykę morfologiczną każdego uzyskanego fenotypu, aby powiązać każdy zmutowany gen z przypuszczalną funkcją w cyklu infekcyjnym Coxiella. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie oddziaływań gospodarz-patogen, takich jak wielkoskalowa identyfikacja genów niezbędnych dla danego patogenu, które są wymagane do interakcji z całą komórką i przejmowania jej mechanizmów molekularnych dla własnych korzyści. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ wysiewanie i izolowanie kolonii COE są trudne do osiągnięcia.W rzeczywistości COE tworzy bardzo małe kolonie, które muszą być ostrożnie wyodrębniane z miękkiego agaru ACCM. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat zakażeń kokowych w laboratorium. Może być ona również zastosowana do innych wewnątrzkomórkowych bakterii patogennych, takich jak Salmonella, Brucella, Mycobacterium i inne.Po transformacji kompetentnych komórek Coxiella plazmidami kodującymi transpozon i transpozazę zgodnie z protokołem tekstowym, w celu izolacji pojedynczych mutantów, należy przygotować agar dolny poprzez wymieszanie 10 ml roztopionego 0,5% agaru z 10 ml 2X ACCM-2 w komorze bezpieczeństwa biologicznego (KBB), dodając odpowiednie antybiotyki. Następnie należy niezwłocznie wylać mieszaninę do szalki Petriego, pozostawić do ostygnięcia bez przykrycia przez 30 minut, a następnie suszyć na powietrzu przez 20 minut. Aby przygotować agar górny, należy wymieszać 1,25 ml 2X ACCM-2 z 0,75 ml wody w 15 ml polistyrenowej probówce. Należy dodać odpowiednie antybiotyki i inkubować w temperaturze 37 °C.Następnie dodaje się od 1 do 100 µL kultury bakteryjnej i miesza w wirówce typu vortex przez pięć sekund. Dalej dodaje się 0,5 mL roztopionej mieszaniny aros i natychmiast wylewa ją na spodnią warstwę aros. Płytkę pozostawia się do ostygnięcia na 20 minut.Nałóż pokrywkę i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby wspomóc zestalenie. Następnie zdejmij pokrywkę i pozostaw płytkę do wyschnięcia przez 20 minut, po czym przenieś ją do wilgotnej inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide i 2,5% oxygen na okres od sześciu do siedmiu dni. Gdy kolonie staną się widoczne, zbierz je, odcinając końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 mL i używając jej do wycięcia krążków zawierających pojedyncze kolonie.Następnie przenosi się je do dołków płytki 24-dołkowej zawierającej 1,5 milliliters pożywki accm two. Po przygotowaniu krzywej wzorcowej zgodnie z protokołem tekstowym, należy określić ilość komórek w każdej zawiesinie bakteryjnej, dozując pięć microliters 10% Triton X 100 do każdego dołka. Do mikropłytki 96-dołkowej z czarnymi ściankami i dnem dodaje się 50 microliters zawiesin bakteryjnych do każdego dołka i inkubuje na potrząsarce do płytek przez 10 minut.W temperaturze pokojowej należy użyć buforu XTE do rozcieńczenia odczynnika do oznaczania ilości dwuniciowego DNA w stosunku 1:200, a następnie dodać 55 µL rozcieńczonego odczynnika do każdej próbki. W mikropłytce 96-dołkowej, przy użyciu wytrząsarki do płytek, należy dokładnie wymieszać próbki przed inkubacją w ciemności w temperaturze pokojowej od dwóch do pięciu minut, a następnie zmierzyć fluorescencję próbek za pomocą mikroczytnika płytek fluorescencyjnych i filtrów dla standardowych długości fal fluoresceiny. Aby uzyskać wykres stężenia bakteryjnego DNA, należy odnieść odczyty fluorescencji do wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej, a następnie podzielić stężenie DNA przez masę genomu Coxiella, aby obliczyć stężenie bakterii.Wyrazić wyniki w ekwiwalentach genomu na mililitr po przeprowadzeniu kolonialnej reakcji PCR z jednym starterem oraz sekwencjonowania DNA zgodnie z protokołem tekstowym. Przy użyciu oprogramowania do analizy sekwencji, załadować kompletny adnotowany genom Coxiella Burnett I 4 93 NM one korzystając z funkcji wyrównania do referencji, załadować i wyrównać wyniki sekwencjonowania za pomocą blast N, a następnie określić miejsce transpozycji. Po przygotowaniu zawiesiny komórek Vero o stężeniu 10⁵ komórek na mililitr w medium RPMI, zgodnie z protokołem tekstowym, nanieść 100 µL zawiesiny do każdego dołka czarnej płytki 96-dołkowej z płaskim, przezroczystym dnem, odwirować płytkę przy 400 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, przygotować płytki 96-dołkowe zawierające mutanty Coxiella i rozcieńczyć 150 µL zawiesin bakteryjnych w 300 µL pożywki RPMI bez czerwieni fenolowej i FBS w głębokiej płytce 96-dołkowej. Następnie usunąć medium z komórek Vero i nanieść 100 µL rozcieńczonych mutantów Coxiella na każdy dołek. Dołek A1 wykorzystać jako kontrolę negatywną, a dołki A2 i A3 jako kontrole pozytywne. Używając szczelnego adaptera do płytek do wirówki, wirować płytkę z prędkością 400 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji płytki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez dwie godziny, zastąpić medium zawierające bakterie 100 µL świeżej, kompletnej pożywki RPMI na