Name: Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Naucz się izolacji leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej. Ta metoda obejmuje rozdrabnianie mechaniczne, trawienie enzymatyczne i separację gradientową, zachowując markery powierzchniowe komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NGL był wspierany przez Wayne State University Perinatal Initiative in Maternal, Perinatal and Child Health. Wyrażamy wdzięczność Maureen McGerty i Amy E. Furcron (Wayne State University) za ich krytyczną lekturę manuskryptu.

Przed rozpoczęciem pracy z próbkami wymienionymi w tym protokole, Lokalna Komisja Etyki Badań Naukowych i Instytucjonalne Komisje Rewizyjne muszą wyrazić zgodę na etyczne stosowanie zwierząt. Podczas pracy z krwią zwierzęcą, komórkami lub czynnikami niebezpiecznymi, jak wspomniano w niniejszym protokole, należy przestrzegać odpowiednich działań w zakresie bezpieczeństwa biologicznego i bezpieczeństwa laboratoryjnego.
1. Obsługa myszy i pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne stanowisko pracy i zaopatrz się w sterylne narzędzia do pobierania tkanek. Narzędzia te będą obejmować duże i małe nożyczki chirurgiczne, kleszcze i pęsety z cienką końcówką. Dołączyć małe szalki Petriego oznakowane odpowiednimi nazwami tkanek, wypełnione 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) (3 - 5 ml) zrównoważonym do temperatury suchej (20 - 22 °C). Dołącz również dużą szalkę Petriego, nieoznakowaną, wypełnioną 1x roztworem PBS (10 - 15 ml).</li>
	<li>Poddaj eutanazji ciężarną mysz (10,5 do 19,0 dni po stosunku (dpc) lub przed porodem) za pomocą dwutlenku węgla (CO2 ). Aby upewnić się, że mysz zostanie poddana eutanazji, użyj techniki zwichnięcia szyjki macicy. 
	Uwaga: Przed 10,5 dpc trudno jest ręcznie oddzielić tkanki dziesiętne od tkanek macicy. Jeśli izolacja leukocytów dziesiętnych nie jest wymagana, leukocyty z tkanek macicy myszy niebędących w ciąży lub leukocyty z myszy w <10,5 dpc można również wykonać, postępując zgodnie z tym protokołem.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych całkowicie usuń dolną część skóry i tkankę mięśniową brzucha. Za pomocą kleszczy odsuń na bok wszystkie inne narządy, aż macica i jajniki będą widoczne. Gdy macica jest nadal przyczepiona, użyj kleszczy, aby przesunąć ją na zewnątrz jamy otrzewnej (ryc. 1A).</li>
	<li>Zlokalizuj jajniki dystalnie do jajowodu i połączenia macicowo-jajowodowego każdego rogu macicy. Za pomocą małych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie na połączeniu maciczniowo-tubowym i oddziel rogi macicy od krezki zawierającej naczynia maciczne; następnie wyciąć szyjkę macicy, aby oderwać rogi macicy od jamy otrzewnej (ryc. 1B).</li>
	<li>Małymi nożyczkami chirurgicznymi wykonaj nacięcie między szyjką macicy a dolnym odcinkiem rogów macicy. Podczas tego procesu pozostaw przyczepioną część szyjki macicy (ryc. 1C), aby uniknąć otwarcia rogu macicy.</li>
	<li>Zanurz rogi macicy (w tym szyjkę macicy) na dużej szalce Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS (10 - 15 ml), aby nawodnić miejsca implantacji.</li>
	<li>Będąc nadal zanurzonym w roztworze 1x PBS, odetnij tłuszcz z rogów macicy za pomocą małych nożyczek chirurgicznych. Utrzymuj tkanki zanurzone w 1x roztworze PBS przez cały czas trwania sekcji.</li>
