Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zobrazowanie i zbadanie właściwości fizycznych membran rozdzielających fazy za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez pierwsze zmieszanie dilio, fosfatydylocholiny, fgo, mieliny i cholesterolu w stosunku dwa do dwóch do jednego, aby utworzyć mieszaninę lipidów rozdzielających fazy. Następnie podtrzymujące dwuwarstwy lipidowe są przygotowywane przez osadzenie zawiesiny liposomów na powierzchni MICA za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Powierzchnia dwuwarstwy jest następnie skanowana, tworząc obraz topograficzny, na którym można zmierzyć cechy strukturalne, takie jak wysokość. Następnie spektroskopia sił jest wykonywana na określonych obszarach dwuwarstwy w celu zbadania właściwości fizycznych dwuwarstwy, w szczególności siły przebicia i grubości membrany. Ostatecznie wyniki pokazują różnice we właściwościach między różnymi fazami lipidowymi w oparciu o obrazy FM i krzywe sił.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest wzrost rozdzielczości i dodatkowych właściwości, które FM może sondować na próbce. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biofizyki, takie jak budowa błon biologicznych i białek osadzonych na takich błonach. Co więcej, możemy również przyjrzeć się właściwościom fizycznym membrany i monitorować, w jaki sposób zmiany w składzie lub dodatkowych membranowych środkach aktywnych mogą zmienić te właściwości.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności ze względu na delikatną naturę próbki. Ma to wpływ na przygotowanie próbki, obsługę, wybór wsporników oraz warunki obrazowania i spektroskopii FM Rozpocznij od rozpuszczenia DOPC, spino, mieliny i cholesterolu w chloroformie w pożądanych stężeniach. Następnie połącz 18,38 mikrolitrów DOPC, 17,1 mikrolitrów mieliny i 11,3 mikrolitrów cholesterolu, aby uzyskać roztwór z jednym miligramem lipidów ogółem i stosunkiem molowym odpowiednio dwa do dwóch do jednego.

Wymieszaj roztwór przez wirowanie, wysusz mieszaninę za pomocą gazu obojętnego, takiego jak azot, a następnie wysusz ją dalej w próżni przez co najmniej jedną godzinę. Następnie rozpuść wysuszone lipidy w 100 mikrolitrach PBS do stężenia 10 miligramów na mililitr. Energicznie mieszać do mieszania przez około minutę.

Aby uzyskać mętną zawiesinę zawierającą wiele pęcherzyków laminarnych. Upewnić się, że po bokach fiolki nie pozostały żadne warstwy lipidowe. Weź 10 mikrolitrów wielowarstwowej zawiesiny lipidowej i dodaj 150 mikrolitrów wspieranego buforu dwuwarstwowego lipidów.

Następnie wymieszaj roztwór i przenieś go do małej szklanej fiolki z dwumililitrową nakrętką i zamknij ją sonikatem para filmowym. Mieszaninę w temperaturze pokojowej w kąpieli sonikować przez 10 minut. W tym czasie roztwór powinien stać się klarowny i wytworzy małe uni lub pęcherzyki o średnicy około 50 nanometrów.

Umyj szkiełka szklanej pokrywy w wodzie, a następnie w etanolu, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie weź krążki Micheasza i odklej zewnętrzną warstwę za pomocą taśmy klejącej. Przymocuj krążek MICA do szkiełka nakrywkowego za pomocą kropli przezroczystego kleju optycznie.

Następnie przymocuj plastikowe butle do MICA za pomocą smaru próżniowego i upewnij się, że nie ma wycieków. Wylej cały roztwór liposomu bezpośrednio na mikę i dodaj dodatkowe 140 mikrolitrów wspieranego dwuwarstwowego buforu lipidowego, aby osiągnąć objętość 300 mikrolitrów. Następnie dodaj 0,9 mikrolitra jednego molowego roztworu chlorku wapnia, aby osiągnąć końcowe stężenie trzech milimoli wapnia, inkubuj próbki przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przez co najmniej 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza na tym etapie, podgrzej również podparty bufor dwuwarstwy lipidowej do 65 stopni Celsjusza.

W razie potrzeby dodać bufor, aby upewnić się, że próbka nie wyschnie. Przykrycie komory na próbkę szkiełkiem nakrywkowym również utrzyma próbkę w stanie uwodnienia. Następnie delikatnie przepłukać próbkę wstępnie podgrzanym lipidem za pomocą buforu warstwowego 10 do 15 razy, aby usunąć wapń i niestopione pęcherzyki.

