Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie wycinków mózgu do rejestrowania zewnątrzkomórkowych oscylacji gamma jako modelu pobudliwości neuronalnej. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie mózgu z czaszki. Drugim krokiem jest szybkie schłodzenie mózgu w lodzie płynu mózgowo-rdzeniowego A i pokrojenie go na plastry o grubości 450 mikronów.

Następnie przenieś plasterek do komory zapisu i umieść elektrodę stymulującą w warstwie, a elektrodę rejestrującą w warstwie około jednej warstwy parama doole. Ostatnim krokiem jest wywołanie oscylacji gamma i ocena wpływu leków na pobudliwość neuronów. Ostatecznie charakterystyka oscylacji gamma w hipokampie służy do pokazania wpływu leków na funkcjonowanie sieci lub do zrozumienia mechanizmów genezy choroby w chorobie neurogenetycznej.

Metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w mechanizmy chorobowe, w których występuje wzrost pobudliwości sieci neuronowych, takich jak padaczka, autyzm i choroba Alzheimera, a także może być wykorzystana do zbadania metody działania leków. Aby rozpocząć tę procedurę, napraw komorę trzymania, wkładając podniesioną nylonową siatkę do zlewki o pojemności 250 mililitrów. Następnie napełnij zlewkę płynem mózgowo-rdzeniowym, aby przykryć siatkę na około dwa centymetry i bąbelkować ją karbogenem w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że bąbelki nie zakłócają bezpośrednio obszaru trzymania plastrów. Następnie umieść narzędzia preparacyjne, w tym dużą parę nożyczek, małą parę nożyczek, małą i dużą szpatułkę do mikro oraz małą i dużą parę kleszczy na lodzie. Umieść schłodzony klocek do cięcia tkanek Vibram na folii aluminiowej na lodzie.

Po tej naprawie dwa kawałki sześciocentymetrowej bibuły filtracyjnej, żyletka z pojedynczą krawędzią i 25-mililitrowa zlewka wypełniona zawiesiną roztworu tnącego. Następnie napełnij drugi pojemnik lodem do sekcji mózgu. Połóż kawałek bibuły na lodzie i umieść na nim 12-centymetrowe naczynie do hodowli.

Następnie napełnij naczynie hodowlane roztworem tnącym, zawiesiną lodową i bąbelkuj ją karbogenem. W tej procedurze wylecz skórę i tkankę łączną głowy w kierunku nosa za pomocą małych nożyczek, przetnij tkankę łączną, aby odsłonić leżącą pod spodem czaszkę. Następnie usuń mięśnie leżące nad grzbietową częścią czaszki i szyi.

Aby usunąć mózg, zabezpiecz przód czaszki parą dużych kleszczy. Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia przez kość po obu stronach rem i magnum. Następnie wykonaj kolejne cięcie między oczami tuż przed bgma.

Ostrożnie przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego i odbić przecięte odcinki czaszki, aby odsłonić mózg. Następnie użyj małej szpatułki, aby zgarnąć mózg i ostrożnie, aby przeciąć nerwy czaszkowe. Umieść mózg w naczyniu z kulturą hodowlaną.

Następnie przenieś mózg do 25-mililitrowej zlewki wypełnionej zawiesiną roztworu tnącego. Aby przygotować półkulę mózgu do krojenia, umieść kawałek sześciocentymetrowej bibuły filtracyjnej na dnie naczynia hodowlanego. Następnie napełnij go świeżą gnojowicą roztworu do cięcia i bąbelkuj samochodem.

Następnie umieść mózg brzuszną stroną do dołu na bibule filtracyjnej. Następnie usuń móżdżek za pomocą nowej i oczyszczonej żyletki z pojedynczą krawędzią. Wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej, aby oddzielić dwie półkule.

Aby przygotować blok tkanki Vibram, osusz powierzchnię schłodzonej platformy do cięcia tkanek Vibram. Umieść kroplę kleju Sano ACRL na środku i rozprowadź ją równomiernie do przybliżonej wielkości mózgu. Użyj małej szpatułki, aby przenieść jedną półkulę na dużą mikroszpatułkę i ustaw ją tak, aby przyśrodkowa strona mózgu była skierowana w dół.