	<li>Przytrzymując rogi macicy na miejscu za pomocą kleszczy, usuń jedno z miejsc implantacji z macicy za pomocą poprzecznego przecięcia przez obszar międzyimplantacyjny, używając małych nożyczek chirurgicznych (ryc. 1D). W miejscu implantacji znajduje się płód otoczony błoną kosmówkowo-omoczniową oraz tkanki macicy, liściastej i łożyska.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przytrzymaj miejsce na miejscu i wykonaj małe nacięcie w ścianie macicy przylegającej do tkanek łożyskowych i dziesiętnych (ryc. 1E). Przyciąć na obwodzie łożyska/decidua, aż zostaną one oddzielone zarówno od ściany macicy, jak i błony kosmówkowo-omoczniowej, która obejmuje płód (ryc. 1F).</li>
	<li>Usunąć łożysko i dołączone tkanki dziesiętne i umieścić w 1x roztworze PBS (3 - 5 ml; patrz krok 1.12).</li>
	<li>Umieść płód otoczony błoną kosmówkowo-omoczkową przyczepioną do tkanek macicy na szalce Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS (3 - 5 ml). Nawodnienie tych tkanek ułatwi oddzielenie błony kosmówkowo-omoczniowej od ściany macicy (patrz krok 1.14).</li>
	<li>Za pomocą pęsety z cienką końcówką delikatnie oderwij tkankę dziesiętną (biało-szarą warstwę) z powierzchni łożyska. Wykonaj ten krok ostrożnie, aby zachować integralność tkanek łożyska i tkanek liściastych (ryc. 1G).</li>
	<li>Umieść łożysko i tkanki dziesiętne na dwóch oddzielnie oznakowanych szalkach Petriego wypełnionych 1x roztworem PBS (3 - 5 ml każda).</li>
	<li>Delikatnie usuń ścianę macicy z błony kosmówkowo-omoczniowej za pomocą pęsety z cienką końcówką. Są to tkanki macicy.</li>
	<li>Umieść tkanki macicy na szalce Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS (3 - 5 ml).</li>
	<li>Powtarzaj kroki od 1.8 do 1.15, aż wszystkie miejsca implantacji zostaną przetworzone.</li>
	<li>Zbierz kilka tkanek macicy, dziesiętnych i łożyska, aby poprawić wydajność komórek podczas trawienia enzymatycznego. Ilość chusteczek zależy od wielkości ściółki; Jednak izolacja leukocytów wymaga >2 kawałków tkanki. 
	Uwaga: Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat sekcji miejsc implantacji w różnych dniach ciąży, zobacz zdjęcia znajdujące się w rozdziale drugim >Przewodnika po badaniu ciąży myszy42.</li>
</ol>
2. Dysocjacja tkanki macicznej, dziesiętnej i łożyskowej
<ol>
	<li>Oznaczyć kilka sterylnych probówek stożkowych o pojemności 2 ml odpowiednią nazwą tkanki i umieścić fiolkę z 1 000 μl roztworu enzymatycznego na lodzie.</li>
	<li>Z szalki Petriego wypełnionej 1x roztworem PBS przenieść dwa kawałki (100 - 150 mg) tkanek macicy, liściastych lub łożyska do znakowanej probówki stożkowej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl zimnego roztworu enzymatycznego do każdej stożkowej probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Za pomocą cienkich sterylnych nożyczek zacznij dysocjować tkankę zanurzoną w roztworze enzymatycznym, aż zostanie drobno zmielona. Z biegiem czasu zawiesina nabierze mlecznego wyglądu. Etap ten nie powinien trwać dłużej niż 2 minuty, aby zapobiec nadmiernej manipulacji próbką.</li>
	<li>Po dysocjacji tkanki dodać dodatkowe 500 μl zimnego roztworu enzymatycznego do stożkowej probówki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Umieść stożkową probówkę o pojemności 2 ml na lodzie.</li>
	<li>Powtarzać kroki od 2.2 do 2.6 z każdą pojedynczą tkanką, aż wszystkie tkanki zostaną przetworzone.</li>
	<li>Przenieść wszystkie stożkowe probówki o pojemności 2 ml z homogenizowanymi próbkami tkanek (tkanka mielona + roztwór enzymatyczny) z lodu do inkubatora w temperaturze 37 °C i przeprowadzić delikatne mieszanie orbitalne (80 obr./min). Inkubować przez 30 - 35 minut. Upewnij się, że temperatura inkubatora jest ustabilizowana przed rozpoczęciem inkubacji.</li>
	<li>Po inkubacji należy wyjąć z inkubatora stożkowe probówki o pojemności 2 ml ze zdysocjowanymi tkankami i umieścić je na lodzie, aby zapobiec dalszemu trawieniu.</li>
