Name: Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej w mózgu szczurów podczas zadań związanych z uczeniem się i pamięcią. Technika łączy farmakogenetykę z paradygmatem behawioralnym, umożliwiając precyzyjną kontrolę obwodów neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy autorom Robinson et al.12 za ich wkład w powstanie rękopisu, na podstawie którego częściowo powstał niniejszy protokół.

Wykorzystanie zwierząt jest zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Oberlin College i jest zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych21.
1. Przygotowanie do infuzji wirusowej
Uwaga: Ten protokół wykorzystuje środki ostrożności BSL-1. W przypadku stosowania środków ostrożności BSL-2 wymagany jest jednorazowy fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze na buty, ochrona oczu i respirator cząstek stałych (typ N95). Wszystkie osoby mające kontakt ze związkami BSL-2 muszą zostać przetestowane pod kątem odporności na cząstki stałe przez lokalną agencję zdrowia publicznego. Patrz Lowery & Majewska (2010)22 w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat obchodzenia się z wektorami wirusowymi i ich przechowywania.
<ol>
	<li>Przy pierwszym użyciu należy podwielokrotnić i przechowywać niewykorzystany wirus w probówkach do mikrowirówek o pojemności 20 μl, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Przygotuj powierzchnię roboczą, usuwając wszelkie niepotrzebne przedmioty i sterylizując powierzchnię 70% etanolem. Przygotuj 10% roztwór wybielacza do odkażania odpadów AAV. Umieść zlewkę pełną roztworu wybielacza i sterylną strzykawkę o pojemności 10 μl na powierzchni roboczej. Umieść probówkę mikrowirówki z AAV w pojemniku z pokruszonym lodem podczas ustawiania.</li>
	<li>Umieść probówkę wirówkową z wirusem w standardowym imadle laboratoryjnym. Załadować strzykawkę o pojemności 10 μl co najmniej 4 μl AAV. Należy uważać, aby nie zginać końcówki strzykawki o dno probówki mikrowirówki podczas ładowania. Upewnij się, że w 4 μl roztworu AAV w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Pustą probówkę z wirusem wyrzucić do zlewki zawierającej 10% wybielacza. Niewykorzystane porcje wirusa należy przechowywać zgodnie z zaleceniami dostawcy.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 10% wybielacza do pojemnika na odpady i pozostaw odpady na 30 minut przed wyrzuceniem odkażonych odpadów płynnych.</li>
	<li>Zutylizuj cały sprzęt ochronny i odpady z tworzyw sztucznych w pojemniku na zagrożenie biologiczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Odkaż wszelkie urządzenia lub powierzchnie, które miały kontakt z wirusem, za pomocą 10% wybielacza.</li>
</ol>
2. Chirurgia
<ol>
	<li>Przygotować obszar operacyjny, umieszczając chłonną bibułę stołową pod aparatem stereotaktycznym i w przyległym miejscu wyznaczonym jako dedykowany obszar do walki z wirusem.
	<ol>
		<li>Umieść pojemnik na odpady z 10% wybielacza w dedykowanym obszarze do obsługi wirusów w pobliżu aparatu chirurgicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wywołaj stały poziom znieczulenia i przygotuj szczura do operacji.
	<ol>
		<li>Umieść szczura w komorze indukcyjnej, która zawiera mieszaninę gazowego izofluranu (zakres od 1 do 3%) i tlenu (100% przy około 1 l/min), aż do utraty przytomności i braku rażących, celowych ruchów. Utrzymuj znieczulenie izofluranem przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego.</li>
		<li>Po osiągnięciu 6 głębokiego znieczulenia ogol szczura od spomiędzy oczu do nieco za uszami. </li>
		<li>Umieść szczura z powrotem w komorze indukcyjnej na dodatkowe 1-3 minuty.</li>
		<li>Upewnij się, że system znieczulenia izofluranem jest połączony ze stożkiem nosowym operacji stereotaktycznej. Otworzyć zawór odcinający na rurkach izofluranu, aby rozpocząć przepływ izofluranu do stereotaksu. Utrzymać izofluran i tlen na poziomach określonych powyżej.</li>
		<li>Umieść szczura w aparacie stereotaktycznym, mocując usta do pręta gryzącego i zabezpieczając nauszniki.</li>
		<li>Nałóż smar do oczu na oczy i betadynę na miejsce operacji przed nacięciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj 2,4 cm nacięcie w linii środkowej skóry na grzbietowej powierzchni czaszki, zaczynając około 2 mm ogonowo do oczu. Cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę. Okresowo wkraplaj sterylną 0,9% sterylną sól fizjologiczną na brzegi pola operacyjnego, aby zapobiec wysuszeniu tkanek. </li>
	<li>Oczysta tkanka błoniasta od czaszki do momentu, gdy bregma i lambda są wyraźnie widoczne.</li>
	<li>Upewnij się, że czaszka jest wypoziomowana, mierząc współrzędne grzbietowo-brzuszne w bregma i lambda. Odpowiednio wyreguluj urządzenie stereotaktyczne, aż współrzędne grzbietowo-brzuszne w bregma i lambda będą się różnić nie więcej niż o 0.04 mm.</li>
	<li>W tym czasie należy zredukować stężenie izofluranu do poziomu od 2 do 2,5%.</li>
	<li>Przywróć wiertło do bregma, ponownie wyzeruj współrzędne, a następnie przesuń wiertło do żądanej współrzędnej przyśrodkowej-bocznej i przednio-tylnej.</li>
	<li>Wywierć otwór na współrzędnej za pomocą wiertła 0,9 mm, ponieważ tworzy ono otwór o odpowiednim rozmiarze dla strzykawki infuzyjnej 28 G.</li>
	<li>Ustawić pompę infuzyjną tak, aby dostarczała wirusa z szybkością 0,2 μl/min. Umieścić strzykawkę w ramieniu infuzyjnym urządzenia stereotaktycznego i opuścić strzykawkę do żądanej współrzędnej. Dostarczyć żądaną ilość wirusa (zakres od 0,1 do 0,8 μl). Na przykład dostarcz 0,8 μl AAV przez 4 min. 
	Uwaga: należy przeprowadzić badania pilotażowe w celu określenia idealnej objętości infuzji i typowego rozprzestrzeniania się wirusa w każdym regionie zainteresowania pacjenta.
	<ol>
		<li>Po zakończeniu podawania wirusa należy pozostawić strzykawkę na miejscu na 10 minut, aby zapobiec cofaniu się do przewodu igły. Powoli podnosić strzykawkę z prędkością około 5 mm/min. Powtarzaj, aż wszystkie współrzędne zostaną nasycone AAV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij ranę za pomocą zszywek chirurgicznych i pokryj ranę miejscową maścią z antybiotykiem.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi leczenia bólu pooperacyjnego.</li>
	<li>Umieść szczura w klatce z ściółką, pokrywką i odpowiednim oznakowaniem, a następnie zwróć szczura do obiektu dla zwierząt.
	<ol>
		<li>Jeśli pracujesz zgodnie ze środkami ostrożności BSL-2, zbieraj pościel przez czas (zwykle 48-72 godziny) określony w wytycznych instytucjonalnych. Umieść ściółkę w pojemniku na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Wszystkie materiały skażone AAV należy utylizować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ich bezpiecznej utylizacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Aparat behawioralny
Uwaga: Aparat do wstępnego kondycjonowania sensorycznego składa się ze standardowej komory kondycjonowania (12" dł. x 9,5" szer. x 11,5" wys.) z podłogą z siatki ze stali nierdzewnej, 2 ścian bocznych z pleksiglasu i 2 ścian metalowych.
<ol>
	<li>Zamontuj światło o mocy 2,8 W na jednej z aluminiowych ścian, aby służyło jako światło domu i jako bodziec wizualny, gdy jest migane z częstotliwością 2 Hz. Zamontuj głośnik na komorze, aby dostarczać bodźce słuchowe (10 sekund, 1500 Hz, 78 dB czystego tonu i 10 sekund 78 dB białego szumu).
	<ol>
		<li>Użyj zasobnika na żywność, aby dostarczyć 45 mg granulek żywności do kubka na żywność. Wewnątrz kubka z jedzeniem fotokomórki na podczerwień wykrywają całkowity czas spędzony w kubku z jedzeniem przed, w trakcie i po prezentacjach bodźców i nagród w postaci jedzenia.</li>
		<li>Komory umieszczono w szafach wygłuszających (22" szer. x 22" wys. x 16" gł.) wyposażonych w wentylatory wyciągowe (~68 dB).</li>
		<li>Użyj komputera PC z oprogramowaniem Med Associates do sterowania komorą operacyjną i pozyskiwania danych. Podczas sesji kondycjonowania zbierz dane na temat całkowitego czasu spędzonego z głową w kubku z jedzeniem podczas prezentacji bodźca świetlnego (epoka 5 sekund) i podczas prezentacji nagrody w postaci jedzenia (epoka 5 sekund). Podczas sesji testowej zbierz dane na temat całkowitego czasu spędzonego w kubku z jedzeniem w odpowiedzi na prezentacje bodźców słuchowych (10 sekund okres rozpoczynający się w momencie zakończenia bodźców słuchowych).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przegląd paradygmatu wstępnego warunkowania sensorycznego
