Name: Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Poznaj metodę izolacji i rozmnażania krążących komórek nowotworowych z krwi mysiego modelu raka wątrobowokomórkowego. Technika zapewnia powtarzalny model do badań nad przerzutami nowotworowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium dr Ogunwobi jest wspierana przez grant Programu Centrów Badawczych w Instytucjach Mniejszościowych od National Institute on Minority Health and Health Disparities (MD007599) National Institutes of Health. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIMHD lub NIH.

Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Hunter College of The City University of New York.
1. Procedury przed eksperymentem
<ol>
	<li>Po przybyciu do obiektu dla zwierząt, początkowo umieść 3 myszy BALB/c w klatce z filtrowaną górą i ściółką z wiórów drzewnych. Upewnij się, że myszy mają swobodny dostęp do jedzenia, karmy dla gryzoni purina i wody. Pościel i jedzenie należy zmieniać dwa razy w tygodniu, a klatki czyścić raz w tygodniu.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie ogólne u myszy za pomocą parownika izofluranu wraz z tlenem przy stałym natężeniu przepływu 1 l na minutę. System jest samowystarczalny i zawiera precyzyjny waporyzator.</li>
	<li>Umieść zwierzę w plastikowym pudełku, do którego podłączony jest precyzyjny waporyzator i system gazowo-znieczulający. Początkowo ustaw waporyzator na 2,5, aż zwierzę straci przytomność, w którym to momencie obniż waporyzator do 2.</li>
	<li>W tym czasie przełącz przewód zaworu, uszczelniając go do skrzynki i otwierając do stożka nosowego.</li>
	<li>Przenieś zwierzę do obszaru przygotowania, z prawidłowo umieszczonym i podłączonym stożkiem nosowym (do znieczulenia podtrzymującego).</li>
	<li>Przygotuj 5 × 106 mysich komórek HCC BNL 1ME A.7R.1 do implantacji na mysz. BNL 1ME A.7R.1 powinien być hodowany w pożywce (10% inaktywowany termicznie FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) inkubowany w naczyniu do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z powietrzem i 5 % CO2 .</li>
	<li>Za pomocą strzykawki z igłą 20 G wszczepić 100 μl PBS zawierającego 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 mysich komórek raka wątrobowokomórkowego do płata wątroby myszy BALB/c w celu wytworzenia guzów pierwotnych. Po implantacji myszy BALB/c należy umieścić w klatce o takich samych wymaganiach domowych, jak przed implantacją.</li>
	<li>W eksperymentalnym punkcie końcowym dowody kliniczne raka wątrobowokomórkowego można zaobserwować jako znaczne obniżenie oceny kondycji ciała (zwykle wykrywane po 4 tygodniach). W tym momencie istnieje prawdopodobieństwo, że pierwotne guzy rozwinęły się w wątrobie, podczas gdy złogi przerzutowe utworzyły się w płucach. Następnie rozpocznij proces izolacji i namnażania krążących komórek nowotworowych.</li>
</ol>
2. Pobieranie krwi pełnej do izolacji krążących komórek nowotworowych
UWAGA: Odpowiednio zdezynfekuj obszar operacji i upewnij się, że jest wolny od bałaganu. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie lub zanurzyć w płynie dezynfekującym zgodnie z zaleceniami producenta
<ol>
	<li>Składanie ofiar z myszy przez humanitarną eutanazję w eksperymentalnym punkcie końcowym (kliniczne dowody rozwoju guza). Eutanazja myszy powinna wiązać się z uduszeniem CO2 . Obserwuj myszy prawidłowo, aby upewnić się, że znieczulenie jest prawidłowo rozprowadzone. Dwutlenek węgla powinien być powoli uwalniany do komory przez okres 5 - 10 minut, powodując zatrzymanie oddechu. Następnie wykrwawienie wewnątrzsercowe i zwichnięcie szyjki macicy. 5</li>
	<li>Do pobrania krwi pełnej należy użyć igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. Nastrzykać strzykawkę 0,01 ml heparyny. Natychmiast nakłuć skórę igłą poniżej ksylfisterku pod kątem około 45°. Powoli przesuwaj igłę, aby nakłuć serce, a następnie zmniejsz kąt igły. Równomiernie przytrzymać igłę i strzykawkę na miejscu i pobrać 500 μl - 1 000 μl pełnej krwi z serca.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę i igłę i przenieść krew do wstępnie oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od pirogenów. Odwirować krew pełną zebraną do 1,5 ml probówki wolnej od pirogenów o stężeniu 1,167 x g przez 5 minut. 
	UWAGA: Wirowanie rozdziela próbkę krwi pełnej na trzy warstwy: dolną lub hematokrytową warstwę składającą się z czerwonych krwinek, pośrednią cienką warstwę kożucha i górną warstwę osocza.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć osocze, pipetując i zbierając je do oddzielnej probówki wolnej od pirogenów o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów, takich jak wykrycie bezkomórkowych kwasów nukleinowych7.</li>
