Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

Celem tej procedury jest tymczasowe i zdalne wyciszenie aktywności neuronalnej w dyskretnych obszarach mózgu, podczas gdy zwierzęta są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Osiąga się to poprzez uprzednie załadowanie litery V, która zawiera receptor projektanta i reporter, do strzykawki do infuzji. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie litery V do obszaru zainteresowania w mózgu szczura.

Następnie przygotowuje się biologicznie obojętny klozapinę i tlenek i wstrzykuje się go ogólnoustrojowo szczurowi. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie testów behawioralnych przy użyciu paradygmatu wstępnego warunkowania sensorycznego. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna na tkance mózgowej szczura służy do sprawdzenia umiejscowienia receptora projektanta.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki behawioralnej, w tym między innymi regulację motywacji, uwagi oraz uczenia się i pamięci Upewnij się, że wszystkie instytucjonalne środki ostrożności dotyczące pracy z wirusami związanymi z adenowirusami są przestrzegane przez cały czas wirus używany w tym filmie jest klasyfikowany jako związek pierwszego poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Przygotuj 10% roztwór wybielacza. Odkażanie miejsca odpadów, bega zawierająca roztwór wybielacza i sterylną strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów.

W miejscu pracy umieść probówkę z mikrowirówką zawierającą podwielokrotność a V w standardowym imadle stołowym Załaduj 10 mikrolitrów strzykawki z co najmniej czterema mikrolitrami AV. Upewnij się, że w czterech mikrolitrach roztworu v nie ma pęcherzyków powietrza. Pustą probówkę z wirusem należy umieścić w strzykawce do zlewki zawierającej 10% wybielacza.

Dodaj dodatkowe 10% wybielacza do pojemnika na odpady i pozostaw odpady na 30 minut przed wyrzuceniem odkażonych odpadów płynnych zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Przygotować obszar operacyjny, umieszczając chłonną bibułę stołową pod aparatem stereotaktycznym i w przyległym miejscu wyznaczonym jako dedykowany obszar do walki z wirusem. Po wywołaniu znieczulenia było 3% izofu, fluoru i tlenu w tempie jednego litra na minutę.

Ogolono futro od między oczami do nieco za uszami. Po ogoleniu umieść szczura z powrotem w komorze indukcyjnej na trzy minuty z zabezpieczeniem szczura w aparacie stereotaktycznym. Zakryj oczy maścią okulistyczną i przygotuj miejsce nacięcia, czyszcząc je Betadine.

Po wykonaniu 2,4-centymetrowego nacięcia w linii środkowej skóry, pokrywającego czaszkę, zaczynając około dwumilimetrowy nasadkę do oczu, cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę, a następnie usuń tkankę błoniastą z czaszki, aż bgma i lambda będą wyraźnie widoczne. Po upewnieniu się, że czaszka jest płaska, ustaw wiertło na bgma, wyzeruj współrzędne, a następnie przesuń wiertło do żądanych współrzędnych przyśrodkowych, bocznych i przednich tylnych. Wywierć otwór za pomocą wiertła 0,9, 0,7 lub 0,5 milimetra.

Ustawić pompę infuzyjną tak, aby dostarczała wirusa z szybkością 0,2 mikrolitra na minutę. La strzykawkę do ramienia infuzyjnego urządzenia stereotaktycznego i opuścić strzykawkę do żądanej współrzędnej. Użyj pompy, aby dostarczyć żądaną ilość wirusa po zakończeniu dostarczania wirusów.

Pozostawić strzykawkę na miejscu na 10 minut, aby zapobiec cofaniu się do igły, powoli podnosić strzykawkę z prędkością około pięciu milimetrów na minutę. Następnie przejdź do następnej współrzędnej i powtarzaj procedurę, aż wszystkie współrzędne zostaną nasycone literą a v. Po zamknięciu rany i wykonaniu znieczulenia pooperacyjnego zgodnie z zatwierdzonym protokołem, należy umieścić szczura w czystej klatce z pościelą, pokrywką i odpowiednim oznakowaniem.

