Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie klinicznie istotnego modelu, w którym gojenie się ran może być obserwowane w ich naturalnym mikrośrodowisku. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie soczewki z oka zarodka kurczaka. Drugim krokiem jest wykonanie małego nacięcia w przedniej części soczewki.

Następnie hydroelucja masy komórek włókna soczewki. Następnie torebka soczewki wraz z powiązanym nabłonkiem jest spłaszczana poprzez wykonanie dodatkowych nacięć w przedniej torebce. Ostatnim krokiem jest przymocowanie zranionej kultury do naczynia do hodowli tkankowej, aby śledzić gojenie się ran w miarę ich występowania.

Ostatecznie mikroskopia poklatkowa, mikroskopia konfokalna i analiza biochemiczna są wykorzystywane do pokazania mechanizmów gojenia się ran w modelu, który ściśle odzwierciedla środowisko in vivo. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia się ran, takie jak to, w jaki sposób komórki koordynacyjnie poruszają się razem, aby zamknąć ranę. Chociaż ta metoda może dać wgląd w proces gojenia się ran.

Może być również stosowany do badań nad gojeniem się ran ABER, w szczególności zwłóknienia i bliznowacenia. Zacznij od umieszczenia trzech 100-milimetrowych szalek Petriego w sterylnym okapie z przepływem laminarnym. Napełnij dwie szalki Petriego do połowy buforem tris dekstrozy w temperaturze pokojowej, pozostawiając trzecią pustą.

Następnie wyjmij płodne jajo embrionalne białego kurczaka w dniu 15 z inkubatora o temperaturze 37,7 stopni Celsjusza i oczyść zewnętrzną część skorupy 70% etanolem w celu jej wysterylizowania. Następnie ostrożnie rozbij jajko i umieść jego zawartość na pustej 100-milimetrowej szalce Petriego. Za pomocą standardowych kleszczy i cienkich nożyczek odetnij głowę zarodkowi i umieść głowę w jednym z naczyń zawierających bufor dekstrozy TST.

W ciągu 15 minut przenieś główkę zarodka pisklęcia na pokrywkę szalki Petriego. Użyj precyzyjnych kleszczyków, aby uszczypnąć tylną część oka, tworząc mały otwór w tylnej części oka. Następnie chwyć ciało szkliste kleszczami i delikatnie pociągnij ciało szkliste ruchem toczenia.

Ciało szkliste z założoną soczewką usunie się z oka. Umieścić soczewkę i ciało szkliste na pozostałej szalce Petriego zawierającej bufor Tex extras. Pozwól, aby soczewki pozostały w buforze nie dłużej niż 30 minut przed kontynuowaniem sekcji.

Następnie przenieś soczewkę do nowej pokrywy szalki Petriego pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą precyzyjnych kleszczy, ostrożnie zetrzyj wszelkie komórki ciała rzęskowego, które zostały przemieszczone za pomocą soczewki za pomocą krawędzi kleszczy. Następnie oddziel soczewkę od ciała szklistego, ściskając ciało szkliste od jego związku z tylną torebką soczewki. Po rozdzieleniu przenieś soczewkę do 200-mikrolitrowej kropli buforu tris dekstrozy w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i ustaw ją tak, aby przednia strona soczewki była skierowana do góry.

Przednia część soczewki jest łatwa do zidentyfikowania dzięki obecności gęstego pierścienia w tkance, który wskazuje granicę między wewnętrznym a równikowym obszarem nabłonka soczewki. Za pomocą dwóch precyzyjnych kleszczyków wykonaj małe nacięcie o długości około 850 mikronów w środku przedniej torebki soczewki, chwytając tkankę jednym kleszkiem w każdej ręce i delikatnie ciągnąc w przeciwnych kierunkach. Następnie weź strzykawkę o pojemności jednego mililitra z końcówką igły o rozmiarze 27,5 i napełnij ją 300 mikrolitrami buforu dekstrozy TST.

