Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych
22 lipca 2015
Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zobrazowanie i zbadanie właściwości fizycznych membran rozdzielających fazy za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez pierwsze zmieszanie dilio, fosfatydylocholiny, fgo, mieliny i cholesterolu w stosunku dwa do dwóch do jednego, aby utworzyć mieszaninę lipidów rozdzielających fazy. Następnie podtrzymujące dwuwarstwy lipidowe są przygotowywane przez osadzenie zawiesiny liposomów na powierzchni MICA za pomocą mikroskopii sił atomowych.
Powierzchnia dwuwarstwy jest następnie skanowana, tworząc obraz topograficzny, na którym można zmierzyć cechy strukturalne, takie jak wysokość. Następnie spektroskopia sił jest wykonywana na określonych obszarach dwuwarstwy w celu zbadania właściwości fizycznych dwuwarstwy, w szczególności siły przebicia i grubości membrany. Ostatecznie wyniki pokazują różnice we właściwościach między różnymi fazami lipidowymi w oparciu o obrazy FM i krzywe sił.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest wzrost rozdzielczości i dodatkowych właściwości, które FM może sondować na próbce. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biofizyki, takie jak budowa błon biologicznych i białek osadzonych na takich błonach. Co więcej, możemy również przyjrzeć się właściwościom fizycznym membrany i monitorować, w jaki sposób zmiany w składzie lub dodatkowych membranowych środkach aktywnych mogą zmienić te właściwości.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności ze względu na delikatną naturę próbki. Ma to wpływ na przygotowanie próbki, obsługę, wybór wsporników oraz warunki obrazowania i spektroskopii FM Rozpocznij od rozpuszczenia DOPC, spino, mieliny i cholesterolu w chloroformie w pożądanych stężeniach. Następnie połącz 18,38 mikrolitrów DOPC, 17,1 mikrolitrów mieliny i 11,3 mikrolitrów cholesterolu, aby uzyskać roztwór z jednym miligramem lipidów ogółem i stosunkiem molowym odpowiednio dwa do dwóch do jednego.
Wymieszaj roztwór przez wirowanie, wysusz mieszaninę za pomocą gazu obojętnego, takiego jak azot, a następnie wysusz ją dalej w próżni przez co najmniej jedną godzinę. Następnie rozpuść wysuszone lipidy w 100 mikrolitrach PBS do stężenia 10 miligramów na mililitr. Energicznie mieszać do mieszania przez około minutę.
Aby uzyskać mętną zawiesinę zawierającą wiele pęcherzyków laminarnych. Upewnić się, że po bokach fiolki nie pozostały żadne warstwy lipidowe. Weź 10 mikrolitrów wielowarstwowej zawiesiny lipidowej i dodaj 150 mikrolitrów wspieranego buforu dwuwarstwowego lipidów.
Następnie wymieszaj roztwór i przenieś go do małej szklanej fiolki z dwumililitrową nakrętką i zamknij ją sonikatem para filmowym. Mieszaninę w temperaturze pokojowej w kąpieli sonikować przez 10 minut. W tym czasie roztwór powinien stać się klarowny i wytworzy małe uni lub pęcherzyki o średnicy około 50 nanometrów.
Umyj szkiełka szklanej pokrywy w wodzie, a następnie w etanolu, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie weź krążki Micheasza i odklej zewnętrzną warstwę za pomocą taśmy klejącej. Przymocuj krążek MICA do szkiełka nakrywkowego za pomocą kropli przezroczystego kleju optycznie.
Następnie przymocuj plastikowe butle do MICA za pomocą smaru próżniowego i upewnij się, że nie ma wycieków. Wylej cały roztwór liposomu bezpośrednio na mikę i dodaj dodatkowe 140 mikrolitrów wspieranego dwuwarstwowego buforu lipidowego, aby osiągnąć objętość 300 mikrolitrów. Następnie dodaj 0,9 mikrolitra jednego molowego roztworu chlorku wapnia, aby osiągnąć końcowe stężenie trzech milimoli wapnia, inkubuj próbki przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przez co najmniej 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza na tym etapie, podgrzej również podparty bufor dwuwarstwy lipidowej do 65 stopni Celsjusza.
