Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie naciekających leukocytów mysiego interfejsu matczyno-płodowego. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie macicy, łożyska i eua. Tkanki są rozkładane przez mechaniczną dysocjację w roztworze enzymatycznym, po której następuje trawienie enzymatyczne.

Powstała zawiesina komórek jest następnie filtrowana i przemywana, w którym to momencie interesujące komórki odpornościowe są oddzielane od resztek komórkowych, takich jak komórki niezdolne do życia, za pomocą gradientu płodowej surowicy bydlęcej. Ostatecznie wyizolowane leukocyty można wykorzystać do immunofenotypowania hodowli komórkowych lub sortowania komórek. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy ustalić protokół izolacji leukocytów z interfejsu matki i płodu i zdaliśmy sobie sprawę, że opublikowane metody nie ułatwiają izolacji rzadkich komórek odpornościowych, które są dla nas interesujące

Demonstracja Procedura zostanie przeprowadzona przez Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez, którzy są współpracownikami naukowymi z mojego laboratorium Aby pobrać tkanki interfejsu matki płodu, zacznij od użycia sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby całkowicie usunąć dolną część skóry brzucha i tkankę mięśniową. Następnie użyj kleszczy, aby odsunąć na bok wszystkie inne narządy, aż macica i jajniki będą widoczne. Następnie wysuń macicę na zewnątrz jamy otrzewnej.

Zlokalizuj jajniki dystalnie do UCT i połączenie jajowodów macicy każdego rogu macicy. Następnie wykonaj nacięcie na połączeniu jajowodów macicy, aby oddzielić rogi od mesentariusza zawierającego naczynia macicy. Wyciąć szyjkę macicy, aby oderwać rogi macicy od jamy otrzewnej.

Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie między szyjką macicy a dolnym segmentem rogów, pozostawiając część szyjki macicy przyczepioną, aby uniknąć otwarcia rogu macicy. Zanurz rogi i szyjkę macicy na dużej szalce Petriego wypełnionej 10 do 15 mililitrami PBS, aby nawilżyć miejsca implantacji. Odetnij tłuszcz z tkanek.

Następnie przytrzymując rogi na miejscu za pomocą kleszczy. Wykonaj poprzeczne przecięcie przez obszar implantacji, aby usunąć jedno z miejsc implantacji z macicy. Teraz przytrzymaj miejsce na miejscu i wykonaj małe nacięcie w ścianie macicy przylegającej do łożyska i pozostałych tkanek.

Przyciąć na obwodzie łożyska i decidua, aż tkanki oddzielą się zarówno od ściany macicy, jak i błony kosmówkowej. Następnie przenieś łożysko i dołączone tkanki dziesiętne na świeżą szalkę Petriego zawierającą od trzech do pięciu mililitrów PBS. Przenieś płód na inną szalkę Petriego za pomocą PBS i użyj pęsety z cienką końcówką, aby delikatnie oderwać białą szarą tkankę deci od powierzchni łożyska.

Dbanie o zachowanie integralności tkanek łożyska i ECI. Podziel tkanki łożyska i ECI na dwie indywidualnie oznakowane szalki Petriego wypełnione PBS. Następnie użyj pęsety z cienką końcówką, aby delikatnie usunąć ścianę macicy z błony toicznej kamufla Allena i umieść te tkanki macicy na nowej szalce Petriego wypełnionej PBS, aby mechanicznie zdysocjować tkanki.

Następnie przenieś dwie 100 do 150 miligramów krążków macicy i tkanek łożyska i indywidualnie oznacz dwie mililitrowe stożkowe rurki. Dodaj 500 mikrolitrów zimnego roztworu enzymatycznego po jednym do każdej probówki. Następnie użyj sterylnych nożyczek, aby mechanicznie zdysocjować każdą z tkanek nie dłużej niż dwie minuty, aż do zawiesiny.

Rozwijaj mleczny wygląd. Dodaj jeszcze 500 mikrolitrów zimnego roztworu enzymatycznego, po jednym do każdej probówki i umieść probówki na lodzie. Następnie inkubuj wszystkie tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem orbitalnym przy 80 obr./min, umieszczając probówki na lodzie po 30 do 35 minutach, aby zatrzymać trawienie.

Teraz przecedź każdą zawiesinę tkanki przez sitko o średnicy 100 mikronów do indywidualnie oznakowanych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów i umyj każdą dwumililitrową probówkę i sitko dwa do trzech razy 20 mililitrami PBS, aby zebrać wszystkie komórki. Gdy wszystkie komórki zostaną przefiltrowane, odkręć je w dół i ostrożnie zasysaj natynkę SUP, nie naruszając granulek. Delikatnie zawiesić izolowane leukocyty i komórki zrębu w jednym mililitrze kultury RPMI, pożywce bez wirowania.

Następnie dla każdej tkanki dodaj 500 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej do pięciomililitrowej probówki z polistyrenu i powoli nakładaj zawiesinę komórek na surowicę. Wreszcie, gdy wszystkie komórki zostaną nałożone na siebie, odwiruj komórki bez przerwy i zasysaj supinat bez dotykania granulek komórek. Na tych obrazach morfologia F czterech 80 dodatnich makrofagów wyizolowanych z tkanek decydowych i macicy.

Po 16,5 dniu od pobrania pokazano komórki zarówno z tkanek brzegowych matki, jak i płodu. Wykazują żywotność ponad 70% po izolacji tą metodą i zawierają makrofagi neutrofilowe, limfocyty T, komórki NK i populacje komórek dendrytycznych z wysokim odsetkiem makrofagów, które wykazują ekspresję subpopulacji leukocytów CD 11 C wyizolowanych z tkanek na lustrze i styku matki z płodem. Obejmują również limfocyty B i CD cztery dodatnie limfocyty T, CD osiem dodatnich limfocytów T i CD trzy dodatnie CD cztery ujemne CD osiem ujemnych limfocytów T są również izolowane, jak obserwowano na tym wykresie gęstości.

W porządku, próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby trzymać tkanki i koktajl enzymatyczny na lodzie, aby ustawić odpowiednią temperaturę w inkubatorze i nie manipulować nadmiernie tkankami podczas trawienia po tej procedurze. Można przeprowadzić inne metody, takie jak immunofenotypowanie, hodowla komórkowa, sortowanie komórek i izolacja D-N-A-R-N-A. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować naciekające leukocyty na styku matki z płodem, macicy i łożysku.