	<li>W celu wyizolowania krążących komórek nowotworowych (CTC) należy zebrać płaszcz kożuchowy do oddzielnej probówki wolnej od pirogenów o pojemności 1,5 ml w celu przygotowania do lizy krwinek czerwonych (RBC). Jest to konieczne, aby usunąć resztki erytrocytów w warstwie kożuchowca.</li>
</ol>
3. Przepis na bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC)
<ol>
	<li>Przygotować 1 l roztworu buforu do lizy RBC.</li>
	<li>Przygotować 500 ml chlorku amonu i 500 ml Tris. Następnie wymieszać, aby uzyskać 1 l roztwór buforu do lizy RBC o końcowym stężeniu 155 mM chlorku amonu i 10 mM Tris.</li>
	<li>Zbuforować roztwór do pH 7,5. Przechowywać bufor do lizy RBC w temperaturze od +2 do +8 °C i bezpośrednio przed użyciem doprowadzić do RT.</li>
</ol>
4. Erytrocyt Sierść Buffy
<ol>
	<li>Dodać 1 ml buforu do lizy RBC do sterylnej, wolnej od pirogenów probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej zebraną powłokę kożuchową.</li>
	<li>Wymieszaj zawartość probówki, odwracając ją kilka razy. Inkubować zmieszaną zawartość probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej na stole. Odwirowywać wymieszaną zawartość przez 5 minut przy sile 1,167 g.</li>
	<li>Po odwirowaniu otrzyma się białawe osady. Czerwonawy supernatant powoli i ostrożnie wyrzucić do 10% wybielacza, nie naruszając przy tym osadu. Jeśli osad nie jest białawy, powtórz kroki 3.1 - 3.5. Pomocne może być również wydłużenie czasu inkubacji w buforze do lizy RBC do 10 - 15 min.</li>
	<li>Odpady biologiczne należy bezpiecznie zutylizować po zakończeniu odkażania odpadów biologicznych w 10% wybielaczu po 24 godzinach.</li>
</ol>
5. Rozmnażanie w hodowli komórkowej
UWAGA: Komórki nowotworowe to zazwyczaj szybko rosnące białe krwinki, które obfitują w oryginalną mieszankę komórek umieszczonych w naczyniu. Po wielokrotnej zmianie pożywki i kolejnych pasażach CTC wszystkie białe krwinki są usuwane i pozostaje stosunkowo czysta populacja CTC.
<ol>
	<li>Po odrzuceniu supernatantu do 10% wybielacza, przynajmniej raz przemyć białawe osady w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie zawiesić w kompletnej pożywce hodowlanej w celu rozmnażania w hodowli komórkowej.</li>
	<li>Po zakończeniu płukania dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej BNL 1ME A.7R.1 (10% inaktywowanego termicznie FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) do osadu i ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Zasiać ponownie zawieszoną mieszaninę komórek do naczynia do hodowli komórkowej. Inkubować naczynie do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z powietrzem i 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co dwa do trzech dni. Po pięciu do siedmiu dniach CTC przylgną do szalki z hodowlą komórkową i zaczną się namnażać. Komórki te pozostaną żywotne po upływie 25 pasaży i po wielokrotnych cyklach zamrażania i rozmrażania5.</li>
</ol>
6. Weryfikacja linii komórkowej krążącego raka wątrobowokomórkowego
<ol>
	<li>Wykonaj metodę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby amplifikować tylko jeden specyficzny segment DNA mysiego genu β-globiny, aby potwierdzić, że nowo ustalone linie komórkowe CTC są komórkami myszy, takimi jak oryginalna wszczepiona linia HCC BNL 1ME A.7R.1. Metoda została pierwotnie opisana i zwalidowana przez Steube i wsp. 5,8</li> pkt.
	<li>Wykonaj barwienie immunologiczne dla specyficznego dla hepatocytów markera cAMP reagującego na element wiążący białko 3-podobne 3 (CREB3L3) przy użyciu specyficznego przeciwciała. Potwierdzi to, że nowo ustalone CTC są rzeczywiście hepatocytami, takimi jak oryginalna wszczepiona linia komórkowa BNL 1ME A.7R.1. 5</li>
</ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
<li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Tissue+is+the+issue%22%3A+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastrointestinal+cancer%22%5BJournal%5D)">"Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li>
<li>Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+HGF+and+c-Met+drives+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma.</a> PloS one. 8, e63765(2013).</li>
<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym badaniu opisano sposób izolowania i namnażania CTC z pełnej krwi myszy syngenicznej z HCC. Celem niniejszej pracy jest pogłębienie trwających badań nad mechanizmami przerzutów nowotworowych. 
Czynnikiem, który przyczynia się do złego rokowania w przypadku wielu nowotworów, jest brak szybkiego wykrywania, a co za tym idzie szerokiego rozpowszechnienia nowotworuzłośliwego 3. CTC wywodzą się z nowotworów pierwotnych i rozprzestrzeniają się przez krwiobieg do odległych narządów. W...