każdy dołek. Pomiary przeprowadzić za pomocą fluorescencyjnego czytnika mikropłytek z filtrami do fluoresceiny.Pomiar fluorescencji GFP należy przeprowadzać codziennie przez siedem dni. Siódmego dnia po zakażeniu należy usunąć pożywkę z płytki i zastąpić ją 50 µL na dołek świeżej pożywki kompletnej zawierającej rozcieńczenie 1:1000 przepuszczalnego przez błony komórkowe barwnika fluorescencyjnego. Komórki należy inkubować przez 30 do 60 minut, a następnie zastąpić pożywkę 50 µL na dołek 4% PFA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie należy usunąć bufor zawierający PFA i trzykrotnie wypłukać dołki za pomocą PBS. Po usunięciu ostatniej porcji płuczącej, do każdego dołka należy dodać 50 µL roztworu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie zastąp roztwór blokujący 40 µL na dołek świeżym roztworem blokującym oraz przeciwciałem anty-LAMP1 w rozcieńczeniu 1:500. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut usuń roztwór i użyj myjki do płytek, aby pięciokrotnie przemyć dołki, aplikując 100 µL PBS na dołek. Następnie dodaj 40 µL na dołek roztworu blokującego zawierającego odpowiednie fluorescencyjne przeciwciało wtórne i hooked 3 3 2 5 8 w stężeniu 5 µg/mL.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Próbki przemyć pięciokrotnie, pozostawiając ostatnią porcję buforu PBS w dołkach, aby zapobiec ich wyschnięciu. W celu pozyskania obrazów należy użyć zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego z oświetleniem epi, wyposażonego w obiektyw 20 x oraz kanały 3 4 88 5 55 i sześć 15 nanometrów.Należy zebrać obrazy z 21 niezależnych pól widzenia na każdą studzienkę, aby zobrazować minimum 5 000 komórek na próbkę. Należy zastosować autofokus, wykorzystując kanał jąder komórek gospodarza jako referencję. Na koniec należy wykorzystać zautomatyzowaną analizę obrazu w celu wyekstrahowania liczby istotnych cech z pozyskanych obrazów.Rysunek ten przedstawia 38 transpozonów w mutantach 16 point ICM Coxe L at Genes; zaprezentowano tutaj krzywe wzrostu oceniające żywotność mutantów. Krzywe wzrostu wewnątrzkomórkowego mutantów Coxiella inkubowanych z komórkami nabłonkowymi umożliwiają ilościową analizę fenotypów związanych z insercjami transpozonów w genomie Coxiella. Na tym rysunku zastosowano zautomatyzowaną akwizycję obrazów w celu identyfikacji i charakterystyki jąder komórek gospodarza, konturów komórek, lizosomów oraz kolonii Coxiella.Korelacja kolonii coxiella z komórkami i lizosomami umożliwia analizę morfologiczną wakuol zawierających coxiella. Korelacja kolonii coxiella z konturami komórek gospodarza pozwala na analizę morfologiczną zakażonych komórek. Na koniec wszystkie cztery kanały są nakładane.Średnią powierzchnię kolonii coxiella przedstawiono w funkcji liczby kolonii na komórkę, aby zidentyfikować mutacje wpływające na replikację wewnątrzkomórkową coxiella oraz/lub zdolność bakterii do wnikania do komórek gospodarza. Zaobserwowano mutanty w trzech skupieniach: mutacje wpływające na wzrost wewnątrzkomórkowy coxiella, internalizację coxiella w komórkach oraz fenotypy nieznaczące. W tym przypadku średnią powierzchnię kolonii coxiella przedstawiono w funkcji liczby komórek gospodarza, które przeżyły infekcję, aby zidentyfikować mutacje nadające coxiella cytotoksyczność po jej rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie infekcji bakteryjnych do badania interakcji między gospodarzem a patogenem na szeroką skalę oraz pozwoliła zidentyfikować cele bakteryjne i gospodarzowe dla rozwoju nowych terapii przeciwdziałających chorobom zakaźnym.

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Ten film demonstruje metodę oceny wewnątrzkomórkowego wzrostu mutantów Coxiella oznaczonych GFP w hodowanych komórkach nabłonkowych. Zmutowany fenotyp jest wizualizowany za pomocą barwienia immunologicznego i mikroskopii epifluorescencyjnej, co pozwala na badanie wpływu mutacji na wzrost wewnątrzkomórkowy.

Ocena wewnątrzkomórkowego wzrostu mutantów Coxiella w komórkach eukariotycznych

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

Badanie interakcji między patogenami bakteryjnymi a ich gospodarzami jest ważnym obszarem badań biologicznych. W tym miejscu opisujemy niezbędne techniki pomiaru translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania genu siRNA przy użyciu substratu BlaM.

Zastosowanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) do zbadania wydajności translokacji efektorowej przez Coxiella burnetii podczas wyciszania siRNA

Tutaj prezentujemy protokoły dla początkujących badaczy, które rozpoczynają fenotypowanie dla farmakologicznie ważnego rodzaju bakterii Streptomyces.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę wytwarzania mutantów transposonowych Coxiella burnetii i ich wielofenotypowego badania przesiewowego. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla cyklu zakaźnego tego patogena.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Przeglądaj więcej filmów