Wchłoń roztwór mózgu kawałkiem bibuły filtracyjnej tak bardzo, jak to możliwe. Następnie zsuń mózg z większej szpatułki i użyj mniejszej szpatułki, aby poprowadzić go na klej. Następnie przymocuj platformę tnącą do komory Vibram.

Zbuduj komorę z zawiesiną roztworu tnącego, aby całkowicie przykryć mózg i bąbelkować roztwór karbogenem. Następnie obróć platformę tnącą tak, aby brzuszna strona mózgu była skierowana w stronę ostrza. Pokrój mózg na sekcje o grubości 450 mikrometrów, przetnij mózg od powierzchni brzusznej do powierzchni grzbietowej, aby uzyskać całe strzałkowe wycinki mózgu do zapisów elektrofizjologicznych.

Jeśli podstawa plastra uniesie się, użyj wygiętej igły o rozmiarze 27, aby delikatnie docisnąć plasterek. Następnie za pomocą pipety przenieś plasterek do komory trzymania. Zazwyczaj z każdej półkuli można wyciąć od trzech do czterech plastrów hipopotama Campbella, aby zamontować plasterek w komorze nagrywającej.

Umieść wycinek mózgu w zanurzonej komorze nagraniowej wypełnionej płynem mózgowo-rdzeniowym płynącym z prędkością od jednego do dwóch mililitrów na minutę i podgrzanym do 32 stopni Celsjusza. Użycie płynu mózgowo-rdzeniowego A do nagrań różni się od tego w komorze przetrzymywania, ponieważ stężenie magnezu wzrasta z dwóch milimoli do czterech milimolów. Zabezpiecz plasterek, umieszczając na nim półokrągły ciężarek ze stali nierdzewnej tak, aby jego pasma były równoległe do hipokampa ca.

Następnie zwiększ prędkość perfuzji do ośmiu do 10 mililitrów na minutę w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego przesuń elektrodę stymulującą do środka orientu warstwy. Następnie przesunąć elektrodę rejestrującą na warstwę parametrów jak najbliżej elektrody stymulującej.

Następnie opuść zarówno elektrody stymulujące, jak i rejestrujące o 50 do 100 mikrometrów w plasterku. Aby wygenerować pole EPSP o wartości jednego miliwolta w odpowiedzi na 120 do 150 mikroimpulsów testowych w celu wygenerowania oscylacji gamma, należy stymulować tkankę ciągiem impulsów 20 razy 0,1 milisekundy dostarczanych z częstotliwością 200 herców. Ten tytaniczny bodziec może dawać powtarzalne reakcje, gdy jest dostarczany co pięć minut.

Schemat ten pokazuje położenie elektrody stymulującej w orientacji warstwy i elektrody rejestrującej w warstwie para warstwy ca. A oto przykład oscylacji gamma wywołanych przez stymulację Titanica. Rysunek ten przedstawia farmakologiczną blokadę receptorów AMPA z 20 mikromolowymi receptorami CN QX gabaa o 20 mikromolowymi prądem Coline IH z 20 mikromolowymi kanałami perydowymi, chlorkowymi i wapniowymi typu T.

Dzięki 100 mikromolowym niklowi każdy środek był w stanie niezależnie zmniejszyć liczbę generowanych kolców. Preparat ten idealnie nadaje się do określania działania leków w skali sieci. Ząb jest klinicznie stosowanym lekiem przeciwpadaczkowym, który otwiera kanały potasowe i zmniejsza pobudliwość błony.

Zastosowanie zębów spowodowało zależne od dawki zmniejszenie liczby skoków w czasie trwania oscylacji. Po opanowaniu przygotowania wycinków mózgu i sekcji do zapisów elektrofizjologicznych można wykonać w ciągu około 10 minut po tej procedurze. Dodanie innych metod, takich jak zapisy klamry całych komórek, może być dodane w celu zrozumienia roli poszczególnych neuronów w sieci w chorobach, a także po zastosowaniu leków.