Name: Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę elektroretinografii ex vivo do badania funkcji komórek siatkówki myszy. Technika umożliwia analizę szlaków sygnałowych pręcików i czopków z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH EY019312 i EY021126 (VJK), EY002687 dla Wydziału Okulistyki i Nauk Wizualnych Uniwersytetu Waszyngtońskiego, oraz przez Badania nad Zapobieganiem Ślepocie.

Wszystkie protokoły eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie Waszyngtońskim.
1. Ustawianie perfuzji i uchwytu na próbki
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do perfuzji siatkówki świeży w dniu eksperymentu. Używaj wody destylowanej i dejonizowanej. Użyj jednego z trzech poniższych rozwiązań.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór Amesa zawierający wodorowęglany (1 l): 1 butelka pożywki Amesa i 1,9 g NaHCO3,</li>
		<li>Przygotuj roztwór Locke'a (w mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO3, 3,0 Na bursztynian, 0,5 Na glutaminian, 0,02 EDTA i 10,0 glukozy, 0,1% MEM witaminy i aminokwasy</li>
		<li>Przygotować buforowany przez HEPES roztwór Ringera (w mM): 133,3 NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl2, 10,0 glukozy, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pH dostosowane do 7,5 z ~5,8 ml 1 M NaOH, dodać 0,72 g/L pożywki hodowlanej Leibovitz L-15. Użyj 20 - 50 μM DL-AP4 i 50 - 100 μM BaCl2, aby wyizolować odpowiedź fotoreceptora za pomocą dowolnego podłoża perfuzyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór dla elektrod28 (w mM): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 3 HEPES, 0,01 EDTA i dostosować pH do 7,4 – 7,5 za pomocą NaOH. Roztwór elektrody można przechowywać w RT przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj i przetestuj uchwyt próbki.
	<ol>
		<li>Przyklej czarną/szarą bibułę filtracyjną na wierzchu kopuł dolnej części uchwytu próbki (patrz rysunek 1A). Dwuskładnikowy 5-minutowy klej epoksydowy ostrożnie rozprowadź wokół krawędzi płaskich wierzchołków kopuł. W razie potrzeby zrób to pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
		<li>Poczekaj, aż klej prawie wyschnie (około 4 minut) i dociśnij bibułę filtracyjną do kopułek za pomocą płaskiego przedmiotu. Przyklej bibułę filtracyjną co najmniej jeden dzień przed eksperymentem. Bibuła filtracyjna może być używana wielokrotnie, ale należy ją wymienić po miesiącu nagrań. Użyj 70% etanolu, aby dokładnie oczyścić kopuły z pozostałości kleju przed zainstalowaniem papieru zastępczego.</li>
		<li>Napełnij kanały elektrod roztworem elektrody, starając się uniknąć pęcherzyków powietrza i wkręć elektrody granulkowe zamknięte w gwintowanym adapterze do kanałów elektrod (patrz rysunki 1A i B). Połącz górną i dolną część uchwytu próbki za pomocą czterech i napełnij przewody perfuzyjne roztworem elektrody.</li>
		<li>Zmierz rezystancję i napięcie między przewodami każdej pary elektrod za pomocą multimetru (rysunek 1B). Rezystancja powinna być poniżej 100 Ωk, a napięcie poniżej 10 mV, jeśli kanały są pozbawione pęcherzyków, a elektrody są w dobrym stanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlej 400 - 700 ml pożywki perfuzyjnej do szklanej butelki. Oddziel kolejne 300 ml do wykorzystania do rozwarstwienia siatkówki i przechowuj je w lodówce. Umieść rurkę perfuzyjną w bloku wymiennika ciepła i umieść podgrzany blok na płycie grzewczej (patrz rysunek 1D).</li>
	<li>Dołącz butelkę do nakrętki, która ma połączenia z gazem CO2/O2 (jeśli używany jest gaz Amesa lub Locke'a) oraz do rurki perfuzyjnej (patrz rysunek 1D). Podgrzej butelkę z podłożem do temperatury 37 oC i umieść ją na płycie grzewczej lub na górze jednostki stymulacji świetlnej w łaźni wodnej ustawionej na 37 – 39 oC17.
	<ol>
		<li>Zalać linie perfuzyjne, wypełniając je środkami perfuzyjnymi, aby zainicjować przepływ napędzany grawitacją.
		<ol>