Społeczność badaczy raka wiedziała o istnieniu krążących komórek nowotworowych (CTC) od czasu ich pierwszej obserwacji przez Thomasa Ashwortha w 1869roku. Od tego czasu wykazano, że CTC odgrywają ważną rolę w przerzutach guza i progresji choroby2-5. Obecnie guzy lite są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. CTC to rzadkie komórki, które pochodzą z guzów pierwotnych i przemieszczają się przez krwiobieg do różnych narządów, z których tylko niewielka część ostatecznie rozwija się w przerzuty2-5. Warto zauważyć, że istnieje dodatnia korelacja między wielkością guza a liczbą CTC3,4. 
Zrozumienie biologii CTC może przyczynić się do poszukiwania terapii celowanej. Ponadto CTC mogą mieć zastosowania diagnostyczne. Aby osiągnąć te potencjalne zastosowania kliniczne, należy przezwyciężyć niektóre obecne wyzwania związane z badaniem CTC. Jedno z wyzwań wiąże się z faktem, że CTC mogą być obecne jako pojedyncze komórki lub jako klastry, a nawet mogą być w stanie zmienić swój fenotyp w odpowiedzi na mikrośrodowisko krwi2. Co więcej, wykrywanie może być bardzo trudne, częściowo ze względu na niską liczbę CTC (od kilku do kilkuset na mililitr) wśród jednego miliarda komórek hematologicznych na mililitr we krwi6. Niemniej jednak w ostatnich latach zintensyfikowano badania nad potencjalnymi zastosowaniami klinicznymi CTC w nowotworach narządów litych.
Pomimo tych wysiłków, wyzwania związane z badaniem i zrozumieniem roli CTC nadal istnieją ze względu na rzadkość CTC i nieadekwatność obecnie dostępnych narzędzi technologicznych. Pomimo tych wyzwań, ogromny potencjał zastosowań klinicznych nadal stanowi zachętę do kontynuowania badań nad rolą CTC w przerzutach raka.
Ostatnio udało nam się wyizolować i rozmnożyć w hodowli komórkowej CTC z ortotopowego syngenicznego mysiego modelu przerzutów raka wątrobowokomórkowego (HCC)5. Celem niniejszego artykułu jest szczegółowe opisanie wszystkich aspektów skutecznej metodologii. Znaczenie tej metodologii polega na tym, że podejście to może być modyfikowane w celu skutecznego wyizolowania i namnażania w hodowli ludzkich CTC, zwiększając w ten sposób możliwości badań in vitro biologii CTC. 
Istnieje wiele potencjalnych zastosowań klinicznych dla stosowania CTC. CTC mogą być przydatne do prognozowania, monitorowania odpowiedzi, badań przesiewowych, dynamicznego monitorowania zmian molekularnych nowotworu i spersonalizowanej terapii4. W związku z tym lepsze zrozumienie biologii CTC ma duży potencjał oddziaływania klinicznego.

