Name: Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologiczną MUNE do oceny liczby jednostek motorycznych w mięśniach kończyn tylnych myszy. Technika ta umożliwia minimalnie inwazyjne, powtarzalne badania integralności motoneuronów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

WDA jest wspierane przez granty z NIH-NICHD (5K12HD001097-17) i Cure SMA. SJK jest wspierany przez dotacje z NINDS (K08NS067282 i U01NS079163).

Ten protokół został zatwierdzony i przestrzega wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i etyki Centrum Medycznego Uniwersytetu Stanowego Ohio Wexner.
1. Przygotowanie i znieczulenie zwierząt 
<ol>
	<li>Podczas obchodzenia się z myszami noś rękawice.</li>
	<li>Znieczulić myszy wziewnym izofluranem i ułożyć w pozycji leżącej. Wywołaj znieczulenie za pomocą 3-5% izofluranu i natężenia przepływu 1 l na minutęO2. Po indukcji znieczulenia utrzymuj znieczulenie na poziomie 2-3% i 1 l na minutę Natężenie przepływuO2.
	<ol>
		<li>Dostosuj przepływO2 i procentową zawartość izofluranu, aby uzyskać odpowiednie znieczulenie w zależności od stanu chorobowego zwierzęcia, wieku i częstości oddechów. Mniejsze lub słabsze zwierzęta mogą wymagać mniejszej ilości izofluranu do odpowiedniego znieczulenia (tj. 1,5-2,5% izofluranu).</li>
		<li>Potwierdź odpowiednie znieczulenie, wywierając lekki nacisk na opuszkę stopy tylnej kończyny przedmiotem, takim jak kleszcze, aby zademonstrować brak reakcji na wycofanie. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę powierzchni na poziomie 37 °C za pomocą termostatycznej płyty grzewczej, ponieważ zmiany temperatury mogą wpływać na rozmiar i czas trwania CMAP.</li>
	<li>Nałóż maść na bazie ropy naftowej weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Monitoruj poziom znieczulenia, obserwując częstość oddechów i oceniając reakcje odstawienia po nacisku na podkładkę stopy za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Usuń włosy z kończyny tylnej, która ma być badana za pomocą maszynki do strzyżenia. Po usunięciu owłosienia z kończyn tylnych, które mają być badane, lekko wyprostuj kończyny tylne w kolanie, odwodz w biodrach i przymocuj do powierzchni roboczej za pomocą taśmy klejącej (jak pokazano na rysunku 1).</li>
	<li>Po zapisach CMAP i MUNE oraz odstawieniu znieczulenia nie należy pozostawiać zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie zwracaj zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje w pełni.</li>
</ol>
2. Konfiguracja i sprzęt do nagrywania
<ol>
	<li>Umieść elektrody do zapisów CMAP i MUNE, jak pokazano na rysunku 1.</li>
	<li>Użyj dwóch cienkich elektrod pierścieniowych do elektrod nagrywających.
	<ol>
		<li>Umieść aktywną (E1) elektrodę pierścieniową na skórze leżącą na bliższej części mięśnia brzuchatego łydki kończyny tylnej, w stawie kolanowym, a referencyjną elektrodę pierścieniową (E2) na skórze nad środkową częścią śródstopia stopy.</li>
		<li>Aby zmniejszyć impedancję, pokryj skórę pod elektrodami pierścieniowymi żelem, aby wystarczająco nasycić resztki włosów i zmaksymalizować kontakt elektrody ze skórą. Unikaj nadmiernego nakładania żelu elektrodowego, ponieważ może to spowodować powstanie mostka elektrycznego między elektrodami i uniemożliwić dokładne nagrywanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do stymulacji nerwu kulszowego w bliższej kończynie tylnej należy użyć dwóch izolowanych igieł monopolarnych 28 G jako katody i anody. Włóż katodę w okolicy bliższej kończyny tylnej i wprowadź anodę bardziej proksymalnie w tkance podskórnej pokrywającej kość krzyżową.
	<ol>
		<li>Unikaj umieszczania elektrod stymulujących zbyt blisko nerwu kulszowego lub zbyt głęboko, aby bezpośrednio uszkodzić nerw kulszowy lub inną strukturę. Rysunek 1 ilustruje rozmieszczenie elektrod.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku elektrody uziemiającej umieść jednorazową elektrodę powierzchniową na przeciwległej kończynie tylnej lub ogonie.</li>
</ol>
3. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Rwa kulszowa CMAP
	<ol>
		<li>Uzyskaj odpowiedzi na rwę kulszową CMAP poprzez stymulację nerwu kulszowego impulsami fali prostokątnej o czasie trwania 0,1 ms i intensywności w zakresie 1-10 mA.</li>
		<li>Uzyskuj odpowiedzi CMAP wraz ze wzrostem intensywności bodźca, aż amplituda odpowiedzi przestanie rosnąć. Następnie, w celu zapewnienia stymulacji supramaksymalnej, należy zwiększyć stymulację do ~120% intensywności bodźca wykorzystanej do uzyskania maksymalnej odpowiedzi i uzyskania dodatkowej odpowiedzi. Jeśli nie ma dalszego wzrostu rozmiaru CMAP, zapisz tę odpowiedź jako maksymalną wartość CMAP.</li>
		<li>Zapisz amplitudy CMAP od linii podstawowej do szczytu i od szczytu do piku w mV (rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Średnia wielkość potencjału pojedynczej jednostki silnikowej (SMUP) i obliczanie MUNE
	<ol>
		<li>Określ średnią wielkość potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP) za pomocą techniki stymulacji przyrostowej1. Aby uzyskać odpowiedzi przyrostowe, należy zapewnić submaksymalną stymulację trwającą 0,1 ms z częstotliwością 1 Hz, jednocześnie zwiększając intensywność w krokach co 0,03 mA, aby uzyskać minimalne odpowiedzi typu "wszystko albo nic". Uzyskaj początkową odpowiedź o intensywności bodźca od 0,21 mA do 0,70 mA.
		<ol>
			<li>Jeśli początkowa reakcja nie występuje przy intensywności bodźca od 0,21 mA do 0,70 mA, dostosuj stymulującą pozycję katody bliżej lub dalej od pozycji nerwu kulszowego w bliższej części uda, aby odpowiednio zmniejszyć lub zwiększyć wymaganą intensywność bodźca.</li>
			<li>Jeżeli początkowa odpowiedź przyrostowa jest uzyskiwana przy natężeniu bodźca między 0,21 mA a 0,70 mA i spełnia kryteria wymienione poniżej (3.2.2), należy przechowywać i zapisywać dodatkowe przyrosty ze wzrostem intensywności bodźca, dostosowując się w krokach co 0,03 mA, aby uzyskać w sumie 9 dodatkowych przyrostów, które spełniają ustalone kryteria.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podczas pomiarów odpowiedzi przyrostowych należy upewnić się, że każdy przyrost spełnia następujące kryteria.
		<ol>
			<li>Upewnij się, że początkowy ujemny pik odpowiedzi przyrostowych jest czasowo wyrównany w ujemnym piku maksymalnej odpowiedzi CMAP pokazanej jako zacieniona część ilustracji CMAP na rysunku 2.</li>
			<li>Upewnij się, że każda odpowiedź przyrostowa jest stabilna i bez frakcjonowania, ustalona przez obserwację trzech zduplikowanych odpowiedzi. Rozróżniaj wizualnie przyrostowe odpowiedzi w czasie rzeczywistym (nałożone na wcześniej zarejestrowane przyrosty). 
			Uwaga: Każdy przyrost powinien być wizualnie odrębny i większy w porównaniu z poprzednią odpowiedzią (Rysunek 3). Analiza w czasie rzeczywistym pozwala na rozpoznanie odpowiedzi o większej amplitudzie (przyrostowej) w porównaniu z wcześniejszymi odpowiedziami, a niewielkie zmiany związane z szumem tła można pominąć. Nałożony widok 10 przyrostów pokazano na rysunku 4 (B i D), aby dodatkowo zilustrować ten punkt.</li>
			<li>Po wizualnym potwierdzeniu każdego przyrostu upewnij się, że zmierzona różnica amplitudy (potwierdzona odpowiedź-amplituda poprzedniej odpowiedzi = różnica amplitudy) wynosi co najmniej 25 μV.</li>
			<li>Jeśli przyrost jest mniejszy niż 25 μV, należy odrzucić i ponownie zmierzyć odpowiedź. Po zarejestrowaniu 10 odpowiedzi przyrostowych należy ocenić przyrosty, aby upewnić się, że amplituda każdej pojedynczej odpowiedzi przyrostowej nie jest większa niż 1/3 sumy wszystkich dziesięciu przyrostów (tj. całkowitej amplitudy odpowiedzi końcowej). Jeśli ten warunek nie jest spełniony, ponownie zmierz odpowiedzi przyrostowe. </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uśrednij 10 wartości przyrostowych, aby oszacować średnią amplitudę potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP) (rysunek 3). Uwaga: Rysunek 3 przedstawia podstawy obliczenia średniej amplitudy SMUP, ale średnią amplitudę SMUP można łatwo obliczyć, dzieląc całą amplitudę końcowej odpowiedzi przyrostowej przez całkowitą liczbę przyrostów (tj. 10). 
		Przykładowe indywidualne obliczenia SMUP (zilustrowane na rysunku 3): 
		SMUP 1 = amplituda międzyszczytowa przyrostu 1 
		SMUP 1=0,050 mV 
		SMUP 2= (amplituda międzyszczytowa przyrostu 2) – (amplituda międzyszczytowa przyrostu 1) 
		SMUP 2=0,150 mV-0,050 mV=0,100 mV
		<ol>
			<li>Oblicz każdy kolejny przyrost (w sumie do 10) i uśrednij dziesięć przyrostów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oblicz MUNE, dzieląc maksymalną amplitudę CMAP (od szczytu do szczytu) przez średnią amplitudę SMUP (od szczytu do szczytu). (MUNE=CMAP/średni SMUP). W niektórych układach elektrofizjologicznych przyrosty SMUP są mierzone w μV, podczas gdy CMAP jest zwykle podawany w mV. W razie potrzeby przekonwertuj wyniki CMAP i SMUP na podobne jednostki przed obliczeniem MUNE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McComas, A. J., Fawcett, P. R., Campbell, M. J., Sica, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+estimation+of+the+number+of+motor+units+within+a+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurology%2C+neurosurgery%2C+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle.</a> Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 34 (2), 121-123 (1971).</li>
<li>Shefner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+number+estimation+in+human+neurological+diseases+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models.</a> Clinical Neurophysiology. 112 (6), 955-964 (2001).</li>
<li>Shefner, J. M., Cudkowicz, M. E., Brown, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+incremental+with+multipoint+MUNE+methods+in+transgenic+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Comparison of incremental with multipoint MUNE methods in transgenic ALS mice.</a> Muscle & Nerve. 25 (1), 39-42 (2002).</li>
<li>Shefner, J. M., Cudkowicz, M., Brown, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+number+estimation+predicts+disease+onset+and+survival+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Motor unit number estimation predicts disease onset and survival in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 34 (5), 603-607 (2006).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Biomarkers+in+Spinal+Muscular+Atrophy%3A+Preclinical+Proof+of+Concept%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+clinical+and+translational+neurology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Biomarkers in Spinal Muscular Atrophy: Preclinical Proof of Concept.</a> Annals of clinical and translational neurology. 1 (1), 34-44 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+three+electrophysiological+methods+for+the+assessment+of+disease+status+in+a+mild+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A comparison of three electrophysiological methods for the assessment of disease status in a mild spinal muscular atrophy mouse model.</a> PloS one. 9 (10), e111428(2014).</li>
<li>Srivastava, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+HSPB1+overexpression+in+neurons+is+sufficient+to+cause+age-related+motor+neuronopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Mutant HSPB1 overexpression in neurons is sufficient to cause age-related motor neuronopathy in mice.</a> Neurobiology of disease. 47 (2), 163-173 (2012).</li>