	<li>Oznacz sterylne probówki stożkowe o pojemności 50 ml w zależności od rodzaju tkanki. Zdejmij pokrywki i zastąp je sterylnym sitkiem do komórek (wielkość porów 100 μm).</li>
	<li>Przelać zdysocjowane tkanki z 2 ml stożkowych probówek przez sitko do komórek, używając ~20 ml 1x roztworu PBS. Fragmenty tkanki pozostaną w sitku komórkowym, a zawiesina komórek przejdzie przez nie.</li>
	<li>Przemyć zdysocjowane tkanki w sitku do komórek 2 - 3 razy 20 ml 1x roztworu PBS za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Przepłukać puste probówki stożkowe o pojemności 2 ml roztworem 1x PBS (1 ml) i przelać zawartość przez sitka do komórek.</li>
	<li>Wyjmij sitka z probówek stożkowych o pojemności 50 ml i załóż pokrywki. Odwirować probówki o sile 1,250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Osad komórkowy zawiera izolowane leukocyty i komórki zrębu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Delikatnie wymieszaj. Nie używaj wiru.</li>
	<li>Dodaj 500 μl czystego FBS do 5 ml plastikowej probówki z polistyrenu i powoli nakładaj zawiesinę komórek.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 1 100 x g bez hamulca w temperaturze pokojowej w celu osadzania żywych komórek, podczas gdy resztki komórkowe są zatrzymywane na granicy faz PBS/FBS.</li>
	<li>Odessać supernatant bez dotykania osadu komórkowego. Osad komórkowy zawiera głównie żywe komórki.</li>
	<li>Opcjonalnie: Aby zagęścić komórki jednojądrzaste, użyj 20% nasyconego roztworu polisacharydów, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1,000 μl pożywki hodowlanej RPMI bez FBS.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 20% nasyconego roztworu polisacharydów do 5 ml plastikowej probówki z polistyrenu i powoli nakładaj zawiesinę komórek na ten roztwór, zgodnie z instrukcjami producenta. Podczas nakładania warstw próbki należy unikać mieszania 20% nasyconego roztworu polisacharydów z zawiesiną komórkową.</li>
		<li>Wirówka z odchylanym wirnikiem o sile 500 x g przez 30 min przy suchej smołce bez hamulca. Bardzo ważne jest, aby wyłączyć hamulec, aby uniknąć mieszania się komórek i utraty gradientu. Komórki jednojądrzaste znajdą się na granicy faz między 20% nasyconym roztworem polisacharydów a roztworem 1x PBS.</li>
		<li>Odessać i wyrzucić supernatant. Osad komórkowy zawiera głównie komórki jednojądrzaste. 
		Uwaga: Aby wykonać barwienie żywotności i barwienie wewnątrzkomórkowe, patrz krok 3. Aby przeprowadzić immunofenotypowanie, patrz krok 4. Aby wykonać barwienie żywotności i barwienie zewnątrzkomórkowe, patrz krok 5. Aby przeprowadzić hodowlę komórkową izolowanych leukocytów, patrz krok 6. Aby przeprowadzić sortowanie komórek magnetycznych, patrz krok 7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie żywotności komórek nadających się do naprawy
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 100 μl roztworu 1x PBS. Delikatnie wymieszaj za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórek do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu. Dodać 400 μl 1x roztworu PBS do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml. Ta probówka jest kontrolą autofluorescencji tkanek. Przechowywać w temperaturze 4 ºC do kroku 3.5.</li>
	<li>Przenieść pozostałe 1 000 μl zawiesiny komórek do nowej probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu. Dodać 1 μl barwnika żywotności i delikatnie homogenizować. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 1,000 μl 1x PBS roztworu. Delikatnie wymieszaj ręcznie.</li>
	<li>Odwirować obie probówki z tworzywa sztucznego polistyrenu o pojemności 5 ml (kroki 3.2 i 3.3) przy 1250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i wyrzucić supernatant. 
