Name: Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dwuwarstw lipidowych za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił. Technika ta umożliwia badanie struktury, grubości i właściwości mechanicznych błon biologicznych z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Towarzystwo Maxa Plancka, Niemieckie Centrum Badań nad Rakiem, Uniwersytet w Tybindze oraz Bundesministerium für Bildung und Forschung (grant nr 0312040).
Dziękujemy Eduardowi Hermannowi za pomoc w automatyzacji analizy danych z krzywej siły oraz dr Jakobowi Suckale za uważne przeczytanie tego manuskryptu.

1. Przygotowanie wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLB)11,12,21
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny lipidów i zawiesin pęcherzyków wielopłytkowych
	<ol>
		<li>Wcześniej przygotuj następujące.
		<ol>
			<li>Przygotować bufor PBS o stężeniach 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4 i 137 mM NaCl, pH 7,2.</li>
			<li>Przygotować bufor SLB (dwuwarstwowy podparty lipidem) o stężeniach 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.</li>
			<li>Przygotować roztwór 1 M CaCl2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozpuścić następujące lipidy w chloroformie w pożądanym stężeniu: na przykład di-oleoilo-fosfatydylocholina (DOPC) w stężeniu 25 mg/ml, sfingomielina (SM) w stężeniu 25 mg/ml i cholesterol (Chol) w stężeniu 10 mg/ml.</li>
		<li>Weź 18,38 μl DOPC, 17,10 μl SM i 11,30 μl Chol, aby uzyskać roztwór z 1 mg całkowitych lipidów w stosunku molowym 2:2:1 DOPC:SM:Chol. Odpowiednio zmienić objętości w zależności od stężeń lipidów przygotowanych w ppkt 1.1.2. Należy jednak utrzymać stosunek molowy na poziomie 2:2:1 DOPC:SM:Chol, ponieważ zmiana stosunku molowego zmieni charakterystykę fazową membrany25.</li>
		<li>Całkowicie wymieszaj roztwór przez wirowanie. Dodaj fluorescencyjny barwnik lipidowy o stężeniu 0,05% mol., jeśli chce się uwidocznić dwuwarstwę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. 
		Uwaga: Rodzina długołańcuchowych dialkilokarbocyjanin, takich jak DiD, DiI i DiO, obejmuje szeroki zakres długości fal i może być idealnie stosowana do znakowania błon lipidowych. Alternatywnie można zastosować fluorescencyjnie znakowane lipidy, takie jak rodamina-fosfatydyloetanoloamina lub BODIPY-cholesterol. W każdym przypadku stężenie barwnika powinno być zoptymalizowane zgodnie z ustawieniami mikroskopii, pamiętając, że wysokie stężenia fluoroforu związanego z lipidem mogą zmienić zachowanie lipidów19.</li>
		<li>Wysuszyć chloroform za pomocą gazuN2 (lub dowolnego dostępnego gazu obojętnego, takiego jak Ar i He).</li>
		<li>Dalej suszyć mieszaninę lipidów w próżni przez co najmniej 1 godz. 
		Uwaga: W przypadku przechowywania tej mieszaniny lipidów, należy przepłukać powietrze gazem obojętnym (N2, Ar lub He) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Nadmiar lipidów w chloroformie przelać do małych brązowych fiolek. Wysuszyć je w podobny sposób jak mieszaninę lipidów, wyprzeć powietrze gazem obojętnym (N2, Ar lub He) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Rozpuścić wysuszone lipidy w buforze PBS do stężenia 10 mg/ml.</li>
		<li>Energicznie mieszaj mieszaninę przez około 20 sekund do 1 minuty, aby uzyskać mętną zawiesinę zawierającą wieloblaszkowe pęcherzyki. Upewnij się, że do ścianek fiolki nie przyklejają się filmy lipidowe.</li>
		<li>Rozprowadzić tę zawiesinę na 10 μl podwielokrotności (1 mg lipidu daje 10 podwielokrotności).</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pęcherzyków jednowarstwowych 
	Uwaga: Różne rozmiary pęcherzyków jednowarstwowych można przygotować metodą sonikacji lub metodą ekstruzji. Sonikacja wykorzystuje energię dźwięku do mieszania mieszaniny i oddzielania warstw zawiesiny wielopłytkowej. Wskazuje na to usunięcie zamglonej zawiesiny. Wytłaczanie zmusza pęcherzyki wieloblaszkowe do przejścia przez filtr membranowy o określonej wielkości porów.