<ol>
	<li>Po powrocie do zdrowia po operacji, stopniowo pokarm ogranicza szczury do 85% ich masy ciała podczas karmienia. Skonsultuj się z personelem weterynaryjnym w celu uzyskania odpowiedniego paradygmatu ograniczeń żywieniowych. 
	Uwaga: 3-fazowy paradygmat wstępnego kondycjonowania sensorycznego zilustrowano na rysunku 2.</li>
	<li>Sesje przygotowania do treningu (Faza 1; Codzienne 64-minutowe sesje treningowe prowadzone przez 4 kolejne dni):
	<ol>
		<li>Przedstaw szczurom 12 mieszanych prób, które polegają na dostarczaniu bodźców słuchowych i wzrokowych. Uwzględnij interwały między próbami, które wynoszą średnio 4,5 minuty (zakres od 4,0 do 5,0 min) po każdej prezentacji słuchowej.</li>
		<li>W 6 próbach prezentuj ton (bodziec warunkowany) przez 10 sekund, a następnie natychmiast 5-sekundową prezentację bodźca światła.</li>
		<li>W pozostałych 6 próbach prezentuj sam biały szum (niesparowany bodziec) przez 10 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sesje kondycjonujące (Faza 2; Codzienne 64-minutowe sesje treningowe prowadzone przez 5 kolejnych dni):
	<ol>
		<li>Przedstaw szczurom 8 prób, które polegają na dostarczeniu bodźca wzrokowego (bodźca światła) przez 5 sekund, a następnie natychmiast podaniu dwóch granulek pokarmu po 45 mg. Uwzględnij interwały między próbami, które wynoszą średnio 7 minut (zakres od 6,0 do 8,0 min) po każdej próbie. Czasami szczury potrzebują więcej niż 5 sesji kondycjonowania, aby nauczyć się skojarzeń z lekkim jedzeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sesja testowa (Faza 3; pojedyncza sesja trwająca 78 minut):
	<ol>
		<li>Przedstaw szczurom 12 mieszanych prób, które polegają na dostarczaniu samych bodźców słuchowych. Uwzględnij interwały między próbami, które wynoszą średnio 4,5 minuty (zakres od 4,0 do 5,0 min) po każdej prezentacji słuchowej.</li>
		<li>W 6 próbach prezentuj sam bodziec tonowy (bodziec warunkowany) przez 10 sekund.</li>
		<li>W pozostałych 6 próbach prezentuj sam biały szum (niesparowany bodziec) przez 10 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównoważ bodźce, kończąc badanie drugim zestawem szczurów, które odbierają biały szum jako bodziec warunkowany, a ton jako bodziec niesparowany.</li>
</ol>
5. Procedura farmakologiczna i behawioralna
<ol>
	<li>Włącz zasilanie aparatu behawioralnego i załaduj kod Med-PC do odpowiedniej sesji behawioralnej. Podłącz i zaprogramuj aparaturę behawioralną w taki sposób, aby wentylatory zamontowane na szafach tłumiących dźwięk włączały się po włączeniu zasilania.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór N-tlenku klozapiny (CNO) o stężeniu 1 mg/ml, należy odważyć 5,0 mg CNO do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 5 ml jałowej wody lub 5 ml jałowego 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Wirować, aż roztwór będzie klarowny.
	<ol>
		<li>Jeśli CNO nie rozpuszcza się w roztworze lub jeśli pożądane są bardziej stężone roztwory CNO, dodaj środek rozpuszczający, taki jak DMSO23. W szczególności, aby przygotować roztwór 1 mg/ml CNO z 0,5% DMSO, odważyć 5,0 mg CNO i dodać 25 μl DMSO do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie potrząśnij, upewniając się, że zawartość pozostała u podstawy tuby. Gdy roztwór stanie się klarowny, dodaj 5 ml sterylnej wody lub 5 ml sterylnego 0,9% soli fizjologicznej. Dalsze instrukcje dotyczące przygotowania rozwiązań CNO są dostępne na stronie25 zasobów wiki DREADD.</li>
		<li>Przygotuj nowy roztwór CNO każdego dnia, w którym jest podawany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzykiwać CNO dootrzewnowo w dawce 1 mg/kg mc. około 30 minut przed testami behawioralnymi. Na przykład należy wstrzyknąć szczurowi o masie 200 g 0,2 ml roztworu CNO o stężeniu 1 mg/ml. Dawka i czas podawania CNO zostały dobrane na podstawie wcześniej opublikowanych doniesień2,12.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć CNO 30 minut przed każdą sesją kondycjonowania wstępnego (Faza 1; łącznie 4 dni wstrzyknięć), ale podawać pojazd przed wszystkimi kolejnymi sesjami behawioralnymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 30 minutach umieść szczury w komorach do testów behawioralnych i zainicjuj kod komputerowy do odpowiedniej sesji behawioralnej.</li>
	<li>Po zakończeniu zadania behawioralnego natychmiast usuń szczury z komór i zwróć szczury do kolonii zwierząt.</li>
</ol>
6. Analizy danych behawioralnych
Uwaga: Zmienną zależną dla wszystkich sesji behawioralnych jest czas, w którym głowa szczura znajduje się w kubku z jedzeniem, wykryty przez przerwanie działania fotokomórek podczerwieni w kubku z jedzeniem. Dane (w sekundach) są gromadzone i rejestrowane przez oprogramowanie komputerowe.
<ol>
	<li>Nie należy przeprowadzać analiz danych wygenerowanych podczas fazy kondycjonowania wstępnego.</li>
	<li>W przypadku sesji kondycjonowania: przeanalizuj zdolność każdego szczura do uczenia się skojarzeń z lekkim jedzeniem, porównując zachowanie kubka z jedzeniem podczas prezentacji bodźca wizualnego w 5 sesjach behawioralnych. W szczególności oblicz średni czas spędzony w kubku z jedzeniem podczas 5-sekundowej epoki światła dla każdej z 8 prób/sesję (tj. średnio 8 prób, z których każda trwa 5 sekund na szczura). Porównaj średnie wartości kontrolne i eksperymentalne dla każdej z 5 codziennych sesji (patrz Rysunek 3A).
	<ol>
		<li>Przeanalizuj motywację szczurów do uzyskania nagrody w postaci jedzenia, porównując zachowanie kubka z jedzeniem podczas dostarczania nagrody w postaci jedzenia (epoka 5 sekund) w 5 sesjach behawioralnych, używając tych samych obliczeń, jak określono dla 5-sekundowej epoki światła powyżej. Wartości te będą konsekwentnie wyższe niż te uzyskane podczas prezentacji bodźca wzrokowego (patrz ryc. 3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla sesji testowej: oblicz współczynnik dyskryminacji, który opisuje zachowanie szczurów w kubku z jedzeniem w odpowiedzi na prezentacje każdego bodźca słuchowego.
	<ol>
		<li>W szczególności dla każdego szczura podziel średni czas spędzony w kubku z jedzeniem po każdej z 6 prezentacji bodźca uwarunkowanego sensorycznie (tj. tonu) przez sumę średniego czasu spędzonego w kubku z jedzeniem po każdej z 6 prezentacji bodźca warunkowanego sensorycznie (tj. bodźca tonalnego) plus średni czas spędzony w kubku z jedzeniem po każdej z 6 prezentacji bodźca niesparowanego (tj. bodziec białego szumu). Każda epoka trwa 10 sekund. 
		Uwaga: Wynik dyskryminacji wynoszący 0,5 lub więcej pokazuje, że szczury nauczyły się skojarzeń nieodłącznie związanych z paradygmatem wstępnego warunkowania sensorycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Weryfikacja umiejscowienia i wyrażenia AAV
<ol>
	<li>Znieczulić i perfuzję przeskórnie szczurów przy użyciu 4% paraformaldehydu. Ze względu na stosowanie etykiet fluorescencyjnych nie należy przekraczać czasu po utrwaleniu wynoszącego 2 godziny, aby zminimalizować utratę antygenowości i zachować sygnał fluorescencyjny.</li>
	<li>Odwodnić perfuzję mózgu, przenosząc je do słoika na mózg zawierającego 30 ml 20% roztworu sacharozy w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (1x) przez co najmniej 2 dni lub do momentu, gdy mózg opadnie na dno słoika mózgowego.</li>
	<li>Użyj zamrażającego mikrotomu przesuwnego, aby wykonać koronalne odcinki mózgu (20-40 μm) w całym obszarze ogonowym obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Przeprowadzić immunohistochemię skierowaną przeciwko znakowanemu receptorowi lub białku reporterowemu, aby ustalić lokalizację i ekspresję receptora projektanta i/lub receptora reporterowego12. Protokół barwienia immunohistochemicznego znajduje się na stronie25 zasobu wiki DREADD.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na szkiełkach superfrost-plus i szkiełku nakrywkowym za pomocą 100-200 μl wodnego medium montażowego.</li>
	<li>Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną na tkance mózgowej, aby zweryfikować rozmieszczenie AAV i ekspresję białka12,24.</li>
</ol>