Włóż końcówkę igły do nacięcia wykonanego w przedniej torebce soczewki i mniej więcej do połowy do soczewki. Następnie delikatnie wciśnij strzykawkę, wstrzykując bufor dekstrozy TST do soczewki. Masa komórek włóknistych.

Wstrzyknąć od 50 do 200 mikrolitrów buforu, aby rozluźnić masę komórek włóknistych z otaczającego nabłonka i torebki soczewki. Nigdy nie wstrzykiwaj więcej niż 300 mikrolitrów. Za pomocą precyzyjnych kleszczy usuń poluzowaną masę komórek włóknistych z soczewki przez przednie miejsce nacięcia.

Usunięcie masy komórek włóknistych z ich przyczepu na tylnej torebce tworzy wysoce powtarzalny obszar rany na błonie podstawnej otoczony zranionym nabłonkiem. Zaczynając od torebki torebkowej, wykonaj pięć nacięć w przedniej części soczewki i aż do równika. Spłaszcz powstałe pięć płatków kapsułki soczewki z dołączonym nabłonkiem na torebce szalki hodowlanej stroną do dołu i komórką do góry.

Delikatnie dociśnij kleszczami w każdym punkcie gwiazdy, aby przymocować kapsułkę do naczynia. Spowoduje to małe wgłębienie na pięciu najbardziej zewnętrznych końcach x explanu i spowoduje trwałe przywiązanie do naczynia. Następnie wyjmij bufor tris dekstrozy z 35-milimetrowej szalki i zastąp go 1,5 mililitra przedwojennego M1 99.

Pożywka uzupełniona o 1% zarówno L-glutaminy, jak i penicyliny. Streptomycyna przykryła naczynie pokrywką i umieściła w inkubatorze. Umieścić szalkę hodowlaną pod mikroskopem preparacyjnym i obserwować rozgraniczenie między centralną strefą migracji a pierwotną strefą przyczepu komórek nabłonka.

Następnie użyj dwóch precyzyjnych kleszczy, aby chwycić krawędź po obu stronach linii demarkacyjnej między dwiema strefami. Delikatnie pociągnij oryginalną strefę mocowania wzdłuż linii, aby łatwo oddzielić te dwie strefy. Kontynuuj oddzielanie dwóch stref wokół całej kultury, aż oba regiony zostaną całkowicie oddzielone.

Zbadaj dwie frakcje przy użyciu standardowych molekularnych lub biochemicznych technik analitycznych. Bezpośrednio po usunięciu masy komórkowej włókna aktywowana jest subpopulacja mezenchymalnych komórek naprawczych wzbogacających mięśnie, które migrują do brzegu rany nabłonka. Komórki te szybko przemieszczają się do wolnego od komórek obszaru endogennej torebki błony podstawnej, centralnej strefy migracji, aby rozpocząć gojenie.

Rana, opisana tutaj technika doskonale przygotowuje ten modelowy system do oglądania tego procesu za pomocą mikroskopu lub kamery wideo, gojenie się ran postępuje szybko, pokrywając znaczny obszar rany do pierwszego dnia w hodowli. Trzeciego dnia proces gojenia się ran jest zazwyczaj zakończony po oddzieleniu centralnej strefy migracji i pierwotnej strefy przyczepu. Przeanalizowano tu różnice molekularne między tymi odrębnymi strefami.

Poziomy ogniskowej kinazy adhezyjnej mierzono w dwóch strefach i stwierdzono, że ilość fosforylowanej, ogniskowej kinazy adhezyjnej jest zwiększona w centralnej strefie migracji specyficznej dla migracji. Po opanowaniu, ta pozorowana technika operacji zaćmy może zostać zakończona w ciągu trzech minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć symulowany model operacji zaćmy, który ściśle naśladuje gojenie się ran w naturalnym mikrośrodowisku.