			<li>W systemie LKC umieść butelkę na górze stymulatora17, aby zapewnić znaczny przepływ grawitacyjny, który jest następnie regulowany przez regulatory natężenia przepływu bez wpływu obniżającego się poziomu roztworu perfuzyjnego w butelce podczas eksperymentu.</li>
			<li>W systemie Ocuscience umieść butelkę perfuzyjną w klatce Faradaya, aby zminimalizować hałas i umieść długie linie wyjściowe perfuzji od uchwytu próbki (patrz krok 2.8) znacznie poniżej poziomu uchwytu próbki (i butelki perfuzyjnej), aby zwiększyć napęd grawitacyjny roztworu. Zasłoń te linie wyjściowe i podłącz ekran do amplifier uziemienie, aby zapobiec sprzężeniu szumu elektromagnetycznego z sygnałem ERG.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj perfuzję do 3 – 5 ml/min za pomocą regulatorów natężenia przepływu. Podłącz 5% gazu CO2 / 95% O2 z butli z odpowiednim regulatorem i wyreguluj natężenie przepływu, aby zapewnić równomierne bulgotanie pożywki w butelce przez kamień napowietrzający.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Złóż czyste i ostre narzędzia do preparowania, w tym mikronożyczki z prostym ostrzem, jedną lub dwie pęsety 45o, żyletkę i prostokątny kawałek bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Wlać około 200 ml zimnego roztworu perfuzyjnego na dużą szalkę Petriego, tak aby cała dolna część uchwytu próbki (w tym kopuły) mogła być zanurzona w roztworze. Ten krok staje się ważny podczas montażu siatkówki na kopułkach (patrz krok 2.6). Chociaż niektóre roztwory są przeznaczone do nasycania karbogenem (5% CO2 / 95% O2 ), nie jest to niezbędne do celów preparacji i nie zostało wykonane w opisanych tutaj eksperymentach.</li>
	<li>W przypadku typowego eksperymentu trzymaj zwierzęta w 12/12-godzinnym cyklu ciemności/światła i przyzwyczajaj je do ciemności przez 6 – 12 godzin przed nagraniami. Poddać zwierzę eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy w przyćmionym czerwonym świetle i wykonać wszystkie poniższe procedury w przyćmionym świetle czerwonym lub podczerwonym (użyj np. czerwonego filtra przed źródłem światła mikroskopu).
	<ol>
		<li>Wyciągnij oczy za pomocą pęsety i umieść je w nośniku. Umieść jedno oko na raz na małym kawałku papieru (np. zwykłej bibule filtracyjnej) i zrób szczelinę mniej więcej na poziomie ora serrata, trzymając oko pęsetą (odbywa się to poza roztworem tutaj).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciąć wzdłuż ora serrata (lub bliżej równika oka) mikronożyczkami i usunąć rogówkę i soczewkę. Umieść muszlę oczną w zimnym podłożu na dużej szalce Petriego i powtórz tę samą procedurę z drugim okiem.</li>
	<li>Wytnij małe nacięcie od górnej części muszli ocznej w kierunku nerwu wzrokowego, trzymając nożyczki między siatkówką a twardówką, aby siatkówka była jak najbardziej nienaruszona. Chwyć twardówkę z obu stron nacięcia za pomocą dwóch pęset i odciągnij pęsetę od siebie, aby odłączyć siatkówkę.
	<ol>
		<li>Przetnij nerw wzrokowy i spróbuj odizolować siatkówkę przy minimalnym kontakcie fizycznym z dystalną powierzchnią. RPE w większości przypadków odłącza się automatycznie od siatkówki podczas procesu preparacji. Ważniejsze jest uniknięcie mechanicznego uszkodzenia siatkówki niż szybkie wykonanie sekcji, zazwyczaj siatkówki można inkubować co najmniej 30 minut w roztworze bez znaczącego wpływu na właściwości odpowiedzi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj siatkówki na kopułach uchwytu próbki (rysunek 1C). Zanurz dolną część uchwytu próbki w szalce Petriego z wypreparowanymi siatkówkami. Przesuń siatkówkę, stroną fotoreceptora (wypukła powierzchnia izolowanej siatkówki) do góry, nad kopułę i podnieś uchwyt próbki tak, aby siatkówka przylegała do bibuły filtracyjnej. Powtórz procedurę dla drugiej siatkówki.</li>