	Uwaga: Osad komórkowy (krok 3.3) zostanie użyty w kroku 4. Osad komórkowy (krok 3.2) będzie służył jako kontrola autofluorescencji tkanek.</li>
</ol>
4. Immunofenotypowanie
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 50 μl anty-mysiego CD16/CD32 (rozcieńczony 1:100 w buforze FACS [0,1% BSA, 0,05% azydku sodu, 1x roztwór PBS, ph 7,4]). Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową. Nie używaj wiru.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórkową w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml w ciemności w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 50 μl każdego przeciwciała monoklonalnego przeciwko leukocytom reagującego z zewnątrzkomórkowymi markerami powierzchniowymi komórek lub przeciwciałem kontrolnym dopasowanym izotypowo (rozcieńczenia przeciwciał muszą być zwalidowane). Na przykład, aby przeanalizować subpopulacje leukocytów, użyj przeciwciał przeciw mysim reagującym z następującymi markerami powierzchniowymi komórek leukocytów: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4 i CD8 (Tabela 1).</li>
	<li>Po dodaniu przeciwciał przeciwko markerom zewnątrzkomórkowym do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu, delikatnie wymieszaj. Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas tej inkubacji przygotować i wstępnie ogrzać roztwór buforowy utrwalający (rozcieńczony wodą dejonizowaną w stosunku 1:5) do temperatury 37 °C, jeśli jest to wymagane. Przechowywać bufor w temperaturze 37 °C w ciemności do czasu, gdy konieczne będzie jego użycie.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji dodać 500 μl buforu FACS do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml i delikatnie wymieszać. Ten krok jest potrzebny do umycia komórek i usunięcia nadmiaru niezwiązanego przeciwciała.</li>
	<li>Odwirować próbki w temperaturze 1 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odessać i wyrzucić supernatant. 
	Uwaga: Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, patrz krok 5. Jeśli wymagane jest barwienie wewnątrzkomórkowe, należy tutaj przeprowadzić przepuszczalność i barwienie wewnątrzkomórkowe, a następnie przystąpić do utrwalania (krok 4.8).</li>
	<li>Dodać 500 μl wstępnie ogrzanego roztworu buforowego utrwalającego do osadu komórkowego i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dozować 500 μl buforu FACS do probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 5 ml z polistyrenu. Delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Odwirować próbki w temperaturze 1,250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odsysać i odrzucać supernatant.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu FACS do każdej próbki. Próbki te można teraz analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy natychmiast pobrać próbki.</li>
</ol>
5. Barwienie żywotności dla komórek niemożliwych do naprawienia
<ol>
	<li>Po immunofenotypowaniu zewnątrzkomórkowym ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu FACS.</li>
	<li>Dodać 1 μl dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI, 200 μg/ml) bezpośrednio przed pobraniem próbki.</li>
	<li>Wizualizacja próbek w ciągu 1-2 minut po dodaniu DAPI za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
6. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotuj stanowisko pracy pod sterylnym wyciągiem. Podgrzej pożywkę do hodowli RPMI do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1000 μl buforu FACS w celu zliczenia komórek.</li>
	<li>Policz liczbę żywotnych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i 0,4% roztworu błękitu trypanowego, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zapisz całkowitą liczbę komórek na żywo.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 1,250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu usunięcia buforu FACS.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej RPMI, delikatnie pipetując 2 do 3 razy.</li>
	<li>Umieścić żądaną liczbę komórek na sterylnej 24-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 37 °C. Czas inkubacji zostanie określony przez pytanie badawcze.</li>
</ol>
7. Magnetyczne sortowanie komórek
<ol>
	<li>Skonfiguruj czystą stację roboczą z następujących materiałów: kolumny MS, magnetyczny separator komórek, stożkowe probówki o pojemności 15 ml, filtry do wstępnej separacji 30 μm i wielostanowiskowy.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MACS (0,5% BSA, 2mM EDTA, 1x roztwór PBS, pH 7,2).</li>
	<li>Używając automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i 0,4% roztworu błękitu trypanowego, policz i zapisz całkowitą liczbę żywych komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 1,250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odsysać i odrzucać supernatant. Dodaj kolejne 500 μl buforu MACS.</li>
	<li>Przystąp do przeprowadzenia separacji magnetycznej zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Określić czystość za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii.</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Gromadzenie spójnych danych, które rejestrują obfitość i cechy fenotypowe naciekających leukocytów na granicy matczyno-płodowej, jest niezbędne do zrozumienia patogenezy powikłań związanych z ciążą. Opisano kilka technik, które ułatwiają izolację naciekających leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej przez cały okres ciąży31,38,39,43-46. Jednak każda technika jest inna, wykorzystuje różne enzymy lub kombinacje enzymów, wymaga różnych czasów dysocjacji, nie określa ilości tkanki i, co najważniejsz...

Tolerancja immunologiczna w ciąży to okres, w którym zachodzą charakterystyczne zmiany w układzie odpornościowym matki. Zmiany te pozwalają matce tolerować płód, przeszczep półallogeniczny1. Płód wykazuje ekspresję ojcowskich antygenów głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC)2, a komórki płodowe znaleziono w krążeniu matki3; Jednak płód nie jest odrzucany4,5. Zagadka ta nie jest do końca zrozumiała.
