Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji komórek z izolowanej siatkówki myszy za pomocą komercyjnego systemu in vivo, elektroretinogramu lub systemu ERG wraz z adapterem ex vivo. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie siatkówki z obu oczu myszy. Drugim krokiem jest zamontowanie fotoreceptora siatkówki stroną do góry w uchwycie na próbki.

Następnie uchwyt próbki umieszcza się na płycie grzewczej w systemie ERG in vivo i podłącza do perfuzji sterowanej grawitacyjnie. Ostatnim krokiem jest podłączenie elektrod uchwytu próbki do wzmacniacza i stymulacja siatkówki światłem w celu uzyskania odpowiedzi ERG. Ostatecznie ERG ex vivo wykorzystuje się do pokazania, w jaki sposób szlaki sygnałowe za pośrednictwem pręcików i stożków mogą być preparowane za pomocą farmakologii i specjalistycznych protokołów stymulacji światłem.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak in vivo, ERG lub zapisy pojedynczych komórek, jest to, że zapewnia ona wyższy stosunek sygnału do szumu, dłuższe i bardziej stabilne zapisy, a także możliwość łatwych i ilościowych manipulacji farmakologicznych. Ponadto metoda ta może być stosowana do badań przesiewowych skuteczności i bezpieczeństwa leków przeznaczonych do leczenia chorób siatkówki u naczelnych i ludzkich dawców siatkówki Co najmniej dzień wcześniej zmodyfikuj dolną część uchwytu próbki, przyklejając czarną szarą bibułę filtracyjną do górnej części kopuł. Użyj dwuskładnikowej pięciominutowej żywicy epoksydowej wzdłuż krawędzi kopuł, a w razie potrzeby użyj mikroskopu preparacyjnego Po wyschnięciu kleju dociśnij bibułę filtracyjną płasko do kopuły.

Będzie to dobre na około miesiąc nagrywania. Następnie usuń papier i wyczyść kopułę 70% etanolem. Teraz, aby najpierw przygotować elektrodę, napełnij kanały elektrod roztworem elektrody.

Staraj się unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie wkręć elektrody peletowe w kanały elektrod. Połącz górną i dolną część uchwytu próbki za pomocą czterech i napełnij przewody perfuzyjne roztworem elektrody.

Następnie zmierz rezystancję i napięcie między przewodami par elektrod. Rezystancja powinna wynosić poniżej 100 kiloomów, a napięcie poniżej 10 miliwoltów. Jeśli kanały są wolne od pęcherzyków, a elektrody są w dobrym stanie, wlej od 400 do 700 mililitrów pożywki perfuzyjnej do szklanej butelki w celu perfuzji próbki.

Wlej również 300 mililitrów do rozwarstwienia i przechowuj w lodówce. Następnie przełóż rurkę perfuzyjną przez blok wymiennika ciepła i umieść podgrzany blok na płycie grzewczej. Teraz zakryj butelkę nakrętką, która ma wlot gazu i wlot rurki perfuzyjnej.

Wlot gazu powinien być przymocowany do kamienia napowietrzającego. Umieść podgrzaną butelkę w miejscu, w którym podłoże perfuzyjne będzie utrzymywane w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie zagruntuj linie perfuzyjne, wypełniając je mediami perfuzyjnymi, aby zainicjować przepływ napędzany grawitacją w systemie naukowym ocus.

Umieść butelkę w klatce Faradaya, aby zminimalizować hałas i użyj długich linii wyjściowych perfuzji z uchwytu próbki. Umieszczony znacznie poniżej poziomu uchwytu próbki i butelki perfuzyjnej osłonić te linie wyjściowe i podłączyć ekran do masy amplifier przez klatkę Faradaya. Aby zapobiec sprzężeniu szumu elektromagnetycznego z sygnałem ERG, należy podłączyć sondę temperatury do stopnia grzewczego.

Teraz za pomocą regulatorów dostosuj przepływ roztworu do trzech do pięciu mililitrów na minutę. Na koniec, jeśli to konieczne, wprowadź samochód i gaz do roztworu i wyreguluj regulator, aby uzyskać stały strumień pęcherzyków z kamienia napowietrzającego. Zacznij od wylania około 200 mililitrów zimnego roztworu perfuzyjnego na dużą szalkę Petriego, tak aby cała dolna część uchwytu próbki mogła być całkowicie zanurzona.