	<ol>
		<li>Metoda sonikacji
		<ol>
			<li>Pobrać 10 μl multilamelarnych zawiesin lipidowych i dodać 150 μl buforu SLB.</li>
			<li>Przenieść mieszaninę do małych (2 ml) szklanych fiolek z nakrętką i zamknąć Parafilmem.</li>
			<li>Sonikować mieszaninę w temperaturze pokojowej w kąpieli sonikatora przez 10 minut lub do momentu, gdy stanie się jasne, aby uzyskać małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV, o średnicy poniżej 50 nm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Metoda wytłaczania
		<ol>
			<li>Pobrać 10 μl multilamelarnych zawiesin lipidowych i dodać 150 μl buforu SLB.</li>
			<li>Przenieść zawiesinę do probówki kriogenicznej.</li>
			<li>Zamrozić zawiesinę lipidową, zanurzając rurkę kriogeniczną na kilka sekund w ciekłym azocie.</li>
			<li>Rozmrozić zawiesinę lipidową, zanurzając rurkę kriogeniczną w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej lub 37 °C na kilka minut. Powtórz kroki zamrażania i rozmrażania co najmniej 10 razy.</li>
			<li>Aby wytłoczyć zawiesinę lipidową, należy użyć membrany poliwęglanowej o wielkości porów 200 nm (dostępne są inne rozmiary porów, takie jak 100 nm lub 400 nm) oraz komercyjnego urządzenia do wytłaczania26, 
			Uwaga: Obecnie na rynku dostępne są dwa urządzenia wytłaczające: wytłaczarka ręczna jest dostępna dla małych objętości (od 200 μl do kilku ml). W takim przypadku próbka jest wytłaczana przez membranę poprzez ręczne popychanie zawiesiny tam iz powrotem między dwiema strzykawkami. W zależności od producenta, podwielokrotności lipidów musiałyby zostać połączone, aby osiągnąć minimalną objętość zestawu. W przypadku większych objętości (do 50 ml) stosuje się bardziej wyrafinowane urządzenia, w których zawiesina jest przetłaczana przez membranę poliwęglanową za pomocą sprężonego gazu. Warunki ustawiania i wytłaczania mogą się zmieniać w zależności od modelu. Przed użyciem należy zapoznać się z instrukcją producenta. Protokół ten odnosi się do ręcznej wytłaczarki dla małych objętości.</li>
			<li>Zrównoważ wytłaczarkę w wodzie, przepuszczając wodę przez wytłaczarkę. Zanurz membranę w wodzie.</li>
			<li>Umieść membranę między dwoma tłokami, zmontuj urządzenie i zrównoważ w buforze, przepuszczając bufor przez wytłaczarkę, z jednej strzykawki do drugiej. Ten krok pozwala dodatkowo przetestować szczelność układu. Jeśli przecieka, zdemontuj go i ponownie zmontuj, zmieniając membranę.</li>
			<li>Zawiesinę lipidową pobrać za pomocą jednej strzykawki ekstrudera ("brudna strona").</li>
			<li>Umieścić strzykawkę zawierającą zawiesinę lipidów w jednej komorze, a pustą strzykawkę w przeciwległej komorze.</li>
			<li>Wcisnąć strzykawkę na jeden koniec. Przepuścić roztwór przez membranę i do przeciwległej strzykawki. To jest 1przejazd.</li>
			<li>Przepuścić go przez membranę w sumie 31 razy, tak aby roztwór znalazł się na przeciwległej strzykawce ("czysta strona"). 
			Uwaga: Sprawdź membranę po wytłaczaniu. Jeśli został uszkodzony, oznacza to, że proces wytłaczania nie powiódł się i należy go powtórzyć.</li>
			<li>Opróżnij strzykawkę do małej tubki. Duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) są stabilne przez 1-2 dni, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie miki i szkiełek nakrywkowych
	<ol>
		<li>Szkiełka nakrywkowe umyć najpierw w wodzie, a następnie w etanolu. Suszyć na powietrzu.</li>
		<li>Weź krążki miki i odklej zewnętrzną warstwę za pomocą taśmy klejącej.</li>
		<li>Przymocuj krążek miki do szkiełka nakrywkowego. Przezroczyste kleje optyczne są optymalne, aby można było sprawdzić dwuwarstwy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Przymocuj plastikowe cylindry (2.5 cm średnicy zewnętrznej, 2 cm średnicy wewnętrznej i 0.5 cm wysokości) za pomocą kleju/smaru optycznego. Upewnij się, że wszystko jest uszczelnione i że nie ma wycieków. Użyj smaru, gdy chcesz ponownie użyć cylindrów, ponieważ można je łatwo odłączyć od szkiełka nakrywkowego i umyć. Wymiary butli z tworzywa sztucznego zależą od wielkości uchwytu wspornika AFM i powinny być odpowiednio dostosowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie się pęcherzyków jednopłytkowych na solidnym podłożu
	<ol>
		<li>Odpipetuj cały roztwór liposomu bezpośrednio na mikę. Dodaj więcej bufora SLB, aby osiągnąć objętość 300 μl.</li>
		<li>Dodać 0,9 μl 1 M roztworu chlorku wapnia, aby osiągnąć końcowe stężenie 3 mM Ca2+.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut. Zawsze przykrywać dwuwarstwy buforem. Kontakt z powietrzem i pęcherzykami powietrza zniszczy go. Podczas inkubacji w razie potrzeby dodać więcej buforu, zwłaszcza w przypadku inkubacji w wyższych temperaturach. 
