Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja na dużą skalę. Czynniki COE biorą udział w kluczowych etapach cyklu zakaźnego, w tym w wnikaniu do komórek gospodarza, wytwarzaniu i utrzymywaniu się bakteryjnej niszy replikacyjnej. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie biblioteki mutantów GF PT co przez transpozycję w mutagenezie.

Następnie komórki gospodarza są zakażane każdym wyizolowanym mutantem. Następnie wewnątrzkomórkowa replikacja każdego mutanta jest śledzona w czasie rzeczywistym za pomocą czytnika mikropłytek w celu zidentyfikowania mutacji, które są najbardziej szkodliwe dla infekcji coxiella. Na koniec zakażone komórki coxiella są analizowane za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii.

Ostatecznie, zautomatyzowana analiza obrazu pozwala na charakterystykę morfologiczną każdego uzyskanego fenotypu w celu powiązania każdego zmutowanego genu z przypuszczalną funkcją w cyklu zakaźnym coxielli. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie interakcji patogenów gospodarza, takich jak identyfikacja na dużą skalę podstawowych genów danego patogenu wymaganych do interakcji z całą komórką i przejęcia jej mechanizmów molekularnych na jej korzyść. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ posiew i izolacja kolonii COE są trudne do osiągnięcia.

Rzeczywiście, COE tworzy bardzo małe kolonie, które muszą być ostrożnie ekstrahowane z miękkiego ACCM two aro. W jaki sposób ta metoda może zapewnić wgląd w infekcję kokową w laboratorium. Może być również stosowany do innych wewnątrzkomórkowych bakterii chorobotwórczych, takich jak salmonella, burel, mycobacterium i tak dalej.

Po przekształceniu właściwej coxielli za pomocą transpozonu i plazmidów powlekających transpozazę zgodnie z protokołem tekstowym, w celu wyizolowania poszczególnych mutantów, należy przygotować dolny aros przez zmieszanie 10 mililitrów stopionego 0,5% aros z 10 mililitrami dwóch X accm, dwóch w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego lub MSC i natychmiast dodać odpowiednie antybiotyki, wlać na szalkę Petriego i pozostawić do ostygnięcia bez przykrycia przez 30 minut, a następnie wyschnąć na powietrzu przez 20 minut. Aby przygotować górną torbę aros, wymieszaj 1,25 mililitra dwóch x accm two z 0,75 mililitra wody w 15-mililitrowej tubie z polistyrenu. Dodaj odpowiednie antybiotyki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj jeden do 100 mikrolitrów kultury bakteryjnej i wiruj przez pięć sekund. Następnie dodaj 0,5 mililitra roztopionej mieszanki aros i natychmiast zalej dolne aros. Pozostaw talerz do ostygnięcia na 20 minut.

Umieść pokrywkę na wierzchu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut, aby pomóc w zastygnięciu. Następnie zdejmij pokrywkę i wysusz płytkę na powietrzu przez 20 minut przed przeniesieniem do inkubatora z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 2,5% tlenem na sześć do siedmiu dni. Gdy kolonie zostaną wykryte, zbierz je, odcinając koniec jednomililitrowej końcówki pipety i używając jej do wyizolowania zatyczek zawierających pojedyncze kolonie.

Następnie przenieś je do dołków 24-dołkowej płytki zawierającej 1,5 mililitra accm dwa. Po przygotowaniu krzywej wzorcowej, zgodnie z protokołem tekstowym, należy oznaczyć ilościowo każdą zawiesinę bakteryjną, dozując pięć mikrolitrów 10% Triton X 100 na studzienkę. W 96-dołkowej mikropłytce z czarnymi ściankami i dnem dodać 50 mikrolitrów zawiesin bakteryjnych do każdej studzienki i inkubować na wytrząsarce płytkowej przez 10 minut.

W temperaturze pokojowej użyj jednego buforu XTE do rozcieńczenia dwuniciowego odczynnika do oznaczania ilościowego DNA od jednego do 200 i dodaj 55 mikrolitrów rozcieńczonego odczynnika do każdej próbki. W 96-dołkowej mikropłytce z wytrząsarką płytkową dobrze wymieszaną przed inkubacją w ciemności w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut, zmierzyć fluorescencję próbek za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych i filtrów dla standardowych długości fal fluoresceiny. Aby uzyskać wykres stężenia DNA bakterii, odczyty fluorescencji w wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej dzielą stężenie DNA przez masę genomu coxielli w celu uzyskania stężenia bakterii.

Wyrazić wyniki w ekwiwalentach genomu na mililitr po przeprowadzeniu PCR kolonii pojedynczej startera i sekwencjonowania DNA zgodnie z protokołem tekstowym. Korzystając z oprogramowania do analizy sekwencji, załaduj pełny opisany genom Coxiella Burnett I 4 93 NM za pomocą funkcji wyrównania do odniesienia, załaduj i wyrównaj wyniki sekwencji za pomocą blastu N i określ miejsce transpozycji. Po przygotowaniu zawiesiny komórek Vero od 10 do piątych komórek na mililitr w pożywce RPMI, zgodnie z protokołem tekstowym, dozować 100 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki czarnej 96-dołkowej płytki z płaskim, przezroczystym dnem, odwirować płytkę przy 400 razy G i odmieścić na pięć minut i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc.