Zachowaj szczególną ostrożność podczas etapów prania, aby dwuwarstwa nigdy nie wyschła po etapach prania. Schłodzić podparte dwuwarstwy do temperatury pokojowej. Przed pomiarami na mikroskopie sił atomowych należy ustawić mikroskop sił atomowych lub FM, aby wykonać obrazowanie dwuwarstw lipidowych w roztworze.

Korzystając z trybu kontaktowego zgodnie ze specyfikacją producenta, dodaj bufor do próbki, aby pozostała zanurzona w buforze przez cały czas trwania eksperymentu. Zamontuj próbkę na stoliku A FM i upewnij się, że wszystkie moduły izolacji drgań są włączone. Odczekaj co najmniej 15 minut, aż system się zrównoważy i zmniejszy dryft termiczny.

Następnie zbliż się do próbki w trybie kontaktowym za pomocą miękkiej końcówki wspornikowej FM, aż do nawiązania kontaktu. Ponieważ dwuwarstwy są bardzo delikatne, zminimalizuj wartość zadaną końcówki A FM podczas obrazowania w trybie kontaktowym, aby utrzymać siłę na minimalnym poziomie i skorygować dryft termiczny przy jednoczesnym utrzymaniu kontaktu z próbką. Po zakończeniu obrazowania przetwarzaj obrazy, dopasowując każdą linię skanowania do funkcji wyrównywania wielomianów.

Wykonaj usuwanie linii w przypadku skanów, które tracą kontakt z membraną. Korzystając z zastrzeżonego oprogramowania firmy produkcyjnej A FM, skalibruj wspornik, postępując zgodnie z protokołem producenta, w celu określenia prawidłowej konwersji sygnału elektrycznego na pomiar siły. Po zobrazowaniu obszaru dwuwarstwy wybierz obszar o wymiarach pięć mikronów na pięć mikronów w dwuwarstwie, aby wykonać spektroskopię sił.

Ustaw AFM tak, aby pobierał krzywe siły w siatce 16 na 16 tego obszaru, co daje 256 krzywych sił na region. Następnie ustaw przemieszczenie Z piso na 400 nanometrów. Określa to maksymalny zakres ruchu piezoelektrycznego i zapewnia, że wspornik całkowicie odsunął się od próbki między pomiarami.

Następnie ustaw prędkość podejścia na 800 nanometrów na sekundę, a prędkość cofania na 200 nanometrów na sekundę. Ustaw również maksymalną siłę docelową dla każdej krzywej siły, w tym przypadku 12 nanoniutonów. Po ustawieniu wszystkich parametrów uzyskaj krzywe siły, naciskając przycisk uruchamiania w oprogramowaniu A FM.

Uzyskaj co najmniej 500 krzywych sił dla każdego warunku, aby zapewnić dobre statystyki, wykreśl histogram wartości, a następnie dopasuj histogramy do rozkładu Gaussa, aby uzyskać szczyt i szerokość rozkładu. Ze względu na skład lipidowy w tym badaniu powstają dwa główne regiony błony. Istnieje region uporządkowany płynem, który składa się z fingu, mieliny i cholesterolu, oraz nieuporządkowany region płynny, który składa się głównie z DOPC.

Profil wysokości z obrazowania A FM może dostarczyć ważnych informacji na temat struktury membrany, patrząc na profil wysokości. Grubość dwuwarstwy można zmierzyć, wykorzystując obecność wad membrany. Mapa wysokości może być również wykorzystana do pomiaru różnicy wysokości między fazami uporządkowanymi i nieuporządkowanymi.

Krzywe siły wyprowadzone z trybu spektroskopii sił służą do pomiaru siły przebicia poprzez obliczenie wartości siły na szczycie krzywej siły, jak pokazano tutaj. Ponadto grubość membrany można wyznaczyć, odejmując wartość odległości od szczytu krzywej siły do wartości odległości. Kiedy krzywa siły zaczyna ponownie rosnąć, Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby zachować roztwór warstwy B i stale monitorować montaż FM, aby skorygować wpływ dryfu termicznego i akumulacji D na końcówce Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak dynamika błony. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować się do pracy z warstwami i użyć FM do obrazowania i badania właściwości fizycznych tych dwuwarstw