Name: Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę przygotowania plasterków mózgu do rejestracji oscylacji gamma w regionie CA1 jako modelu pobudliwości neuronowej. Technika ta umożliwia ocenę wpływu leków na funkcję sieci neuronowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wspierane przez APA dla RJH, grant programu NHMRC 400121 dla SP, a stypendium NMHRC 1005050 dla SP. CAR dziękuje za wsparcie ARC (FT0990628) i programu stypendialnego DOWD. Instytut Neurologii i Zdrowia Psychicznego Florey jest wspierany przez fundusze infrastrukturalne rządu stanu Wiktoria.

Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Instytutu Florey.
1. Konfiguracja do wycinania plasterków mózgu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór tnący składający się z (mM) 125 Choliny-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 D-glukozy nasyconej gazowym karbogenem (95% O2–5% CO2) i roztworu do zapisu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) składającego się z (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glukoza, nasycona karbogenem. Umieść roztwór tnący na lodzie, aby był zimny.</li>
	<li>Zamrozić około 400 ml roztworu do krojenia i zmieszać ze 100 ml niezamrożonego roztworu do krojenia, aby uzyskać zawiesinę lodu. Pęcherzyki z karbogenem (95 % O,2–5 % CO2 ) przy przepływie około 0,5 l/min przez rurki małego kalibru lub szkło spiekane w celu uzyskania stałego, ale delikatnego przepływu pęcherzyków.</li>
	<li>Przygotuj zlewkę o pojemności 250 ml z wypukłą wkładką z nylonowej siatki, na której zostaną umieszczone plastry mózgu. Napełnij płynem CSF, aby przykryć siatkę na około 2 cm i bąbelkować karbogenem, upewniając się, że pęcherzyki nie zakłócają bezpośrednio obszaru trzymania plastrów. Ważne jest również, aby w nylonowej siatce nie było pęcherzyków powietrza, więc jeśli takie są, usuń je. Jest to komora przetrzymywania, która jest utrzymywana w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C).</li>
	<li>Ułóż narzędzia preparacyjne, w tym dużą parę nożyczek, małą parę nożyczek, małe i duże mikroszpatułki oraz duże i małe pary kleszczy i schłodź je na lodzie. Umieść klocek do cięcia tkanek wibratomu na lodzie na kwadracie folii aluminiowej. Zaopatrz się w 2 kawałki bibuły filtracyjnej o średnicy 6 cm, żyletkę z pojedynczą krawędzią i zlewkę o pojemności 25 ml wypełnioną zawiesiną roztworu tnącego.</li>
	<li>Napełnij drugi pojemnik lodem, połóż kawałek bibuły na lodzie i umieść na nim naczynie hodowlane o średnicy 12 cm. Napełnij naczynie hodowlane roztworem do cięcia, zawiesiną lodu i bąbelkami karbogenu. Jest to pojemnik, w którym przeprowadza się sekcję mózgu.</li>
	<li>Przygotuj wibratom. Wyjmij świeżą obosieczną żyletkę (za każdym razem używaj nowego ostrza) z opakowania i spryskaj 80% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną. Przeciąć plastikową pipetę transferową o pojemności 3 ml w miejscu, w którym zaczyna się zwężać. Zostanie to wykorzystane do przeniesienia wycinków mózgu. Zegnij igłę 27 G u podstawy pod kątem około 45° i podłącz do strzykawki o pojemności 1 ml. Zostanie to wykorzystane do manipulowania plasterkami podczas krojenia.</li>
</ol>
2. Wycinanie plastrów mózgu
<ol>
	<li>Znieczulić mysz (P16 - P18) 2% izofluranem lub lokalnie zatwierdzoną metodą. Po indukcji odetnij głowę zwierzęciu za pomocą dużej pary nożyczek i wrzuć głowę do naczynia hodowlanego o średnicy 12 cm, które zawiera bąbelkową zawiesinę roztworu do cięcia. Gnojowica musi całkowicie zanurzyć głowicę, aby zapewnić szybkie schłodzenie.</li>
	<li>Jedną ręką przytrzymaj przód głowy, złuszczając skórę i tkankę łączną do przodu w kierunku nosa. Za pomocą małych nożyczek przetnij tkankę łączną, aby odsłonić leżącą pod spodem czaszkę. Następnie usuń mięśnie leżące nad grzbietową częścią czaszki i szyi.</li>
	<li>Usuń mózg z czaszki, najpierw zabezpieczając przód czaszki dużymi kleszczami, a następnie wykonaj dwa boczne nacięcia przez kość po obu stronach otworu wielkiego za pomocą małych nożyczek (ryc. 1, nacięcia oznaczone jako A1 i A2).
	<ol>
		<li>Wykonaj kolejne nacięcie między oczami (tuż przed bregmą) (ryc. 1, cięcie oznaczone jako B), a następnie ostrożnie przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego do przodu i odbić przecięte sekcje czaszki, aby odsłonić mózg (ryc. 1, cięcie oznaczone jako C).</li>
		<li>Użyj małej szpatułki, aby zgarnąć mózg i umieścić go na naczyniu hodowlanym. Należy pamiętać o nerwach czaszkowych w dolnej części mózgu, które będą musiały zostać przecięte, można to zrobić za pomocą mniejszej mikroszpatułki. Za pomocą większej szpatułki przenieś mózg do zlewki o pojemności 25 ml wypełnionej zawiesiną roztworu tnącego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie półkuli mózgu do krojenia.
	<ol>
		<li>Umieść jeden kawałek bibuły filtracyjnej o grubości 6 cm na dnie świeżego naczynia hodowlanego, a następnie napełnij świeżym roztworem do cięcia, zawiesiną i bąbelkami. Użyj większej szpatułki, aby umieścić mózg brzuszną stroną do dołu na bibule filtracyjnej. Weź nową i oczyszczoną żyletkę z pojedynczą krawędzią i przetnij mózg, aby usunąć móżdżek, a następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej, aby rozdzielić mózg na dwie półkule.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bloku tkankowego wibratomu.
