Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka
9 października 2015
Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).
Ogólnym celem tej procedury jest izolacja i namnażanie krążących komórek nowotworowych z krwi pełnej syngenicznego modelu mysiego nowotworu z przerzutami raka hepatokomórkowego. Osiąga się to poprzez wstępne odwirowanie pobranej od myszy krwi pełnej i wyizolowanie warstwy leukocytarnej (buffy coat). Następnie erytrocyty zawarte w warstwie leukocytarnej są lizowane, a krążące komórki nowotworowe są zbierane w formie osadu.
Następnie komórki są płukane, zawieszane w pełnej pożywce hodowlanej i propagowane w hodowli komórkowej. Szybko rosnące komórki nowotworowe pozostają żywotne przez wiele pasażowania i mogą zostać zweryfikowane za pomocą standardowych technik diagnostyki molekularnej. Znaczenie izolowania krążących komórek nowotworowych za pomocą naszej techniki polega na zapewnieniu powtarzalnego modelu, który może zostać zoptymalizowany pod kątem potencjalnego zastosowania w warunkach klinicznych.
Procedurę zaprezentuje Michelle Nadu, studentka studiów licencjackich z naszego laboratorium. W celu rozpoczęcia należy pobrać krew pełną z modelu nowotworowego Ciea Kamau z przerzutami raka hepatokomórkowego, zgodnie z opisem w osobnym materiale JoVE. Następnie krew pełną należy wirować przy 1 167 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Po rozdzieleniu na warstwy, ostrożnie usuń górną warstwę plazmy i przenieś ją do oddzielnej probówki 1,5 ml wolnej od nukleaz w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów, takich jak detekcja wolnych kwasów nukleinowych. Następnie przenieś warstwę białkową (buffy coat) do oddzielnej probówki 1,5 ml wolnej od nukleaz w celu przygotowania do lizy erytrocytów. Jest to konieczne, aby usunąć resztkowe krwinki czerwone z warstwy białkowej przed izolacją krążących komórek nowotworowych.
Zacznij od przygotowania jednego litra roztworu buforu do lizy erytrocytów o końcowym stężeniu 155 millimolar chlorku amonu oraz 10 millimolar TRIS. Dostosuj pH roztworu do wartości 7.5. Odmierz alikwot od dwóch do czterech mililitrów z przygotowanego jednego litra zapasu mieszaniny buforu do lizy erytrocytów.
Następnie do probówki zawierającej zebraną warstwę leukocytarną (buffy coat) dodaj 1 mL buforu do lizy erytrocytów. Wymieszaj zawartość probówki, kilkakrotnie ją odwracając. Następnie inkubuj probówkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej na blacie.
Następnie odwiruj zmieszaną zawartość przez pięć minut. Przy 1 167 ×g po wirowaniu powstanie białawy osad. Powoli i ostrożnie odlej czerwonawy nadsącz do 10% roztworu wybielacza, uważając, aby nie naruszyć osadu.
Po odlaniu supernatantu, przemyj białawy osad w jednym mililitrze PBS. Następnie ponownie odwiruj komórki i resuspenduj je w pełnej pożywce hodowlanej. Przenieś resuspendowane komórki do naczynia hodowlanego i inkubuj je w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem, w atmosferze powietrza i 5% carbon dioxide.
Wymieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co dwa do trzech dni. Po pięciu do siedmiu dniach krążące komórki nowotworowe przylgną do naczynia hodowlanego i zaczną proliferować. Aby zweryfikować, czy krążące komórki nowotworowe raka hepatokomórkowego zostały poprawnie wyizolowane.
Przeprowadź reakcję PCR dla konkretnego fragmentu genu beta-globiny myszy, zgodnie z opisem i walidacją Stu. Następnie przeprowadź immunobarwienie komórek przeciwciałem specyficznym dla markeru hepatocytów: białka wiążącego element odpowiedzi na cykliczny AMP 3-podobnego 3, stosując standardowe techniki. Przedstawione tutaj obrazy reprezentują krążące komórki nowotworowe pobrane od dwóch osobnych myszy.