<li>Yalvac, M., Arnold, E., D, W., Hussain, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP-expressing+dendritic+cells+protect+against+spontaneous+autoimmune+peripheral+polyneuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">VIP-expressing dendritic cells protect against spontaneous autoimmune peripheral polyneuropathy.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (7), 1353-1363 (2014).</li>
<li>Gooch, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+number+estimation%3A+A+technology+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Motor unit number estimation: A technology and literature review.</a> Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).</li>
<li>Arnold, W. D., Kassar, D., Kissel, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+diagnosis+and+management+in+a+new+therapeutic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: diagnosis and management in a new therapeutic era.</a> Muscle Nerve. , (2014).</li>
<li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+denervation+in+SMA%3A+Relation+to+age%2C+SMN2+copy+number%2C+and+function%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function).</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li>
<li>Finkel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+motor+function+scale+association+in+a+pre-symptomatic+infant+with+spinal+muscular+atrophy+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and motor function scale association in a pre-symptomatic infant with spinal muscular atrophy type I.</a> Neuromuscular Disorders. 23 (2), 112-115 (2013).</li>
<li>Kaufmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+cohort+study+of+spinal+muscular+atrophy+types+2+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prospective cohort study of spinal muscular atrophy types 2 and 3.</a> Neurology. 79 (18), 1889-1897 (2012).</li>
<li>Arnold, W. D., Burghes, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+muscular+atrophy%3A+The+development+and+implementation+of+potential+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spinal muscular atrophy: The development and implementation of potential treatments.</a> Annals of Neurology. 74 (3), 348-362 (2013).</li>
<li>Li, J., Sung, M., Rutkove, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiologic+biomarkers+for+assessing+disease+progression+and+the+effect+of+riluzole+in+SOD1+G93A+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Electrophysiologic biomarkers for assessing disease progression and the effect of riluzole in SOD1 G93A ALS mice.</a> PloS one. 8 (6), e65976-65 (2013).</li>
<li>Ngo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+Bayesian+motor+unit+number+estimation+and+histological+measurements+of+motor+neurons+in+wild-type+and+SOD1+%28G93A%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The relationship between Bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and SOD1 (G93A) mice.</a> Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).</li>
<li>Shefner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+MUNE+studies+in+animal+models+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Supplements+to+Clinical+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Recent MUNE studies in animal models of motor neuron disease.</a> Supplements to Clinical neurophysiology. 60, 203-208 (2009).</li>
<li>Souayah, N., Potian, J. G., Garcia, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+number+estimate+as+a+predictor+of+motor+dysfunction+in+an+animal+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology+Endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Motor unit number estimate as a predictor of motor dysfunction in an animal model of type 1 diabetes.</a> American journal of physiology Endocrinology and metabolism. 297 (3), E602-E608 (2009).</li>
<li>Zhou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+comparison+in+monitoring+disease+progression+of+G93A+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+official+publication+of+the+World+Federation+of+Neurology+Research+Group+on+Motor+Neuron+Diseases%22%5BJournal%5D)">A method comparison in monitoring disease progression of G93A mouse model of ALS.</a> Amyotrophic lateral sclerosis: official publication of the World Federation of Neurology Research Group on Motor Neuron Diseases. 8 (6), 366-3672 (2007).</li>
<li>Feng, X. H., Yuan, W., Peng, Y., Ss Liu, M., Cui, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+dl-3-n-butylphthalide+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+medical+journal%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of dl-3-n-butylphthalide in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Chinese medical journal. 125 (10), 1760-1766 (2012).</li>
<li>Mancuso, R., Santos-Nogueira, E., Osta, R., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+analysis+of+a+murine+model+of+motoneuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+neurophysiology+%3A+official+journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological analysis of a murine model of motoneuron disease.</a> Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 122 (8), 1660-1670 (2011).</li>
<li>Lee, Y. i, Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+show+profound+defects+in+neuromuscular+development+even+in+the+absence+of+failure+in+neuromuscular+transmission+or+loss+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons.</a> Developmental biology. 356 (2), 432-444 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MUNE i CMAP są klinicznie istotnymi pomiarami, często stosowanymi w badaniach naukowych i monitorowaniu pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, takimi jak ALS i rdzeniowy zanik mięśni (SMA)9, 10. Na przykład w SMA CMAP i MUNE dobrze korelują z wiekiem, nasileniem i klinicznymi wskaźnikami funkcji10-14. Oba pomiary są minimalnie inwazyjne i umożliwiają ocenę funkcji podłużnie u tej samej osoby. Co ważne, pomiary te nie mogą mierzyć aktywacji lub rekrutacji jednostki motorycznej przez korowe neurony ruchowe, ale zapewniają klinicznie istotną ocenę integralności neuronu ruchowego i jego funkcjonalnego odpowiednika, jednostki motorycznej.
Zwierzęce modele chorób nerwowo-mięśniowych mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów patogennych chorób u ludzi oraz dla przedklinicznego rozwoju potencjalnie skutecznych środków terapeutycznych. Zdolność do translacji miar wyników i biomarkerów, które można wykorzystać u różnych gatunków, może ułatwić i przyspieszyć przełożenie obiecujących wyników przedklinicznych na badania kliniczne na ludziach. Kilka grup wykorzystało wcześniej zarówno pomiary elektrofizjologiczne, jak i siłowe (mechaniczne) do oszacowania funkcji jednostek motorycznych w modelachmyszy 2-4, 15-22. Ze względu na względną złożoność pomiarów, udoskonaliliśmy te techniki w formacie wizualnym, aby umożliwić szersze stosowanie i implementację u myszy. Format demonstracji wideo i instrukcji pozwala na podkreślenie kluczowych etapów procedury i wyeliminowanie potencjalnych pułapek. Zastosowanie tych technik do badań przedklinicznych potencjalnych terapii w chorobach neuronu ruchowego może poprawić przełożenie przypuszczalnych terapii z myszy na chorobę ludzką.
W procesie uzyskiwania odpowiedzi CMAP i MUNE składa się z kilku krytycznych etapów. Prawidłowe i spójne rozmieszczenie elektrod rejestrujących oraz wystarczający kontakt elektrody z kończyną tylną mają kluczowe znaczenie dla powtarzalnego pomiaru amplitudy i zmniejszenia szumu tła. Dlatego należy konsekwentnie potwierdzać bliski kontakt skóry kończyn tylnych z elektrodami. Odkryliśmy, że elektrody powierzchniowe oferują bardziej spójne zapisy CMAP i MUNE niż elektrody igłowe. Ze względu na bardzo cienkie tkanki podskórne, niewielkie ruchy powierzchni zapisu igły mogą prowadzić do dużych różnic w amplitudach CMAP. Ponadto bardziej inwazyjny charakter elektrod igłowych nie jest optymalny dla nowonarodzonych myszy lub badań podłużnych ze względu na potencjalne zakłócenia i urazy mięśni. Jedna potencjalna wada nieselektywnych zapisów elektrod powierzchniowych wiąże się z możliwością zmniejszonej rozdzielczości fenotypu, jeśli jeden mięsień jest mniej lub bardziej zaangażowany w porównaniu z innym, i zostało to zgłoszone w mysim modeluALS 21.
Uzyskanie średniego rozmiaru SMUP jest technicznie trudniejsze w porównaniu z CMAP. Ze względu na mniejszy rozmiar odpowiedzi (w zakresie μV, a nie mV) szum tła może być bardziej problematyczny. Szum tła można zredukować, regulując elektrodę masową, katodę, anodę i sprawdzając inne urządzenia elektryczne w pobliżu konfiguracji eksperymentalnej. Klatka Faradaya, zwykle używana do zastosowań w elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej, nie jest wymagana. Wizualne określanie poszczególnych odpowiedzi SMUP jest najtrudniejszą umiejętnością do zdobycia i wymaga praktyki w celu uzyskania spójnych wyników z odpowiednią powtarzalnością. Ważne jest, aby upewnić się, że SMUP, które są rejestrowane, inicjują się w czasie trwania maksymalnej odpowiedzi CDAP. Określiliśmy kryteria akceptacji poszczególnych odpowiedzi przyrostowych, aby ułatwić przeprowadzenie tego procesu i zwiększyć wiarygodność wewnątrz i między oceniającymi.
Jedną z potencjalnych wad techniki przyrostowej MUNE jest możliwość przeszacowania liczby funkcjonalnych jednostek motorycznych z powodu naprzemienności jednostek motorycznych. Użyliśmy techniki podobnej do Shefnera i wsp. W tym sensie, że każda odpowiedź powinna być powtarzalnie widziana w sumie 3 razy, aby zmniejszyć wpływ tego zjawiska3.
Z naszego doświadczenia wynika, że kliniczne systemy elektrodiagnostyczne są zoptymalizowane pod kątem opisanych w nich badań ze względu na ulepszoną ergonomię interfejsu między egzaminatorem a systemem elektrodiagnostycznym, co ułatwia kontrolę. System dwukanałowy stosowany w naszym laboratorium wyposażony jest w dwa nieprzełączane kanały wzmacniacza wykorzystujące wzmacniacz z 24-bitowym przetwornikiem analogowo-cyfrowym i częstotliwością próbkowania 48 kHz na kanał. Wzmocnienie sprzętowe można regulować w zakresie od 10 nV do 100 mV/działkę. Filtr niskich tonów ma zakres od 0,2 Hz-5 kHz, a ustawienia filtra wysokich tonów od 30 Hz-10 kHz. Stosowany jest stymulator prądu stałego (natężenie: 0-100 mA; czas trwania: 0,02-1 ms). Większość systemów klinicznych ma podobne odpowiednie funkcje i można je dostosować tak, aby odpowiednio rejestrować odpowiedzi CMAP i MUNE. Dodatkowo, standardowe zestawy elektrofizjologiczne mogą być zmontowane, aby odpowiednio rejestrować CMAP i MUNE, ale interfejs może wymagać dostosowania w celu łatwej regulacji stymulacji i szybkiej identyfikacji odpowiedzi CMAP i SMUP.
Wcześniej wykorzystaliśmy opisane tutaj techniki CMAP i MUNE, aby umożliwić szybką i powtarzalną ocenę unerwionego mięśnia kulszowego kończyny tylnej u myszy we wczesnym okresie poporodowym do dorosłości5. Techniki te umożliwiają ocenę w modelach mysich, gdy testy behawioralne funkcji motorycznych są niewykonalne lub są mniej wiarygodne. Zastosowanie tej techniki u nowonarodzonych myszy ułatwia badanie rozwoju jednostek motorycznych i może poszerzyć naszą wiedzę na temat unerwienia i przycinania neuronów ruchowych. Na przykład wykazaliśmy, że liczba funkcjonalnych jednostek motorycznych zarejestrowanych za pomocą MUNE wzrośnie podczas przycinania z unerwienia polineuronalnego do mononeuronalnego w ciągu pierwszych dwóch tygodni życia u nowonarodzonych myszy5. Możliwość testowania myszy przez długi czas za pomocą tej techniki nadaje się do badania reakcji jednostek motorycznych na uszkodzenie nerwów obwodowych, dziedziczne zaburzenia nerwowo-mięśniowe i starzenie się.

Szacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) zostało pierwotnie opisane przez McComas et al. ponad trzy dekady temu1. Pierwotna technika polegała na modyfikacji techniki rejestracji złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP), która wykorzystywała stopniowe zwiększanie stymulacji w celu uzyskania submaksymalnych przyrostów. Przyrosty te zostały zsumowane i uśrednione w celu określenia szacowanej wielkości potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP). Wielkość ta została podzielona na odpowiedź CMAP w celu oszacowania liczby jednostek motorycznych unerwiających badany mięsień. Zgodnie z pierwotnym opisem, liczne warianty wykorzystujące zarówno reakcje elektrofizjologiczne, jak i pomiary siły przyrostowej (mechanicznej) zostały wykorzystane zarówno w badaniach na ludziach, jak i w modelach zwierzęcych2. Technika MUNE została zmodyfikowana przez Shefnera i współpracowników w celu zbadania mysich modeli stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)3, 4.
W obecnym opisie szczegółowo opisujemy uproszczone modyfikacje technik MUNE, które są szybkie do wykonania. Co ważne, CMAP i MUNE umożliwiają wiarygodne pomiary zarówno u noworodków, jak i dorosłych myszyw wieku 5-8 lat. Doświadczone osobniki mogą wykonać te pomiary w ciągu 10-20 minut na zwierzę, a wielokrotne pomiary są wykonalne, co pozwala na uzyskanie danych dotyczących zmian w czasie5. W prowadzonych obecnie badaniach wykorzystujemy kliniczny system elektrodiagnostyczny. Z naszego doświadczenia wynika, że kliniczne systemy elektrodiagnostyczne są zoptymalizowane pod kątem szybkiego i wydajnego przechwytywania danych elektrofizjologicznych in vivo, niemniej jednak standardowe stanowiska elektrofizjologiczne można łatwo dostosować do tego zastosowania.