<ol><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G-protein+coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+%28Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs%29%3A+Chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.Toxicol%22%5BJournal%5D)">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).</li>
<li>Weiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+M1+muscarinic+receptor+agonism+of+N-desmethylclozapine+in+the+unique+clinical+effects+of+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharm.+%28Berl%22%5BJournal%5D)">The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine.</a> Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).</li>
<li>Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+NJ+%22amnesia+and+the+hippocampal+system%22">amnesia and the hippocampal system</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).</li>
<li>Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+memory%3A+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network).</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).</li>
<li>Agster, K. L., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+efferents+of+the+perirhinal%2C+postrhinal+and+entorhinal+cortices+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat.</a> Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).</li>
<li>Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anatomical+systems+embedded+within+the+primate+medial+temporal+lobe%3A+implications+for+hippocampal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).</li>
<li>Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+circuitry+between+retrosplenial+and+postrhinal+cortices+during+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning.</a> J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).</li>
<li>Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).</li>
<li>Kaut, K. P., Bunsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+lesions+to+the+rat+hippocampus+or+rhinal+cortex+on+olfactory+and+spatial+memory%3A+retrograde+and+anterograde+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Cogn.+Affect.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).</li>
<li>Brogden, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Sensory preconditioning.</a> J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).</li>
<li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+silencing+of+neurons+in+retrosplenial+cortex+disrupts+sensory+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning.</a> J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+guidelines+for+research+involving+recombinant+or+synthetic+nucleic+acid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Available+from%3A+http%3A%2F%2Foba.od.nih.gov%2Frdna%2Fnih_guidelines_oba.html%22%5BJournal%5D)">NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules.</a> Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Virol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Gene Ther. 3, 545-565 (2003).</li>
<li>Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-2+%28AAV-2%29+causes+trophoblast+dysfunction%2C+and+placental+AAV-2+infection+is+associated+with+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Path%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia.</a> Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).</li>
<li>Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+in+testicular+tissue+and+in+abnormal+semen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples.</a> Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).</li>
<li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vector+integration+sites+in+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma.</a> Science. 317 (5837), 477-47 (2007).</li>
<li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+Pctk1%2C+Tcf12+and+Ccnd+in+hippocampus+of+rats%3A+impact+on+cognitive+function%2C+synaptic+plasticity+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and.</a> 97 (1), 69-80 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Academy+Press.+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22National+Academy+Press%22%5BJournal%5D)">National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> National Academy Press. , Washington, DC. (1996).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Cavaletti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+in+the+peripheral+nervous+system+of+systemically+administered+dimethylsulfoxide+in+the+rat%3A+a+neurophysiological+and+pathological%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological.</a> 119 (1-2), 1-2 (2000).</li>
<li>Parnaudeau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediodorsal+thalamus+hypofunction+impairs+flexible+goal-directed+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior.</a> Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).</li>
<li>wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).</li>
<li>Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-pathway+striatal+neurons+regulate+the+retention+of+decision-making+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies.</a> J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).</li>
<li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharm%22%5BJournal%5D)">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li>
<li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22GABA%2C+NPY+and+AgRP.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li>
<li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li>
<li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje, w jaki sposób zastosować podejście farmakogenetyczne (DREADD) w celu zbadania, w jaki sposób określony region mózgu przyczynia się do wielofazowego, złożonego zadania uczenia się. Dzięki możliwości tymczasowego i zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej w dyskretnych regionach mózgu we wszystkich fazach uczenia się, ta kombinacja podejść zapewnia platformę do badania szerokiego zakresu zachowań, w tym bardziej zniuansowanych lub zamaskowanych form uczenia się. W przykładzie opisanym w tym protokol...

