Wytwarzanie skalowalnych, metalicznych nanokompozytów o wysokim współczynniku kształtu w biologicznym ciekłym ośrodku

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie liniowych mikro- i nanokompozytów o wysokim współczynniku kształtu, przy użyciu cysteiny oraz materiałów wyjściowych zawierających miedź. Osiąga się to poprzez wstępne połączenie poddanych sonikacji nanocząsteczek miedzi lub siarczanu miedzi z cysteiną i wodą w sterylnej, wentylowanej kolbie hodowlanej. Drugim etapem syntezy jest umieszczenie kolby z połączonymi składnikami w inkubatorze z 5%CO2 w temperaturze 37°C na co najmniej sześć godzin.

Następnie kolbę ogląda się gołym okiem oraz pod mikroskopem świetlnym. Aby określić stopień formowania się struktur liniowych, w ostatnim kroku przerywa się syntezę, umieszczając kolbę w lodówce w temperaturze 4 °C. Ostatecznie do charakterystyki zsyntetyzowanych struktur wykorzystuje się mikroskopię cyfrową. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak osadzanie elektrodowe, jest możliwość łatwego skalowania syntezy w formie ciekłej oraz fakt, że proces przebiega w warunkach fizjologicznych.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę chorób, takich jak nowotwory, ponieważ syntetyczne struktury mogą być degradowane przez komórki, co potencjalnie stwarza możliwość dostarczania leków. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy podczas przeprowadzania eksperymentów badających potencjalną toksyczność różnych nanomateriałów. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, gdyż końcowe etapy syntezy mogą być trudne do opanowania.

Nieprawidłowe procedury mogą prowadzić do powstania struktur zagregowanych lub całkowitego braku struktur. Aby przeprowadzić syntezę samoorganizacyjną z wykorzystaniem nanocząsteczek miedzi lub CMP, należy przygotować roztwór nanocząsteczek miedzi, odważając co najmniej dwa miligramy CMP. Podczas tego kroku należy używać jednorazowych rękawiczek, aby zapobiec ewentualnemu kontaktowi CMP ze skórą.

Przenieść nanocząstki do pustej, sterylnej szklanej fiolki o pojemności 16 mililitrów z fiolki zawierającej CMP. Dodać sterylną wodę dejonizowaną w odpowiedniej objętości, aby przygotować roztwór o stężeniu dwóch miligramów na mililitr, a następnie mieszać roztwór na wortexie przez 20 sekund w celu zapewnienia dyspersji nanocząstek przed rozpoczęciem syntezy. Nie napełniać fiolki wodą powyżej połowy jej objętości, ponieważ będzie to hamować proces.

Po wymieszaniu za pomocą wortexa CMPs szybko opadną na dno probówki, a roztwór przybierze ciemny kolor. Przed rozpoczęciem syntezy poddaj roztwór CNP sonikacji przez 17 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić maksymalną dyspersję CMPs. Okresowo sprawdzaj, czy CMPs mieszają się pod wpływem sonikacji; po pomyślnym przeprowadzeniu tego procesu CMPs pozostają w zawiesinie w roztworze przez co najmniej 30 minut, a roztwór zachowuje ciemny kolor.

Odważ 7,29 mg cystyny do syntezy. Ponieważ cystyna nie rozpuszcza się bezpośrednio w wodzie, przenieś odważoną cystynę do naczynia wagowego zawierającego cysteinę. Dodaj odpowiednią objętość sterylnego 1 M wodorotlenku sodu, aby cystyna całkowicie się rozpuściła, tworząc roztwór o stężeniu 72,9 mg/ml.

Całkowicie rozpuścić cysteinę w 100 µL 1 M wodorotlenku sodu. Następnie połączyć 7 µL rozpuszczonej cysteiny z 6 643 µL sterylnej wody w sterylnej kolbie do syntezy. Umieścić kolbę z połączonym roztworem w inkubatorze na 30 minut w temperaturze 37 °C, pozostawiając korek kolby otwarty, aby zapewnić efektywne mieszanie.