		Uwaga: Temperatury inkubacji różnią się w zależności od wymaganych mieszanin lipidów i faz. Do uformowania podpartych dwuwarstw potrzebny jest czas inkubacji wynoszący co najmniej 10 minut, ale może być dłuższy, w zależności od temperatury i składu.</li>
		<li>Przemyć dwuwarstwę gorącym (65 °C) buforem SLB 15-20 razy, aby usunąć wapń i niezrośnięte pęcherzyki. Zachowaj szczególną ostrożność podczas etapów prania, aby utrzymać dwuwarstwę pod buforem i delikatnie odpipetuj roztwór myjący, aby uniknąć zniszczenia dwuwarstwy.</li>
		<li>Schłodzić podparte dwuwarstwy do temperatury pokojowej przed pomiarami AFM. Jest to potrzebne do uformowania różnych faz membrany, a także zminimalizowania dryfu termicznego w instrumencie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pomiary mikroskopii sił atomowych11,12
<ol>
	<li>Obrazowanie 
	Uwaga: Wykonaj obrazowanie mikroskopią sił atomowych w trybie kontaktowym lub w trybie stukania. Dwuwarstwy obsługiwane przez obraz w roztworze; Nie dopuścić do całkowitego odparowania roztworu, ponieważ spowoduje to zniszczenie dwuwarstw. Podobnie jak w przypadku pracy z buforem, należy przestrzegać środków ostrożności, aby upewnić się, że każda część AFM jest chroniona przed rozlaniem cieczy.
	<ol>
		<li>Wybierz miękki wspornik (zalecana jest stała sprężystości poniżej 0,2 N/m) i zamontuj go na AFM. Wybór sztywności wspornika jest bardziej krytyczny dla spektroskopii sił (i zostanie to omówione później).</li>
		<li>Zamontuj próbkę na stoliku AFM i upewnij się, że wszystkie moduły wibroizolacyjne są włączone. Odczekaj co najmniej 15 minut, aby zrównoważyć i zmniejszyć dryft termiczny systemu. W zależności od konfiguracji AFM, specyfikacje strojenia i obrazowania mogą się różnić. Zapoznaj się z instrukcją producenta.</li>
		<li>Zbliżyć się do próbki z końcówką AFM aż do kontaktu.</li>
		<li>Ponieważ dwuwarstwy lipidowe mają zwykle wysokość 4 nm, należy użyć zakresu Z urządzenia, który zapewni najwyższą rozdzielczość z (na przykład 1,5 μm).</li>
		<li>Wybierz region do zobrazowania. Aby uzyskać przegląd dwuwarstwy lipidowej, dobrym punktem wyjścia do obrazowania będzie obszar o wymiarach 50 μm x 50 μm lub 25 μm x 25 μm. Jeśli pojawią się mniejsze obiekty, można obrazować w mniejszych obszarach (10 μm x 10 μm lub 2 μm x 2 μm). Wybór obszaru obrazowania zależy również od zasięgu roboczego skanera piezoelektrycznego. W tym celu należy zapoznać się z instrukcją obsługi przyrządu.</li>
		<li>Ponieważ dwuwarstwy są bardzo delikatne, dostosuj nastawę końcówki AFM podczas obrazowania, aby utrzymać siłę na minimalnym poziomie i skorygować dryft termiczny, zachowując jednocześnie kontakt z próbką. W trybie kontaktowym zminimalizuj wartość zadaną. W trybie stukania zmaksymalizuj wartość zadaną.</li>
		<li>Przetwarzaj obrazy, dopasowując każdą linię skanowania do funkcji wyrównywania wielomianów. Wykonaj usuwanie linii w przypadku skanów, które tracą kontakt z membraną, za pomocą zastrzeżonego oprogramowania firmy produkcyjnej AFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spektroskopia sił
	<ol>
		<li>Skalibruj wspornik zgodnie z instrukcjami zgodnie z protokołem producenta. Kalibracja umożliwia konwersję sygnału elektrycznego fotodiod na siłę (rys. 1B).
		<ol>
			<li>Skalibruj czułość końcówki, aby zmierzyć ugięcie jako ruch z-piezoelektryczny (w jednostkach długości) zamiast sygnału elektrycznego w woltach. 