Ekscytującym wyzwaniem w dziedzinie neuronauki behawioralnej jest określenie neuronalnych substratów złożonych zachowań. Szereg technik, takich jak trwałe zmiany chorobowe, tymczasowa inaktywacja mózgu za pomocą implantów kaniul i optogenetyka, zostało wykorzystanych w celu zidentyfikowania wkładu dyskretnych regionów mózgu w podskładniki złożonych zachowań. Chociaż podejścia te wpływają na nasze zrozumienie specyfiki regionalnej podczas uczenia się, każda technika nie jest pozbawiona ograniczeń. W szczególności trwałe zmiany chorobowe są zwykle przeprowadzane przed testami behawioralnymi, dlatego ich efekty są obecne przez cały czas trwania paradygmatu. Badania kaniulacji, które obejmują prezentację krótkotrwałej inaktywatora neuronalnego (np. tetrodotoksyny), mogą powodować znaczne uszkodzenia tkanki mózgowej i mogą wywoływać stres u osób tuż przed testami behawioralnymi. Ponadto inaktywacja poprzez kaniulację jest ograniczona do obszaru tkanki otaczającego końcówkę kaniuli. Wreszcie, chociaż optogenetyka oferuje szereg elastyczności w zakresie czasowej kontroli aktywności w określonych obszarach mózgu, jest ona zbyt kosztowna i wymagająca technicznie.
Te ograniczenia można przezwyciężyć za pomocą podejścia farmakogenetycznego (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs, DREADDs)1,2. Co ważne, chociaż koncepcja farmakogenetyki jest wyrafinowana, wykonanie tej techniki jest proste. Podobnie jak tradycyjne stereotaktyczne metody chirurgiczne, które polegają na infuzji toksyny (np. NMDA, kwasu ibotenowego) do dyskretnych obszarów mózgu, technika ta polega na wstrzyknięciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV), który zawiera fragment DNA zmodyfikowanego hamującego receptora sprzężonego z białkiem G (hM4Di; receptor projektowany) do obszaru zainteresowania standardowych gryzoni laboratoryjnych (patrz ryc. 1). Wektor wirusowy zawiera również reporter fluorescencyjny (mcytrynę). Po włączeniu do komórek, receptor projektanta (i białko reporterowe) uzyskuje maksymalną ekspresję ~3 tygodnie po infuzji i może być selektywnie aktywowany przez 2-5 godzin przez ogólnoustrojowe podawanie biologicznie obojętnego, N-tlenku klozapiny (CNO)1,3. Ponieważ eksperymentator jest obdarzony precyzyjną, ale odległą kontrolą czasową nad aktywnością neuronalną w określonych obszarach mózgu, farmakogenetyka szczególnie dobrze łączy się z paradygmatami behawioralnymi, które są prowadzone w wielu fazach. W tym przykładzie wkład kory zaśledziony (RSC) w uczenie się bodziec-bodziec jest porównywany z jego rolą w uczeniu się Pawłowa, jednak ta kombinacja podejść dobrze nadaje się do dowolnej liczby pytań, które mają na celu określenie, w jaki sposób określone regiony mózgu przyczyniają się do złożonego zachowania.
Ponadto, chociaż nie jest to opisane w niniejszym protokole, wirusowe i transgeniczne podejścia mogą być używane do osiągnięcia specyficznej dla typu komórki ekspresjiDREADD 2. Jak to jest nieodłącznie związane z paradygmatami behawioralnymi, które obejmują manipulacje farmakologiczne i/lub inne rodzaje manipulacji eksperymentalnych, przy stosowaniu podejścia DREADD wymagane jest staranne rozważenie projektu eksperymentalnego i późniejsza analiza ilościowa. Eksperymentatorzy, którzy nie mają doświadczenia w podejściu DREADD, są kierowani do kompleksowego przeglądu obecnej technologii DREADD2.
Każdego dnia, organizmy uczą się o nowych bodźcach i wydarzeniach oraz ich wzajemnych relacjach. Nawet w znajomym środowisku, takim jak dom, można szybko wykryć zmiany w relacjach między bodźcami, ponieważ zmiany te mogą być predyktorem znaczących wydarzeń. Takie uczenie się bodziec-bodziec (tj. relacyjne) polega na łączeniu wielu bodźców i tradycyjnie jest związane z hipokampem, który znajduje się centralnie w przyśrodkowym płacie skroniowym4. Jednak hipokamp nie istnieje ani nie działa w izolacji; Obszary korowe, zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz przyśrodkowego płata skroniowego, dostarczają krytycznych informacji czuciowych do formacji hipokampa5-7. Tradycyjne badania nad trwałymi zmianami chorobowymi dostarczają przekonujących dowodów na udział wielu regionów kory mózgowej (np. kory zaśledzionowej, zanosowej i śródwęchowej) w uczeniu się zależnym od hipokampa, ale mają ograniczoną zdolność do rozpoznania roli określonego regionu podczas odrębnych faz uczenia się8-10.
Obecny protokół testuje hipotezę, że RSC jest niezbędny do uczenia się bodziec-bodziec, poprzez wyciszenie RSC podczas pojedynczej fazy 3-fazowego paradygmatu wstępnego warunkowania sensorycznego11,12. Krótko mówiąc, szczury otrzymują wlewy AAV, który zawiera receptor projektanta, a ~ 3 tygodnie później podaje się im (CNO) 30 minut przed rozpoczęciem testów behawioralnych. W niniejszym protokole szczury doświadczalne otrzymują CNO podczas pierwszej fazy testów (kiedy następuje uczenie się bodziec-bodziec) i otrzymują nośnik podczas następnych 2 faz testów. Aby kontrolować niezamierzony wpływ CNO na zachowanie, należy podać szczurom receptor projektanta (hM4Di) i wstrzyknąć nośnik zamiast CNO. Aby uwzględnić ogólne skutki infuzji wirusa i ekspresji receptora, należy podać wirusa kontrolnego, który nie zawiera receptora zaprojektowanego i podać CNO.
Do dostarczania materiału genetycznego używa się wielu różnych serotypów AAV. Obecne wytyczne NIH dotyczące badań nad cząsteczkami rekombinowanymi lub syntetycznymi utrzymują, że AAV (wszystkie serotypy) oraz rekombinowane lub syntetyczne konstrukty AAV, w których transgen nie koduje ani potencjalnie rakotwórczego produktu genowego, ani cząsteczki toksyny i są wytwarzane przy braku wirusa pomocniczego, wymagają środków ostrożności BSL-1 (Załącznik B-1. Czynniki grupy ryzyka 1 (RG1)13. Dostępnych jest wiele opinii dotyczących struktury, użyteczności i bezpieczeństwa AAV14,15. Warto jednak zauważyć, że ze względu na obawy związane z możliwymi mechanizmami reprodukcyjnymi16,17 i potencjalnymi mechanizmami rakotwórczymi18-20 u gryzoni, niektóre instytucje wymagają stosowania środków ostrożności BSL-2 podczas pracy z AAV. Sprawdź odpowiedni BSL przed użyciem, konsultując się z komitetami nadzorczymi w poszczególnych instytucjach, w których będą prowadzone badania, Centrami Kontroli Chorób i wytycznymi NIH dotyczącymi badań z udziałem rekombinowanych cząsteczek DNA13 w przypadku stosowania wektorów wirusowych do manipulacji genami w Stanach Zjednoczonych. Niniejsze wytyczne określają wymagania dotyczące ochrony osobistej, szkolenia badaczy, powstrzymywania rozprzestrzeniania się nosicieli, dekontaminacji, usuwania odkażonych materiałów oraz pomieszczeń dla zwierząt po wstrzyknięciu. Ponadto należy zapoznać się z odpowiednimi wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt lub równoważnymi wytycznymi Komitetu Nadzoru Instytucjonalnego i postępować zgodnie z nimi, aby zapewnić bezpieczne obchodzenie się, podawanie i usuwanie AAV.