	<li>Ostrożnie osusz płytkę mocującą, aby zapobiec przesłuchom elektrycznym między siatkówkami, a także szumom i bocznikowaniu sygnału. Uchwyt na próbkę posiada O-ringi wokół kopuł dolnej części, aby zapobiec rozlaniu roztworu między dolną i górną częścią uchwytu, a także pomóc w izolacji elektrycznej stron fotoreceptorów i komórek zwojowych poszczególnych siatkówk. Przymocuj górną część uchwytu za pomocą czterech (patrz Rysunek 1B) i napełnij kanały perfuzyjne roztworem perfuzyjnym za pomocą strzykawki i igły.</li>
	<li>Przenieś uchwyt próbki obok bloku wymiennika ciepła i podłącz wejściowe i wyjściowe przewody perfuzyjne do uchwytu próbki (Rysunek 1D). Podłącz elektrody do ERG amplifier (górne elektrody łączą się z pinem masy/minus we amplifier) i przymocuj stymulator/jednostkę sterującą do uchwytu próbki za pomocą adaptera lub wsuń poduszkę grzewczą do stymulatora, w zależności od tego, który system ERG in vivo jest używany.</li>
</ol>
3. Nagrania
<ol>
	<li>Skonfiguruj ustawienia wzmacniacza i bodźca za pomocą oprogramowania systemu in vivo. Ustaw częstotliwość akwizycji na wartość od 1 do 10 kHz, a filtrowanie dolnoprzepustowe na 300 Hz. Nie używaj filtrowania górnoprzepustowego. W razie potrzeby użyj filtra wycinającego 60 Hz (lub 50 Hz w Europie).</li>
	<li>Zapisz linię bazową bez stymulacji światłem i ze słabą stymulacją (np. zielone światło -35 dB lub 0,3 mCd sm-2), aby przetestować dobre połączenie elektryczne między elektrodami a próbką siatkówki. Odczekaj 10 – 20 minut przed rozpoczęciem zbierania danych, aby temperatura i funkcja siatkówki osiągnęły stabilny stan.
	<ol>
		<li>Wybierz parametry bodźca zgodnie z konkretnym eksperymentem i rozpocznij zbieranie danych. Na przykład użyj zielonego światła od -40 do 0 dB lub od 0,1 do 1,000 mCd sm-2 dla rodziny odpowiedzi skotopowych. Używaj około 2 do 3 jednostek logarytmu jaśniejszych błysków w nagraniach fotopowych, w których pręciki muszą być stłumione przez światło tła (3 – 30 Cdm-2) lub błysk sondy (około 1,3 Cd sm-2 = 1 dB, patrz rysunek 3).</li>
		<li>Pamiętaj jednak, że dokładne wartości natężenia światła mogą być w pewnym stopniu zależne od kalibracji systemu i warunków eksperymentalnych. Z reguły należy zmniejszyć intensywność o 5-10 razy w porównaniu z nagraniami in vivo przy użyciu zielonego światła17. osłona z otworami nad siatkówkami (zawarta w komercyjnym systemie adapterów) może być użyta w celu zmniejszenia rozpraszania światła w uchwycie próbki i ułatwienia jednorodnej i równej stymulacji obu siatkówk przez sferę Ganzfelda komercyjnych systemów in vivo. 
		UWAGA: W przypadku nagrań z siatkówki przystosowanej do ciemności, intensywność błysków testowych stosowanych w typowym eksperymencie wybiela tylko znikomą część pigmentu, więc brak regeneracji opartej na RPE nie stanowi problemu. Ponadto wykazano wcześniej, że regeneracja pigmentu czopków może nadal zachodzić w izolowanej siatkówce za pośrednictwem cyklu widzenia komórek Müllera20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponieważ eksperymenty trwają zazwyczaj od 30 minut do kilku godzin, należy monitorować dryft linii bazowej, poziom hałasu i stabilność odpowiedzi podczas eksperymentu, ponieważ zmiany w nich mogą wskazywać na problemy techniczne. 
	UWAGA: Zwiększony szum lub zmniejszona amplituda odpowiedzi mogą wskazywać na pęcherzyki powietrza w kanałach perfuzyjnych lub elektrodowych, zbyt niską lub wysoką temperaturę, wyciek/rozlanie roztworu lub przemieszczenie siatkówki.</li>
</ol>
4. Czyszczenie
<ol>
	<li>Odłącz uchwyt próbki od przewodów perfuzyjnych, otwórz go i przepłucz siatkówki z bibuły filtracyjnej. Wyjmij elektrody i przepłucz je wodą destylowaną (nie używaj etanolu). Oczyścić uchwyt próbki (w tym kanały perfuzyjne) etanolem i/lub wodą destylowaną. Ostrożnie przepłukać rurkę perfuzyjną >70% etanolem.</li>
	<li>Wypłucz butelkę perfuzyjną wodą destylowaną (nie używaj detergentów). Etanol może być również używany do czyszczenia butelki.</li>
</ol>