	<ol>
		<li>Weź schłodzony blok tkanki wibratomowej, osusz powierzchnię i umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na środku i rozprowadź równomiernie do przybliżonej wielkości mózgu. Użyj małej szpatułki, aby manipulować jedną z półkul mózgowych na dużej mikroszpatułce, tak aby przyśrodkowa strona mózgu była w dół.</li>
		<li>Dotknij krawędzi szpatułki na styku mózgu na drugim kawałku bibuły filtracyjnej, aby usunąć jak najwięcej roztworu. Zsuń mózg z większej szpatułki za pomocą mniejszej szpatułki, aby poprowadzić go na klej.</li>
		<li>Przymocuj blok tnący do komory wibratomu i napełnij komorę zawiesiną i pęcherzykami roztworu tnącego, upewniając się, że mózg jest całkowicie zanurzony. Obróć blok tnący tak, aby brzuszna strona mózgu była skierowana w stronę ostrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krojenie mózgu. 
	Uwaga: Każdy wibratomus jest unikalny, więc postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Ustaw grubość plastra na 450 μm i upewnij się, że ostrze wibruje, gdy porusza się po mózgu z prędkością około 0,3 mm/s. Przecięcie w całości przez mózg od strony brzusznej do powierzchni kory mózgowej, spowoduje to powstanie całych wycinków strzałkowych mózgu, które można wykorzystać do zapisów elektrofizjologicznych. Plastry będą produkowane bocznie lub przyśrodkowo i zazwyczaj można wyciąć 3-4 plasterki z każdej półkuli.</li>
		<li>Jeśli podstawa plastra uniesie się, użyj wygiętej igły 27 G, aby delikatnie docisnąć plasterek z powrotem w dół. Podczas krojenia każdej kropelki należy użyć pipety transferowej, aby przesunąć ją na platformę w komorze przetrzymywania, gdzie są żywotne przez okres do 8 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zapisy elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej
<ol>
	<li>Montaż plastra w komorze nagrywania.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety transferowej umieścić wycinek mózgu w zanurzonej komorze rejestracyjnej wypełnionej płynem CSF płynącym z prędkością 1 - 2 ml/min i podgrzanym do temperatury 32 °C. ACSF używany do nagrań różni się od tego w komorze przetrzymywania, ponieważ stężenieMg2+ wzrasta z 2 mM do 4 mM.</li>
		<li>Zabezpiecz plasterek za pomocą "harfy" (półokrągłej stali nierdzewnej z nylonowymi pasmami rozciągniętymi w poprzek w odstępach 2-3 mm). Umieść harfę tak, aby pasma biegły równolegle do CA1. Zwiększyć prędkość perfuzji do 8 - 10 ml/min w temperaturze 32 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić elektrodę stymulującą i elektrodę rejestrującą (elektrodę szklaną wypełnioną roztworem rejestrującym aCSF) na powierzchni warstwy promieniowej CA1 (ryc. 2A). Najpierw umieść elektrodę stymulującą, a następnie umieść elektrodę nagrywającą.</li>
	<li>Stymuluj zabezpieczenia Schaffera impulsem testowym o amplitudzie 120 - 150 μA i czasie trwania 0,1 ms i obserwuj wynikowy przebieg fali pobudzającego potencjału postsynaptycznego (fEPSP) w celu określenia stanu warstwy (Rysunek 2B). Elektrody stymulujące i rejestrujące mogą wymagać przesunięcia do warstwy około 50 - 100 μm od powierzchni warstwy, aby uzyskać zapis fEPSP z małą salwą włókien i dużą amplitudą. Zabezpieczenia Schaffera przywołane przez fEPSP są stereotypowe i stanowią dobry wskaźnik zdrowia plastrów. Zdrowe plastry zazwyczaj wykazują stosunek amplitudy włóknistej do fEPSP mniejszy niż 0,3.</li>
	<li>Zmiana położenia elektrod.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego przesunąć elektrodę stymulającą do środka warstwy oriens i przesunąć elektrodę rejestrującą do warstwy ogniwa piramidalnego jak najbliżej elektrody rejestrującej, jak pokazano na rysunku 3A. Może być konieczne wsunięcie elektrod stymulujących i rejestrujących w warstwę o wielkości około 50 - 100 μm, tak aby amplituda odpowiedzi fEPSP na impuls testowy 120 - 150 μA wynosiła około 1 mV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie oscylacji γ.
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć γ oscylacje, stymuluj tkankę ciągiem impulsów o mocy 20 x 0,1 ms dostarczanych z częstotliwością 200 Hz. Ten bodziec tężcowy może dawać powtarzalne odpowiedzi, gdy jest dostarczany co 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj następujących parametrów nagrywania.
	<ol>
		<li>Przeskaluj wzmocnienie sygnału wyjściowego, aby dopasować je do zakresu napięcia wejściowego przetwornika analogowo-cyfrowego. Upewnij się, że maksymalny oczekiwany skok sygnału wykorzystuje co najmniej 30% napięcia wejściowego zakresu. Zachowaj ostrożność podczas ustawiania wzmocnień na wysokie, ponieważ sygnały mogą się przeciąć. Typowa szerokość pasma potrzebna do nagrań terenowych wynosi 500 Hz ze sprzężeniem AC przy 0,1 Hz w celu usunięcia dryfu linii bazowej.</li>
		<li>Digitalizuj co najmniej 4 - 5 razy szybciej niż częstotliwość narożna filtra dolnoprzepustowego, aby uniknąć aliasowania sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych.
	<ol>