<table><tbody><tr><td>Heparyna Sól sodowa 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tubka Micro 1,5 ml Przezroczysta NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1,5 ml&nbsp; Probówki eppendorf bez pirogenów Igła</td></tr><tr><td>Sterylna dysz BD 25 G x 1 cala</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G Końcówka igły</td></tr><tr><td>Slp SRNG 1 ml 200 szt. w opakowaniu</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml końcówka strzykawki</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>Strzykawka 1 ml</td></tr><tr><td>VWR Kleszcze Chusteczki 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>Kleszcze</td></tr><tr><td>Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct compund 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct compound</td></tr><tr><td>VWR Prowadnica 25 x 75 mm PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Prowadnice</td></tr><tr><td>VWR Szkło osłonowe #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>Szkło pokrywowe</td></tr><tr><td>VWR Skrzynka przesuwna True North Fm Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>Skrzynka przesuwna</td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>Długopis PAP</td></tr><tr><td>Woda bez RNASe i DNAz 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>Bufor wodny bez nukleaz</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure Grade 500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris Bufor</td></tr><tr><td>Chlorek amonu ACS Grade 2, 5 kg</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>Bufor chlorku amonu</td></tr><tr><td>Falcon Naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm Polistyren Styl</td><td>VWR</td><td>353002</td><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Wybielacz bakteriobójczy Clorox, zwykły</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox Bleach</td></tr><tr><td>PBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) bez wapnia i magnezu (500 ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp; z 4,5 g/l glukozy i L-glutamina bez pirogronianu sodu</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM 1x pożywka dla komórek BNL 1ME A.7R.1</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fischer Scientific</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna Roztwor, 100x Penicylina</td><td>Scientific</td><td>30-002-Cl</td><td>Penicylina Streptomycyna</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75002411</td><td>Wirówka 13 000 obr./min</td></tr></tbody></table>

izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Przerzuty do raka są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Ostatnie badania wykazały, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach raka. Rzeczywiście, liczba CTC koreluje z wielkością guza. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy opis metodologii izolacji i namnażania CTC z syngenicznego mysiego modelu raka wątrobowokomórkowego (HCC), co pozwala na dalszą analizę potencjalnie ważnych mechanizmów molekularnych przerzutów guza w narządach litych. Ta metoda jest wydajna i powtarzalna. Jest to technika nieinwazyjna, a zatem może zastąpić inwazyjną biopsję tkanek pobranych od ludzi, co może wiązać się z powikłaniami. Dlatego omawiana tutaj metoda pozwala na izolację i namnażanie CTC z próbek krwi pełnej, tak aby można je było zbadać i scharakteryzować. Ma to potencjał do przyszłej adaptacji do zastosowań klinicznych, takich jak diagnoza i spersonalizowana terapia celowana.