<ol><li>Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).</li>
<li>Einthoven, W., Jolly, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+form+and+magnitude+of+the+electrical+response+of+the+eye+to+stimulation+by+light+at+various+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities.</a> Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).</li>
<li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> J. Physiol. 77, 207-239 (1933).</li>
<li>Penn, R. D., Hagins, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transmission+along+retinal+rods+and+the+origin+of+the+electroretinographic+a-wave%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave.</a> Nature. 223, 201-204 (1969).</li>
<li>Stockton, R. A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-wave+of+the+electroretinogram.+A+reflection+of+ON+bipolar+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity.</a> J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).</li>
<li>Robson, J. G., Frishman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+linearity+and+kinetics+of+the+cat+retina%3A+the+bipolar+cell+component+of+the+dark-adapted+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram.</a> Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).</li>
<li>Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+responses+to+light+from+cat+pigment+epithelium%3A+origin+of+the+electroretinogram+c-wave%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave.</a> Nature. 227, 728-730 (1970).</li>
<li>Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bovine+arterially-perfused+eye%3A+an+in+vitro+method+for+the+study+of+drug+mechanisms+on+IOP%2C+aqueous+humour+formation+and+uveal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature.</a> Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+%28Rana+temporaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).</li>
<li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> J. Physiol. 167, 156-168 (1963).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).</li>
<li>Bastian, B. L., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+adaptation+in+toad+rods%3A+requirement+for+an+internal+messenger+which+is+not+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium.</a> J. Physiol. 297, 493-520 (1979).</li>
<li>Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gradients+across+the+receptor+layer+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina.</a> J. Physiol. 256, 333-360 (1976).</li>
<li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Res. 101, 108-117 (2014).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
<li>Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+conductance+block+by+barium+in+amphibian+Muller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells.</a> Brain Res. 498, 308-314 (1989).</li>
<li>Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+buffering+of+extracellular+potassium+by+Muller+%28glial%29+cells+in+the+toad+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina.</a> Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).</li>
<li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration%3A+retinal+tissue+as+a+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).</li>
<li>Walter, P., Luke, C., Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+light+responses+in+superfused+bovine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and light responses in superfused bovine retina.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+profile+of+alkylphosphocholines+in+the+model+of+the+isolated+perfused+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).</li>
<li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+toxicity+testing+of+VEGF+Trap-Eye+in+an+isolated+perfused+vertebrate+retina+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model.</a> Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+sensitivities+of+short-+and+long-wavelength+sensitive+cone+mechanisms+in+the+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina.</a> Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).</li>
<li>Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-+and+midwave-sensitive+cone-driven+retinal+responses+of+the+mouse%3A+a+possible+phenotype+for+coexpression+of+cone+photopigments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments.</a> J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).</li>
<li>Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+candelas+to+photoisomerizations+in+the+mouse+eye+by+rhodopsin+bleaching+in+situ+and+the+light-rearing+dependence+of+the+major+components+of+the+mouse+ERG%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG.</a> Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).</li>
<li>Azevedo, A. W., Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+protocols+alter+phototransduction%3A+the+implications+for+retinal+processing+at+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold.</a> J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+I.+Structural+analysis+using+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy.</a> J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).</li>
<li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation in vertebrate photoreceptors.</a> Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).</li>
<li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li>
<li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors%3A+adaptation%2C+noise%2C+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li>
<li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina%3A+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li>
<li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li>
<li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li>
</ol>