		<li>Dane filtru górnoprzepustowego przy 5 Hz w celu usunięcia wszelkich przesunięć linii bazowej. Zidentyfikuj skoki za pomocą progu pochodnej, z minimalną separacją zdarzeń wynoszącą 10 ms, typowym czasem zdarzenia do szczytu i interwałem regresji wynoszącym 7 ms, progiem ~100 mV/ms i doliną separacji wynoszącą 100%. Oblicz opóźnienie jako czas potrzebny do wystąpienia pierwszego zidentyfikowanego skoku po zakończeniu artefaktu stymulacji. Analiza ta pozwala na scharakteryzowanie liczby skoków, opóźnień, interwałów między zdarzeniami i czasu trwania obliczonych w następujący sposób:</li>
		<li>Oblicz liczbę spajków, gdy określana jest całkowita liczba skoków na oscylację dla każdego przeciągnięcia.</li>
		<li>Oblicz opóźnienie oscylacji. Dla każdej oscylacji odejmij czas pierwszego zidentyfikowanego skoku od końca artefaktu stymulacji.</li>
		<li>Oblicz średni interwał między zdarzeniami (ISI). Określ okres czasu między wieloma wykrytymi skokami a średnią.</li>
		<li>Oblicz czas trwania oscylacji. Zmierz czas między pierwszym a ostatnim wykrytym skokiem w każdej oscylacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theta+rhythm+of+navigation%3A+link+between+path+integration+and+landmark+navigation%2C+episodic+and+semantic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory.</a> Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).</li>
<li>Vanderwolf, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+electrical+activity+and+voluntary+movement+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 26 (4), 407-418 (1969).</li>
<li>Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+mechanisms+of+synchronized+gamma+oscillations+in+inhibitory+interneuron+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 45-56 (2007).</li>
<li>Buzsáki, G., Wang, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+gamma+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of gamma oscillations.</a> Annu. Rev. Neurosci. 35, 203-225 (2012).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+contribution+to+scalp+EEG+gamma+rhythms+associated+with+epileptic+spasms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Cortical contribution to scalp EEG gamma rhythms associated with epileptic spasms.</a> Brain Dev. 35 (8), 762-770 (2013).</li>
<li>Andreou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Resting-State+Gamma-Band+Connectivity+in+First-Episode+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">Increased Resting-State Gamma-Band Connectivity in First-Episode Schizophrenia.</a> Schizophr Bull. , (2014).</li>
<li>Alarcon, G., Binnie, C. D., Elwes, R. D., Polkey, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+spectrum+and+intracranial+EEG+patterns+at+seizure+onset+in+partial+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Power spectrum and intracranial EEG patterns at seizure onset in partial epilepsy.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 94 (5), 326-337 (1995).</li>
<li>Fisher, R. S., Webber, W. R., Lesser, R. P., Arroyo, S., Uematsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+EEG+activity+at+the+start+of+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">High-frequency EEG activity at the start of seizures.</a> J. Clin. Neurophysiol. 9 (3), 441-448 (1992).</li>
<li>Kwan, P., Brodie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+identification+of+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Early identification of refractory epilepsy.</a> N. Engl. J. Med. 342 (5), 314-319 (2000).</li>
<li>Traub, R. D., Kopell, N., Bibbig, A., Buhl, E. H., LeBeau, F. E., Whittington, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+between+interneuron+dendrites+can+enhance+synchrony+of+gamma+oscillations+in+distributed+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions between interneuron dendrites can enhance synchrony of gamma oscillations in distributed networks.</a> J. Neurosci. 21 (23), 9478-9486 (2001).</li>
<li>Traub, R. D., Whittington, M. A., Buhl, E. H., Jefferys, J. G., Faulkner, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+the+gamma+--%3E+beta+frequency+shift+in+neuronal+oscillations+induced+in+rat+hippocampal+slices+by+tetanic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of the gamma --> beta frequency shift in neuronal oscillations induced in rat hippocampal slices by tetanic stimulation.</a> J. Neurosci. 19 (3), 1088-1105 (1999).</li>
<li>Whittington, M. A., Stanford, I. M., Colling, S. B., Jefferys, J. G., Traub, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+gamma+frequency+oscillations+tetanically+induced+in+the+rat+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of gamma frequency oscillations tetanically induced in the rat hippocampal slice.</a> J. Physiol. 502 (3), 591-607 (1997).</li>
<li>Avoli, M., Panuccio, G., Herrington, R., D’Antuono, M., de Guzman, P., Lévesque, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+different+interictal+spike+patterns+anticipate+ictal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Two different interictal spike patterns anticipate ictal activity in vitro.</a> Neurobiol. Dis. 52, 168-176 (2013).</li>
<li>Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Dynamics+During+the+Progression+of+Seizure-Like+Events+in+the+Hippocampal-Parahippocampal+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions.</a> Cereb Cortex. 24 (1), 162-173 (2014).</li>