Poddaj eutanazji zwierzę wychowywane w 12-, 12-godzinnym cyklu ciemnego światła, a następnie przystosowane do ciemności przez sześć do 12 godzin przed nagraniami. Wszystkie poniższe procedury należy wykonywać w słabym świetle czerwonym lub podczerwonym. Po wyizolowaniu każdego oka umieść je w pożywce do oczu.

Następnie przenieś jedno oko na mały kawałek bibuły filtracyjnej na bibułze. Chwyć go pęsetą i wytnij w nim szczelinę mniej więcej na tym samym poziomie, co aura serrata ze szczeliny. Przetnij wzdłuż aury serrata lub gdzieś bliżej równika, aby usunąć rogówkę i soczewkę.

Następnie wyjmij rogówkę i końce soczewek i przenieś muszlę oczną z powrotem do zimnego podłoża. Powtórz tę samą procedurę z drugim okiem. Teraz pracując z muszlą oczną, wykonaj małe nacięcie od góry w kierunku nerwu wzrokowego.

Trzymaj nożyczki między siatkówką a twardówką, aby siatkówka pozostała tak nienaruszona, jak to możliwe. Następnie chwyć twardówkę po obu stronach nacięcia za pomocą dwóch pęsety i rozsuń tkankę, aby odłączyć siatkówkę. Aby wyizolować siatkówkę, przetnij nerw wzrokowy i usuń siatkówkę przy minimalnym kontakcie z jej dystalną powierzchnią.

Teraz zamontuj izolowane siatkówki na kopułach uchwytu próbki. Najpierw zanurz dolną część uchwytu próbki na szalce Petriego z wypreparowanymi siatkówkami. Następny slajd.

Fotoreceptor siatkówki lub wypukła strona skierowana do góry nad kopułą. Następnie delikatnie podnieś uchwyt próbki, tak aby siatkówka przymocowała się do bibuły filtracyjnej. Następnie powtórz procedurę dla drugiej siatkówki.

Teraz ostrożnie osusz płytkę uchwytu, aby zapobiec zakłóceniom przesłuchów i bocznikowaniu sygnału. Po wysuszeniu uchwytu przykręć górną część i napełnij kanały perfuzyjne roztworem perfuzyjnym ze strzykawki za pomocą igły. Umieść uchwyt próbki obok bloku wymiany ciepła.

Następnie podłącz wejściowe i wyjściowe linie perfuzyjne. Zakończ konfigurację, podłączając elektrody do wzmacniacza ERG i podłączając jednostkę sterującą stymulatora do uchwytu na próbkę. Korzystanie z adaptera Aby uzyskać duże i wielokrotnego użytku odpowiedzi, ważne jest, aby przeprowadzić staranną sekcję i montaż siatkówki, a także utrzymać stabilną i wolną od pęcherzyków perfuzję nad siatkówkami przed zebraniem danych.

Odczekaj od 10 do 20 minut, aby temperatura i funkcja siatkówki ustabilizowały odpowiedzi błysku z zaadaptowanych do ciemności dzikich sześciu siatkówek typu C 57 przy użyciu różnych standardowych roztworów obfitości. Przebiegi odpowiedzi i kinetyka wydawały się podobne w mediach Amesa i w ośrodkach zamków. Czułość fotoreceptorów pręcików była również podobna.

Z drugiej strony, w hałdach buforowanego roztworu pierścienia bez odpowiedzi wodorowęglanowej lub karbogenicznej, amplitudy były znacznie mniejsze. Stabilność BWA była również często zagrożona w dzwonku hałdy. Dodanie 40 mikromolów A PB skutecznie usunęło dodatnią falę B.

Ujawniło to dużą, powolną falę ujemną, którą przypisano aktywności komórek Muellera, dodając 100 mikromoli zniesionego baru. Składowy ten ujawnia odpowiedź fotoreceptorową sygnału ERG ex vivo. Metodę tę można połączyć z innymi narzędziami, takimi jak farmakologia i genetyka, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące molekularnych mechanizmów sygnalizacji siatkówkowej i chorób powodujących ślepotę u ssaków, w tym ludzkich siatkówk.