Następnego dnia zanurz w temperaturze pokojowej 96-dołkowe płytki zawierające mutanty coxiella i rozcieńcz 150 mikrolitrów zawiesin bakteryjnych w 300 mikrolitrach RPMI bez czerwieni fenolowej i FBS na głębokiej płytce 96-dołkowej, następnie usuń pożywkę z komórek Vero i dozuj 100 mikrolitrów na studzienkę rozcieńczonych mutantów coxiella. Użyć studzienki A jeden jako kontroli ujemnej, a studzienek A dwie i trzy jako kontrole dodatnie, używając szczelnego uchwytu na płytkę wirówkową w aerozolu, odwirować płytkę w temperaturze 400 razy G i temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie po inkubacji płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny, zastąp pożywkę zawierającą bakterie 100 mikrolitrami na studzienkę świeżej kompletnej pożywki RPMI z czytnikiem mikropłytek fluorescencyjnych i filtrami do fluoresceiny.

Mierz fluorescencję GFP codziennie przez siedem dni W siódmym dniu po zakażeniu usuń pożywkę z płytki i zastąp ją 50 mikrolitrami na studzienkę świeżej kompletnej pożywki zawierającej rozcieńczenie od jednego do 1000 przepuszczalnego dla komórek barwnika fluorescencyjnego. Inkubować komórki przez 30 do 60 minut po inkubacji, zastąpić pożywkę 50 mikrolitrami na studzienkę 4% PFA w PBS inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usuń bufor zawierający PFA przed użyciem PBS do trzykrotnego przemycia studzienek Po usunięciu końcowego płukania dozuj 50 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie zastąp roztwór blokujący 40 mikrolitrami na studzienkę, świeżym roztworem blokującym i rozcieńczeniem przeciwciała antylampowego w proporcji jeden do 500. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 30 minut usunąć roztwór i użyć myjki talerzowej, aby umyć studzienki pięć razy, stosując 100 mikrolitrów na studzienkę PBS. Następnie dodać 40 mikrolitrów do studzienki roztworu blokującego zawierającego odpowiednie fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe i zaczepić 3, 3, 2, 5, 8 w stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj próbki pięć razy i pozostaw końcowe płukanie PBS w studzienkach, aby zapobiec ich wyschnięciu. Do akwizycji obrazu należy użyć automatycznego mikroskopu epi fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw o kącie 20 x oraz 3, 4, 88, 5, 55 i sześć kanałów 15 nanometrów.

Zdobądź 21 niezależnych pól na studzienkę, aby zobrazować co najmniej 5 000 komórek na próbkę. Zastosuj automatyczne ustawianie ostrości, używając kanału jąder komórek gospodarza jako odniesienia. Na koniec użyj automatycznej analizy obrazu, aby ekstrapolować szereg istotnych cech z pozyskanych obrazów.

Rysunek ten ilustruje 38 transpozycji mutantów w 16-punktowym ICM Coxe L w Genes aen krzywe wzrostu, które oceniają żywotność mutantów, są pokazane tutaj. Tu. Wewnątrzkomórkowe krzywe wzrostu mutantów coxiella inkubowanych z komórkami nabłonkowymi zapewniają ilościową analizę fenotypów związanych z transpozycją na insercje w genomie coxielli. Na tym rysunku przeprowadzono zautomatyzowaną akwizycję obrazu w celu zidentyfikowania i scharakteryzowania jąder komórek gospodarza, konturów komórek, lizosomów i kolonii coxielli.

Korelacja kolonii coxiella z komórkami i lizosomami umożliwia analizę morfologiczną wakuoli zawierających coxiellę. Korelacja kolonii coxiella z konturami komórek gospodarza umożliwia analizę morfologiczną zakażonych komórek. Na koniec cztery kanały są łączone.

Średnia powierzchnia kolonii coxiella jest wykreślana w stosunku do liczby kolonii na komórkę w celu zidentyfikowania mutacji, które wpływają na wewnątrzkomórkową replikację coxiella i/lub zdolność bakterii do inwazji komórek gospodarza. Mutanty obserwowano w trzech mutacjach klastrowych, które wpływały na wewnątrzkomórkowy wzrost coxiella coxiella internalizację w komórkach i nieistotne fenotypy. W tym przypadku średnia powierzchnia kolonii coxiella jest wykreślana w stosunku do liczby komórek gospodarza, które przeżyły infekcję, w celu zidentyfikowania mutacji, które nadają cytotoksyczność coxielli po jej rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się infekcjami bakteryjnymi do zbadania interakcji patogenów gospodarza na dużą skalę oraz zidentyfikowania celów gospodarza i bakterii w celu opracowania nowych terapii przeciwdziałających chorobom zakaźnym.