Uniwersytet Waszyngtoński w St. Louis ma umowę licencyjną z firmą Xenotec, Inc. i może otrzymywać tantiemy ze sprzedaży adaptera ex vivo .

Pokazujemy tutaj kluczowe kroki do uzyskania wysokiej jakości zapisów ERG ex vivo jednocześnie z dwóch izolowanych siatkówk myszy przy użyciu komponentów systemu ERG in vivo wraz z adapterem ERG ex vivo . W tym badaniu przeprowadziliśmy perfuzję obu siatkówk zwierzęcia tym samym roztworem (Amesa, Locke'a lub Ringera), ale możliwe jest również perfuzje każdej siatkówki innym roztworem , np . w celu przeprowadzenia testów narkotykowych. Najważniejszymi krokami do uzyskania wysokiej jakoś...

Elektroretinogram (ERG) to sprawdzona technika, która może być używana do rejestrowania aktywności elektrycznej siatkówki wywołanej przez światło. Sygnał ERG generowany jest głównie przez zmiany napięcia wywołane prądami promieniowymi (wzdłuż osi fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych) płynącymi w rezystancyjnej przestrzeni zewnątrzkomórkowej siatkówki. Pierwszy sygnał ERG został zarejestrowany w 1865 roku przez Holmgrena z powierzchni rybiego oka1. Einthoven i Jolly 1908podzielili odpowiedź ERG na nadejście światła na trzy różne fale, zwane falami a, b i c, o których obecnie wiadomo, że odzwierciedlają głównie aktywność fotoreceptorów, komórek dwubiegunowych ON i komórek nabłonka barwnikowego, odpowiednio3-8. ERG można rejestrować z oczu znieczulonych zwierząt lub ludzi (in vivo), z izolowanego preparatu oka9, przez izolowaną nienaruszoną siatkówkę (ex vivo)3,10-15 lub przez określone warstwy siatkówki za pomocą mikroelektrod (miejscowy ERG)4,16. Spośród nich ERG in vivo jest obecnie najczęściej stosowaną metodą oceny funkcji siatkówki. Jest to nieinwazyjna technika, która może być stosowana do celów diagnostycznych lub do śledzenia postępu chorób siatkówki u zwierząt lub pacjentów. Jednak zapisy ERG in vivo wytwarzają skomplikowany sygnał z kilkoma nakładającymi się na siebie komponentami, często zanieczyszczony pozagałkowym szumem fizjologicznym (np. oddechem i czynnością serca).
Lokalne ERG może być używane do nagrywania sygnału przez określone warstwy siatkówki, ale jest najbardziej inwazyjne i ma najniższy stosunek sygnału do szumu (SNR) w porównaniu do innych konfiguracji zapisu ERG. Miejscowy ERG jest również wymagający technicznie i wymaga drogiego sprzętu (np. mikroskopu i mikromanipulatorów). Transsiatkówkowa ERG z nienaruszonej, izolowanej siatkówki (ex vivo ERG) stanowi kompromis między metodami ERG in vivo i miejscowymi, umożliwiając stabilne i wysokie zapisy SNR z nienaruszonych siatkówk zwierząt lub ludzi17. Ostatnio metoda ta jest z powodzeniem stosowana do badania funkcji fotoreceptorów pręcików i czopków w siatkówkach ssaków, naczelnych i ludzkich18-20. Ponadto, ze względu na brak nabłonka barwnikowego w siatkówce ex vivo, dodatnia składowa załamka c sygnału ERG jest usuwana, a w nagraniach ex vivo ujawnia się wyraźna ujemna wolna składowa PIII. Wykazano, że powolny składnik PIII pochodzi z aktywności komórek glejowych Müllera w siatkówce21-23. W ten sposób metoda ERG ex vivo może być również wykorzystana do badania komórek Müllera w nienaruszonej siatkówce. Kilka badań wykazało również, że zapisy ERG ex vivo mogą być wykorzystywane do pomiaru stężenia środków farmakologicznych wokół siatkówki24 oraz testowania bezpieczeństwa i skuteczności leków25-27.
Wiele komercyjnych systemów in vivo jest dostępnych i używanych w wielu laboratoriach, które niekoniecznie mają rozległe zaplecze elektrofizjologiczne. Z kolei urządzenia ex vivo nie były dostępne do niedawna17 i w rezultacie tylko bardzo niewiele laboratoriów korzysta obecnie z tej potężnej techniki. Korzystne byłoby udostępnienie zapisów ERG ex vivo większej liczbie laboratoriów w celu pogłębienia naszej wiedzy na temat fizjologii i patologii siatkówki oraz opracowania nowych terapii chorób powodujących ślepotę. Demonstrujemy tutaj proste i niedrogie urządzenie ERG ex vivo 17 i pokazujemy, w jaki sposób można je wykorzystać w połączeniu z kilkoma dostępnymi na rynku systemami ERG in vivo do rejestrowania sygnalizacji za pośrednictwem pręcików i czopków (fale a- i b) oraz funkcji komórek Müllera (wolne PIII) z nienaruszonych siatkówek myszy typu dzikiego.

<table><tbody><tr><td>In vivo System ERG</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td></tr><tr><td>In vivo System ERG</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex Adapter vivo</td><td>OcuScience</td><td>Ex Adapter VIVO</td> <td>ERG<a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp; idCategory=27">Może używać emitera IR dowolnej marki</a></td></tr> <tr><td>Opto</td><td>Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler Noktowizory</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Produkt klasy wojskowej.</td></tr><tr><td>Filtr czerwony</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Średni Czerwony</td><td>Może być używany zamiast systemu IR</td></tr><tr><td>Czerwona lampa czołowa</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>pęseta Dumont #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Może używać dowolnej marki</a></td></tr><tr><td>pH-metr i elektroda</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Może używać dowolnej marki</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Może używać dowolnej marki</a</td></tr><tr><td>>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M roztwór</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M roztwór</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu bursztynowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>Może używać dowolnej marki</td></tr><tr><td>MEM witaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO2</td></tr></tbody></table>

jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Sygnał elektroretinogramu in vivo (ERG) składa się z kilku nakładających się na siebie składników pochodzących z różnych typów komórek siatkówki, a także szumu ze źródeł pozasiatkówkowych. Ex vivo ERG zapewnia skuteczną metodę preparowania funkcji komórek siatkówki bezpośrednio z nienaruszonej izolowanej siatkówki zwierząt lub oczu dawcy. Ponadto ERG ex vivo może być stosowany do testowania skuteczności i bezpieczeństwa potencjalnych środków terapeutycznych na tkance siatkówki zwierząt lub ludzi. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób dostępne na rynku systemy ERG in vivo mogą być wykorzystywane do prowadzenia zapisów ERG ex vivo z izolowanych siatkówek myszy. Łączymy jednostki stymulacji świetlnej, elektroniczne i grzewcze standardowego systemu in vivo ze specjalnie zaprojektowanym uchwytem na próbki, systemem perfuzji sterowanym grawitacyjnie i ekranowaniem szumów elektromagnetycznych, aby rejestrować niskoszumowe sygnały ERG ex vivo jednocześnie z dwóch siatkówk za pomocą oprogramowania do akwizycji zawartego w komercyjnym in vivo Systemów. Ponadto pokazujemy, jak stosować tę metodę w połączeniu z leczeniem farmakologicznym, które usuwa określone składniki ERG w celu zbadania funkcji niektórych typów komórek siatkówki.

