Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zmapowanie rozmieszczenia białek naprawczych DNA wokół pęknięć dwuniciowych DNA w skali nanometrycznej. Ma to na celu zbadanie ultrastruktury uszkodzonej chromatyny poddawanej naprawie przy użyciu obrazowania spektroskopowego elektronów. Osiąga się to poprzez generowanie konstruktów ekspresyjnych DNA kodujących białka fuzyjne białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA z wykorzystaniem białka fluorescencyjnego oraz tagu mini SOG.

W drugim kroku konstrukty są wprowadzane do komórek poprzez transfekcję, a następnie komórki są poddawane uszkodzeniu za pomocą lasera lub promieniowania gamma. Następnie napromieniowane i utrwalone komórki przechodzą etapy przygotowania do mikroskopii elektronowej, aby umożliwić uwidocznienie w mikroskopie elektronowym rozmieszczenia białka naprawczego znakowanego mini SOG. Uzyskane w ten sposób obrazy spektroskopii elektronowej dostarczają szczegółowych danych, które pozwalają na analizę ultrastruktury chromatyny oraz związku specyficznych białek z ogniskami naprawy DNA.

Główną zaletą tej technologii w stosunku do innych istniejących metod, takich jak znakowanie ImmunoGold, jest brak zależności od dostępności przeciwciał oraz możliwość bardzo gęstego znakowania struktur docelowych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ fotoutlenianie jest bardzo wrażliwe na pH, natężenie światła oraz nasycenie tlenem. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy fotoutleniania, nasycenia tlenem i oświetlania są wrażliwe na bardzo niewielkie zmiany, dlatego ważne jest zilustrowanie sposobu przeprowadzenia metody w celu jej poprawnego odtworzenia.

Dr Hilmar Fadden, postdok w moim laboratorium, zaprezentuje Państwu metodę hodowli. Ludzkie komórki osteosarcoma, które stabilnie ekspresują mini SOG oraz białka naprawcze znakowane M cherry, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Po przesianiu komórek z płytki 10 centymetrowej, należy doprowadzić je do 80% konfluencji.

Następnie umieść komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym i za pomocą sterylnego pisaka diamentowego obrysuj niewielki obszar o powierzchni około jednego milimetra kwadratowego, zawierający wcześniej oznakowane komórki wykazujące ekspresję białek ektopowych; uwrażliw komórki, dodając do roztworu herx tak, aby końcowe stężenie wyniosło 0,5 µg/ml, a następnie inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie przeprowadź mikroirradiację laserową komórek, używając laserowego emitera stanu stałego o długości fali 405 nm mikroskopu konfokalnego, aby wywołać uszkodzenia DNA; po wywołaniu uszkodzeń DNA utrwal komórki w ciemności, używając jednego mililitra 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze octanowym sodu w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Przemyj komórki dwukrotnie czterema mililitrami 0,1 molarnego buforu sodowego Cate o pH 7,4. Następnie potraktuj utrwalone komórki dwoma mililitrami roztworu zawierającego 50 milimolarną glicynę, pięć milimolarny aminotriazol i 10 milimolarny cyjanek potasu o pH 7,4 przez 30 minut. Zastąp bufor dwoma mililitrami buforu do fotoutleniania o pH 7,4, przygotowanego zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Następnie inkubuj próbkę w ciemności na lodzie, jednocześnie przedmuchując roztwór tlenem, aby utrzymać jego nasycenie tlenem. Następnie ostrożnie zamocuj szalkę z utrwalonymi komórkami w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw imersyjny 40x i przesuń ją do wcześniej wyznaczonego obszaru zainteresowania. Pobudź znacznik mini SOG światłem niebieskim, korzystając z kostek filtrujących dla zielonego białka fluorescencyjnego.

Kontynuuj naświetlanie nawet po całkowitym zaniku zielonej fluorescencji mini-SOG. Proces ten należy prowadzić do momentu, gdy w kanale światła przechodzącego pojawi się brązowy produkt fotoutleniania spolimeryzowanej diaminobenzydyny. Następnie utrwal komórki, stosując 1 ml 2% glutaraldehydu w 0,1 M buforze boranu sodu o pH 7,4 przez 30 minut.

Następnie utrwal błony komórkowe, stosując 0,1 do 0,5% tetrotlenku osmu w 0,1 M buforze octanowym sodu przez 20 minut przy pH 7,4. Po utrwaleniu odwodnij komórki poprzez serię przemyć etanolem. Następnie inkubuj komórki w mieszaninie 100% etanolu i żywicy akrylowej w stosunku jeden do jednego na wytrząsarce przez cztery godziny.

Następnie wyjmij mieszaninę i dodaj do próbek 100% żywicy akrylowej na kolejne cztery godziny. Aby spolimeryzować żywicę, odetnij żyletką wieczko oznakowanej probówki do mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów i pokryj krawędź akceleratorem żywicy akrylowej. Ostrożnie napełnij probówkę w około dwóch trzecich jej objętości białą żywicą LR, używając do tego pipety transferowej.

Należy zadbać o to, aby żywica nie miała kontaktu z akceleratorem na krawędzi. Usuń żywicę, która przeniknęła do komórek w naczyniu, a następnie odwróć naczynie do góry dnem i umieść je na pionowo ustawionej mikroprobowce do wirówki w taki sposób, aby szerokość probówki niemal całkowicie wypełniała oszklone okno obserwacyjne ciężarka naczynia. Odczekaj od jednej do dwóch minut, aż akcelerator uszczelni probówkę i szkiełko nakrywowe.

