Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

Ogólnym celem tej procedury jest ułatwienie szybkiego przedklinicznego odkrycia klinicznie istotnych wariantów pojedynczego nukleotydu, które mogą funkcjonalnie napędzać oporność na różne klasy terapii. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie onkologii, takie jak to, które mutacje genów mogą przyczyniać się do funkcjonalnej oporności na terapie w klinice, co ostatecznie może prowadzić do poprawy terapii i alternatywnych strategii postępowania klinicznego dla pacjentów opornych na leki. Główną zaletą tej techniki jest to, że ponieważ ułatwiamy pojawianie się spontanicznych mutacji i stosujemy bezstronną technologię badań przesiewowych u opornych klonów, istnieje większe prawdopodobieństwo, że te warianty napędzają ukierunkowane terapie nawrotowe w klinice.

Demonstracją procedury będzie bardzo utalentowany badacz z mojego laboratorium, który oceni IG 50 dla linii komórkowych. Przygotować płytkę testową, wysiewając komórki w nieprzezroczystym przezroczystym materiale. Na dnie 96-dołkowe płytki w 100 mikrolitrach pożywki komórkowej zgodnie z pokazaną tutaj mapą.

Przygotuj płytkę kontrolną w podobny sposób, dodając komórki do niebieskich studzienek i tylko pożywkę do białych studzienek. Po inkubacji płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, zrównoważyć odczynnik żywotności komórek luminescencyjnych do temperatury pokojowej i delikatnie wymieszać przez odwrócenie. Aby uzyskać jednorodny roztwór, dodaj 80 mikrolitrów odczynnika do dołków płytki kontrolnej i wstrząsaj zawartością przez 30 minut.

Aby wywołać lizę komórek. Użyj luminometru o ekspozycji od 0,1 do 1,0 sekundy i długości fali detekcji 560 nanometrów, aby zarejestrować luminescencję. Następnie, aby dodać badane związki do płytek testowych, należy wykonać serię rozcieńczeń jeden na cztery związków w DMSO, zaczynając od stężenia 2000 mikromolowych, co daje łącznie 10 rozcieńczeń.

Następnie dodać seryjnie rozcieńczone związki do pożywki, aby uzyskać mieszaninę pożywki o 10-krotnym stężeniu końcowym. Płytkę złożoną należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do użycia w trzecim dniu testu. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonych związków do komórek w trzech powtórzeniach, tak aby najwyższa dawka wynosiła 10 mikromolowych.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni. Trzeciego dnia przygotuj 400-litrową mieszankę pożywki One X compound, używając płytek złożonych przygotowanych trzy dni wcześniej. Odwróć płytki testowe, aby usunąć pożywkę i osusz ręczniki papierowe w autoklawie dwa do trzech razy.

Dodaj jeden x związek do dobrze zacienionego na niebiesko i dodaj 100 mikrolitrów pożywki do studzienek obwodowych, aby zapobiec parowaniu. Szóstego dnia oceń względną liczbę żywotnych komórek, wykonując odczyt luminescencji, jak pokazano wcześniej w filmie. Następnie oblicz wartości IG 50 za pomocą oprogramowania takiego jak PRISM, korzystając z obliczonych wartości IG 50, skonfiguruj komórki do testów oporności na leki.

W przypadku pracy z czynnikiem cytostatycznym, komórki nasienne przy zbieganiu od 30 do 40% w 150 milimetrowych kwadratowych szalkach hodowlanych. Jeśli pracujesz z czynnikiem toksycznym, zobacz komórki przy zbieganiu się od 70 do 80%. Po określeniu początkowych stężeń związków zgodnie z protokołem tekstowym, należy potraktować komórki związkami testowymi pod kątem wysoce toksycznych związków, które powodują śmierć komórki w sześciodniowym teście żywotności.

Zacznij od IG 50 i stopniowo zwiększaj stężenie co dwa do trzech tygodni, aż do uzyskania silnej odporności. Aby wyizolować klony pojedynczych komórek, użyj mikroskopii z kontrastem fazowym przy 40-krotnym powiększeniu, aby zbadać szalkę hodowlaną i zidentyfikować żywotne skupiska komórek na dnie szalki. Użyj pisaka, aby oznaczyć klony, które są średniej wielkości i dobrze odizolowane od innych kolonii, aby wybrać klony za pomocą pipetera P 200.

Usuń pożywkę wzrostową z naczynia i użyj jednego XPBS, aby spłukać wszelkie pływające komórki. Za pomocą końcówki pipety podnieś klony i przenieś do studzienek 48-dołkowej płytki zawierającej 50 mikrolitrów 0,25% trypsyny, inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki o połowie stężenia związku, aby umożliwić optymalną regenerację komórek.

Aby wyizolować klony za pomocą trzymilimetrowych krążków klonujących, umieść je w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym pięć mililitrów 0,25% tripsin EDTA na dwie minuty. Następnie odessać pożywkę z naczynia zawierającego odporne klony i nałożyć klony na tripy i namoczone krążki klonowania. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch minut, w zależności od tego, jak łatwo klony odrywają się od płytek.

Następnie za pomocą sterylnych kleszczy podnieś krążki klonujące i przenieś do 48 płytek dołkowych z 200 mikrolitrami świeżej pożywki i delikatnie pipetuj stężenie związku w górę iw dół, aby usunąć komórki z krążków klonowania i inkubować w temperaturze 37 stopni przez noc następnego dnia, usuń krążki klonujące, inkubuj komórki, Następnie oceń oporność na leki. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, HCT jeden 16 komórek leczonych przez dłuższy czas cytotoksycznym. Związek numer jeden doprowadził do spontanicznego pojawienia się opornych klonów, które kontynuowały wzrost podczas leczenia.

Klony zostały pobrane za pomocą pipety. Na tym rysunku wszystkie odporne klony od jednego do trzech wykazywały znaczną oporność na związek numer jeden i jego bliski analog związek numer dwa, podczas gdy wszystkie klony wykazywały wrażliwość na niepowiązany związek cytotoksyczny. Velcade. Po potwierdzeniu oporności fenotypowej, GDNA wyizolowano i przekazano do analizy sekwencjonowania całego egzomu.

Warianty strukturalne, które były powtarzalne i miały potencjalny wpływ funkcjonalny, zostały potwierdzone za pomocą niezależnego narzędzia sekwencjonowania, takiego jak sekwencjonowanie Sangera. Pokazany tutaj przykład zawierał heterozygotyczną mutację typu missense, a rodzicielska linia komórkowa została następnie zmodyfikowana do ekspresji zmutowanego CDNA. Natomiast nadekspresja CDNA typu dzikiego nie powodowała oporności na leki.

Zmutowany CD NA znacząco nadał fenotypową oporność na związek numer jeden, potwierdzając funkcjonalną rolę zmienności strukturalnej jako czynnika napędzającego oporność. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozwinąć spontaniczny wzrost oporności w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku genów odpowiedzialnych za oporność na leki w komórkach rakowych po ich rozwoju. Technika ta umożliwia naukowcom z dziedziny onkologii badanie mechanizmów oporności na leki w bezstronny sposób zarówno w liniach komórek nowotworowych, jak i na modelach zwierzęcych.