<li>Gloveli, T., Albrecht, D., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+low+Mg2%2B+induced+epileptiform+activity+in+rat+hippocampal+and+entorhinal+cortex+slices+during+adolescence%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Properties of low Mg2+ induced epileptiform activity in rat hippocampal and entorhinal cortex slices during adolescence.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 87 (2), 145-152 (1995).</li>
<li>McLeod, F., Ganley, R., Williams, L., Selfridge, J., Bird, A., Cobb, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+seizure+threshold+and+altered+network+oscillatory+properties+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced seizure threshold and altered network oscillatory properties in a mouse model of Rett syndrome.</a> Neuroscience. 231, 195-205 (2013).</li>
<li>Bracci, E., Vreugdenhil, M., Hack, S. P., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+synchronizing+mechanisms+of+tetanically+induced+hippocampal+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the synchronizing mechanisms of tetanically induced hippocampal oscillations.</a> J. Neurosci. 19 (18), 8104-8113 (1999).</li>
<li>Main, M. J., Cryan, J. E., Dupere, J. R., Cox, B., Clare, J. J., Burbidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+KCNQ2%2F3+potassium+channels+by+the+novel+anticonvulsant+retigabine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine.</a> Mol. Pharmacol. 58 (2), 253-262 (2000).</li>
<li>Wickenden, A. D., Yu, W., Zou, A., Jegla, T., Wagoner, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retigabine%2C+a+novel+anti-convulsant%2C+enhances+activation+of+KCNQ2%2FQ3+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Retigabine, a novel anti-convulsant, enhances activation of KCNQ2/Q3 potassium channels.</a> Mol. Pharmacol. 58 (3), 591-600 (2000).</li>
<li>Otto, J. F., Kimball, M. M., Wilcox, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+anticonvulsant+retigabine+on+cultured+cortical+neurons%3A+changes+in+electroresponsive+properties+and+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of the anticonvulsant retigabine on cultured cortical neurons: changes in electroresponsive properties and synaptic transmission.</a> Mol. Pharmacol. 61 (4), 921-927 (2002).</li>
<li>Pomper, J. K., Graulich, J., Kovacs, R., Hoffmann, U., Gabriel, S., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+oxygen+tension+leads+to+acute+cell+death+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">High oxygen tension leads to acute cell death in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 126 (1), 109-116 (2001).</li>
<li>Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vitro+CA1+network+activity+in+a+sodium+channel+%CE%B21%28C121W%29+subunit+model+of+genetic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vitro CA1 network activity in a sodium channel β1(C121W) subunit model of genetic epilepsy.</a> Epilepsia. 55 (4), 601-608 (2014).</li>
<li>Lord, L. -D., Expert, P., Huckins, J. F., Turkheimer, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+energy+metabolism+and+the+brain%2F%27s+functional+network+architecture%3A+an+integrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cerebral energy metabolism and the brain/'s functional network architecture: an integrative review.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 33 (9), 1347-1354 (2013).</li>
<li>Hájos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur. J. Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Hájos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> J. Neurosci. Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li>
<li>Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Dynamics+During+the+Progression+of+Seizure-Like+Events+in+the+Hippocampal-Parahippocampal+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions.</a> Cereb Cortex. 24 (1), 163-173 (2012).</li>
<li>Antuono, M., Köhling, R., Ricalzone, S., Gotman, J., Biagini, G., Avoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiepileptic+drugs+abolish+ictal+but+not+interictal+epileptiform+discharges+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Antiepileptic drugs abolish ictal but not interictal epileptiform discharges in vitro.</a> Epilepsia. 51 (3), 423-431 (2010).</li>
<li>Stenkamp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+temporal+stability+of+cholinergic+hippocampal+gamma+oscillations+following+respiratory+alkalosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced temporal stability of cholinergic hippocampal gamma oscillations following respiratory alkalosis in vitro.</a> J. Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano solidną metodę generowania oscylacji γ CA1 w ostrych wycinkach mózgu. Generowane oscylacje pochodzą z obwodu lokalnego, co daje lepszą możliwość kontrolowania i zrozumienia neurofizjologicznych podstaw oscylacji sieciowych12. Receptory AMPA, receptory GABAA , Ih i kanały Ca2 + typu T są wymagane do oscylacji γ w tym modelu. Podczas gdy opisane tutaj lokalne oscylacje CA1 mogą być solidnie generowane, zależy to od zapewnienia, że wycinki mózgu są zdrowe. Krytycznym kroki...