Następnie odwróć probówkę tak, aby żywica wewnątrz niej pokryła komórki. Umieść szalkę z probówką w piecu w temperaturze 60 °C i utwardzaj przez 12 godzin. Po utwardzeniu bloku wyjmij z pieca szalkę z przymocowaną, wypełnioną żywicą probówką do mikrowirowania i oddziel probówkę od szalki.

Wyrzuć szkiełko z dnem i ostrożnie przetnij probówkę do mikrocentryfugi żyletką, aby wydobyć blok. Za pomocą żyletki przytnij blok tak, aby pozostał jedynie obszar o wielkości jednego milimetra kwadratowego, zawierający wcześniej zaznaczony diamentowym lub wolframowym pisakiem region. Następnie zamocuj blok w ultramikrotomie i przycinaj go nożem do momentu dotarcia do komórek.

Następnie należy przejść na nóż diamentowy i wyciąć ultracienkie sekcje o grubości około 50 nanometrów przez komórki. Sekcje należy zebrać na siatki 300 mesh do wysokiej rozdzielczości transmisyjnej. Następnie siatki umieszcza się w naparowaczu węglowym i pokrywa sekcje warstwą węgla o grubości od około 0,2 do 0,4 nanometrów, aby pomóc w ich stabilizacji pod wiązką elektronową w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

Wprowadź siatki do transmisyjnego mikroskopu elektronowego wyposażonego w filtr energii. Przejrzyj komórki na przekrojach, korzystając z trybu normalnej transmisji przy niskim powiększeniu, i porównaj je z wcześniej wykonanymi obrazami fluorescencyjnymi. Po zlokalizowaniu jądra z śladem uszkodzenia DNA lub ognisk naprawy DNA przełącz urządzenie w tryb filtrowania energii i zarejestruj próbkę wraz z mapą grubości.

Następnie zarejestruj obrazy mapy fosforu po krawędzi przy stracie energii elektronów wynoszącej 175 eV i szerokości szczeliny wynoszącej 20 eV. Zarejestruj również obrazy przed krawędzią przy stracie energii 120 eV, również z szerokością szczeliny 20 eV, dla zapisu map azotu. Obrazy po krawędzi zarejestruj przy 447 eV z szerokością szczeliny 35 eV, a obrazy przed krawędzią przy 358 eV.

Również przy szerokości szczeliny wynoszącej 35 eV. Otwórz mapy stosunków pierwiastkowych w programie do przetwarzania obrazów, takim jak ten. Skopiuj mapę azotu do kanału czerwonego, a mapę fosforu do kanału zielonego obrazu RGB.

Następnie nałóż na siebie i wyrównaj mapy. Eksportuj obraz złożony jako plik w formacie TIFF, a następnie otwórz go w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów obsługującym warstwy. Następnie dostosuj zakres dynamiczny każdego kanału, skalując wartości minimalne i maksymalne w obrazie do ośmiobitowego zestawu danych.

Następnie w oknie warstw odjąć zawartość fosforu od mapy azotu. Przekonwertować obraz na kolor indeksowany i utworzyć żółtą tabelę wyszukiwania (lookup table) w przestrzeni kolorów CMYK dla mapy pokazującej rozkład kwasów nukleinowych oraz cyjanową tabelę wyszukiwania dla mapy białek poza chromatynowych. Następnie utworzyć nowy obraz i zaimportować mapy pokazujące rozkłady fosforu oraz białek poza chromatynowych jako oddzielne warstwy.

Użyj trybu przezroczystości ekranu, aby zobaczyć obie warstwy nałożone na siebie. Przedstawione tutaj mapy stosunków spektroskopowych elektronów z wnętrza jądra komórkowego pokazują rozmieszczenie fosforu i azotu, gdy obie mapy stosunków zostaną nałożone na siebie w przestrzeni kolorów RGB. W ten sposób uzyskuje się obraz taki, jak ten przedstawiony tutaj.

Żółte struktury reprezentują białka jądrowe, odzwierciedlając obecność zarówno fosforu, jak i azotu. W tym przypadku zastosowano obrazowanie spektroskopowe elektronów, aby zobrazować zmiany w strukturze ognisk po napromieniowaniu gamma komórek U2 OS. W górnym rzędzie przedstawiono obrazy komórek nienapromieniowanych, stabilnie wykazujących ekspresję białek naprawczych znakowanych mCherry.

Drugi rząd przedstawia komórki utrwalone trzy godziny po napromieniowaniu. Trzeci rząd przedstawia komórki utrwalone sześć godzin po napromieniowaniu. Obrazowanie spektroskopowe elektronowe wykazuje, że struktura ognisk ulega reorganizacji w czasie, ponieważ względna ilość białka 53 BP1 w ognisku, wskazywana przez wzrost sygnału azotu, wydaje się zwiększać, podczas gdy chromatyna, wskazywana przez sygnał fosforu, zajmuje bardziej peryferyjną pozycję.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania napromieniowanych komórek wykazujących ekspresję białek naprawy DNA w celu analizy ultrastruktury chromatyny w ogniskach naprawy DNA z wykorzystaniem obrazowania spektroskopowego elektronów. Należy pamiętać, że praca z buforem sodium cacodylate, cyjankiem potasu i tlenkiem osmu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium i noszenie rękawiczek.