			Uwaga: AFM wykrywa zmiany w ugięciu wspornika za pomocą lasera odbitego z tyłu wspornika. Laser dociera do fotodiody, która może przestrzennie wykryć położenie plamki lasera. Zmiana ugięcia wspornika, gdy wygina się on w kontakcie z próbką, jest wykrywana przez tę fotodiodę jako "ugięcie pionowe" i to w jednostkach napięcia. Ponieważ wspornik jest poruszany przez z-piezo, odchylenie pionowe jest związane z ruchem w z-piezo. Stosunek odchylenia pionowego do ruchu z nazywany jest czułością i przekształca napięcie na odległość.</li>
			<li>Oblicz stałą sprężystości wspornika za pomocą metody częstotliwości szumu termicznego, zwykle włączonej do oprogramowania AFM. W tej metodzie należy wykreślić amplitudę drgań spowodowanych hałasem w odniesieniu do częstotliwości oscylacji, tworząc wykres gęstości widmowej mocy. Ten wykres pokaże szczyt wokół częstotliwości rezonansowej. Częstotliwość, w której amplituda jest największa, to częstotliwość rezonansowa. Zamontuj funkcję Lorentza wokół szczytu, aby automatycznie obliczyć stałą sprężystości przez oprogramowanie. Niektóre przydatne zasoby dla teorii metody szumu termicznego znajdują się w piśmiennictwie27-30.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po zobrazowaniu obszaru dwuwarstwy wybierz obszar 5 μm x 5 μm w dwuwarstwie, aby wykonać spektroskopię sił.</li>
		<li>Ustaw AFM tak, aby pobierał krzywe siły w siatce 16 x 16 tego obszaru. Daje to 256 krzywych sił na region. Przestrzeń między dwoma sąsiednimi punktami powinna być wystarczająca, aby obszar membrany badany przez jeden punkt pokrywał się z następnym punktem. Jest to zależne od promienia końcówki. Idealna byłaby odległość 100 nm między dwoma punktami. Podziel obszar 5 μm x 5 μm na siatkę 16 x 16. W zależności od wielkości fazy można wybrać mniejszy lub większy region, a następnie odpowiednio dostosować rozmiar siatki.</li>
		<li>Ustaw przemieszczenie z-piezoelektryczne na 400 nm. Określa to maksymalny zakres ruchu z-piezo. Powinien być wystarczająco duży, aby upewnić się, że wspornik całkowicie odsunął się od próbki między pomiarami.</li>
		<li>Ustaw prędkość zbliżania na 800 nm/s i prędkość cofania na 200 nm/s. Użyj prędkości zbliżania od 400 do 6 000 nm/s w zależności od składu dwuwarstwowego i fazy lipidowej, która ma być badana6,16.</li>
		<li>Po ustawieniu wszystkich parametrów należy uzyskać krzywe siły, naciskając przycisk "uruchom" w oprogramowaniu AFM.</li>
		<li>Zapisz krzywe siły jako krzywe siły w funkcji wysokości (miara ruchu z-piezoelektrycznego). Nie uwzględnia to wygięcia wspornika w kontakcie z próbką. Na etapie przetwarzania danych oprogramowanie AFM umożliwia korektę zginania wspornika w celu uzyskania krzywych separacji siły w funkcji końcówki i próbki (rysunek 1C), które dadzą odpowiednie wartości grubości dwuwarstwy. Wartości korekcyjne są zwykle uwzględniane w kalibracji, która jest zapisywana przy każdej krzywej siły. Oblicz separację końcówka-próbka, odejmując odchylenie pionowe od ruchu piezoelektrycznego w danym punkcie. 
		Uwaga: Szczyt na krzywej siły zbliżającej (wartość siły spada, nawet jeśli ruch wspornika jest nadal w cyklu zbliżania) jest siłą przebijającą membrany, podczas gdy różnica między położeniem tego piku a położeniem punktu, w którym siła zaczyna ponownie rosnąć, zapewnia grubość membrany.</li>
		<li>Zdobądź co najmniej 500 krzywych siły dla każdego warunku, aby uzyskać dobre statystyki. Wykreśl histogram wartości za pomocą programów takich jak Origin lub MatLab i dopasuj histogramy do rozkładu Gaussa, aby uzyskać szczyt i szerokość rozkładu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy%3A+Application+to+Biology+and+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li>
<li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+of+biological+complexes%3A+What+can+we+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Curr%2C+Opin.+Colloid+In%22%5BJournal%5D)">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li>
<li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRedondo-Morata%2C+L+%22Atomic+Force+Microscopy+in+Liquid%3A+Biological+Applications%22">Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications</a>. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li>
<li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. </a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li>
<li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li>
<li>Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li>
<li>Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li>
<li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers%3A+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li>
<li>Butt, H. -J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601(2002).</li>
<li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li>
<li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide%3A+a+combined+AFM+and+FCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li>
<li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li>
<li>García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide%3A+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li>
<li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+future+of+scanning+probe+microscopy%3A+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques%2C+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+Systems%2C+Lipid+Rafts%2C+and+Cell+Membranes1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Bioph.+Biom%22%5BJournal%5D)">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rafts+defined%3A+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li>
<li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome%3A+classification%2C+preparation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102(2013).</li>
<li>Butt, H. -J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973(2000).</li>
<li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64(1998).</li>
<li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310(2005).</li>
<li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li>
<li>Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li>
<li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+physical+journal.+E%2C+Soft+matter%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li>
<li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li>
<li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li>
<li>Rigaud, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

SLB składające się z DOPC:SM:Chol (2:2:1) utworzono na miki po adsorpcji pęcherzyków i ich rozerwaniu indukowanym przez chlorek wapnia. Ten skład lipidowy uległ rozdzieleniu na fazy Ld i Lo. Faza Lo jest wzbogacona w sfingomielinę i cholesterol i jest mniej płynna/bardziej lepka (Rysunek 1A) niż faza Ld11. Rozdzielenie fazy Lo od Ld przejawia się pod postacią struktur kolistych wznoszących się ponad otoczenie (Rysunek 1B...