W razie potrzeby dodać bufor, aby upewnić się, że próbka nie wyschnie. Przykrycie komory na próbkę szkiełkiem nakrywkowym również utrzyma próbkę w stanie uwodnienia. Następnie delikatnie przepłukać próbkę wstępnie podgrzanym lipidem za pomocą buforu warstwowego 10 do 15 razy, aby usunąć wapń i niestopione pęcherzyki.
Zachowaj szczególną ostrożność podczas etapów prania, aby dwuwarstwa nigdy nie wyschła po etapach prania. Schłodzić podparte dwuwarstwy do temperatury pokojowej. Przed pomiarami na mikroskopie sił atomowych należy ustawić mikroskop sił atomowych lub FM, aby wykonać obrazowanie dwuwarstw lipidowych w roztworze.
Korzystając z trybu kontaktowego zgodnie ze specyfikacją producenta, dodaj bufor do próbki, aby pozostała zanurzona w buforze przez cały czas trwania eksperymentu. Zamontuj próbkę na stoliku A FM i upewnij się, że wszystkie moduły izolacji drgań są włączone. Odczekaj co najmniej 15 minut, aż system się zrównoważy i zmniejszy dryft termiczny.
Następnie zbliż się do próbki w trybie kontaktowym za pomocą miękkiej końcówki wspornikowej FM, aż do nawiązania kontaktu. Ponieważ dwuwarstwy są bardzo delikatne, zminimalizuj wartość zadaną końcówki A FM podczas obrazowania w trybie kontaktowym, aby utrzymać siłę na minimalnym poziomie i skorygować dryft termiczny przy jednoczesnym utrzymaniu kontaktu z próbką. Po zakończeniu obrazowania przetwarzaj obrazy, dopasowując każdą linię skanowania do funkcji wyrównywania wielomianów.
Wykonaj usuwanie linii w przypadku skanów, które tracą kontakt z membraną. Korzystając z zastrzeżonego oprogramowania firmy produkcyjnej A FM, skalibruj wspornik, postępując zgodnie z protokołem producenta, w celu określenia prawidłowej konwersji sygnału elektrycznego na pomiar siły. Po zobrazowaniu obszaru dwuwarstwy wybierz obszar o wymiarach pięć mikronów na pięć mikronów w dwuwarstwie, aby wykonać spektroskopię sił.
Ustaw AFM tak, aby pobierał krzywe siły w siatce 16 na 16 tego obszaru, co daje 256 krzywych sił na region. Następnie ustaw przemieszczenie Z piso na 400 nanometrów. Określa to maksymalny zakres ruchu piezoelektrycznego i zapewnia, że wspornik całkowicie odsunął się od próbki między pomiarami.
Następnie ustaw prędkość podejścia na 800 nanometrów na sekundę, a prędkość cofania na 200 nanometrów na sekundę. Ustaw również maksymalną siłę docelową dla każdej krzywej siły, w tym przypadku 12 nanoniutonów. Po ustawieniu wszystkich parametrów uzyskaj krzywe siły, naciskając przycisk uruchamiania w oprogramowaniu A FM.
Uzyskaj co najmniej 500 krzywych sił dla każdego warunku, aby zapewnić dobre statystyki, wykreśl histogram wartości, a następnie dopasuj histogramy do rozkładu Gaussa, aby uzyskać szczyt i szerokość rozkładu. Ze względu na skład lipidowy w tym badaniu powstają dwa główne regiony błony. Istnieje region uporządkowany płynem, który składa się z fingu, mieliny i cholesterolu, oraz nieuporządkowany region płynny, który składa się głównie z DOPC.