Najnowsza hipoteza mówi, że tolerancja matczyno-płodowa jest tworzona podczas stosunku płciowego i zapłodnienia6,7 i utrzymywana do utrzymania donoszonej ciąży8-10. Załamanie tej tolerancji matczyno-płodowej jest uważane za mechanizm choroby we wczesnych i późnych stadiach ciąży10-16. Tolerancja matczyno-płodowa obejmuje udział różnych subpopulacji leukocytów, w tym limfocytów T (limfocytów T regulatorowych, komórek Th1, komórek Th2 i komórek Th17), makrofagów, neutrofili, komórek tucznych, komórek NK i komórek NKT, komórek dendrytycznych i komórek B, które zmieniają gęstość i lokalizację w czasie ciąży15,17-19. Tolerancja matczyno-płodowa jest wzbogacona na granicy matczyno-płodowej20 - anatomicznym miejscu, w którym układ odpornościowy matki oddziałuje z antygenami płodu20,21.
Interfejs matczyno-płodowy powstaje podczas łożyskowania, gdy pozakosmkowe komórki trofoblastu płodu atakują błonę śluzową macicy22-24. Po stronie płodu tego interfejsu błony otaczające płód tworzą wyspecjalizowaną powierzchnię nabłonka w łożysku, a komórki syncytiotrofoblastu kontrolują wymianę składników odżywczych poprzez bezpośredni kontakt z krwią matki22. Po matczynej stronie interfejsu, decidua rekrutuje heterogeniczną pulę leukocytów, które u myszy stanowią od 30% do 50% wszystkich komórek dziesiętnych. Oprócz udziału w matczynej tolerancji immunologicznej, komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych procesach zachodzących w czasie ciąży, np. w ochronie układu rozrodczego przed infekcjami, zapłodnieniu, zagnieżdżeniu się zarodka7,25, angiogenezie dziesiętnej26, przebudowie naczyń krwionośnych24,27, inwazji trofoblastu28, rozwoju łożyska24,25 i ostatecznie porodzie i porodzie15,17. Dlatego badanie leukocytów biorących udział w tolerancji matczyno-płodowej jest niezbędne do wyjaśnienia patogenezy powikłań związanych z ciążą.
Podczas gdy użycie immunohistochemii i immunofluorescencji wygenerowało dane do bezpośredniej wizualizacji i lokalizacji leukocytów macicy, dziesiętnych lub łożyskowych29,30, analiza cytometrii przepływowej ujawniła również specyficzne podzbiory leukocytów w każdej z tych tkanek31,32. Dodatkowo zastosowano cytometrię przepływową do określenia gęstości i proporcji leukocytów na granicy matczyno-płodowej33 oraz poziomów ekspresji białek zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych8-10,34. Analiza leukocytów metodą cytometrii przepływowej na granicy matczyno-płodowej wymaga zawiesiny jednokomórkowej. W celu wyizolowania leukocytów naciekających z tkanek liściastych, macicy i łożyska zastosowano dwie metody dysocjacji tkanek: mechaniczną i enzymatyczną. Obie metody pozwalają na oddzielenie naciekających leukocytów od macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) tych tkanek. Enzymatyczna dysocjacja tkanek jest lepsza niż mechaniczna dysocjacja tkanek, ponieważ pozwala na wyższą wydajność leukocytów przy mniejszych uszkodzeniach związanych z siłą ścinającą35. W związku z tym mechaniczna dysocjacja tkanek wymaga łączenia tkanek36, co może zwiększyć zmienność i niejednorodność próbek. Jednak dysocjacja mechaniczna może być wyborem, gdy antygen będący przedmiotem zainteresowania może zostać zmieniony przez dysocjację enzymatyczną lub gdy konieczne jest zachowanie funkcjonalności komórek będących przedmiotem zainteresowania (np. cytotoksyczność komórek NK)35.