Będzie to roztwór roboczy cysteiny. Resuspender roztwór CNP o stężeniu 2 mg/ml poprzez wirowanie w vortexie przez 30 s, ponieważ CMP osadzą się po etapie sonikacji dla całkowitej objętości syntezy wynoszącej 7 ml. Przenieść roztwór roboczy cysteiny do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm² i dodać 350 µl resuspenderowanych CMP.

Zakręć kolbę, mocno dokręcając korek, aby zapewnić szczelność. Po połączeniu wszystkich składników syntezy delikatnie wymieszaj zawartość kolby, obracając ją cztery lub pięć razy. Umieść kolbę w inkubatorze z dwutlenkiem węgla i odpowietrz ją, poluzowując korek, aby umożliwić wymianę gazową między wnętrzem kolby a otoczeniem.

Podczas syntezy należy pozostawić próbki w inkubatorze przez około 24 godziny. W trakcie syntezy za pomocą mikroskopii oraz gołym okiem można zaobserwować tworzenie się wysoce liniowych kompozytów. Krok ten jest krytyczny, aby upewnić się, że struktury powstają i że proces samorzecznienia nie trwa zbyt długo.

Przerwać syntezę biokompozytów po zaobserwowaniu w kolbie struktur liniowych, szczelnie zamykając kolbę syntezy; należy opisać kolbę, podając warunki syntezy, w tym datę przeprowadzenia syntezy oraz czas inkubacji przed jej przerwaniem. Następnie naczynie należy przechowywać w lodówce, ponieważ powstałe struktury pozostają stabilne w tej formie przez co najmniej rok. Alternatywnie, aby przeprowadzić syntezę samoorganizującą z wykorzystaniem siarczanu miedzi, należy zastąpić CMP solą siarczanu miedzi, stosując technikę sterylną, i rozpuścić co najmniej 2 mg siarczanu miedzi w odpowiedniej objętości sterylnej wody dejonizowanej, aby przygotować roztwór o stężeniu 2 mg/mL.

Kryształy siarczanu miedzi łatwo rozpuszczają się przy tym stężeniu, jednak w razie potrzeby należy wymieszać probówkę w wkręcaniu i sprawdzić wzrokowo, czy wszystkie kryształy rozpuściły się po przygotowaniu siarczanu miedzi. Przeprowadzić syntezę zgodnie z przedstawioną procedurą, zastępując CMP siarczanem miedzi. Scharakteryzować biokompozyty pochodzące z CMP oraz z siarczanu miedzi za pomocą mikroskopii światła białego i mikroskopii elektronowej w celu ich charakterystyki i inspekcji.

Do parasynthesis przy użyciu mikroskopii światła białego należy użyć mikroskopu odwróconego. Kompozyty osiądą na dnie kolby w ciągu kilku minut od położenia jej poziomo, po czym można je ustawić w ostrości. Należy użyć ustawienia pola jasnego w mikroskopie, aby zmaksymalizować kontrast między biokompozytami a medium ciekłym; kompozyty pochodne z CMP i siarczanu miedzi będą miały kolor od przezroczystego do mętnego, natomiast niezreagowane agregaty CNP będą miały bardzo ciemny kolor.

Użyj odwróconej mikroskopii w świetle białym, aby ocenić skuteczność syntezy dla danego eksperymentu. Na przykład udokumentuj obecność lub brak niereaktywnych CMP w syntezie. Kolby użyte do otrzymywania biokompozytów pochodnych CNP z kolb o różnych parametrach, takich jak czas inkubacji lub czas sonikacji.

Poszczególne CMP są zbyt małe, aby można je było zaobserwować pod mikroskopem świetlnym, jednak nieaktywne agregaty CNP będą widoczne jako ciemne obiekty o okrągłym kształcie. Kontrastuje to z pomyślnie zsyntetyzowanymi kompozytami CNP, które będą charakteryzować się wysokim współczynnikiem proporcji, liniową formą i zróżnicowaną długością. Należy unikać prowadzenia syntezy przez zbyt długi czas przed jej przerwaniem, ponieważ doprowadzi to do powstania silnie rozgałęzionych struktur typu jeż, które po utworzeniu są trudne do rozdzielenia na pojedyncze struktury.