<table><tbody><tr><td>Samiec, długie szczury Evans, 55-60 dni</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8 / hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Uwaga: Jest to rdzeń</td></tr><tr><td>wektora</td><td></td> wirusa<td>rAAV8 / hSyn-GFP</td> ze związkiem <td>BSL-1 Uwaga: Jest to związek BSL-1</td></tr><tr><td>N-tlenek klozapiny</td><td>R& D Systems</td><td>4936-10</td> Wieko klatki dla szczurów <td>dla narkotyków</td></tr><tr><td>(poliwęglan)</td><td>Alternatywny projekt&nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>Służy do przykrywania klatek dla zwierząt 48-72 godziny po infuzji</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (zamiennik)</td><td>Alternatywna konstrukcja</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>Bibuła filtracyjna, która pasuje do pokryw klatek</td></tr><tr><td>Imadło stołowe</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>Do przechowywania probówek mikroscentrifugowych zawierających AAV w kapturze</td></tr><tr><td>Worki na śmieci Biohazard</td><td>Zszywki</td><td>113444</td><td>Wkładki Medline Biohazard</td></tr><tr><td>Kosz na śmieci Biohazard</td><td></td><td></td> Amazon.com <td>United Solutions 34-galonowy prostokątny kosz na śmieci na kółkach z haczykiem i uchwytem zamka</td></tr><tr><td>Isoflurane, 100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>Anestezjologiczny</td></tr><tr><td>Podwójny stereotaktyczny dla małych zwierząt z konsolą odczytu z cyfrowym wyświetlaczem</td><td>David Kopf</td><td>Model 942</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Niepękające nauszniki uszne, zestaw 2 sztuk (szczur)</td><td>David Kopf</td><td>Model 955</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Maska anestezjologiczna (szczur)</td><td>David Kopf</td><td>Model 906</td><td>Sprzęt</td></tr> <tr><td>chirurgicznySzybkobieżna wiertarka stereotaktyczna zawiera sterownik silnika stołowego, pedał nożny, rękojeść, stereotaktyczny uchwyt rękojeści</td><td>David Kopf</td><td>Model 1474</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Frezy do mikrowierteł, 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Automatyczna pompa strzykawkowa ze sterownikiem micro4</td><td>David Kopf</td><td>Model UMP3-1</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Odłączane ostrze ceramiczne Pro-animal zestaw maszynki do strzyżenia</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Betadine środek do oczyszczania skóry</td><td>Perdue Products L.P</td><td>67618-149-04</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Maść z potrójnym antybiotykiem</td><td>Medline Supply</td><td>53329-087-01</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna Puralube</td><td>Tylko zaopatrzenie weterynaryjne</td><td>17033-211-38</td><td>Zaopatrzenie chirurgiczne</td></tr><tr>Mikroskop<td></td><td></td> <td>Dino-liteAD7013MTL</td><td>Alternatywa dla tradycyjnej lunety sekcyjnej</td></tr><tr><td>Dino-lite sztywny stojak na wysięgnik stołowy</td><td>Mikroskop</td><td>MS36B</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>28 G 10 &mu; l strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Bardzo wysoka kabina dźwiękochłonna MDF</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' szer. x 22" wys. x 16" gł</td></tr>. <tr><td>Bardzo wysoka modułowa komora</td><td>testowa Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Podłoga z siatki ze stali nierdzewnej</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>Sprzęt</td></tr> <tr><td>behawioralnyOświetlenie domowe</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>Używane jako światło domowe i bodźce</td></tr><tr><td>Modułowy dozownik</td><td>pelletu Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Pojemnik na pelety, typ kubka</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Detektor wejścia głowy dla szczura</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-254-CB</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Bezpyłowe precyzyjne granulki spożywcze, 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>Zasilanie behawioralne</td></tr><tr><td>Głośnik klatkowy do komory dla</td><td>szczurów Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Programowalny generator audio</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Smart ctrl 8 wejść/16 wyjść</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Duża szafka stołowa i zasilacz</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Pakiet interfejsu PCI</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>MED Pakiet komputerowy Intel Core z monitorem X Pro 19"</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>Sprzęt behawioralny</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (grannularny), 1 kg</td><td>Mikrosopia elektronowa Nauki</td><td>19210</td><td>Zagrożenie: rakotwórcze, ważenie w kapturze</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne królika (HA-Tag)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>3724S</td><td>Odczynnik histologiczny</td></tr><tr><td>XP Przeciwciało monoklonalne królika (GFP)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>2956S</td><td>Odczynnik histologiczny</td></tr><tr><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>IgG Anty-królicze Technologie</td> sygnalizacji komórkowej <td>4412S</td><td>Histologia dostarcza</td></tr><tr><td>slajdy Superfrost plus</td><td>VWR international</td><td>483111-703</td><td>Materiały histologiczne</td></tr></tbody></table>

metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w oddzielnych obszarach mózgu, podczas gdy zwierzęta są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), który ma na celu rozróżnienie różnych form uczenia się. W szczególności dostarczanie za pośrednictwem wirusa jest wykorzystywane do ekspresji genetycznie zmodyfikowanego hamującego receptora sprzężonego z białkiem G (receptora projektanta) do dyskretnego regionu mózgu gryzonia. Trzy tygodnie później, gdy poziom ekspresji receptora projektanta jest wysoki, środek farmakologiczny (Designer Drug) jest podawany ogólnoustrojowo 30 minut przed określoną sesją behawioralną. Lek ma powinowactwo do receptora projektanta, a zatem powoduje hamowanie neuronów, które wyrażają receptor projektanta, ale poza tym jest biologicznie obojętny. Obszar mózgu pozostaje wyciszony przez 2-5 godzin (w zależności od dawki i drogi podania). Po zakończeniu paradygmatu behawioralnego tkanka mózgowa jest oceniana pod kątem prawidłowego rozmieszczenia i ekspresji receptora. Podejście to jest szczególnie przydatne do określania wkładu poszczególnych regionów mózgu w określone komponenty zachowania i może być stosowane w dowolnej liczbie paradygmatów behawioralnych.

Wyniki behawioralne
Po zakończeniu eksperymentu należy przeprowadzić ilościową i jakościową ocenę skuteczności czasowej inaktywacji specyficznej dla danego regionu. Przedstawiony przykład obejmuje 3-fazowy paradygmat behawioralny (uwarunkowanie sensoryczne), w którym podawano CNO w celu osłabienia aktywności neuronalnej w RSC podczas sesji uwarunkowania wstępnego, aby przetestować hipotezę, że RSC jest niezbędne do tworzenia asocjacji między bodźcami neutralnymi12. Co ważne, eksperymen...

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w dyskretnych obszarach mózgu, podczas gdy szczury są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), które ma na celu rozróżnienie różnych elementów uczenia się.

Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Celem niniejszej procedury jest tymczasowe i zdalne wyciszenie aktywności neuronalnej w wybranych obszarach mózgu podczas wykonywania przez zwierzęta zadań związanych z uczeniem się i pamięcią. Jest to realizowane poprzez najpierw nabranie do strzykawki do infuzji a a V zawierającego receptor projektowany oraz reporter. Drugim krokiem jest wprowadzenie a a V do docelowego obszaru w mózgu szczura.Następnie przygotowuje się biologicznie obojętny lek projektowany klozapina i tlenek, który jest wstrzykiwany systemowo szczurowi. Ostatnim etapem jest przeprowadzenie testów behawioralnych z wykorzystaniem paradygmatu prekondycjonowania sensorycznego. Ostatecznie, w celu weryfikacji rozmieszczenia projektowanego receptora, stosuje się mikroskopię immunofluorescencyjną tkanki mózgowej szczura.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki behawioralnej, w tym, między innymi, dotyczące regulacji motywacji, uwagi oraz uczenia się i pamięci. Należy upewnić się, że przez cały czas przestrzegane są wszystkie instytucjonalne środki ostrożności dotyczące pracy z wirusami towarzyszącymi adeno, przy czym wirus użyty w tym filmie jest zakwalifikowany jako związek pierwszego poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Przygotować 10% roztwór wybielacza. W celu dekontaminacji odpadów AV należy przygotować becher z roztworem wybielacza oraz sterylną strzykawkę 10 µL.W obszarze roboczym umieść mikroprobówkę zawierającą alikwot wirusa w standardowym uchwycie laboratoryjnym. Naciągnij do strzykawki o pojemności 10 µL co najmniej 4 µL wirusa. Upewnij się, że w 4 µL roztworu wirusa nie ma pęcherzyków powietrza. Pustą probówkę z wirusem wyrzuć do zlewki zawierającej 10% wybielacz.Dodaj dodatkowe 10% wybielacza do pojemnika na odpady i pozostaw odpady na 30 minut przed utylizacją zdekontaminowanych płynnych odpadów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Przygotuj obszar zabiegowy, kładąc chłonny papier do pracy przy stole pod aparatem stereotaksycznym oraz w sąsiedniej przestrzeni wyznaczonej jako dedykowany obszar do pracy z wirusami. Po wprowadzeniu w stan znieczulenia zastosowano 3% isofluranu i tlen z przepływem jeden litr na minutę.Wygolono sierść z obszaru między oczami aż do miejsca nieco za uszami. Po goleniu umieszczono szczura z powrotem w komorze indukcyjnej na trzy minuty, z zabezpieczonym zwierzęciem w aparacie stereotaktycznym. Oczy pokryto maścią oftalmiczną, a miejsce nacięcia przygotowano, oczyszczając je Betadine.Po wykonaniu 2,4 centymetrowego nacięcia skóry w linii środkowej nad czaszką, zaczynając około dwóch milimetrów kudalnie od oczu, odsunąć skórę, aby odsłonić czaszkę, a następnie oczyścić czaszkę z tkanki błoniastej, aż do momentu, gdy bgma i lambda będą wyraźnie widoczne. Po upewnieniu się, że czaszka jest płaska, ustawić wiertarkę w punkcie bgma, wyzerować współrzędne, a następnie przesunąć wiertarkę do pożądanych współrzędnych przyśrodkowych, bocznych oraz przednio-tylnych. Wywiercić otwór, używając wiertła o średnicy 0,9, 0,7 lub 0,5 milimetra.Ustaw pompę infuzyjną tak, aby podawała wirusa z prędkością 0,2 µL na minutę. Umieść strzykawkę w ramieniu infuzyjnym urządzenia stereotaktycznego i opuść ją do pożądanych współrzędnych. Użyj pompy, aby podać odpowiednią ilość wirusa; po zakończeniu podawania wirusów wyjmij strzykawkę.Pozostaw strzykawkę w tym miejscu na 10 minut, aby zapobiec cofaniu się treści do kanału igły, a następnie powoli wysuń strzykawkę z prędkością około pięciu milimetrów na minutę. Następnie przejdź do następnej współrzędnej i powtórz procedurę, aż we wszystkie współrzędne zostanie podany lek. Po zamknięciu rany i zastosowaniu przeciwbólowego leczenia pooperacyjnego zgodnie z zatwierdzonym protokołem, umieść szczura w czystej klatce z podścieliskiem, pokrywą i odpowiednim oznakowaniem.Po całkowitym wybudzeniu szczura z narkozy, należy przenieść go z powrotem do pomieszczenia z klatkami. Przed rozpoczęciem testów behawioralnych należy odczekać co najmniej trzy tygodnie, aby zapewnić odpowiednią ekspresję zaprojektowanego receptora. Rysunek ten przedstawia trzy fazy paradygmatu wstępnego warunkowania sensorycznego: fazę wstępnego warunkowania, fazę warunkowania oraz fazę testową.Syntetyczny lek clozapiny N-tlenek (CNO) jest stosowany do wyciszania aktywności neuronalnej poprzez aktywację zaprojektowanego receptora; CNO można wstrzyknąć przed dowolną fazą testów. W niniejszej procedurze CNO wstrzykuje się na 30 minut przed każdą z sesji prekondycjonowania. Po przygotowaniu świeżego roztworu clozapiny N-tlenku o stężeniu 1 mg/mL, zgodnie z instrukcjami zawartymi w części pisemnej protokołu, należy wstrzyknąć CNO drogą dosytrawną w dawce 1 mg/kg na 30 minut przed testami behawioralnymi.Uruchom kod komputerowy dla odpowiedniej sesji behawioralnej. Po upływie 30 minut umieść szczury w komorach testowych i rozpocznij pierwszą z 4 64-minutowych sesji prekondycjonowania, prezentując szczurom 12 wymieszanych prób składających się z podawania bodźców słuchowych i wzrokowych. W sześciu próbach zaprezentuj ton, będący bodźcem prekondycjonującym, przez 10 sekund, a następnie niezwłocznie zaprezentuj bodziec w postaci migającego światła przez pięć sekund w pozostałych sześciu próbach.Prezentuj szum biały, czyli sam bodziec niepowiązany, przez 10 sekund. Po zakończeniu fazy warunkowania wstępnego rozpocznij sesje warunkowania, które będą prowadzone przez pięć kolejnych dni. Przeprowadź u szczurów osiem prób składających się z podania bodźca wizualnego w postaci migającego światła przez pięć sekund, a bezpośrednio po nim podania 2 pelletów pokarmowych o masie 45 milligram.Tym razem uwzględnij siedmiominutowe odstępy między próbami po zakończeniu sesji warunkowania. Przeprowadź pojedynczą, 78-minutową sesję testową, prezentując szczurom 12 przemieszanych prób, które polegają na podawaniu wyłącznie bodźców słuchowych. W sześciu z tych prób.Przedstaw bodziec dźwiękowy, czyli sam bodziec warunkujący, przez 10 sekund. W pozostałych sześciu próbach przedstaw szum biały, czyli sam bodziec nieparowany, przez 10 sekund. Po zakończeniu zadania behawioralnego natychmiast usuń szczury z komór i przenieś je z powrotem do kolonii zwierząt.Przeanalizuj dane z fazy warunkowania i testowania zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu. Po przeprowadzeniu immunohistochemii skierowanej przeciwko oznakowanemu reporterowi lub białku reporterowemu, zbadaj barwione przekroje za pomocą mikroskopii, aby potwierdzić lokalizację i ekspresję projektora receptora i/lub reportera; oczekuje się, że szczury kontrolne i eksperymentalne w podobny sposób nauczyły się powiązania pawłowowskiego między bodźcem w postaci migającego światła a pożywieniem podczas sesji warunkowania.W trakcie sesji obie grupy były również motywowane do uzyskania nagrody pokarmowej podczas sesji warunkowania. W przeciwieństwie do tego, podczas krytycznej sesji testowej szczury eksperymentalne nie potrafiły odróżnić bodźców słuchowych uprzednio warunkowanych od tych nieparowanych, podczas gdy szczury kontrolne wykazywały większą aktywność przy misce z pokarmem w odpowiedzi na prezentację bodźca uprzednio warunkowanego. Zatem szczury kontrolne, a nie eksperymentalne, wykazały efekt uprzedniego warunkowania sensorycznego.Na tym obrazie przedstawiono weryfikację histologiczną lokalizacji infuzji do obszaru zainteresowania w mózgu gryzonia po jej przeprowadzeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do zgłębiania roli konkretnych obszarów mózgu i/lub typów komórek w złożonych zachowaniach in vivo.

