Name: Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę symulowanej operacji zaćmy ex vivo na soczewce embrionu kurzego do badania mechanizmów gojenia ran nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. Model ten umożliwia obserwację procesów naprawczych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant dla A.S.M. (EY021784).

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Thomasa Jeffersona oraz z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach nad widzeniem.
1. Ustawienie i przygotowanie soczewek do hodowli ran ex vivo
<ol>
	<li>Umieść trzy szalki Petriego o średnicy 100 mm w sterylnym okapie z przepływem laminarnym. Napełnij dwie szalki Petriego do połowy buforem Tris/Dekstroza (bufor TD; 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2PO4, 5 mM D-glukozy, 8,25 mM zasady Tris, pH do 7,4 HCl) w temperaturze pokojowej, pozostawiając trzecią pustą. Wstępnie podgrzane podłoża hodowlane (pożywka 199 uzupełniona 1% L-glutaminą i 1% penicyliny/streptomycyny) do 37oC. 
	Uwaga: Standardowe podłoże hodowlane do gojenia ran nie zawiera surowicy, co ma miejsce in vivo; Jednak kultury gojące rany mogą być z powodzeniem hodowane w określonych warunkach, które obejmują surowicę lub inne czynniki.</li>
	<li>Wyjmij z inkubatora płodne jajo embrionalne piskląt z dnia 15 (utrzymywane w temperaturze 37,7°C z delikatnym kołysaniem)</li>
	<li>Umieść wybrane jajko w okapie z przepływem laminarnym i oczyść ze skorupy 70% etanolem z butelki do mycia. Wszystkie poniższe procedury należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych w okapie z przepływem laminarnym, przy użyciu sterylnych roztworów i narzędzi.</li>
	<li>Rozbij jajko i umieść jego zawartość na pustej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odetnij głowę zarodkowi za pomocą standardowych kleszczy i cienkich nożyczek. Umieścić głowę zarodka pisklęcia na szalce Petriego zawierającej bufor TD i odpowiednio usunąć pozostałą część zarodka. Opcjonalnie główki zarodków piskląt należy przechowywać w buforze TD przez krótki okres czasu, nie dłuższy niż 15 minut.</li>
	<li>Umieść głowę zarodka pisklęcia na pokrywie szalki Petriego. Za pomocą precyzyjnych kleszczy usuń soczewkę wraz z dołączonym ciałem szklistym z oka w następującej kolejności. Ściśnij tylną część oka kleszczami, aby utworzyć mały otwór w tylnej części oka.</li>
	<li>Następnie chwyć ciało szkliste kleszczami i delikatnie pociągnij za ciało szkliste ruchem tocznym, ciało szkliste z przymocowaną soczewką zostanie usunięte z oka. Umieścić soczewkę/ciało szkliste na pozostałej szalce Petriego zawierającej bufor TD. Pozwól, aby soczewki pozostały w buforze TD nie dłużej niż 30 minut.</li>
	<li>Przenieś soczewkę na nową pokrywę szalki Petriego pod mikroskopem preparacyjnym. Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą precyzyjnych kleszczyków ostrożnie zetrzyj wszelkie ciała rzęskowe (komórki barwnikowe), które zostały przemieszczone wraz z soczewką za pomocą krawędzi kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić tkanki soczewki. 
	Uwaga: Usunięcie ciała rzęskowego zapewnia, że typy komórek, które nie są endogenne w stosunku do soczewki, nie są włączane do hodowli gojącej rany.</li>
	<li>Oddziel soczewkę od ciała szklistego za pomocą precyzyjnych kleszczy, ściskając ciało szkliste od jego związku z tylną torebką soczewki.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnych kleszczyków przenieś soczewkę do małej kropli buforu TD (około 200 μl) w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm.</li>
</ol>
2. Przeprowadzanie pozorowanej operacji zaćmy
<ol>
	<li>Ustaw soczewkę w kropli bufora TD w czaszy 35 mm przednią częścią soczewki skierowaną do góry. 
	Uwaga: Przednia część soczewki jest łatwa do zidentyfikowania po obecności gęstego pierścienia w tkance, który wskazuje na granicę między przednim i równikowym obszarem nabłonka soczewki. W przeciwieństwie do tego, brak jest oznaczeń z tyłu torebki soczewki, do której przymocowane są komórki włókna soczewki.</li>