Kiedy szczur w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia, zwróć go do pomieszczenia socjalnego. Odczekaj trzy lub więcej tygodni przed rozpoczęciem testów behawioralnych, aby zapewnić odpowiednią ekspresję receptora projektanta. Rysunek ten przedstawia trzy fazy paradygmatu wstępnego warunkowania sensorycznego: fazę warunkowania, fazę warunkowania i fazę testowania.

, klozapina i tlenek lub CNO, jest stosowany w celu wyciszenia aktywności neuronalnej Poprzez aktywację receptora projektowego, CNO można wstrzyknąć przed dowolną fazą testów. W tym przypadku CNO jest wstrzykiwany 30 minut przed każdą z sesji kondycjonowania wstępnego. Po przygotowaniu świeżego roztworu klozapiny i tlenku w ilości jednego miligrama na mililitr, zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu, wstrzyknąć CNO dootrzewnowo w dawce jednego miligrama na kilogram 30 minut przed testami behawioralnymi.

Zainicjuj kod komputerowy dla odpowiedniej sesji behawioralnej. Po upływie 30 minut umieść szczury w komorach testowych i rozpocznij pierwszą z 4 64-minutowych sesji kondycjonowania wstępnego, przedstawiając szczurom 12 mieszanych prób, które polegają na dostarczaniu bodźców słuchowych i wzrokowych. W sześciu próbach przez 10 sekund prezentowany był bodziec warunku wstępnego, po którym natychmiast następowała pięciosekundowa prezentacja bodźca światła w pozostałych sześciu próbach.

Prezentuj biały szum, sam niewyemitowany bodziec przez 10 sekund. Po zakończeniu fazy przygotowania do kondycjonowania rozpocznij sesje kondycjonujące, które będą prowadzone przez pięć kolejnych dni. Przedstaw szczurom osiem prób, które polegają na dostarczeniu bodźca wizualnego, światła przez pięć sekund, a następnie natychmiast dostarczenia 2 45-miligramowych granulek pokarmu.

Czas ten obejmuje interwały między próbami, które trwają siedem minut po zakończeniu sesji kondycyjnych. Wykonaj pojedynczą 78-minutową sesję testową, przedstawiając szczurom 12 mieszanych prób, które polegają na dostarczaniu samych bodźców słuchowych. W sześciu próbach.

Prezentuj bodziec tonalny, sam bodziec warunku wstępnego przez 10 sekund. W pozostałych sześciu próbach zaprezentuj biały szum, sam niesparowany bodziec przez 10 sekund. Po wykonaniu zadania behawioralnego natychmiast usuń szczury z komór i zwróć je do kolonii zwierząt.

Przeanalizuj dane z fazy kondycjonowania i testu zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu. Po przeprowadzeniu immunohistochemii skierowanej przeciwko znakowanemu białku reporterowemu lub reporterowemu, zbadaj skrawki barwienia za pomocą mikroskopii, aby ustalić lokalizację i ekspresję receptora projektanta i/lub reportera zgodnie z oczekiwaniami Szczury kontrolne i eksperymentalne podobnie nauczyły się związku Pawłowa między bodźcem światła a jedzeniem. Podczas sesji kondycyjnych.

Sesje, obie grupy były również zmotywowane do uzyskania nagrody w postaci jedzenia podczas sesji kondycyjnej. W przeciwieństwie do tego, podczas krytycznej sesji testowej, szczury eksperymentalne nie były w stanie rozróżnić między wstępnie uwarunkowanymi i niewyemitowanymi bodźcami słuchowymi, podczas gdy szczury kontrolne wykazywały większe zachowanie kubka z jedzeniem w odpowiedzi na prezentację bodźca warunku wstępnego. Tak więc szczury kontrolne, ale nie eksperymentalne, wykazały efekt wstępnego warunkowania sensorycznego.

Obraz ten przedstawia histologiczną weryfikację lokalizacji naparu a v w obszarze zainteresowania w mózgu gryzonia po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania wpływu określonych regionów mózgu i/lub typów komórek na złożone zachowanie in vivo.