Profil wysokości z obrazowania A FM może dostarczyć ważnych informacji na temat struktury membrany, patrząc na profil wysokości. Grubość dwuwarstwy można zmierzyć, wykorzystując obecność wad membrany. Mapa wysokości może być również wykorzystana do pomiaru różnicy wysokości między fazami uporządkowanymi i nieuporządkowanymi.
Krzywe siły wyprowadzone z trybu spektroskopii sił służą do pomiaru siły przebicia poprzez obliczenie wartości siły na szczycie krzywej siły, jak pokazano tutaj. Ponadto grubość membrany można wyznaczyć, odejmując wartość odległości od szczytu krzywej siły do wartości odległości. Kiedy krzywa siły zaczyna ponownie rosnąć, Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby zachować roztwór warstwy B i stale monitorować montaż FM, aby skorygować wpływ dryfu termicznego i akumulacji D na końcówce Postępując zgodnie z tą procedurą.
Inne metody, takie jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak dynamika błony. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować się do pracy z warstwami i użyć FM do obrazowania i badania właściwości fizycznych tych dwuwarstw
.Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół przygotowania wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz charakteryzacji ich struktury i właściwości mechanicznych przy użyciu mikroskopii sił atomowych (AFM). Metoda ta umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz spektroskopię sił w celu zbadania podstruktur błonowych, ich grubości oraz siły przebicia, dostarczając informacji na temat właściwości fizycznych biologicznych błon ulegających separacji fazowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Biologia błon
- Skaningowa mikroskopia sił atomowych
Wprowadzenie
- AFM jest techniką obrazowania o wysokiej rozdzielczości, która umożliwia wizualizację błon biologicznych na poziomie molekularnym.
- Wsparte dwuwarstwy lipidowe służą jako systemy modelowe do badania struktury i mechaniki błon.
- Właściwości mechaniczne i chemiczne błon są kluczowe dla procesów komórkowych, takich jak homeostaza i stabilizacja kompleksów białkowych.
- AFM pozwala na pomiar zarówno topografii, jak i właściwości mechanicznych, przewyższając możliwości mikroskopii fluorescencyjnej.
Cel badania
- Zaprezentowanie sposobu przygotowania wspieranych lipidowych dwuwarstw odpowiednich do analizy AFM.
- Charakterystyka struktury, grubości i właściwości mechanicznych błony za pomocą obrazowania AFM oraz spektroskopii sił.
- Porównanie właściwości fizycznych różnych faz lipidowych w obrębie dwuwarstwy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie rozdzielających się fazowo mieszanin lipidowych (DOPC, sfingomielina, mielina, cholesterol) w określonych proporcjach.
- Tworzenie małych pęcherzyków jednowarstwowych poprzez sonikację i osadzanie ich na podłożach z miki.
- Tworzenie wspieranych lipidowych dwuwarstw oraz dokładne przemywanie w celu usunięcia nadmiaru pęcherzyków i wapnia.
- Obrazowanie AFM w trybie kontaktowym w celu uzyskania map topograficznych i pomiaru grubości dwuwarstwy.
- Spektroskopia sił z użyciem AFM w celu określenia siły przebicia oraz grubości błony w różnych obszarach.
Główne wyniki
- Obrazowanie AFM ujawnia odrębne regiony błony odpowiadające fazom uporządkowanej i nieuporządkowanej cieczy.
- Profile wysokości umożliwiają pomiar grubości dwuwarstwy oraz różnic między fazami.
- Spektroskopia sił dostarcza ilościowych danych na temat siły przebicia oraz właściwości mechanicznych błony.
- Histogramy pomiarów siły umożliwiają analizę statystyczną właściwości błony w różnych warunkach.
Wnioski
- AFM jest potężnym narzędziem do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i charakterystyki mechanicznej wspieranych dwuwarstw lipidowych.
- Protokół ten umożliwia rozróżnienie faz błonowych oraz kwantyfikację ich właściwości fizycznych.