Oscylacje sieci mózgowej występują w różnych pasmach częstotliwości, które korelują ze stanami behawioralnymi. U gryzoni oscylacje θ w hipokampie (5 - 10 Hz) obserwuje się podczas zachowań eksploracyjnych1,2, podczas gdy oscylacje γ (20 - 80 Hz) wiążą się z różnymi procesami poznawczymi, w tym percepcją i uwagą3,4. Synchroniczna aktywność sieci γ jest również zaangażowana w patologię zaburzeń, takich jak padaczka i schizofrenia5,6. Na przykład uważa się, że oscylacje γ odpowiadają obszarom korowych ognisk padaczkowych5,7,8 i mogą być wykorzystywane jako markery wrażliwości na farmakoterapię lub oporności, dwóch ważnych obszarów badań w badaniach nad padaczką9.
Wycinek mózgu hipokampa to model, który był szeroko stosowany do badania aktywności sieci10-12. Opracowano różne protokoły w celu generowania γ oscylacji w wycinkach mózgu, które zazwyczaj obejmują modulację farmakologiczną, taką jak niska zawartość Mg2 +, 4-aminopirydyna (4AP), bicukulina i kwas kainowy12-17. Wadą oscylacji wyzwalanych farmakologicznie jest to, że występują one losowo po zastosowaniu leku i nie są niezawodnie generowane ani stabilne w czasie. Elektrycznie wyzwalane oscylacje γ przezwyciężają wiele z tych problemów, a także mają tę zaletę, że są czasowo zablokowane na stymulujące zdarzenie, co pozwala na epizodyczne nagrywanie i analizę. Tutaj opisano protokół generowania oscylacji γ CA1 poprzez dostarczanie stymulacji tężcowej do warstwy oriens w wycinku hipokampa.