Należy również zastosować odwróconą mikroskopię w świetle białym, aby ocenić skuteczność syntezy dla danego eksperymentu z użyciem siarczanu miedzi. Ponieważ siarczan miedzi całkowicie rozpuszcza się zgodnie z tym protokołem, roztwór ten będzie wydawał się mniej ciemny niż roztwór otrzymany w wyniku syntezy. Z zastosowaniem CMPs.

Udokumentuj rozmiar i zakres kompozytów siarczanu miedzi, porównując kolby z różnymi warunkami syntezy, takimi jak czas syntezy przed jej zakończeniem. Aby najpierw skoncentrować biokompozyty parasyntezy, dodaj 6 ml struktur pochodnych CNP lub struktur pochodnych siarczanu miedzi do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wiruj przez 10 minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej, aby utworzyć pellet dla mniejszych objętości.

Dodaj 500 µL struktur w roztworze do probówek o pojemności 0,6 ml, wiruj przy 2000 ×g w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut, aby uformować pellet. Umieść struktury w sterylnej wodzie dejonizowanej i poddaj sonikacji przez co najmniej 10 minut w celu resuspensji. Powtarzanie tego procesu w czasie prowadzi do fragmentacji struktur i zmniejszenia ich średniej długości.

Zdokumentowano zmiany rozmiarów kompozytów przy różnych czasach sonikacji przy użyciu odwróconego mikroskopu światła białego i kamery cyfrowej; nasze reprezentatywne wyniki z badania biokompozytów w pożywkach hodowli komórkowych w ciągu 82 godzin pokazują, że początkowo równomierne dyspersje CMP agregują w mikrostruktury. Z czasem cząsteczki są usuwane, a tworzą się większe agregaty. Ostatecznie pojawiają się większe agregaty o strukturach liniowych, tworząc struktury typu jeżowatego.

Przedstawiono transformację CMP w liniowe biokompozyty. CMP połączono z cysteiną i wodą, wyjściowo stosując równomierne dyspersje CMP. Po trzech godzinach powstają mikrostruktury w formie agregatów, natomiast do szóstej godziny tworzą się struktury pośrednie.

Struktury o wysokim współczynniku kształtu powstają podczas mikroskopii elektronowej. Charakterystyka zsyntetyzowanych biokompozytów została przedstawiona za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, która ukazuje materiał wyjściowy CNP wraz z tworzącymi się kompozytami liniowymi; wyjściowe CMP są okrągłe, co wykazano w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Cechy nano- i mikroskalowe kompozytów utworzonych z CMP i cysteiny zostały przedstawione za pomocą SEM.

Cechy kompozytów utworzonych z siarczanu miedzi i cysteiny zostały również przedstawione za pomocą SEM z detekcją energii rozpylanych elektronów. Pokazano analizę pierwiastkową za pomocą spektroskopii rentgenowskiej materiałów wyjściowych oraz syntetyzowanych komponentów liniowych. Początkowe CMP wykazują wyraźny piki miedzi przy braku obecności siarki.

Biokompozyty z CMP i cystyny wykazują pojawienie się pików siarki i węgla ze względu na zastosowanie cystyny jako materiału wyjściowego dla siarczanu miedzi. Materiał wykazuje piki miedzi i siarki. Biokompozyty z siarczanu miedzi i cystyny wykazują pojawienie się pików węgla ze względu na obecność cystyny. Po opanowaniu tej techniki, procedura może zostać przeprowadzona w ciągu 12 do 24 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest monitorowanie przebiegu syntezy zarówno gołym okiem, jak i pod mikroskopem, aby zapobiec zbyt silnej agregacji syntetyzowanych struktur. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak znakowanie struktur fluorescencyjne, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące wiązania się syntetyzowanych struktur z komórkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować odczynniki do syntezy, prawidłowo je połączyć, monitorować postęp syntezy oraz zagęszczać i modyfikować struktury po zakończeniu syntezy.