W hodowli z ortotopowego syngenicznego modelu mysiego raka wątrobowokomórkowego. Komórki nowotworowe przerzutowe przylegają do naczynia i szybko proliferują. Można je namnażać powyżej 25 pasaży, a komórki te są odporne na powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować i propagować żywotne cyrkulujące komórki nowotworowe, a także jak charakteryzować je pod kątem molekularnym i funkcjonalnym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano metodę izolacji i namnażania krążących komórek nowotworowych (CTCs) z krwi pełnej syngenicznego modelu mysiego przerzutów raka wątrobowokomórkowego (HCC). Technika ta ma na celu zapewnienie powtarzalnego modelu dla potencjalnych zastosowań klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Biologia komórki
- Badania nad przerzutami
Wstęp
- Krążące komórki nowotworowe (CTCs) odgrywają kluczową rolę w przerzutowaniu nowotworów.
- Izolowanie CTCs może pomóc w zrozumieniu progresji raka.
- Obecne metody izolacji CTCs mogą charakteryzować się niską powtarzalnością.
- Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście z wykorzystaniem modelu mysiego.
Cel badania
- Efektywna izolacja CTC z krwi pełnej.
- Namnażanie CTC w celu prowadzenia dalszych badań.
- Opracowanie modelu, który można zoptymalizować do zastosowań klinicznych.
Zastosowane metody
- Wirowanie krwi pełnej w celu wyizolowania warstwy leukocytarnej (buffy coat).
- Liza erytrocytów w celu zebrania CTC w formie osadu.
- Przemywanie i zawieszenie komórek w pełnej pożywce hodowlanej.
- Namnażanie komórek w hodowli komórkowej w celu oceny żywotności.
Główne wyniki
- CTC zachowują żywotność przez wiele pasażowań.
- Standardowe techniki diagnostyki molekularnej pozwalają na weryfikację komórek.
- Metoda ta zapewnia powtarzalny model do badań.
- Potencjał optymalizacji w warunkach klinicznych.
Wnioski
- Technika izolacji jest skuteczna w przypadku CTC pochodzących z modeli HCC.
- Wyniki wspierają dalsze badania nad przerzutowaniem nowotworów.
- Metoda ta może usprawnić zastosowania kliniczne w leczeniu nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja i namnażanie krążących komórek nowotworowych (CTCs) z krwi pełnej umożliwiają nieinwazyjne monitorowanie dynamiki guza oraz potencjału przerzutowego w modelach przedklinicznych. Podejście to wspiera walidację celu, zapewniając odnawialne źródło żywotnych komórek rakowych do badań mechanistycznych i opracowywania testów. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania poprzez umożliwienie funkcjonalnej charakterystyki CTCs w kontrolowanych warunkach hodowli.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych z wykorzystaniem CTC pochodzących z syngenicznego modelu przerzutów HCC.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system do funkcjonalnej walidacji celów oraz wyjaśniania szlaków sygnałowych.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie molekularnej i funkcjonalnej charakterystyki wyizolowanych CTC.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia namnażanie CTC w ilościach odpowiednich do przygotowania zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszych badań przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację testów dzięki spójnej żywotności i proliferacji komórek w wielu pasażach.
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościowy pomiar zmiennych zależnych, takich jak tempo proliferacji i ekspresja markerów, w celu oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność kliniczną choroby poprzez wykorzystanie CTC z ortotopowego syngenicznego modelu mysiego przerzutów HCC.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki możliwości namnażania kultur CTC.
- Wartość naukowa: Ułatwia badania nad dopasowaniem biomarkerów przy użyciu zweryfikowanych markerów specyficznych dla raka hepatokomórkowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – poprzez dostarczanie scharakteryzowanych kultur CTC do testów funkcjonalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez molekularne potwierdzenie tożsamości CTC.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych populacji komórek z ilościowymi parametrami wzrostu do badań przesiewowych związków.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki, takie jak adhezja, proliferacja i ekspresja markerów, do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi za pomocą linii CTC zachowujących cechy charakterystyczne dla HCC.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania platformy hodowli komórkowych w wielu cyklach badań i kampaniach testowania związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki walidacji molekularnej i funkcjonalnej namnożonych CTC.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom izolacji i hodowli.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki zmniejszeniu niejednoznaczności mechanistycznej w modelach przerzutowania.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o funkcjonalne dane pochodzące z CTC.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach hodowli komórkowych, hematologii i biologii molekularnej.
- Zależy od dostępności wirówek, buforów lizujących oraz sterylnej infrastruktury do hodowli.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia spójności izolacji warstwy leukocytarnej (buffy coat) oraz lizy RBC.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy jej zastosowaniu do różnych modeli nowotworowych lub gatunków.
- Ograniczona koniecznością przeprowadzenia etapów weryfikacji molekularnej w celu potwierdzenia tożsamości CTC po izolacji.