<table><tbody><tr><td>Chlorek 4-(N-etylo-N-fenyloamino)-1,2-dimetylo-6-(metyloamino)pirymidynowy (ZD7288)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>Biuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-cyjano-7-nitrochinoksa-line-2,3-dion (CNQX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>Nikiel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>Karbamazepina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>(2R)-amino-5-fosfonopentano-inian (APV)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Retigabine</td><td>ChemPacific</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Choline-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & byk; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Szklana elektroda</td><td>Aparat Harvard&nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Koncentryczna bipolarna elektroda metalowa stymulująca&nbsp;</td><td>Cyfrowy izolator FHC</td><td>CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Model BJN8-9V1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz model 1800</td><td>systemy AM Model</td><td>1800 wzmacniacz</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Intruments</td><td>NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Wibrotom</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie lokalnych oscylacji γ ca1 przez stymulację tężcową

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Oscylacje sieci neuronalnej są ważnymi cechami aktywności mózgu w zdrowiu i chorobie i mogą być modulowane przez szereg klinicznie stosowanych leków. Dostarczany jest protokół do generowania modelu do badania oscylacji γ CA1 (20 - 80 Hz). Te γ oscylacje są stabilne przez co najmniej 30 minut i zależą od pobudzającej i hamującej aktywności synaptycznej oprócz aktywacji prądów rozrusznika. Oscylacje stymulowane tetanicznie mają szereg powtarzalnych i łatwych do zmierzenia cech, w tym liczbę skoków, czas trwania oscylacji, opóźnienie i częstotliwość, które informują o stanie sieci. Do zalet oscylacji stymulowanych elektrycznie należą: stabilność, odtwarzalność i akwizycja epizodyczna, co umożliwia solidną charakterystykę funkcji sieci. Ten model oscylacji γ CA1 może być wykorzystany do badania mechanizmów komórkowych i systematycznego badania, w jaki sposób aktywność sieci neuronalnej jest zmieniana w chorobie i przez leki. Farmakologia stanu choroby może być łatwo włączona poprzez wykorzystanie wycinków mózgu z genetycznie zmodyfikowanych lub interwencyjnych modeli zwierzęcych, aby umożliwić wybór leków, które są specyficznie ukierunkowane na mechanizmy choroby.