Użycie proteolizy z określonymi enzymami do degradacji ECM eliminuje niskie plony obserwowane przy dysocjacji mechanicznej. Kilka badań wykazało stosowanie trypsyny32, kolagenazy37, DNazy31, dyspazy38 i komercyjnych koktajli różnych enzymów32,39. Jednak charakter i stężenie różnych enzymów oraz czas trawienia muszą być skrupulatnie określone i zwalidowane, aby zapewnić utrzymanie integralności epitopów antygenowych na powierzchni komórki wymaganych do immunofenotypowania. Różne struktury powierzchniowe są w różny sposób podatne na zniszczenie przez różne enzymy, przy czym niektóre enzymy, takie jak trypsyna, są znane z usuwania epitopów powierzchniowych leukocytów rozpoznawanych przez wiele przeciwciał monoklonalnych.
Tu przedstawiona jest metoda wykorzystująca proteolityczny i kolagenolityczny koktajl enzymatyczny, zwany Accutase. Ten enzymatyczny roztwór jest wystarczająco delikatny, a jednocześnie skuteczny w dysocjacji tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej i nie wymaga dodawania innych odczynników dysocjujących lub surowicy w celu zakończenia reakcji dysocjacji. Co więcej, jest gotowy do użycia w takiej postaci, w jakiej został dostarczony i chociaż czas dysocjacji musi zostać zweryfikowany, jest bardziej wytrzymały niż wyżej wymienione enzymy40,41.
Wykorzystanie kombinacji obu typów dezagregacji tkanek poprawia jakość i ilość uzyskanych komórek; dlatego w kilku badaniach zastosowano łączne zastosowanie dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej z zadowalającymi wynikami31,32,37. Opisany w niniejszym dokumencie protokół został ustalony i zatwierdzony w naszym laboratorium; Wykorzystuje kombinację delikatnej dysocjacji mechanicznej, po której następuje silna dezagregacja enzymatyczna. Protokół ten pozwala na izolację i dalsze badanie naciekających leukocytów w tkankach mysich na granicy matczyno-płodowej (macica, decidua i łożysko). Poniższy protokół utrzymuje również integralność markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, jak wykazano w analizie cytometrii przepływowej. Wreszcie, protokół ten utrzymuje spójność przygotowania komórek do analizy i porównania różnych tkanek mysich tworzących interfejs matczyno-płodowy.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Magentic Cell Separation</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separator komórek</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtry do wstępnej</td><td>separacji Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Preparat laboratoryjny</td> <td>(0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 2mM EDTA i 1x PBS, pH 7,2)</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Odczynniki</silny></td></tr><tr><td>Roztwór enzymatyczny Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała zewnątrzkomórkowe przeciw myszom</td><td>BD Bioscences/eBiosciencesTabela</td><td></td> <td>1</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY barwnik żywotności</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy do utrwalania</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Bufor</td><td>BD Biosciences</td><td>Preparat laboratoryjny</td><td>0,1% BSA, 0,05% azydek sodu, 1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dodatkowe instrumenty</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>System</td><td></td><td></td> próżniowy <td>zbudowany laboratoryjnie</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Termo Inkubator Naukowy</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Precyzyjna</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Automatyczny licznik</td><td></td>komórek</tr><tr><td>Mikroskopy optyczne i fluorescencyjne</td><td>Zeiss i Olympus</td><td>Zeiss LSM780 i Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Tolerancja immunologiczna w ciąży wymaga, aby układ odpornościowy matki ulegał charakterystycznym zmianom, aby akceptować i pielęgnować rozwijający się płód. Tolerancja ta jest inicjowana podczas stosunku, ustalana podczas zapłodnienia i zagnieżdżania się i utrzymywana przez całą ciążę. Aktywne mediatory komórkowe i molekularne tolerancji matczyno-płodowej są wzbogacone w miejscu kontaktu między tkankami płodu i matki, znanym jako interfejs matczyno-płodowy, który obejmuje łożysko oraz tkanki macicy i dziesiętne. Ten interfejs składa się z komórek zrębu i naciekających leukocytów, a ich liczebność i cechy fenotypowe zmieniają się w trakcie ciąży. Naciekające leukocyty na granicy matczyno-płodowej obejmują neutrofile, makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki tuczne, limfocyty T, limfocyty B, komórki NK i komórki NKT, które razem tworzą lokalne mikrośrodowisko podtrzymujące ciążę. Brak równowagi między tymi komórkami lub jakakolwiek niewłaściwa zmiana w ich fenotypach jest uważana za mechanizm choroby w ciąży. Dlatego badanie leukocytów, które infiltrują granicę matczyno-płodową, jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów immunologicznych, które prowadzą do powikłań związanych z ciążą. Opisany w niniejszym dokumencie jest protokół, który wykorzystuje kombinację delikatnej dysocjacji mechanicznej, po której następuje silna dezagregacja enzymatyczna z proteolitycznym i kolagenolitycznym koktajlem enzymatycznym w celu wyizolowania naciekających leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej. Protokół ten pozwala na izolację dużej liczby żywotnych leukocytów (>70%) o wystarczająco konserwatywnych właściwościach antygenowych i funkcjonalnych. Wyizolowane leukocyty można następnie analizować za pomocą kilku technik, w tym immunofenotypowania, sortowania komórek, obrazowania, immunoblottingu, ekspresji mRNA, hodowli komórkowej i testów funkcjonalnych in vitro, takich jak mieszane reakcje leukocytów, proliferacja lub testy cytotoksyczności.