Rejestrowaliśmy odpowiedzi błyskowe z siatkówek myszy szczepu dzikiego (WT) C57BL/6 zaadaptowanych do ciemności, postępując zgodnie z opisanymi powyżej i zilustrowanymi na Rysunku 1 protokołami eksperymentalnymi, stosując różne standardowe roztwory perfuzyjne (Rysunek 2). Kształt i kinetyka fal odpowiedzi, a także czułość fotoreceptorów pręcikowych, wydawały się podobne w pożywkach Ames’a i Locke’a (Rysunek 2A i B). Z kolei w roztworze Ringera buforowany...

Ex vivo ERG może być używany do rejestrowania aktywności elektrycznej komórek siatkówki bezpośrednio z izolowanych nienaruszonych siatkówk zwierząt lub ludzi. Pokazujemy tutaj, jak powszechne systemy ERG in vivo można dostosować do zapisów ERG ex vivo w celu zbadania aktywności elektrycznej komórek siatkówki.

Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena funkcji komórek wyizolowanej siatkówki myszy przy użyciu komercyjnego systemu do elektroretinogramu (ERG) in vivo wraz z adapterem ex vivo. Procedura ta polega najpierw na wypreparowaniu siatkówek z obu oczu myszy. Drugim krokiem jest zamontowanie siatkówek w uchwycie do próbek stroną fotoreceptorów do góry.Następnie uchwyt do preparatu umieszcza się na płycie grzewczej w systemie ERG in vivo i podłącza do perfuzji sterowanej grawitacyjnie. Ostatnim krokiem jest podłączenie elektrod uchwytu do preparatu do wzmacniacza i stymulacja siatkówek światłem w celu uzyskania odpowiedzi ERG. Ostatecznie ERG ex vivo służy do wykazania, w jaki sposób szlaki sygnalizacyjne zapśredniczone przez pręciki i czopki mogą być analizowane z wykorzystaniem farmakologii oraz specjalistycznych protokołów stymulacji świetlnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak badania in vivo, ERG czy rejestracje z pojedynczych komórek, jest zapewnienie wyższego stosunku sygnału do szumu, dłuższych i bardziej stabilnych rejestracji, a także możliwość łatwych i ilościowych manipulacji farmakologicznych. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do badania skuteczności i bezpieczeństwa leków opracowanych w celu leczenia chorób siatkówki na siatkówkach naczelnych oraz siatkówkach pochodzących od dawców ludzkich. Przynajmniej jeden dzień wcześniej należy zmodyfikować dolną część uchwytu preparatu, przyklejając czarno-szary papier filtrujący do górnej części kopułek. Należy użyć dwuskładnikowej, pięciominutowej żywicy epoksydowej wzdłuż krawędzi kopułek, a w razie potrzeby skorzystać z mikroskopu sekcyjnego. Po wyschnięciu kleju należy dociśnąć papier filtrujący do kopułki.Będzie to wystarczające na około miesiąc pomiarów. Następnie należy usunąć papier i wyczyścić kopułkę 70% ethanolem. Aby przygotować elektrodę, w pierwszej kolejności należy wypełnić kanały elektrody roztworem elektrolitycznym.Należy starać się unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza. Następnie wkręć elektrody peletowe w kanały elektrodowe. Połącz górną i dolną część uchwytu do próbek za pomocą czterech śrub i wypełnij linie perfuzyjne roztworem elektrodowym.Następnie należy zmierzyć rezystancję oraz napięcie między przewodami par elektrod. Rezystancja powinna wynosić poniżej 100 kilo omów, a napięcie poniżej 10 milivoltów. Jeśli w kanałach nie ma pęcherzyków powietrza, a elektrody są w dobrym stanie, należy nalać od 400 do 700 mililitrów pożywki perfuzyjnej do szklanej butelki przeznaczonej do perfuzji próbki.Należy również odlać 300 mililitrów do sekcji i przechowywać go w lodówce. Następnie należy przeprowadzić przewód perfuzyjny przez blok wymiennika ciepła i umieścić podgrzany blok na płycie grzewczej. Teraz należy zamknąć butelkę nakrętką z wlotem gazu i wlotem dla przewodu perfuzyjnego.Wlot gazu należy podłączyć do kamienia napowietrzającego. Umieść podgrzaną wcześniej butelkę, w której medium perfuzyjne będzie utrzymywane w temperaturze 37 °C. Następnie przygotuj linie perfuzyjne, napełniając je medium perfuzyjnym, aby zainicjować przepływ grawitacyjny w systemie ocus science.Umieść butelkę w klatce Faradaya, aby zminimalizować szumy, i zastosuj długie linie wyjściowe perfuzji z uchwytu preparatu. Linie