Mikroskopia sił atomowych (AFM) generuje obraz powierzchni poprzez skanowanie w poprzek obszaru próbki za pomocą wspornika z bardzo ostrą końcówką1. Ruch wspornika bada topologię powierzchni próbki. AFM jest szeroko stosowany do cząsteczek biologicznych - w tym białek, DNA i błon, ze względu na jego wszechstronność w analizie utrwalonych próbek w powietrzu lub w stanie zbliżonym do natywnego w cieczy2-5.
Oprócz możliwości obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zakresie nanometrów, wspornik AFM działa jak sprężyna do badania sił oddziaływania (adhezji i odpychania) oraz właściwości mechanicznych próbki5,6. Jest to znane jako spektroskopia sił. W tym trybie sonda najpierw zbliża się do próbki i wywiera na nią siłę, a następnie jest chowana, aż straci kontakt z próbką (rysunek 1A). Wygenerowane krzywe pokazują siłę w funkcji odległości wspornika zarówno dla zbliżania, jak i cofania. Można wyprowadzić kilka właściwości, w tym moduł sprężystości do pomiaru sztywności materiału i siły przyczepności.
Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe to błony modelu biologicznego leżące na solidnym podłożu - zwykle mika, szkło borokrzemianowe, stopiona krzemionka lub utleniony krzem7. Przygotowuje się je przy użyciu różnych technik, takich jak osadzanie pęcherzyków, metoda Langmuira-Blodgetta i powlekaniewirowe 8,9. Obrazowanie AFM zostało wykorzystane do śledzenia powstawania tych podpartych dwuwarstw10 i badania różnych struktur utworzonych przez błony o różnym składzie11-15.
Wykonanie spektroskopii sił na obsługiwanych dwuwarstwach powoduje pik na krzywej podejścia. Ten szczyt wskazuje siłę potrzebną do przebicia dwuwarstwy i nazywa się siłą przebicia. Grubość dwuwarstwy można również zmierzyć za pomocą krzywej siły6 . Typowa siła przebicia dwuwarstw mieści się w zakresie 1-50 nN6. Właściwości te zależą od upakowania lipidów (faza ciekła lub żelowa) i struktury (długość łańcucha acylowego i stopień nienasycenia) i są zmieniane przez środki czynne błonowo16. Teoria stojąca za pęknięciem została wyjaśniona17, a inne parametry eksperymentalne, takie jak miękkość wspornika, promień końcówki i prędkość zbliżania, również wpływają na siłę przebicia15,16,18. Spektroskopia sił została wykorzystana do analizy właściwości różnych faz lipidowych11,19, zmian zależnych od składu12,20, a także wpływu innych biomolekuł, takich jak peptydy, na stabilność błony21.
Płaska orientacja wspieranych dwuwarstw jest korzystna dla łączenia AFM z innymi metodami, takimi jak powierzchniowy rezonans plazmonów22 i mikroskopia fluorescencyjna11,19 w celu lepszego scharakteryzowania struktury i właściwości membran.
Ten szczegółowy protokół wideo ma na celu przygotowanie wspieranych dwuwarstw lipidowych za pomocą osadzania pęcherzyków i analizowanie ich za pomocą AFM i spektroskopii sił. Podczas gdy pęcherzyki o różnych rozmiarach mogą być używane do przygotowania dwuwarstw, protokół ten koncentruje się na małych i dużych pęcherzykach jednowarstwowych. Scharakteryzowano dwuwarstwy nośne, które rozdzielają fazę na fazę uporządkowaną cieczą (LO) i fazę nieuporządkowaną cieczą (LID)11,15. Błona składa się z di-oleoilo-fosfatydylocholiny (DOPC), sfingomieliny (SM) i cholesterolu (Chol) w stosunku 2:2:1. Kompozycja ta modeluje tratwy lipidowe, które mają zachowywać się jak platformy ważne dla transportu i sortowania białek, sygnalizacji komórkowej i innych procesów komórkowych23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Występuje w postaci liofilizowanego proszku w szczelnie zamkniętych fiolkach. Po otwarciu rozpuścić cały proszek w chloroformie. Przechowywać dodatkowe w postaci wysuszonych filmów lipidowych, w atmosferze obojętnej, w temperaturze -20&nbsp; &deg;C. Odwiedź stronę <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=artykuł& id=1679& Itemid=398">tutaj</a> aby uzyskać więcej informacji na temat przechowywania i obsługi.</td></tr><tr><td>Sfingomielina (mózg, świnia)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Występuje w postaci liofilizowanego proszku w dużych, szczelnie zamkniętych plastikowych pojemnikach. Po otwarciu rozpuścić szpatułkę z proszkiem w chloroformie. Przechowywać dodatkowe w postaci wysuszonych filmów lipidowych, w atmosferze obojętnej, w temperaturze -20&nbsp; &deg;C. Odwiedź <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=artykuł& id=1679& Itemid=398">tutaj</a> aby uzyskać więcej informacji na temat przechowywania i obsługi.