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

W niniejszym raporcie przedstawiamy w pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system umożliwiający jednoczesne badanie wielu zachowań poznawczych oraz rejestrację aktywności neuronów u gryzoni.

W pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system do badania wielorakich funkcji poznawczych i rejestracji aktywności neuronalnej u gryzoni

Umieść znieczulone noworodkowe szczenię na poduszce grzewczej.Zdezynfekuj skórę głowy etanolem.Napełnij strzykawkę roztworem wirusa zawierającym wirusy związane z adenowirusem przenoszącym gen receptora hamującego aktywowanego lekiem i barwnika śledzącego.Dopasuj końcówkę strzykawki do głowy szczeniaka i powoli wstrzyknij wirusa do mózgu, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie.Pozwól szczeniakowi dojść do siebie.Podczas inkubacji cząsteczki wirusa wnikają do neuronów i uwalniają swój materiał...

Chemogenetyczne wyciszenie aktywności neuronalnej u nowonarodzonej myszy

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Zaproponowano w pełni zautomatyzowany protokół warunkowania działania gryzoni. Protokół opiera się na precyzyjnej kontroli czasowej zdarzeń behawioralnych w celu zbadania zakresu, w jakim ta kontrola wpływa na aktywność neuronalną leżącą u podstaw integracji sensomotorycznej i eksperymentów kontroli poznawczej.

W pełni zautomatyzowany protokół kondycjonowania gryzoni do eksperymentów z integracją sensomotoryczną i kontrolą poznawczą

Uczenie się nowych powiązań bodziec-reakcja angażuje szeroki zakres procesów neuronalnych, które ostatecznie znajdują odzwierciedlenie w zmianie wydajności skoków poszczególnych neuronów. Tutaj opisujemy protokół behawioralny pozwalający na ciągłą rejestrację aktywności pojedynczego neuronu, podczas gdy zwierzęta nabywają, wygaszają i ponownie nabywają warunkową reakcję w ciągu jednej sesji eksperymentalnej.

Rejestrowanie potencjałów czynnościowych pojedynczych neuronów od swobodnie poruszających się gołębi na trzech etapach uczenia się

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Nauka unikania shuttle-boxów jest dobrze ugruntowana w neuronauce behawioralnej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób uczenie się w pudełku wahadłowym u gryzoni można połączyć z specyficzną dla miejsca elektryczną mikrostymulacją wewnątrzkorową (ICMS) i jednoczesnymi przewlekłymi zapisami in vivo jako narzędzie do badania wielu aspektów uczenia się i percepcji.

Połączony trening w skrzynce wahadłowej z rejestracją i stymulacją kory elektrofizjologicznej jako narzędziem do badania percepcji i uczenia się

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) pojawiła się jako narzędzie do wywoływania ukierunkowanej plastyczności synaptycznej w przodomózgowiu w celu modyfikacji szeregu zachowań. Ten protokół opisuje, jak zaimplementować VNS, aby ułatwić konsolidację pamięci wygaszania strachu.

Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Opisano projektowanie i montaż mikronapędów do elektrofizjologicznych zapisów in vivo sygnałów mózgowych od myszy. Dzięki przymocowaniu wiązek mikroelektrod do wytrzymałych nośników napędzanych, techniki te pozwalają na długotrwałe i stabilne zapisy neuronowe. Lekka konstrukcja pozwala na nieograniczoną wydajność behawioralną zwierzęcia po wszczepieniu napędu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

Poznaj metodę zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej w mózgu szczurów podczas zadań związanych z uczeniem się i pamięcią. Technika łączy farmakogenetykę z paradygmatem behawioralnym, umożliwiając precyzyjną kontrolę obwodów neuronalnych.

Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

Przeglądaj więcej filmów