	<li>Za pomocą dwóch precyzyjnych kleszczyków wykonaj małe nacięcie (około 850 μm) w środku przedniej torebki soczewki, grubej błony podstawnej otaczającej tkankę soczewki i związany z nią przedni nabłonek soczewki, chwytając tkankę jednym kleszczem w każdej ręce i delikatnie ciągnąc w przeciwnych kierunkach.</li>
	<li>Usuń masę komórek włóknistych, która stanowi większość tkanki soczewki, usuwając ją z przyczepów do nabłonka soczewki i otaczającej torebki soczewki przez hydroelucję (podejście stosowane w klasycznej chirurgii zaćmy, modelowane na rycinie 1A).</li>
	<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml końcówką igły o pojemności 27,5 g 300 μl buforu TD. Włóż końcówkę igły do nacięcia wykonanego w przedniej torebce soczewki i mniej więcej do połowy soczewki.</li>
	<li>Delikatnie wciśnij strzykawkę wstrzykującą bufor TD do masy komórek włókna soczewki. Wstrzykiwać od 50 do 200 μl TD i nigdy więcej niż 300 μl. Obserwuj, jak masa komórek włóknistych rozluźnia się z nabłonka i torebki soczewki.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnych kleszczy usuń rozluźnioną masę komórek włóknistych z soczewki przez przednie miejsce nacięcia. 
	Uwaga: Ta procedura pozostawia torebkę błony podstawnej tylnej soczewki, do której przyłączono komórki włókniste, pozbawioną komórek, a uszkodzony nabłonek soczewki przylega do tego miejsca.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zranionej soczewki do hodowli ex vivo
<ol>
	<li>Spłaszcz torebkę torebki soczewki, która jest wynikiem operacji zaćmy opisanej powyżej, na naczyniu hodowlanym, komórką do góry, wykonując pięć nacięć w przedniej części torebki torebkowej.</li>
	<li>Przeciąć prostopadle do pierwotnego miejsca nacięcia do równika soczewki. Spłaszcz powstałe pięć "płatków" kapsułki soczewki z dołączonym nabłonkiem na torebce z naczyniem hodowlanym stroną do dołu, komórką do góry. Zauważ, że uszkodzona soczewka ex vivo powinna teraz przybrać kształt gwiazdy lub kwiatu (patrz ryc. 1B).</li>
	<li>Aby przymocować kapsułkę do naczynia, delikatnie dociśnij kleszczami w każdym punkcie gwiazdy. Spowoduje to małe wgłębienie na pięciu najbardziej zewnętrznych końcach eksplantatu i spowoduje trwałe przywiązanie do naczynia. 
	Uwaga: Podczas tej procedury możliwe jest uszkodzenie kapsułki, dlatego ważne jest, aby przymocować kapsułkę do naczynia jak najbliżej końcówek klapek, a także wykonać jak najmniejszą liczbę punktów zabezpieczających (zwykle dwa, maksymalnie trzy na klapkę).</li>
	<li>Wyjmij bufor TD z naczynia 35 mm i zastąp go 1.5 ml wstępnie podgrzanego podłoża. Przykryj naczynie o średnicy 35 mm pokrywką i umieść w inkubatorze (37°C, 5% CO2 ).</li>
</ol>
4. Oddzielenie Centralnej Strefy Migracji (CMZ), gdzie następuje reepitelializacja uszkodzonego obszaru tylnej torebki, od Pierwotnej Strefy Przyczepu (OAZ) komórek nabłonka soczewki, w celu analizy ilościowej.
Uwaga: Komórki zaczynają natychmiast przemieszczać się do obszaru CMZ w odpowiedzi na uraz. Do pierwszego dnia w hodowli wystarczająca liczba komórek migruje przez CMZ do analizy molekularnej i biochemicznej, po oddzieleniu CMZ i OAZ przez mikropreparację23. Protokół ten polega na usuwaniu jednego płata (OAZ) na raz z uszkodzonego obszaru kapsułki.
<ol>
	<li>Obserwuj wyraźnie widoczne pod mikroskopem preparacyjnym rozgraniczenie między OAZ a CMZ (patrz rysunek 2A). Używając dwóch szczypiec o wysokiej precyzji, chwyć obiema kleszczami krawędź linii OAZ/CMZ, jeden tuż przylegający do drugiego, po obu stronach linii (patrz rysunek 2A, B, strzałka).</li>
	<li>Używając jednej ręki/jednego kleszcza po stronie CMZ, kontynuuj trzymanie zranionej kultury, podczas gdy drugą ręką/kleszczami delikatnie przeciągnij OAZ wzdłuż linii OAZ/CMZ. CMZ łatwo oddziela się od OAZ wzdłuż tej linii. Kontynuuj wzdłuż tej linii wokół całej kultury, aż oba regiony zostaną całkowicie oddzielone.</li>
	<li>Zbadaj oddzielone frakcje OAZ i CMZ do analizy molekularnej, takiej jak RNA-Seq 24 lub analizy biochemicznej, takiej jak western blot lub koimmunoprecypitacja 23,25.</li>
</ol>