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Występuje w postaci liofilizowanego proszku w dużych, szczelnie zamkniętych plastikowych pojemnikach. Po otwarciu rozpuścić szpatułkę z proszkiem w chloroformie. Przechowywać dodatkowe w postaci wysuszonych filmów lipidowych, w atmosferze obojętnej, w temperaturze -20&nbsp; &deg;C. Odwiedź <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=artykuł& id=1679& Itemid=398">tutaj</a> aby uzyskać więcej informacji na temat przechowywania i obsługi.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl), 99,8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan sodu (Na2HPO4), >99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2), klasa biologii molekularnej</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, klasa biologii molekularnej</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, 24&nbsp; x&nbsp; 60&nbsp; mm, 1&nbsp; mm grubości</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dziurkaczy i matryc</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Klej optyczny</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Płynny klej, który twardnieje po utwardzeniu w świetle UV o dużej długości fali.</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Mica blokuje</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>Są to kawałki miki o powierzchni co najmniej 1 cala kwadratowego i grubości od 0,006 cala do 0,016 cala. Są one przycinane przez firmę do określonego rozmiaru do wysyłki. Małe krążki miki można wykrawać z bloków miki za pomocą zestawu dziurkacza i matrycy.&nbsp; Zawsze obchodź się z miką w rękawiczkach lub pęsety.</td></tr><tr><td>Sprzęt laboratoryjny Smarownica</td><td>Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Wytłaczarka do liposomów</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>Jako alternatywę można również zapoznać się z ofertami Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-calowa)</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>Bez grzania, Częstotliwość: 35 kHz, Moc szczytowa ultradźwięków: 160 W, Moc HF: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">Karta katalogowa</a>)</td></tr><tr><td>Wspornik z azotku krzemu AFM&nbsp;</td><td>Sondy AFM firmy Bruker</td><td>DNP-10</td><td>Każdy wspornik ma cztery końcówki, a ich nominalny promień końcówki wynosi 20 nm (z możliwym maksimum przy 60&nbsp; nm). W oparciu o specyfikację stosujemy końcówkę D o częstotliwości rezonansowej 18 kHz i nominalnej stałej sprężystości 0,06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II zamontowany na Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Mikroskopia sił atomowych (AFM) to wszechstronna technika obrazowania o wysokiej rozdzielczości, która umożliwia wizualizację błon biologicznych. Ma wystarczające powiększenie, aby zbadać podstruktury błony, a nawet pojedyncze cząsteczki. AFM może działać jako sonda siły do pomiaru oddziaływań i właściwości mechanicznych membran. Dwuwarstwy lipidowe są konwencjonalnie stosowane jako modele błonowe w badaniach AFM. W tym protokole pokazujemy, jak przygotować podparte dwuwarstwy oraz scharakteryzować ich strukturę i właściwości mechaniczne za pomocą AFM. Należą do nich grubość dwuwarstwy i siła przebicia. 
Informacje dostarczane przez obrazowanie AFM i spektroskopię sił pomagają określić mechaniczne i chemiczne właściwości membran. Właściwości te odgrywają ważną rolę w procesach komórkowych, takich jak utrzymanie hemostazy komórkowej przed stresem środowiskowym, łączenie białek błonowych i stabilizacja kompleksów białkowych.

Wspierane dwuwarstwy lipidowe składające się z DOPC:SM:Chol (2:2:1) obrazowano za pomocą AFM (Rysunek 2 A-C). Ze względu na skład lipidowy zaobserwowano fazy Lo bogate w SM/Chol oraz fazy Ld bogate w DOPC. Profil wysokości uzyskany z obrazowania AFM może dostarczyć istotnych informacji o strukturze błony. Na podstawie profilu wysokości można zmierzyć grubość dwuwarstwy w obecności defektów w błonie (Rysunek 2B) lub określić różnicę wysokości między fazami Lo</s...