- Podejście to poszerza zrozumienie zależności między strukturą a funkcją błon, które są istotne dla procesów komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz spektroskopia sił w odniesieniu do wspieranych dwuwarstw lipidowych dostarczają wysokorozdzielczych, ilościowych informacji na temat struktury i mechaniki błon, co bezpośrednio wspiera wczesną walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Możliwości te pozwalają zespołom biofarmaceutycznym na analizę celów związanych z błonami, ocenę wpływu składu lipidowego oraz zwiększenie pewności prognostycznej w badaniach nad białkami błonowymi. Integracja danych pochodzących z AFM na etapie odkrywania leków usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfela projektów poprzez redukcję niejednoznaczności w hipotezach terapeutycznych skierowanych na błony.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośredni pomiar grubości błony i siły przebicia w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie uporządkowanych i nieuporządkowanych faz błony.
- Dostarcza danych ilościowych pozwalających wyjaśnić wpływ składu lipidowego na właściwości błony.
- Ułatwia testowanie hipotez dotyczących interakcji i stabilności białek błonowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne i ilościowe wyniki dotyczące właściwości mechanicznych błon w różnych warunkach.
- Ustanawia zwalidowane systemy modelowe do późniejszego przesiewania związków celujących w komponenty błonowe.
- Umożliwia standaryzację warunków analizy w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wspiera skalowalność poprzez generowanie statystycznie istotnych zbiorów danych z siatek spektroskopii sił.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie biofizycznych właściwości błony do modeli istotnych dla danej choroby podczas badania czynników aktywnych w obrębie błony.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w przypadku modalności ukierunkowanych na błony.
- Umożliwia postęp w badaniach z uwzględnieniem oceny ryzyka poprzez kwantyfikację wpływu związków kandydujących na integralność błony.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie właściwości mechanicznych z efektami funkcjonalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Obrazowanie AFM i spektroskopia sił w odniesieniu do wspieranych dwuwarstw lipidowych wpisują się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących związków, dostarczając fundamentalnych danych dla programów ukierunkowanych na błony komórkowe.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe pomiary siły i grubości wspierają weryfikację hipotez i wyjaśnianie mechanizmów.
- Screening: Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości i mapowanie sił umożliwiają przygotowanie testów oraz zapewnienie ich powtarzalności.
- Analityka: Analiza statystyczna krzywych siły i profili wysokości ułatwia porównywanie warunków i podejmowanie decyzji.
- Badania translacyjne: Dane dotyczące właściwości mechanicznych pomagają w wyborze modelu przedklinicznego i dopasowaniu biomarkerów, gdy jest to istotne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Procedura AFM jest adaptowalna do różnych systemów błonowych i może być stosowana w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach ukierunkowanych na błony komórkowe.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiary właściwości błon i wspiera powtarzalność wyników między zespołami.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka w przypadku celów we wczesnej fazie badań.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój aktywów koncentrujących się na błonach komórkowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze AFM oraz w biofizyce błon.
- Wymaga dostępu do wysokorozdzielczej aparatury AFM oraz oprogramowania analitycznego.
- Konieczne jest stosowanie rygorystycznych protokołów przygotowania i obchodzenia się z próbkami w celu zachowania integralności dwuwarstwy.
- Korzystna jest międzyzespołowa standaryzacja parametrów obrazowania i spektroskopii sił.
- Kruchość próbek oraz dryft termiczny to ograniczenia praktyczne, które muszą być kontrolowane podczas eksperymentów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
2:01
Preparation of Multilamellar and Unilamellar Vesicle Suspensions
3:42
Deposition of Unilamellar Vesicles on Solid Support
5:34
Atomic Force Microscopy Imaging
6:52
Force Spectroscopy
8:22
Results: Supported Lipid Bilayer Analysis Using AFM and Force Spectroscopy
9:28
Conclusion