<ol><li>Walker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+precursors+for+the+mesenchymal+cells+involved+in+injury+response+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+laboratory+automation%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).</li>
<li>Khalil, A. A., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+leader+cells+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Determinants of leader cells in collective cell migration.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).</li>
<li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).</li>
<li>Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+basement+membrane+after+corneal+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Disruption of the basement membrane after corneal debridement.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+of+the+epithelium+in+experimental+corneal+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds.</a> Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).</li>
<li>Sherrard, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium+in+vivo%3A+its+response+to+mild+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma.</a> Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).</li>
<li>Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+the+fibrotic+repair+phenotype+in+cornea%3A+implications+for+surgical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).</li>
<li>Escamez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).</li>
<li>Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+growth+factor+expression+is+reduced+and+delayed+during+wound+healing+in+the+genetically+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse.</a> The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).</li>
<li>Tarin, D., Croft, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin.+II.+Dermo-epidermal+interrelationships%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships.</a> Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).</li>
<li>Croft, C. B., Tarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin+I.+Epithelial+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour.</a> Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).</li>
<li>Winstanley, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+reaction+in+the+healing+of+excised+cutaneous+wounds+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+comparative+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog.</a> Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).</li>
<li>Wormstone, I. M., Wride, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+lens%3A+a+classic+model+for+development%2C+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).</li>
<li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">The lens capsule.</a> Experimental eye research. 88, 151-164 (2009).</li>
<li>Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsular+opacification%3A+a+problem+reduced+but+not+yet+eradicated%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated.</a> Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).</li>
<li>Walker, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+attempts+to+reduce+posterior+capsule+opacification+after+cataract+surgery--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review.</a> Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).</li>
<li>Schmidbauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22International+ophthalmology+clinics%22%5BJournal%5D)">Posterior capsule opacification.</a> International ophthalmology clinics. 41, 109-131 (2001).</li>
<li>Menko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+vimentin+in+regulating+repair+function+during+healing+of+the+lens+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium.</a> Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).</li>
<li>Chauss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+state-specific+mitochondrial+dynamic+regulatory+networks+are+revealed+by+global+transcriptional+analysis+of+the+developing+chicken+lens%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens.</a> G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).</li>
<li>Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+N-Cadherin+linked+c-Src+and+fyn+kinases+in+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).</li>
<li>Sieg, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK+integrates+growth-factor+and+integrin+signals+to+promote+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration.</a> Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).</li>
<li>Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Required+role+of+focal+adhesion+kinase+%28FAK%29+for+integrin-stimulated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).</li>
<li>Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion+kinase--a+regulator+of+cell+migration+and+invasion%29%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+life%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion).</a> IUBMB life. 53, 115-119 (2002).</li>
<li>Zhao, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+and+its+signaling+pathways+in+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis.</a> Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).</li>
<li>Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional-specific+alterations+in+cell-cell+junctions%2C+cytoskeletal+networks+and+myosin-mediated+mechanical+cues+coordinate+collectivity+of+movement+of+epithelial+cells+in+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury.</a> Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li>
<li>Ferguson, M. W., O'Kane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scar-free+healing%3A+from+embryonic+mechanisms+to+adult+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).</li>
<li>Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+inflammation%3A+embryos+reveal+the+way+to+perfect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).</li>
<li>Nodder, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+embryology%22%5BJournal%5D)">Wound healing in embryos: a review.</a> Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisano technikę przygotowania modelu hodowlanego gojenia się ran, która polega na wykonaniu operacji zaćmy ex vivo na soczewkach zarodków piskląt po ich usunięciu z oka. Nabłonek soczewki reaguje na to klinicznie istotne zranienie procesem naprawy, który ściśle naśladuje ten, który zachodzi in vivo, i ma wspólne cechy z gojeniem ran w innych tkankach nabłonkowych2,4. Chociaż protokół jest prosty i prosty do przestrzegania, wykonanie pozorowanej operacji zaćmy za pomocą soczewek embrionalnych...