<table><tbody><tr><td>Profesjonalny trymer Zestaw do pielęgnacji zwierząt</td><td>Oster</td><td>078577-010-003</td><td>maszynki do strzyżenia do depilacji</td></tr><tr><td>System EMG Synergy T2</td><td>Natus Neurology</td><td>Model nie jest już dostępny</td><td>przenośny system elektrodiagnostyczny</td></tr><tr><td>igły monopolarne 28 G</td><td>Teca</td><td>017K121</td><td>elektrody stymulujące katodę i anodę</td></tr><tr><td>Alpine Biomed Digital Ring Electrode ze skręconymi drutami i złączami TP 1,5 mm.</td><td>Elektrody nagrywające</td> <td>Alpine Biomed</td><td>9013S0312</td></tr><tr><td>Pomocna dłoń klips aligatora z żelazną podstawą</td><td>Radio Shack</td><td>64-079</td><td>Utrzymanie umieszczenia elektrody nagrywającej&nbsp;</td></tr><tr><td>Żel elektrodowy Spectra 360&nbsp;</td><td>Parker Laboratories</td><td>9013G5012</td><td>stosowany w celu zmniejszenia impedancji skóry</td></tr><tr><td>monojektowa strzykawka do irygacji z zakrzywioną końcówką</td><td>Covidien</td><td>81412012</td><td>wykorzystywany do aplikacji</td></tr><tr><td>igłowego EMG</td> w żelu elektrodowym <td>Teca</td><td>902-RLC-TP&nbsp;</td><td>do podłączenia elektrod monopolarnych do stymulatora elektrodiagnostycznego</td></tr><tr><td>Jednorazowa elektroda 2" x 2" lub podobnie przycięta w razie potrzeby</td><td>Carefusion</td><td>019-415000&nbsp;</td><td>elektroda uziemiająca</td></tr><tr><td>Mała płyta grzewcza z wbudowanym czujnikiem RTD, 15 x10 cm</td> Płyta grzewcza <td>World Precision Instruments</td><td>61830</td><td>używana z regulatorem temperatury zwierząt do przekazywania ciepła zwierzętom</td></tr><tr><td>Silikonowa podkładka do użytku z ATC2000</td><td>World Precision Instruments</td><td>503573</td><td>przewodząca wyjmowana podkładka zakrywająca płytę grzewczą ułatwiająca czyszczenie</td></tr><tr><td>Regulator temperatury zwierząt</td><td>World Precision Instruments</td><td>ATC2000</td><td>Cichy system ogrzewania zwierząt do utrzymywania temperatury zwierząt</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna na bazie ropy naftowej&nbsp;</td><td>Puralube</td><td>26870</td><td>stosowany podczas znieczulenia w celu uniknięcia uszkodzenia rogówki</td></tr></tbody></table>

elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (mune) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (cmap) w mięśniach kończyn tylnych myszy

Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles

Złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) i szacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) to techniki elektrofizjologiczne, które mogą być używane do monitorowania stanu funkcjonalnego puli jednostek motorycznych in vivo. Pomiary te mogą zapewnić wgląd w prawidłowy rozwój i zwyrodnienie układu nerwowo-mięśniowego. Środki te mają wyraźny potencjał translacyjny, ponieważ są rutynowo stosowane w badaniach diagnostycznych i klinicznych na ludziach. Przedstawiamy techniki elektrofizjologiczne podobne do tych stosowanych u ludzi, aby umożliwić rejestrację funkcji nerwu kulszowego myszy. Odpowiedź CMAP reprezentuje elektrofizjologiczny wynik z mięśnia lub grupy mięśni po supramaksymalnej stymulacji nerwu obwodowego. MUNE jest techniką elektrofizjologiczną, która opiera się na modyfikacjach odpowiedzi CMAP. MUNE to obliczona wartość, która reprezentuje szacowaną liczbę neuronów ruchowych lub aksonów (dane wejściowe kontroli motorycznej) zaopatrujących badany mięsień lub grupę mięśni. Przedstawiamy metody rejestrowania odpowiedzi CMAP z mięśni proksymalnych nóg za pomocą powierzchniowych elektrod rejestrujących po stymulacji nerwu kulszowego u myszy. Opisano technikę przyrostowego MUNE przy użyciu bodźców submaksymalnych w celu określenia średniej wielkości potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP). MUNE oblicza się, dzieląc amplitudę CMAP (peak-to-peak) przez amplitudę SMUP (peak-to-peak). Te techniki elektrofizjologiczne pozwalają na powtarzanie pomiarów zarówno u noworodków, jak i dorosłych myszy w taki sposób, że ułatwiają szybką analizę i gromadzenie danych, jednocześnie zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do badań eksperymentalnych. Co więcej, pomiary te są podobne do tych zarejestrowanych w badaniach na ludziach, co pozwala na bardziej bezpośrednie porównania.