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obrazowanie i badanie właściwości fizycznych membran ulegających separacji faz za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez wstępne zmieszanie dilio, fosfatydylocholiny, fgo, mieliny i cholesterolu w stosunku dwa do dwóch do jednego, aby utworzyć lipidową mieszaninę ulegającą separacji faz. Następnie preparuje się wspierane dwuwarstwy lipidowe poprzez naniesienie zawiesiny liposomów na powierzchnię MICA z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych.Następnie skanowana jest powierzchnia dwuwarstwy, co pozwala na uzyskanie obrazu topograficznego, na którym można zmierzyć cechy strukturalne, takie jak wysokość. W dalszej kolejności przeprowadzana jest spektroskopia sił w określonych obszarach dwuwarstwy w celu zbadania jej właściwości fizycznych, przede wszystkim siły przebicia i grubości błony. Ostatecznie wyniki wykazują różnice w właściwościach pomiędzy poszczególnymi fazami lipidowymi na podstawie obrazów FM oraz krzywych sił.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest zwiększenie rozdzielczości oraz możliwość badania dodatkowych właściwości próbki za pomocą FM. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biofizyki, takie jak struktura błon biologicznych i białek w nich osadzonych. Co więcej, możemy również badać właściwości fizyczne błony i monitorować, w jaki sposób zmiany w składzie lub dodatek czynników aktywnych w błonach mogą wpływać na te właściwości.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na delikatną naturę próbki. Ma to wpływ na przygotowanie próbki, sposób jej obchodzenia, wybór wsporników oraz warunki obrazowania FM i spektroskopii. Należy rozpocząć od rozpuszczenia DOPC, sfingomieliny i cholesterolu w chloroformie w pożądanych stężeniach. Następnie należy połączyć 18,38 µL DOPC, 17,1 µL sfingomieliny i 11,3 µL cholesterolu, aby otrzymać roztwór zawierający 1 mg całkowitej ilości lipidów w stosunku molowym odpowiednio 2:2:1.Wymieszać roztwór za pomocą vortexa, osuszyć mieszaninę używając gazu obojętnego, takiego jak azot, a następnie suszyć dalej w próżni przez co najmniej jedną godzinę. Następnie rozpuścić osuszone lipidy w 100 µL PBS do stężenia 10 mg/mL. Intensywnie mieszać za pomocą vortexa przez około jedną minutę.Aby uzyskać mętną zawiesinę zawierającą pęcherzyki wielowarstwowe, należy upewnić się, że na ściankach fiolki nie pozostały żadne filmy lipidowe. Należy pobrać 10 µL wielowarstwowej zawiesiny lipidowej i dodać 150 µL buforu do wspieranych dwuwarstw lipidowych.Następnie wymieszać roztwór, przenieść go do małej, dwumililitrowej szklanej fiolki z zakrętką i szczelnie zamknąć folią parafilmową. Mieszaninę poddać sonikacji w temperaturze pokojowej w kąpieli ultradźwiękowej przez 10 minut. W tym czasie roztwór powinien stać się klarowny, co pozwoli na otrzymanie małych jednobłonkowych lub wielobłonkowych pęcherzyków o średnicy około 50 nm.Szklane szkiełka nakrywkowe należy przemyć wodą, a następnie etanolem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Następnie należy wziąć krążki mikowe i odkleić ich warstwę zewnętrzną za pomocą taśmy klejącej. Krążek mikowy należy przymocować do szkiełka nakrywkowego za pomocą kropli przezroczystego kleju optycznego.Następnie przymocuj plastikowe cylindry do miki za pomocą smaru próżniowego i upewnij się, że nie ma wycieków. Pipetuj cały roztwór liposomów bezpośrednio na mikę i dodaj dodatkowe 140 µL buforu do wspomnianych warstw lipidowych (SLB), aby osiągnąć objętość 300 µL. Następnie dodaj 0,9 µL jednomolowego roztworu chlorku wapnia, aby uzyskać końcowe stężenie wapnia wynoszące 3 mM, inkubuj próbki przez dwie minuty w temperaturze 37 °C, a następnie przez co najmniej 10 minut w temperaturze 65 °C; na tym etapie podgrzej wstępnie bufor do wspomnianych warstw lipidowych (SLB) do 65 °C.W razie potrzeby dodać bufor, aby zapobiec wysychaniu próbki. Przykrycie komory z próbką szkiełkiem nakrywkowym również pomoże utrzymać nawodnienie próbki. Następnie delikatnie wypłukać próbkę podgrzanym wcześniej buforem do wspieranych lipidowych warstw (supported lipid bilayer buffer) od 10 do 15 razy, aby usunąć wapń i niefuzowane pęcherzyki.Należy zachować szczególną ostrożność podczas etapów płukania, aby zapobiec wysychaniu dwuwarstwy po zakończeniu tych czynności. Schłodzić podparte dwuwarstwy do temperatury pokojowej. Przed wykonaniem pomiarów za pomocą mikroskopu sił atomowych, należy przygotować mikroskop sił atomowych lub FM do obrazowania dwuwarstw lipidowych w roztworze.Korzystając z trybu kontaktowego zgodnie ze specyfikacją producenta, dodaj bufor do próbki, aby pozostała ona zanurzona w buforze przez cały czas trwania eksperymentu. Zamocuj próbkę na stoliku AFM i upewnij się, że wszystkie moduły izolacji wibracyjnej są włączone. Odczekaj co najmniej 15 minut, aby system się ustabilizował i zredukowano dryft