Stymulacja tetaniczna warstwy oriens wygenerowała silne i powtarzalne oscylacje γ (35,4 ± 2,2 Hz), patrz Rysunek 3B. Aby wykazać, że oscylacje były generowane w obrębie lokalnej sieci CA1, przerwano dopływy z CA3 poprzez przecięcie skrawka w obszarze CA2 przy użyciu zgiętej igły 32 G. Właściwości oscylacji w przeciętych skrawkach nie różniły się od skrawków nieprzeciętych (p = 0,85; skrawki przecięte 6,16 ± 1,1 spikes, n = 6; skrawki nieprzecięte 5,89 ± 0,8 spikes, n = 6), co wskazuje na to, że oscylacje...

Oscylacje są podstawowymi właściwościami sieci i są modulowane przez choroby i leki. Badanie oscylacji wycinków mózgu pozwala na scharakteryzowanie izolowanych sieci w kontrolowanych warunkach. Zapewniono protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu do wywoływania oscylacji γ CA1.

Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie skrawków mózgu do rejestracji zewnątrzkomórkowych oscylacji gamma jako modelu pobudliwości neuronalnej. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie mózgu z czaszki. Drugim krokiem jest szybkie schłodzenie mózgu w lodzie z CSF A i pocięcie go na skrawki o grubości 450 micron.Następnie przenieś skrawek do komory rejestracyjnej i umieść elektrodę stymulującą w stratum oraz elektrodę rejestrującą w ca one stratum parama doole. Ostatnim krokiem jest wywołanie oscylacji gamma i ocena wpływu leków na pobudliwość neuronalną. W ostateczności charakterystyka oscylacji gamma w hipokampie jest wykorzystywana do wykazania wpływu leków na funkcjonowanie sieci lub do zrozumienia mechanizmów genezy chorób w schorzeniach neurogenetycznych.Metodę tę można wykorzystać do uzyskania informacji na temat mechanizmów chorobowych, w których dochodzi do zwiększenia pobudliwości sieci neuronalnych, takich jak epilepsja, autyzm i choroba Alzheimera, a także do badania mechanizmu działania leków. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować komorę utrzymującą, umieszczając podniesioną nylonową siatkę w zlewce o pojemności 250 mililitrów. Następnie zlewkę należy

generation-of-local-ca1-oscillations-by-tetanic-stimulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę indukowania lokalnych oscylacji gamma CA1 w wycinku mózgu myszy w hipokampie CA1 za pomocą symulacji tężcowych. Ta metoda jest ważna dla zrozumienia aktywności sieci neuronalnej.

Generowanie lokalnych oscylacji gamma Cornu Ammonis 1 (CA1) za pomocą stymulacji tężcowej w wycinku mózgu hipokampa

Ten film demonstruje metodę rejestrowania odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura. Przedstawiono w nim kroki związane z umieszczeniem elektrod stymulujących i rejestrujących na wycinku hipokampa oraz pomiarem pobudzającego potencjału postsynaptycznego pola (fEPSP) w celu oceny siły odpowiedzi synaptycznej.

Rejestrowanie odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura

Ten film pokazuje rejestrację rytmicznej aktywności sieci neuronalnej, znanej również jako oscylacje theta, w izolowanym hipokampie. Elektrody są umieszczane w różnych warstwach i pozycjach przestrzennych w celu wykrywania i analizowania oscylacji theta. Pokazuje to unikalny skład neuronalny i łączność sieci neuronalnej w różnych warstwach hipokampa.

Zapis in vitro oscylacji theta w hipokampie myszy

Ten film pokazuje metodę wykorzystania optogenetyki do modulowania dynamiki sieci hipokampa poprzez aktywację genetycznie zmodyfikowanych światłoczułych interneuronów w wycinku mózgu myszy, poprawiając synchronizację oscylacji theta i badając zachowanie obwodów neuronalnych.

Optogenetyczna kontrola dynamiki sieci hipokampa

Jądro szypułkonowe (PPN) znajduje się w pniu mózgu, a jego neurony są maksymalnie aktywowane podczas czuwania i szybkich ruchów gałek ocznych (REM) podczas snu mózgu. W pracy opisano eksperymentalne podejście do rejestracji in vitro podprogowych oscylacji błony pasma gamma w neuronach PPN.

Rejestrowanie oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego

Tutaj prezentujemy protokół rejestrowania rytmicznych oscylacji sieci neuronalnej theta i gamma z izolowanego całego preparatu hipokampa. Opisujemy etapy eksperymentalne od ekstrakcji hipokampa do szczegółów nagrań klamry polowej, unitarnej i całokomórkowej, a także optogenetycznej stymulacji rytmu theta.

Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

Opisujemy użycie optogenetyki i zapisów elektrofizjologicznych do selektywnych manipulacji oscylacjami theta hipokampa (5-10 Hz) u zachowujących się myszy. Skuteczność porywania rytmu jest monitorowana za pomocą lokalnego potencjału pola. Połączenie inhibicji opto- i farmakogenetycznej rozwiązuje eferentny odczyt synchronizacji hipokampa.

Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

U niektórych zwierząt manipulowanych genami, użycie pojedynczego protokołu może nie wywołać LTD w komórkach Purkinjego móżdżku, a między LTD a uczeniem motorycznym może wystąpić rozbieżność. Do oceny indukcji LTD u zwierząt manipulowanych genami koniecznych jest wiele protokołów. Pokazane są standardowe protokoły.

Ocena długotrwałej indukcji depresji w wycinkach móżdżku u dorosłych

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Poznaj metodę przygotowania plasterków mózgu do rejestracji oscylacji gamma w regionie CA1 jako modelu pobudliwości neuronowej. Technika ta umożliwia ocenę wpływu leków na funkcję sieci neuronowej.

Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Przeglądaj więcej filmów