Techniki CMAP i MUNE opisane w niniejszym raporcie umożliwiają rejestrację funkcji nerwowo-mięśniowej mięśni kończyny tylnej unerwionych przez nerw kulszowy przy wykorzystaniu małoinwazyjnego umiejscowienia elektrod (Rycina 1). Supramaksymalną wielkość CMAP, która reprezentuje całkowity wyjściowy sygnał z grupy mięśniowej, można opisać za pomocą parametrów amplitudy i pola (Rycina 2), jednak w obecnych metodach wykorzystujemy amplitudę do ilościowego określenia wielkości CMAP oraz SMUP. Ponieważ odpowiedź CMAP mierzy sumaryczną depolaryzację włókien mięśniowych w obrębie mięśnia, patologia na każdym etapie od neuronu ruchowego do włókna mięśniowego może skutkować zmniejszeniem wielkości CMAP. W związku z tym CMAP stanowi doskonałą miarę całkowitego stanu funkcjonalnego. Zgodnie z oczekiwaniami, wielkość CMAP będzie wzrastać podczas rozwoju5. Ze względu na zmiany kompensacyjne, które mogą wystąpić po denerwacji (t.j. kiełkowanie poboczne), wielkość CMAP może zostać zachowana mimo procesów utraty neuronów ruchowych lub aksonów ruchowych. Dlatego technika MUNE jest niezbędna do określenia wkładu neuronów ruchowych lub aksonów w mięsień lub grupę mięśni poddawanych badaniu. Rejestracja poszczególnych przyrostów (Rycina 3) pozwala na oszacowanie średniego wyjścia pojedynczych jednostek ruchowych (wielkość SMUP), co dostarcza bardziej szczegółowych informacji o stanie funkcjonalnym jednostek ruchowych.
CMAP oraz MUNE mogą być wykorzystywane do pomiaru funkcji nerwowo-mięśniowych w różnych modelach mysich chorób nerwowo-mięśniowych. Na Rysunku 4 zestawiono wyniki uzyskane u dorosłej myszy kontrolnej oraz u dorosłej myszy 11 tygodni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego. Po zmiażdżeniu nerwu kulszowego wartość MUNE jest znacznie obniżona do szacunkowych 50 funkcjonalnych jednostek motorycznych w porównaniu z prawidłowym wynikiem 278 funkcjonalnych jednostek motorycznych u myszy kontrolnej. Z kolei amplituda CMAP u zwierzęcia po zmiażdżeniu (39,6 mV od linii bazowej do szczytu, 74,9 mV od szczytu do szczytu) wykazuje jedynie niewielki spadek w porównaniu z grupą kontrolną (49,0 mV od linii bazowej do szczytu, 84,2 mV od szczytu do szczytu) ze względu na wypustkowanie kolateralne.
<img alt="Układ do operacji na szczurze; przymocowane sondy do elektromiografii (EMG); pomiar aktywności mięśni." src="/files/ftp_upload/52899/52899fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Rozmieszczenie elektrod. Czarna elektroda „aktywna” (E1) (A) oraz czerwona elektroda rejestrująca „referencyjna” (E2) (B) są umieszczone nad mięśniem brzuchatym łydki w jego proksymalnej części przy kolanie. Stymulująca katoda (czarna) (C) oraz anoda (czerwona) (D) są wprowadzane podskórnie proksymalnie względem elektrod rejestrujących w celu wygenerowania odpowiedzi dystalnych. Jednorazowa elektroda tarczowa (D) jest umieszczana na kończynie tylnej, ogonie lub kości krzyżowej jako uziemienie, aby zminimalizować artefakty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat dopasowania widma przedstawiający analizę piku absorpcji z zaznaczonymi obszarami sygnałów A i B." src="/files/ftp_upload/52899/52899fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Złożony potencjał czynnościowy mięśnia. Na ilustracji przedstawiono reprezentatywną odpowiedź CMAP. (A) Amplitudę od linii bazowej do piku mierzy się od izoelektrycznej linii bazowej do początkowego piku ujemnego (napięcie ujemne przedstawiono powyżej linii bazowej). (B) Amplitudę od piku do piku mierzy się od napięcia piku ujemnego do napięcia piku dodatniego. Szary obszar oznacza pole piku ujemnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przyrosty elektrofizjologiczne, pomiary w mV, pokazują nałożone na siebie wyniki przebiegów falowych; wykres analityczny." src="/files/ftp_upload/52899/52899fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reakcje przyrostowe. Przedstawiono dwie reprezentatywne reakcje przyrostowe, nałożone na siebie oraz w izolacji. Do obliczeń MUNE amplitudy każdego przyrostu są mierzone od szczytu do szczytu. Przyrost nr 1 to zarejestrowana początkowa odpowiedź typu wszystko albo nic, która reprezentuje pojedynczy potencjał jednostki motorycznej (SMUP). Każdy kolejny przyrost (#2-10) reprezentuje kwantowy wzrost nałożony na poprzednią odpowiedź. W związku z tym, aby uzyskać amplitudy SMUP dla przyrostów 2-10, od amplitudy otrzymanego przyrostu odejmuje się amplitudę poprzedniej odpowiedzi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat potencjałów czynnościowych nerwu kulszowego; nerw prawidłowy i zmiażdżony z reinnerwacją, sygnały elektryczne." src="/files/ftp_upload/52899/52899fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Przykład CMAP i MUNE nerwu kulszowego. (A) Złożony potencjał czynnościowy mięśnia (CMAP) nerwu kulszowego u dorosłej myszy kontrolnej (6 miesięcy) z amplitudą od linii bazowej do szczytu wynoszącą 49,0 mV i amplitudą od szczytu do szczytu wynoszącą 84,2 mV. Czułość ekranu=10 mV na dywizję i czas trwania ekranu 10 ms. (B) Dziesięć odpowiadających temu odpowiedzi przyrostowych (u myszy kontrolnej) o całkowitej amplitudzie 3,028 mV podzielono przez 10, aby wyznaczyć średnią wielkość SMUP (0,3028 mV). Czułość ekranu=0,5 mV i prędkość przesuwu 1 ms na dywizję. Obliczone MUNE=278 (MUNE=CMAP/średnia SMUP (84,2 mV/ 0,3028 mV)) (C) CMAP nerwu kulszowego 11 tygodni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego u dorosłej myszy (6 miesięcy), wykazujący lekko obniżoną amplitudę od linii bazowej do szczytu (39,6 mV) i amplitudę od szczytu do szczytu (74,9 mV). Czułość ekranu=10 mV na dywizję i prędkość przesuwu 1 ms na dywizję. (D) Dziesięć odpowiadających temu odpowiedzi przyrostowych (u myszy ze zmiażdżeniem nerwu) o całkowitej amplitudzie od szczytu do szczytu 14,923 mV podzielone przez 10 w celu uzyskania średniej wielkości SMUP wynoszącej 1,4923 mV. Czułość ekranu=2 mV na dywizję i prędkość przesuwu 1 ms na dywizję. Obliczone MUNE=50 (MUNE=CMAP/średnia SMUP (74,9 mV/1,4923 mV)). (**Należy zwrócić uwagę na inną czułość dla odpowiedzi przyrostowych myszy ze zmiażdżeniem nerwu kulszowego). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52899/52899fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Prezentujemy udoskonalone protokoły, które pozwalają na monitorowanie in vivo funkcji jednostki motorycznej u myszy. Opisano techniki pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) i szacowania liczby jednostek motorycznych (MUNE) w mięśniach kończyn tylnych myszy unerwionych przez nerw kulszowy.

Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy

Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest oszacowanie liczby funkcjonalnych jednostek motorycznych unerwiających mięśnie triceps surae u myszy in vivo. Osiąga się to poprzez uprzedni pomiar maksymalnej amplitudy CMAP z mięśni triceps surae. W drugim kroku uzyskuje się 10 podmaksymalnych odpowiedzi przyrostowych, które następnie uśrednia się, aby otrzymać średnią amplitudę potencjału czynnościowego pojedynczej jednostki motorycznej.Następnie amplitudę CMAP dzieli się przez średnią amplitudę SUP. W celu obliczenia MUNE, wyniki zapewniają szacunkową wartość in vivo liczby funkcjonalnych jednostek motorycznych unerwiających mięśnie triceps surae kończyny. Elektrofizjologiczna technika szacowania liczby jednostek motorycznych, czyli MUNE, może być wykorzystywana do badania terapii przedklinicznych zaburzeń lub urazów obwodowego układu nerwowego.Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania modelu mysiego Delta seven w rdzeniowym zaniku mięśni. W modelu tym występuje ciężki fenotyp, co zmusiło nas do badania myszy noworodkowych. W związku z tym technikę tę można stosować zarówno u myszy noworodkowych, jak i u myszy dorosłych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa dla uzyskania powtarzalnych odpowiedzi inkrementalnych, co pozwala na dokładną oszacowanie liczby funkcjonalnych jednostek motorycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami pomiaru jednostek motorycznych u myszy, takimi jak metody opierające się na pomiarach siły inkrementalnej, jest fakt, że jest ona małoinwazyjna i może być powtarzana w czasie. Możliwość przeprowadzania klinicznie istotnych, wiarygodnych i powtarzalnych ocen integralności jednostek motorycznych w modelach chorób neuronu ruchowego oraz uszkodzeń nerwów obwodowych zwiększa potencjał translacyjny tych modeli i pogłębia nasze zrozumienie czynników determinujących utrzymanie i zdrowie jednostek motorycznych.Aby przeprowadzić pomiary CMAP oraz MUNI, umieść aktywną elektrodę pierścieniową na skórze, nad proksymalną częścią kończyny tylnej, w obrębie mięśnia brzuchatego znieczulonej myszy. Następnie umieść referencyjną elektrodę pierścieniową na skórze nad środkową częścią śródstopia. W celu zmniejszenia impedancji pokryj skórę i pozostałe włosy pod elektrodami pierścieniowymi żelem, aby zmaksymalizować kontakt elektrod ze skórą. Unikaj nadmiernego nakładania żelu do elektrod, ponieważ może to spowodować powstanie mostka elektrycznego między elektrodami i uniemożliwić dokładny zapis podczas stymulacji nerwu kulszowego.Wprowadź izolowaną jednobiegunową igłę o rozmiarze 28 G jako katodę do proksymalnej części kończyny tylnej. Należy unikać wprowadzania elektrod stymulujących zbyt blisko nerwu kulszowego lub zbyt głęboko, aby nie uszkodzić nerwu kulszowego ani innych struktur. Wprowadź drugą izolowaną jednobiegunową igłę o rozmiarze 28 G jako anodę, bardziej proksymalnie w tkankę podskórną nad kością krzyżową. Następnie umieść jednorazową elektrodę powierzchniową jako elektrodę uziemiającą na przeciwległej kończynie tylnej lub ogonie.W tej procedurze należy uzyskać odpowiedzi CMAP nerwu kulszowego poprzez stymulację nerwu kulszowego impulsami prostokątnymi o czasie trwania 0,1 milliseconds. Należy rejestrować odpowiedzi CMAP przy zwiększającej się intensywności bodźca od 1 do 10 milliamps, aż do momentu, gdy amplituda odpowiedzi przestanie wzrastać. Aby zapewnić stymulację supramaksymalną, należy zwiększyć stymulację do około 120% intensywności bodźca wykorzystanej do uzyskania maksymalnej odpowiedzi i zarejestrować dodatkową odpowiedź.Jeśli nie nastąpi dalszy wzrost wielkości cmap, należy zarejestrować tę odpowiedź jako maksymalne cmap. Następnie należy zapisać amplitudy cmap od linii bazowej do szczytu oraz od szczytu do szczytu w milivoltach. Aby wyznaczyć średnią wielkość SUP, należy zastosować technikę stymulacji inkrementalnej, podając stymulację podmaksymalną przy jednoczesnym zwiększaniu natężenia w przyrostach 0,03 miliampera w celu uzyskania minimalnych odpowiedzi typu wszystko albo nic.Jeśli początkowa odpowiedź nie występuje przy intensywności bodźca między 0,21 milliamps a 0,70 milliamps, należy przesunąć katodę stymulującą bliżej lub dalej od miejsca przebiegu nerwu kulszowego w bliższej części uda. Uzyskaj początkową odpowiedź przyrostową przedstawioną tutaj. Upewnij się, że latencja ujemnego piku odpowiedzi przyrostowej jest mniej więcej zbieżna z ujemnym pikiem wcześniej uzyskanej maksymalnej odpowiedzi cmap.Należy upewnić się, że odpowiedź jest stabilna i bez frakcjonowania, obserwując trzy spójne odpowiedzi inkrementalne w czasie rzeczywistym, oraz potwierdzić, że amplituda wynosi co najmniej 25 microvolts. Następnie należy uzyskać drugą odpowiedź inkrementalną, upewniając się, że przyrost jest stabilny i bez frakcjonowania poprzez nałożenie trzech odpowiedzi inkrementalnych w czasie rzeczywistym. Drugi przyrost powinien być wyraźnie widoczny i o co najmniej 25 microvolts większy od poprzedniej odpowiedzi.Następnie uzyskaj trzecią odpowiedź przyrostową, upewniając się, że przyrost jest stabilny i nie występuje frakcjonowanie. Podobnie jak w przypadku wcześniej pokazanej drugiej odpowiedzi przyrostowej, trzeci przyrost powinien być wyraźnie widoczny i mieć amplitudę większą o co najmniej 25 µV od drugiej odpowiedzi. Kontynuuj pozyskiwanie odpowiedzi przyrostowych w ten sposób, aż zostanie zarejestrowanych łącznie 10 odpowiedzi przyrostowych.Oceń przyrosty, aby upewnić się, że amplituda każdej pojedynczej odpowiedzi przyrostowej jest mniejsza niż jedna trzecia sumy wszystkich 10 przyrostów. Następnie wykorzystaj 10 wartości przyrostowych do wyznaczenia średniej amplitudy SUP. Przedstawiono obliczone wartości dla 10 odpowiedzi przyrostowych.Średni rozmiar SUP wyznacza się poprzez uśrednienie 10 przyrostów lub po prostu dzieląc ostatni przyrost przez 10. Następnie oblicza się muni, dzieląc maksymalną amplitudę cmap od szczytu do szczytu przez średnią amplitudę SM. Aby zilustrować zastosowanie tych technik, zbadaliśmy wpływ zmiażdżenia nerwu kulszowego na funkcję jednostki motorycznej.Na tej rycinie porównano odpowiedzi u dorosłej myszy kontrolnej oraz u dorosłej myszy 11 tygodni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego; nie stwierdzono różnic w czułości między pomiarami. Po zmiażdżeniu nerwu kulszowego liczba jednostek motorycznych (muni) jest znacznie zredukowana i wynosi szacunkowo 50 funkcjonalnych jednostek motorycznych w porównaniu z prawidłowym wynikiem 278 funkcjonalnych jednostek motorycznych u myszy kontrolnej. W przeciwieństwie do tego, amplituda CMAP u zwierzęcia po urazie wykazuje jedynie niewielki spadek w porównaniu z grupą kontrolną, co wynika z pączkowania kolateralnego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić szacowanie liczby jednostek motorycznych w mięśniach kończyn tylnych myszy in vivo. Po opanowaniu tej techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zazwyczaj zajmuje mniej niż 20 minut. Mamy nadzieję, że ta wizualna prezentacja protokołu przyczyni się do szerokiego zastosowania tej ważnej techniki, co w naszej opinii doprowadzi do poprawy powtarzalności między laboratoryjnej oraz skutecznego przeniesienia odkryć laboratoryjnych na efektywne terapie kliniczne.