wyjściowe, umieszczone znacznie poniżej poziomu uchwytu preparatu i butelki perfuzyjnej, należy ekranować, a ekran podłączyć do masy wzmacniacza poprzez klatkę Faradaya. Aby zapobiec sprzężeniu szumów elektromagnetycznych z sygnałem ERG, przytwierdź sondę temperatury do stołu grzewczego.Następnie, za pomocą regulatorów, dostosuj przepływ roztworu do wartości od trzech do pięciu mililitrów na minutę. Na koniec, w razie potrzeby, wprowadź powietrze i gaz do roztworu i ustaw regulator tak, aby z kamienia napowietrzającego wydobywał się stały strumień pęcherzyków. Rozpocznij od wlania około 200 mililitrów zimnego roztworu perfuzyjnego do dużej płytki Petriego, aby cała dolna część uchwytu preparatu mogła zostać całkowicie zanurzona.Uśmierć zwierzę hodowane w cyklu światło-ciemność 12/12 h, a następnie poddane adaptacji do ciemności przez okres od 6 do 12 godzin przed rozpoczęciem pomiarów. Wszystkie poniższe procedury muszą być wykonywane przy słabym czerwonym lub podczerwonym świetle. Po wyizolowaniu każdego oka, należy umieścić je w medium do oczu.Następnie przenieś jedno oko na mały kawałek papieru filtracyjnego. Chwyć je pęsetą i wykonaj nacięcie na poziomie podobnym do aura serrata. Przetnij wzdłuż aura serrata lub bliżej równika, aby usunąć rogówkę i soczewkę.Następnie usunąć rogówkę oraz końcówkę soczewki i przenieść oczodoł do zimnego medium. Powtórzyć tę samą procedurę z drugim okiem. Pracując teraz z oczodołem, wykonać niewielkie nacięcie od góry w kierunku nerwu wzrokowego.Utrzymuj nożyczki pomiędzy siatkówką a twardówką, aby siatkówka pozostała w jak najmniejszym stopniu uszkodzona. Następnie, chwyć twardówkę po obu stronach nacięcia za pomocą dwóch pęset i rozsuń tkankę, aby odizolować siatkówkę. Aby wyizolować siatkówkę, przetnij nerw wzrokowy i usuń siatkówkę, minimalizując kontakt z jej powierzchnią dystalną.Teraz zamocuj wyizolowane siatkówki na kopułach uchwytu do preparatów. Najpierw zanurz dolną część uchwytu do preparatów w szalce Petriego z wypreparowanymi siatkówkami. Następny slajd.Fotoreceptory siatkówki lub strona wypukła powinny być skierowane ku górze nad kopułą. Następnie delikatnie unieś uchwyt preparatu, aby siatkówka przywarła do papieru filtracyjnego. Powtórz tę procedurę dla drugiej siatkówki.Następnie ostrożnie osusz płytkę uchwytu, aby zapobiec szumom wynikającym z przesłuchów oraz zwarciom sygnału. Po osuszeniu uchwytu przykręć górną część i napełnij kanały perfuzyjne roztworem perfuzyjnym za pomocą strzykawki z igłą. Umieść uchwyt preparatu obok bloku wymiany ciepła.Następnie podłącz linie perfuzyjne wejściowe i wyjściowe. Uzupełnij konfigurację, podłączając elektrody do wzmacniacza ERG i mocując jednostkę sterującą stymulatora do uchwytu preparatu. Aby uzyskać powtarzalne i wyraźne odpowiedzi, należy przeprowadzić staranną dysekcję i montaż siatkówek, a także zapewnić stabilną perfuzję nad siatkówkami, wolną od pęcherzyków powietrza, przed rozpoczęciem zbierania danych.Odczekać od 10 do 20 minut, aby temperatura i funkcja siatkówek ustabilizowały się; odpowiedzi błyskowe rejestrowano z ciemnoadaptowanych siatkówek dzikiego typu C 57 black six, stosując różne standardowe roztwory perfuzyjne. Kształty i kinetyka przebiegów odpowiedzi były podobne w medium Ames oraz w medium Locke. Czułość fotoreceptorów pręcikowych była również podobna.Z drugiej strony, w roztworze ringera Hepesa bez wodorowęglanów lub napowietrzania karbogenem, amplitudy były znacznie mniejsze. Stabilność fali B była również często zaburzona w roztworze ringera Hepesa. Dodanie 40 µM APB skutecznie usunęło dodatnią falę B.Wykazało to obecność dużej, powolnej fali ujemnej, którą przypisuje się aktywności komórek Müllera; dodanie 100 μM baru znosi ten efekt. Składnik ten ujawnia odpowiedź fotoreceptorów w sygnale ERG ex vivo. Metoda ta może być łączona z innymi narzędziami, takimi jak farmakologia i genetyka, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące mechanizmów molekularnych sygnalizacji siatkówkowej oraz chorób prowadzących do ślepoty u ssaków, w tym w siatkówkach ludzkich.