Klinicznie istotny, symulowany model leczenia ran nabłonkowych ex vivo opisany tutaj został opracowany, aby dostarczyć narzędzia do badania mechanizmów regulujących naprawę tkanek nabłonkowych w odpowiedzi na uraz. Kluczowe cechy, które miały na celu stworzenie tego modelu, obejmowały: 1) zapewnienie warunków, które ściśle odwzorowywały reakcję in vivo na zranienie w warunkach hodowli, 2) łatwość modulowania elementów regulacyjnych naprawy oraz 3) zdolność do obrazowania procesu naprawy w całości w czasie rzeczywistym. Wyzwanie polegało zatem na stworzeniu modelu hodowli, w którym możliwe było badanie i manipulowanie nabłonkowym gojeniem ran w natywnym mikrośrodowisku komórek. Dostępność tego modelu gojenia ran otwiera nowe możliwości identyfikacji endogennych sygnałów sygnalizacyjnych z białek macierzy, cytokin i chemokin, które regulują proces naprawy. Ponadto model jest idealny do zbadania, w jaki sposób nabłonek jest w stanie poruszać się jako arkusz zbiorowy w celu ponownego nabłonkowania obszaru rany 2,3 oraz do określenia linii mezenchymalnych komórek liderowych na krawędzi rany, które działają w kierowaniu zbiorową migracją uszkodzonego nabłonka 4. Model ten stanowi również platformę, za pomocą której można zidentyfikować środki terapeutyczne, które mogą wspomagać skuteczne gojenie się ran i zapobiegać nieprawidłowemu gojeniu się ran5.
Istnieje już wiele dostępnych modeli gojenia ran, zarówno w hodowli, jak i in vivo, które dostarczyły większość tego, co obecnie wiadomo o procesie gojenia się ran. W modelach uszkodzeń zwierząt, takich jak rogówka 6-12 i skóra13-17, istnieje możliwość zbadania reakcji tkanki na zranienie w kontekście wszystkich mediatorów naprawy, które mogą być zaangażowane w ten proces, w tym wkładu układu naczyniowego i nerwowego. Istnieją jednak ograniczenia w manipulowaniu warunkami eksperymentalnymi in vivo i nie jest jeszcze możliwe prowadzenie badań obrazowych odpowiedzi naprawczej in vivo, w sposób ciągły w czasie. W przeciwieństwie do tego, większość modeli hodowli ran in vitro, takich jak rana po zadrapaniu, może być łatwo manipulowana i obserwowana w czasie, ale brakuje im kontekstu środowiskowego badania gojenia się ran w tkance in vivo. Podczas gdy modele ex vivo mają tę zaletę, że badają proces naprawy uszkodzeń w sposób ciągły w czasie w kontekście mikrośrodowiska komórek w połączeniu ze zdolnością do modulowania molekularnych regulatorów naprawy w dowolnym momencie procesu, istnieje niewiele modeli, które pasują do tych parametrów.
Tutaj opisana jest procedura generowania wysoce powtarzalnych kultur gojenia ran nabłonkowych ex vivo, które odtwarzają reakcję tkanki nabłonkowej na fizjologiczne zranienie. Wykorzystując soczewkę zarodka kurczątka jako źródło tkankowe, przeprowadza się pozorowaną operację zaćmy ex vivo. Soczewka jest idealną tkanką do wykorzystania w tych badaniach, ponieważ jest zamknięta w grubej torebce błony podstawnej, naczyniowa, nieunerwiona i wolna od jakiegokolwiek powiązanego zrębu18,19. W chorobie człowieka operacja zaćmy ma na celu rozwiązanie problemu utraty wzroku spowodowanej zmętnieniem soczewki i polega na usunięciu masy komórek włókna soczewki, która stanowi większość soczewki. Po operacji zaćmy wzrok zostaje przywrócony poprzez wprowadzenie sztucznej soczewki wewnątrzgałkowej. Zabieg chirurgii zaćmy, poprzez usunięcie komórek włóknistych, wywołuje reakcję urazu w sąsiednim nabłonku soczewki, który reaguje ponownym nabłonkiem tylnej części torebki soczewki, która była zajęta przez komórki włókniste. W chirurgii zaćmy, podobnie jak w większości reakcji na gojenie się ran, czasami występuje nieprawidłowy wynik zwłóknienia reakcji gojenia się rany, związany z pojawieniem się miofibroblastów, co w soczewce jest znane jako zmętnienie tylnej torebki20-22. Aby wygenerować model gojenia się ran po operacji zaćmy, procedura operacji zaćmy jest naśladowana w soczewkach usuniętych z oka zarodka zarodka pisklęcia w celu wywołania urazu fizjologicznego. Mikrochirurgiczne usunięcie komórek włókien soczewki skutkuje bardzo spójnym okrągłym obszarem rany otoczonym komórkami nabłonka soczewki. Ta populacja komórek pozostaje mocno przyczepiona do torebki błony podstawnej soczewki i ulega uszkodzeniu w wyniku zabiegu chirurgicznego. Komórki nabłonkowe migrują do ogołoconego obszaru endogennej błony podstawnej, aby zagoić ranę, prowadzone przez populację komórek mezenchymalnych bogatych w wimentynę, znanych w procesie naprawy jako komórki liderowe1. Dzięki temu modelowi można łatwo zobrazować reakcję nabłonka na uraz i śledzić ją w czasie w kontekście mikrośrodowiska komórek. Komórki są łatwo dostępne dla modyfikacji ekspresji lub aktywacji cząsteczek, które mają odgrywać rolę w gojeniu się ran. Potężną cechą tego modelu jest zdolność do izolowania i badania zmian specyficznych dla migracji w ramach gojenia się ran. Kolejną zaletą tego modelu jest możliwość przygotowania do badań dużej liczby starych, dopasowanych kultur gojenia się ran ex vivo. W ten sposób ten modelowy system daje wyjątkową okazję do wyodrębnienia mechanizmów gojenia się ran i przetestowania leków pod kątem ich wpływu na proces gojenia się ran. Oczekuje się, że symulowany model operacji zaćmy ex vivo będzie miał szerokie zastosowanie, stanowiąc kluczowe źródło do badania mechanizmów naprawy urazów.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Stosować przy 140 mM w buforze TD</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Stosować przy 5 mM w buforze TD</td></tr><tr><td>Fosforan sodu (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>Stosować przy 0,7 mM w buforze TD</td></tr><tr><td>D-glukoza (dekstroza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td>Stosować przy 0,5 mM w TD Buffer</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Stosować przy 8,25 mM w TD Buffer</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Stosować do pH buforu TD do 7,4</td></tr><tr><td>Media 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning/CellGro</td><td>25-005-CI</td><td>Stosować w stężeniu 1% w Media199</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Corning/ CellGro</td><td>30-002-CI</td><td>Stosować przy 1% w Media199</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Stericup</td><td>Millipore</td><td>SCGPU01RE</td><td>Służy do filtracji sterylizacji</td></tr><tr><td>Kleszcze Media Dumont #5 (potrzebne 2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1 ml SlipTip z precyzyjna igła ślizgowa</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Inne potrzebne przedmioty: Ogólne narzędzia preparacyjne,&nbsp; płodne białe jaja kurze leghorn, sprawdź inkubator jaj (nawilżany, 37,7&deg; C), okap z przepływem laminarnym, dwuokularowy stereowizyjny mikroskop</td><td></td><td></td><td></td> preparacyjny</tr></tbody></table>

opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Główną przeszkodą w zrozumieniu, w jaki sposób tkanka nabłonkowa wykonuje naprawę rany, jest ograniczona dostępność modeli, w których można śledzić i manipulować reakcją rany ex vivo w środowisku, które ściśle naśladuje uszkodzenie tkanki nabłonkowej in vivo. Ten problem rozwiązano przez utworzenie klinicznie istotnego modelu naprawy uszkodzeń nabłonka ex vivo na podstawie operacji zaćmy. W tym modelu hodowli reakcję nabłonka soczewki na zranienie można śledzić na żywo w natywnym mikrośrodowisku komórek, a molekularnymi mediatorami gojenia się ran można łatwo manipulować podczas procesu naprawy. Aby przygotować hodowle, soczewki są usuwane z oka i wykonuje się małe nacięcie w przedniej części soczewki, z którego usuwa się wewnętrzną masę komórek włókien soczewki. Ta procedura tworzy okrągłą ranę na tylnej torebce soczewki, grubej błonie podstawnej otaczającej soczewkę. Ten obszar rany, do którego przyczepiono komórki włókniste, znajduje się tuż obok ciągłej monowarstwy komórek nabłonka soczewki, która pozostaje połączona z torebką soczewki podczas zabiegu chirurgicznego. Uszkodzony nabłonek, typ komórki, z której pochodzą komórki włókniste podczas rozwoju, reaguje na uraz spowodowany usunięciem komórek włóknistych, przemieszczając się zbiorczo po obszarze rany, prowadzony przez populację bogatych w wimentynę komórek naprawczych, których mezenchymalne komórki progenitorowe są endogenne w stosunku do soczewki1. Właściwości te są typowe dla normalnej reakcji na gojenie się ran nabłonkowych. W tym modelu, podobnie jak in vivo, gojenie się ran jest zależne od sygnałów dostarczanych przez środowisko endogenne, które jest unikalnie utrzymywane w tym systemie hodowli ex vivo, co stanowi idealną okazję do odkrycia mechanizmów regulujących naprawę nabłonka po zranieniu.