termiczny.Następnie należy zbliżyć końcówkę przetwornika AFM do próbki w trybie kontaktowym, aż do momentu nawiązania kontaktu. Ponieważ dwuwarstwy są bardzo delikatne, podczas obrazowania w trybie kontaktowym należy zminimalizować wartość set point końcówki AFM, aby utrzymać siłę na minimalnym poziomie i skorygować dryft termiczny przy jednoczesnym zachowaniu kontaktu z próbką. Po zakończeniu obrazowania należy przetworzyć obrazy, dopasowując każdą linię skanowania do wielomianowych funkcji wyrównawczych.Przeprowadź usuwanie linii (line removal) dla skanów, w których utracono kontakt z membraną. Używając autorskiego oprogramowania firmy produkującej AFM, skalibruj zwezgle przez zastosowanie protokołu producenta, aby wyznaczyć prawidłową konwersję sygnału elektrycznego na pomiar siły. Po obrazowaniu obszaru dwuwarstwy, wybierz region o wymiarach pięć mikronów na pięć mikronów w dwuwarstwie w celu przeprowadzenia spektroskopii sił.Skonfiguruj mikroskopy AFM tak, aby pobierały krzywe siły w siatce 16 na 16 w danym obszarze, co daje 256 krzywych siły na obszar. Następnie ustaw przemieszczenie piezoelektryka Z na 400 nanometrów. Określa to maksymalny zakres ruchu piezoelektryka Z i zapewnia, że wspornik został całkowicie wycofany z próbki pomiędzy pomiarami.Następnie ustaw prędkość podejścia na 800 nanometrów na sekundę, a prędkość wycofania na 200 nanometrów na sekundę. Ustaw również maksymalną siłę docelową dla każdej krzywej siły, w tym przypadku 12 nano Newtona. Po skonfigurowaniu wszystkich parametrów zarejestruj krzywe siły, naciskając przycisk uruchom w oprogramowaniu AFM.Należy zarejestrować co najmniej 500 krzywych siły dla każdego warunku, aby zapewnić odpowiednią statystykę, a następnie wykreślić histogramy wartości i dopasować je do rozkładu Gaussa w celu wyznaczenia maksimum oraz szerokości rozkładu. Ze względu na zastosowany w tej badaniu skład lipidowy tworzą się dwa główne obszary błony. Pierwszym jest obszar ciekłego uporządkowanego, składający się z fing, mieliny i cholesterolu, a drugim obszar ciekłego nieuporządkowanego, składający się głównie z DOPC.Profil wysokości uzyskany z obrazowania AFM może dostarczyć istotnych informacji na temat struktury błony poprzez analizę profilu wysokości. Grubość dwuwarstwy można zmierzyć, wykorzystując obecność defektów w błonie. Mapa wysokości może być również wykorzystana do pomiaru różnicy wysokości między fazą uporządkowaną a nieuporządkowaną.Krzywe siły uzyskane w trybie spektroskopii sił są wykorzystywane do pomiaru siły przebicia poprzez odczytanie wartości siły w szczycie krzywej siły, jak pokazano tutaj. Ponadto grubość błony można wyznaczyć, odejmując wartość odległości w szczycie krzywej siły od wartości odległości w momencie, gdy krzywa siły zaczyna ponownie rosnąć. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać roztwór warstwujący B i stale monitorować zespół FM w celu skorygowania efektów dryftu termicznego oraz akumulacji D na końcówce po zastosowaniu tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące dynamiki błon, można zastosować inne metody, takie jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowywania warstw wspieranych oraz wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej do obrazowania i badania właściwości fizycznych tych dwuwarstw.

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Prezentujemy metodę przygotowania dwuwarstwowych lipidów na podłożu miki do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Mika jest przezroczysta i płaska w skali atomowej, ale rzadko stosowana w obrazowaniu ze względu na trudności w obsłudze; Nasze przygotowanie skutkuje równomiernym osadzaniem się arkusza miki i zmniejsza ilość materiału używanego do przygotowania dwuwarstwowego.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych na podłożu miki do obrazowania mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Przedstawiamy eksperymentalny protokół tworzenia dwuwarstwy lipidowej na stałych podłożach bez użycia pęcherzyków lipidowych. Demonstrujemy jednoetapową metodę tworzenia dwuwarstwy lipidowej na dwutlenku krzemu i złocie, a także na membranach nośnych z domeną wzbogaconą w cholesterol do różnych zastosowań biologicznych.

Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów o rozdzielczości subnanometrowej za pomocą mikroskopii sił atomowych z modulacją amplitudy (tryb stukania) w cieczy. Metodę zademonstrowano na komercyjnych mikroskopach sił atomowych. Wyjaśniamy powody naszego wyboru parametrów i sugerujemy strategie optymalizacji rozdzielczości.

Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę obrazowania dwuwarstw lipidowych za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił. Technika ta umożliwia badanie struktury, grubości i właściwości mechanicznych błon biologicznych z wysoką rozdzielczością.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Przeglądaj więcej filmów