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowanie wieloogniskowego elektroretinogramu (mfERG) stanowi istotny postęp w diagnostyce i charakteryzacji retinopatii. Wieloogniskowe elektroretinogramy są średnią matematyczną przybliżenia fali b. Programy komputerowe potrafią wygenerować ERG z ponad stu obszarów siatkówki w ciągu zaledwie kilku minut na jedno oko. Dzięki temu możliwe jest mapowanie i ilościowa ocena scotom oraz dysfunkcji siatkówki.

Multifokalne elektroretinogramy

Opisujemy stosunkowo prostą metodę rejestracji transretinalnego elektroretinogramu (ERG) w celu uzyskania odpowiedzi fotoreceptorowych pręcików i czopków z nienaruszonej siatkówki myszy. Podejście to wykorzystuje blokadę przekaźnictwa synaptycznego z fotoreceptorów w celu wyizolowania ich odpowiedzi na światło i zarejestrowania ich za pomocą elektrod polowych umieszczonych w poprzek wyizolowanej, rozłożonej płasko siatkówki.

Rejestracja transretinalnego ERG z siatkówki myszy: fotoreakcje czopków i pręcików

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Ten film pokazuje, jak rejestrować elektroretinogram (ERG) i wizualny potencjał wywołany (VEP) u przytomnego szczura. Szczur, z chirurgicznie wszczepionymi elektrodami, jest najpierw przystosowany do ciemności. Po zastosowaniu kropli rozszerzających zwierzę umieszcza się w unieruchomieniu i umieszcza w misce Ganzfelda. Następnie rejestrowane są sygnały ERG i VEP.

Zapis elektroretinogramu i wizualnego potencjału wywołanego u szczura

Elektroretinogram (ERG) to potencjał elektryczny generowany przez siatkówkę w odpowiedzi na światło. W artykule opisano, w jaki sposób można wykorzystać ERG do oceny funkcji siatkówki u szczurów przystosowanych do ciemności oraz jak można go wykorzystać do oceny interwencji neuroprotekcyjnej, w tym przypadku zdalnego warunkowania niedokrwiennego.

Wykorzystanie elektroretinogramu do oceny funkcji siatkówki gryzoni i ochronnych skutków warunkowania wstępnego niedokrwiennego kończyn na odległość

Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.

Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) u myszy za pomocą techniki znanej jako DC-ERG, po raz pierwszy opisanej przez Marmorsteina, Peacheya i współpracowników na początku 2000 roku.

Elektroretinogram ze sprzężeniem bezpośrednim (DC-ERG) do rejestrowania wywołanych światłem reakcji elektrycznych nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Przestrzeganie międzynarodowych standardów i utrzymanie adaptacji siatkówki do ciemności jest niezbędne do uzyskania prawidłowych odpowiedzi na elektroretinogram w pełnym polu w diagnostyce i leczeniu dziedzicznych chorób siatkówki. Dostępny jest praktyczny protokół wykorzystujący przenośną ciemnię w celu uzyskania  pełnopolowy elektroretinogram dla niemowląt i dzieci w sedacji lub znieczuleniu ogólnym na sali operacyjnej.

Zapis elektroretinogramu dla niemowląt i dzieci pod narkozą w celu osiągnięcia optymalnej adaptacji do ciemności i międzynarodowych standardów

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Modyfikacja istniejących urządzeń do tworzenia wieloelektrodowych układów lub krosówek sprawia, że elektroretinogram ex vivo jest szerzej dostępny. Ulepszone metody rejestrowania i utrzymywania odpowiedzi na światło ex vivo ułatwiają badanie funkcji fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych ON w zdrowej siatkówce, zwierzęcych modelach chorób oczu i ludzkich siatkówkach dawców.

Optymalizacja ustawień i warunków elektroretinogramu ex vivo w celu badania funkcji siatkówki w małych i dużych oczach

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Poznaj metodę elektroretinografii ex vivo do badania funkcji komórek siatkówki myszy. Technika umożliwia analizę szlaków sygnałowych pręcików i czopków z wysoką rozdzielczością.

Jednoczesne badanie funkcjonalne ex vivo dwóch siatkówk za pomocą systemu elektroretinogramu in vivo

Przeglądaj więcej filmów