electrophysiological-motor-unit-number-estimation-mune-measuring

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Ta nowa metoda umożliwia jednoczesną rejestrację wewnątrzkomórkową pojedynczego motoneuronu dorosłej myszy oraz pomiar siły generowanej przez jego włókna mięśniowe. Połączone badanie właściwości elektrycznych i mechanicznych jednostek motorycznych u zwierząt zdrowych i modyfikowanych genetycznie stanowi przełom w badaniach nad układem nerwowo-mięśniowym.

Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Ten film demonstruje technikę in vivo pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) u myszy. Przedstawiono w nim kroki ustawiania elektrod, stymulacji neuronów kończyn przednich, które unerwiają włókna mięśniowe, oraz rejestrowania reakcji mięśni. Technika ta ocenia demielinizację neuronów i funkcjonalną utratę neuronów.

Pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni w mięśniach kończyn przednich myszy in vivo

Ten film demonstruje procedurę rejestrowania złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) u szczurów poprzez zastosowanie bodźców elektrycznych do nerwu łokciowego, dostosowanie elektrod do optymalnego sygnału i zwiększenie stymulacji w celu oceny funkcjonalności nerwu. Metoda ta umożliwia badanie in vivo funkcji nerwów obwodowych w zaburzeniach neurologicznych.

Pomiar in vivo złożonego potencjału czynnościowego mięśni u szczura

Ten film opisuje rejestrowanie złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP) we włóknach mięśniowych przepony u szczura poprzez stymulację nerwu przeponowego. Stymulacja impulsem elektrycznym nerwu przeponowego o dużej intensywności generuje potencjały czynnościowe we włóknach mięśniowych przepony, które obserwuje się poprzez uzyskanie krzywej odpowiedzi.

Pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni poprzez stymulację nerwu przeponowego u szczura

Ten protokół opisuje nową metodę szacowania liczby funkcjonujących jednostek motorycznych w mięśniu, poprzez dopasowanie modelu do szczegółowej krzywej bodziec-odpowiedź złożonego potencjału czynnościowego mięśni. Jest szybki i łatwy do wykonania i analizy oraz ma doskonałą powtarzalność.

CMAP Scan MUNE (MScan) - Nowatorska metoda szacowania liczby jednostek motorycznych (MUNE)

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Prezentowany jest protokół do wytwarzania różnych typów uszkodzeń nerwu pośrodkowego (MN) i naprawy u szczura. Dodatkowo protokół pokazuje, jak ocenić funkcjonalną regenerację nerwu za pomocą kilku nieinwazyjnych testów behawioralnych i pomiarów fizjologicznych.

Funkcjonalne i fizjologiczne metody oceny regeneracji nerwu pośrodkowego u szczura

Ta metoda pozwala na rejestrację siły skurczów skurczowych i tężcowych oraz potencjałów czynnościowych w trzech typach jednostek motorycznych w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowego szczura. Izolacja funkcjonalna pojedynczej jednostki silnikowej jest indukowana przez stymulację elektryczną aksonu.

Funkcjonalna izolacja pojedynczych jednostek motorycznych mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego szczura

W tym badaniu prezentujemy metodę in vivo do szacowania liczby i wielkości jednostek motorycznych w celu ilościowego określenia połączenia jednostki motorycznej membrany szczura. Opisano podejście krok po kroku do tych technik.

Ocena miar wyników łączności przepony przeponowej jednostki motorycznej szczura jako ilościowych biomarkerów zwyrodnienia i kompensacji neuronów ruchowych frenii

Inchworming to wysoce powtarzalny synchroniczny ruch kopania wyświetlany przez myszy BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR) po umieszczeniu w klatce testowej z wystarczającą ilością ściółki trocinowej.  Procedura jest modyfikacją protokołu interakcji społecznych dla nieletnich i jest stosowana tutaj do oceny powtarzających się stereotypów motorycznych związanych z zaburzeniami ze spektrum autyzmu.

Gąsienicowość: nowa stereotypia motoryczna w mysim modelu autyzmu BTBR T+ Itpr3tf/J

Poznaj metodę elektrofizjologiczną MUNE do oceny liczby jednostek motorycznych w mięśniach kończyn tylnych myszy. Technika ta umożliwia minimalnie inwazyjne, powtarzalne badania integralności motoneuronów in vivo.

Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy

Przeglądaj więcej filmów