Preparatyka tkanek mysich z interfejsu matka-płód została przedstawiona na Rysunku 1; procedura ta obejmuje otwarcie jamy otrzewnej (Rysunek 1A,B), rogów macicy (Rysunek 1C) w tym miejsc implantacji (Rysunek 1D), a także pobranie tkanek macicy (Rysunek 1E), łożyska (Rysunek 1F) oraz tkanek decydualnych (Rysunek 1G) w 16,5 dpc. Rysunek 2 przedstawia morfologię wyizolowanych makrofagów (F4...

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja leukocytów infiltrujących macierzyńsko-płodowy interfejs u myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie macicy, łożyska i eua. Tkanki są rozdrabniane poprzez dysocjację mechaniczną w roztworze enzymatycznym, a następnie poddawane trawieniu enzymatycznemu.Otrzymaną zawiesinę komórkową należy następnie przefiltrować i przemyć, a następnie oddzielić interesujące nas komórki odpornościowe od resztek komórkowych, takich jak komórki nieżywe, za pomocą gradientu płodowej surowicy bydlęcej. Ostatecznie wyizolowane leukocyty mogą zostać wykorzystane do immunofenotypowania, hodowli komórkowej lub sortowania komórek. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy próbowaliśmy opracować protokół izolacji leukocytów z miejsca styku macicy z płodem i zdaliśmy sobie sprawę, że opublikowane metody nie ułatwiały izolacji rzadkich komórek odpornościowych, które nas interesowały.Procedurę zaprezentują Mile El Sanchez Rodriguez i Marcina Hernandez, asystenci naukowi z mojego laboratorium. Aby pobrać tkanki z interfejsu matka-płód, należy rozpocząć od całkowitego usunięcia skóry oraz tkanki mięśniowej z dolnej części brzucha za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych. Następnie, używając pęsety, odsunąć pozostałe organy, aż do momentu, gdy macica i jajniki staną się widoczne. Następnie należy wysunąć macicę poza jamę otrzewną.Zlokalizuj jajniki dystalnie względem UCT oraz miejsce połączenia jajowodu z macicą każdego rogu macicy. Następnie wykonaj nacięcie w miejscu połączenia jajowodu z macicą, aby oddzielić rogi od krezki zawierającej naczynia maciczne. Wykonaj wycięcie na poziomie szyjki macicy, aby oddzielić rogi macicy od jamy otrzewnej.Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie między szyjką macicy a dolnym odcinkiem rogów, pozostawiając część szyjki przytwierdzoną, aby uniknąć otwarcia rogu macicy. Zanurz rogi i szyjkę macicy w dużej szalce Petriego wypełnionej 10 do 15 ml PBS, aby nawodnić miejsca implantacji. Usuń nadmiar tkanki tłuszczowej z tkanek.Następnie, przytrzymując rogi macicy pęsetą, należy wykonać cięcie poprzeczne przez obszar między implantacyjnymi, aby usunąć jedno z miejsc implantacji z macicy. Teraz należy unieruchomić to miejsce i wykonać małe nacięcie w ścianie macicy w sąsiedztwie tkanek łożyska i tkanek pozostałych.Przytnij brzegi łożyska i błony błoniowej, aż tkanki oddzielą się zarówno od ściany macicy, jak i od błony chorionowej. Następnie przenieś łożysko wraz z przylegającymi tkankami błoniowymi do nowej szalki Petriego zawierającej od 3 do 5 ml PBS. Przenieś płód do drugiej szalki Petriego z PBS i za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami delikatnie oddziel biało-szarą tkankę błoniową z powierzchni łożyska.Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć integralności tkanek łożyska i ECI. Podzielić tkanki łożyska oraz ECI do dwóch osobno oznakowanych szalek Petri wypełnionych PBS. Następnie, używając pęsety z cienkim końcem, delikatnie usunąć ścianę macicy z błony nuchalno-allantoicznej i umieścić te tkanki macicy w nowej szalce Petri wypełnionej PBS w celu mechanicznej dysocjacji tkanek.Następnie przenieś od 100 do 150 mg tkanek tarcz macicznych oraz łożyska do oddzielnie oznakowanych probówek stożkowych o pojemności 2 mL. Do każdej probówki dodaj 500 µL schłodzonego roztworu enzymatycznego nr 1. Następnie, używając sterylnych nożyczek, mechanicznie rozdrabniaj każdą z tkanek nie dłużej niż przez dwie minuty, aż do uzyskania zawiesiny.Do momentu uzyskania mlecznego wyglądu. Do każdej probówki należy dodać kolejne 500 µL zimnego roztworu enzymatycznego, a następnie umieścić probówki w lodzie. Następnie wszystkie tkanki należy inkubować w temperaturze 37 °C przy łagodnym wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 80 RPM, przenosząc probówki do lodu po 30 do 35 minutach w celu przerwania trawienia.Następnie przefiltruj każdą zawiesinę tkankową przez sito o oczkach 100 µm do oddzielnie oznakowanych probówek stożkowych o pojemności 50 ml i przemyj każdą probówkę oraz sito dwa do trzech razy 20 ml PBS, aby zebrać wszystkie komórki. Po przefiltrowaniu wszystkich komórek odwiruj je i ostrożnie odessij nadsącz, nie naruszając osadów. Delikatnie resuspenduj wyizolowane leukocyty i komórki zrębu w 1 ml pożywki RPMI, nie używając wirówki vortex.Następnie dla każdej tkanki należy dodać 500 µL płodowej surowicy bydlęcej do polistyrenowej probówki o pojemności 5 mL i powoli nanieść zawiesinę komórkową na surowicę. Po naniosieniu wszystkich komórek należy je odwirować bez przerwy, a następnie odessać nadsącz, nie dotykając osadów komórkowych. Na tych obrazach przedstawiono morfologię makrofagów dodatnich pod kątem F4/80 wyizolowanych z tkanek błony podstawnej łożyska i macicy.W 16,5 dniu po poczęciu przedstawiono komórki z tkanek zarówno z interfejsu macierzyńskiego, jak i płodowego. Wykazują one żywotność przekraczającą 70% po izolacji tą metodą i zawierają populacje neutrofili, makrofagów, limfocytów T, komórek NK oraz komórek dendrytycznych, z wysokim udziałem makrofagów koekspresujących CD 11 C. Subpopulacje leukocytów izolowane z tkanek na granicy macierzyńsko-płodowej obejmują również limfocyty B, limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+ oraz limfocyty T CD3+ CD4- CD8-, co zostało zaobserwowane na tym wykresie gęstości.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o utrzymywaniu tkanek i koktajlu enzymatycznego w lodzie, ustawieniu odpowiedniej temperatury w inkubatorze oraz o unikaniu nadmiernej manipulacji tkankami podczas trawienia zgodnie z tą procedurą. Można przeprowadzić inne metody, takie jak immunofenotypowanie, hodowla komórek, sortowanie komórek oraz izolacja DNA/RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować leukocyty naciekające w obrębie macierzyno-płodowego interfejsu, macicy oraz łożyska.

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano szybką metodę pozyskiwania leukocytów naciekających mózg myszy. Metoda ta wykorzystuje ciągły gradient Percoll oraz nieciągły gradient Ficoll w celu wyselekcjonowania i oczyszczenia warstwy wzbogaconej w leukocyty. Wyizolowane leukocyty mogą być następnie scharakteryzowane za pomocą pomiarów cytometrycznych.

Izolacja leukocytów naciekających mózg

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

W tym filmie pokazujemy izolację leukocytów wątrobowych z wątroby myszy za pomocą wymuszonej perfuzji.

Izolacja marginesujących leukocytów wątrobowych z wątroby myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Naucz się izolacji leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej. Ta metoda obejmuje rozdrabnianie mechaniczne, trawienie enzymatyczne i separację gradientową, zachowując markery powierzchniowe komórek.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Przeglądaj więcej filmów