Ex Vivo Model stworzony w celu badania procesu gojenia ran w rodzimym mikrośrodowisku komórek
Aby zbadać mechanizmy zaangażowane w regulację gojenia ran nabłonka w naturalnym mikrośrodowisku komórek, stworzono klinicznie istotny model symulowanej operacji zaćmy ex vivo. Model ten powstaje z tkanki soczewki, która oferuje wiele zalet dzięki swoim wewnętrznym właściwościom: 1) soczewka jest autonomicznym organem otoczonym grubą błoną podstawną zwaną torebką soczewki; 2) jest be...

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie klinicznie istotnego modelu, w którym można obserwować gojenie rany w jej naturalnym mikrośrodowisku. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie soczewki z oka zarodka kurczaka. Drugim krokiem jest wykonanie niewielkiego nacięcia w przedniej części soczewki.Następnie masę komórek włókien soczewki wypłukuje się hydronicznie. W kolejnym kroku torebkę soczewki wraz z powiązanym z nią nabłonkiem spłaszcza się, wykonując dodatkowe nacięcia w torebce przedniej. Ostatnim etapem jest przymocowanie uszkodzonej hodowli do naczynia hodowlanego, aby móc obserwować przebieg procesu gojenia rany.Ostatecznie, mikroskopia poklatkowa, mikroskopia konfokalna oraz analiza biochemiczna są wykorzystywane do wykazania mechanizmów gojenia ran w modelu, który ściśle odtwarza środowisko in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie gojenia ran, takie jak sposób, w jaki komórki koordynują swój wspólny ruch w celu zamknięcia rany. Metoda ta pozwala zatem uzyskać wgląd w proces naprawy tkanek.Metodę tę można również zastosować w badaniach nad gojeniem ran ABER, w szczególności w kontekście włóknienia i bliznowacenia. W pierwszej ko

establishment-clinically-relevant-ex-vivo-mock-cataract-surgery-model

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Ten artykuł opisuje protokół upraszczający proces i obniżający koszty przygotowania autologicznej surowicy kondycjonowanej (ACS). Nie są potrzebne żadne specjalne strzykawki ani szklane kulki powlekane powierzchniowo. Co więcej, zmodyfikowany ACS (mACS) ma przewagę konkurencyjną nad konwencjonalną surowicą autologiczną w gojeniu ran rogówki mysich oczu ex vivo.

Produkcja modyfikowanej surowicy kondycjonowanej autologicznie i ocena ex vivo jej potencjału leczniczego w nabłonku rogówki myszy

Ten artykuł opisuje metodę tworzenia ran w nabłonku żywej Clytia hemisphaerica medusa i obrazowania gojenia ran w wysokiej rozdzielczości in vivo. Dodatkowo przedstawiono technikę wprowadzania barwników i leków w celu zakłócenia procesów sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej podczas gojenia się ran.

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

Ta metoda modeluje operację zaćmy in vivo, usuwając komórki włókna soczewki od dorosłych myszy i pozostawiając torebkę z dołączonymi komórkami nabłonka soczewki (LEC). Reakcja na uraz jest następnie oceniana w różnych momentach po operacji przy użyciu kryteriów molekularnych i morfologicznych.

Modelowanie operacji zaćmy u myszy

Poznaj metodę symulowanej operacji zaćmy ex vivo na soczewce embrionu kurzego do badania mechanizmów gojenia ran nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. Model ten umożliwia obserwację procesów naprawczych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Przeglądaj więcej filmów