Opisana tutaj metodologia wykazała, że możliwe jest wyizolowanie CTC. Myszy poddano humanitarnej eutanazji w punkcie końcowym eksperymentu. Proces obejmował uduszenie dwutlenkiem węgla, eksanguinację wewnątrzsercową oraz zwichnięcie stawów szyjnych. Schemat kluczowych etapów procedury przedstawiono na Rysunku 2. Próbki krwi pełnej pobrane drogą eksanguinacji wewnątrzsercowej przetworzono zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Następnie zastosowano wirowanie w celu wyznaczenia warstwy buffy coat, która zo...

Wykazano, że Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja i namnażanie krążących komórek nowotworowych z krwi pełnej syngenicznego modelu mysiego nowotworu z przerzutami raka hepatokomórkowego. Osiąga się to poprzez wstępne odwirowanie pobranej od myszy krwi pełnej i wyizolowanie warstwy leukocytarnej (buffy coat). Następnie erytrocyty zawarte w warstwie leukocytarnej są lizowane, a krążące komórki nowotworowe są zbierane w formie osadu.Następnie komórki są płukane, zawieszane w pełnej pożywce hodowlanej i propagowane w hodowli komórkowej. Szybko rosnące komórki nowotworowe pozostają żywotne przez wiele pasażowania i mogą zostać zweryfikowane za pomocą standardowych technik diagnostyki molekularnej. Znaczenie izolowania krążących komórek nowotworowych za pomocą naszej techniki polega na zapewnieniu powtarzalnego modelu, który może zostać zoptymalizowany pod kątem potencjalnego zastosowania w warunkach klinicznych.Procedurę zaprezentuje Michelle Nadu, studentka studiów licencjackich z naszego laboratorium. W celu rozpoczęcia należy pobrać krew pełną z modelu nowotworowego Ciea Kamau z przerzutami raka hepatokomórkowego, zgodnie z opisem w osobnym materiale JoVE. Następnie krew pełną należy wirować

isolation-propagation-circulating-tumor-cells-from-mouse-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Film opisuje technikę iniekcji śródśladowej komórek rakowych w celu opracowania ortotopowego modelu myszy z wysoce jednorodnymi guzami. W związku z tym ortotopowy model myszy umożliwia realistyczną symulację przerzutów, stanowiąc cenne narzędzie do badania zmian fenotypu podczas wzrostu i rozprzestrzeniania się guza.

Wstrzyknięcie śródśladowych komórek nowotworowych: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka jelita grubego

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania krążących komórek nowotworowych z próbki krwi pełnej z mysiego modelu guza jelita grubego poddanego eutanazji. Te wyizolowane CTC mogą być hodowane i wykorzystywane do zamierzonej dalszej analizy.

Izolacja CTC z próbki krwi pełnej: metoda uzyskiwania CTC z mysiego modelu raka jelita grubego

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.

"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego

Zgłaszamy wiarygodną metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu z genetycznie modyfikowanych modeli mysich.

Izolacja i ekspansja hodowli komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Ten protokół opisuje powtarzalną metodę izolacji komórek pierwotnych mięsaka prążkowanokomórkowego u myszy, tworzenia i leczenia guza oraz przeszczepu allogenicznego, zaczynając od hodowli guzów.

Wyprowadzanie i leczenie guza z pierwotnych komórek nowotworowych wyizolowanych z mięsaków prążkowanokomórkowych myszy

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Poznaj metodę izolacji i rozmnażania krążących komórek nowotworowych z krwi mysiego modelu raka wątrobowokomórkowego. Technika zapewnia powtarzalny model do badań nad przerzutami nowotworowymi.

Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Przeglądaj więcej filmów